Summary
Las enfermedades hepáticas son inducidas por muchas causas que promueven la fibrosis o la cirrosis. El trasplante es la única opción para recuperar la salud. Sin embargo, dada la escasez de órganos trasplantables, se deben explorar alternativas. Nuestra investigación propone la implantación de andamios de colágeno en tejido hepático a partir de un modelo animal.
Abstract
Las enfermedades hepáticas son la principal causa de muerte en todo el mundo. El consumo excesivo de alcohol, una dieta alta en grasas y la infección por el virus de la hepatitis C promueven la fibrosis, la cirrosis y / o el carcinoma hepatocelular. El trasplante de hígado es el procedimiento clínicamente recomendado para mejorar y extender la vida útil de los pacientes en etapas avanzadas de la enfermedad. Sin embargo, solo el 10% de los trasplantes son exitosos, con disponibilidad de órganos, procedimientos prequirúrgicos y posquirúrgicos, y costos elevados directamente correlacionados con ese resultado. Los andamios de matriz extracelular (ECM) han surgido como una alternativa para la restauración de tejidos. La biocompatibilidad y la aceptación del injerto son las principales características beneficiosas de esos biomateriales. Aunque la capacidad de restaurar el tamaño y la función correcta del hígado se ha evaluado en modelos de hepatectomía hepática, no se ha evaluado el uso de andamios o algún tipo de soporte para reemplazar el volumen de la masa hepática extirpada.
La hepatectomía parcial se realizó en un hígado de rata con la xenoimplantación de un andamio de matriz de colágeno (CMS) de un cóndilo bovino. Se extirpó tejido del lóbulo hepático izquierdo (aproximadamente el 40%), y se implantó quirúrgicamente una proporción igual de CMS. Las pruebas de función hepática se evaluaron antes y después del procedimiento quirúrgico. Después de los días 3, 14 y 21, los animales fueron sacrificados y se realizaron evaluaciones macroscópicas e histológicas. En los días 3 y 14, se observó tejido adiposo alrededor del CMS, sin evidencia clínica de rechazo o infección, al igual que neoformación de vasos y reabsorción de CMS en el día 21. Hubo evidencia histológica de un proceso de inflamación insignificante y migración de células adyacentes al CMS, observado con la hematoxilina y la eosina (H&E) y la tinción tricrómica de Masson. Se demostró que el CMS funciona bien en el tejido hepático y podría ser una alternativa útil para estudiar la regeneración y reparación de tejidos en enfermedades hepáticas crónicas.
Introduction
El hígado es uno de los órganos más importantes implicados en el mantenimiento de la homeostasis y la producción de proteínas1. Desafortunadamente, la enfermedad hepática es la principal causa de muerte en todo el mundo. En etapas avanzadas de daño hepático, que incluyen cirrosis y carcinoma hepatocelular, el trasplante de hígado es el procedimiento clínicamente recomendado. Sin embargo, debido a la escasez de donantes y la baja tasa de trasplantes exitosos, se han desarrollado nuevas técnicas en ingeniería de tejidos (TE) y medicina regenerativa (RM)2,3.
La TE implica el uso de células madre, andamios y factores de crecimiento4 para promover la restauración de órganos y tejidos inflamados, fibróticos y edematosos1,5,6. Los biomateriales utilizados en los andamios imitan la ECM nativa, proporcionando las señales físicas, químicas y biológicas para la remodelación celular guiada7. El colágeno es una de las proteínas más abundantes obtenidas de la dermis, tendón, intestino y pericardio8,9. Además, el colágeno se puede obtener como biopolímero para producir andamios bidimensionales y tridimensionales mediante bioimpresión o electropinning10,11. Este grupo es el primero en reportar el uso de colágeno de una fuente ósea para la regeneración del tejido hepático. Otro estudio reporta el uso de andamios sintetizados a partir de colágeno bovino, que se obtuvo a partir de la piel, con poros homogéneos y estrechamente situados, sin ninguna comunicación entre ellos12.
La descelularización preserva la ECM nativa, permitiendo la posterior incorporación de células con potencial de células madre13,14. Sin embargo, este procedimiento aún se encuentra en fase experimental en el hígado, corazón, riñón, intestino delgado y vejiga urinaria de ratones, ratas, conejos, cerdos, ovejas, bovinos y equinos3,14. Actualmente, el volumen de masa hepática resecada no se reemplaza en ninguno de los modelos de hepatectomía animal. Sin embargo, el uso de soporte adicional o red (biomateriales) que permite la proliferación celular y la angiogénesis podría ser esencial para la pronta restauración de las funciones del parénquima hepático. Por lo tanto, los andamios podrían emplearse como enfoques alternativos para regenerar o reparar tejidos en enfermedades hepáticas crónicas, a su vez, eliminando las limitaciones debidas a la donación y las complicaciones clínicas del trasplante hepático.
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Protocol
La presente investigación fue aprobada por el comité de ética de la Facultad de Medicina (DI/115/2015) de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) y el comité de ética del Hospital General de México (CI/314/15). La institución cumple con todas las especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de animales de laboratorio y está legalmente certificada por la legislación nacional (NOM-062-ZOO-1999). Las ratas Wistar macho que pesan 150-250 g (6-8 semanas de edad) fueron obtenidas del Centro de Animales de Laboratorio de la Facultad de Medicina de la UNAM para este estudio.
1. Obtención de andamios de matriz de colágeno a partir del fémur bovino
- Obtener el cóndilo del fémur bovino de un matadero certificado por las autoridades sanitarias y agrícolas de México.
- Diseccione cuidadosamente la grasa, el músculo y el cartílago del cóndilo con un instrumento quirúrgico. Cortar los fragmentos de cóndilo en fragmentos de 3 cm x3 cm con un cortador de sierra y limpiar la grasa y la sangre con una toalla. Lave los fragmentos del cóndilo con agua.
- Hervir (92 °C) los fragmentos con 1 L de detergente aniónico (10 g/L) durante 30 min. Lave los fragmentos del cóndilo dos veces para eliminar cualquier resto del detergente aniónico.
- Secar los fragmentos del cóndilo durante 3 h con papel de filtro (0,5 mm).
- Preparar un CMS triangular (1 cm x1 cm x1 cm) de espesor 0,5 cm a partir de los fragmentos mencionados en el paso 1.1 (Figura 1A).
- Desmineralizar los fragmentos en 100 mL de 0,5 M HCl durante 10 min con agitación constante. Retire el HCl.
NOTA: Neutralizar el HCl con hidróxido de sodio (10 M). - Enjuague los fragmentos tres veces con 100 ml de agua destilada, 15 minutos cada vez, con agitación constante. Secar el CMS con papel de filtro (0,5 mm) durante 1 h.
- Utilice un microscopio estereoscópico15 para analizar las propiedades estructurales del CMS (tamaño de los poros, formación de poros e interconexión porosa) (Figura 1B).
- Utilice un microscopio electrónico debarrido 16 para analizar la superficie rugosa de las trabéculas CMS (Figura 1C).
- Utilice el instrumento de disección para mezclar y estirar para evaluar los cambios mecánicos (plasticidad y flexibilidad) del CMS(Figura 1D).
- Empaque el CMS en la bolsa de esterilización y esteriléctelo con plasma de peróxido de hidrógeno durante 38 minutos. Guarde el CMS estéril en el envase original en una zona seca a 20-25 °C hasta su uso.
- Desmineralizar los fragmentos en 100 mL de 0,5 M HCl durante 10 min con agitación constante. Retire el HCl.
2. Preparación del área quirúrgica y manejo y preparación del modelo animal
- Desinfecte el área quirúrgica, la mesa de trabajo, el microscopio de microcirugía y el asiento con solución de clorhexidina al 2%. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos, esponja quirúrgica, hisopos y cortinas quirúrgicas desechables mediante esterilización por calor (121 °C/30 min/100 kPa)
- Asigne a las ratas (n = 5) en tres grupos de cinco ratas por grupo: 1. simulación, 2. hepatectomía y 3. hepatectomía más CMS, y siga a todos los grupos en los días 3, 14 y 21 días.
- Administrar ketamina (35 mg/kg) y xilazina (2,5 mg/kg) por vía intramuscular en la extremidad posterior.
NOTA: El período sedante generalmente dura de 30 a 40 minutos. - Afeitar la piel abdominal (5 cm x 2 cm) con jabón quirúrgico y una cuchilla de doble filo, y desinfectar la piel con una solución tópica de povidona-yodo al 10% en tres rondas17.
- Coloque al animal en una placa caliente en la posición dorsal del decúbito, con el cuello hiperextendido para mantener una vía aérea permeable (Figura 2).
- Evaluar la profundidad de la anestesia a través del patrón respiratorio y la pérdida del reflejo de abstinencia en las extremidades.
- Coloque una cortina quirúrgica desechable alrededor de la piel afeitada y haga una incisión (2,5 cm) en la línea de albous con un bisturí, utilizando el proceso xifoide como punto de referencia. Evite el vaso sanguíneo de la pared abdominal para prevenir el sangrado.
- Coloque el retractor abdominal en su lugar y observe la cavidad abdominal. Usando las fórceps de disección, extraiga el lóbulo hepático izquierdo y colóquelo sobre la placa de metal (Figura 3A).
NOTA: En el grupo simulado, solo extraiga el lóbulo hepático izquierdo y luego devuelva el hígado a la cavidad abdominal. Sutura la pared abdominal y la piel con una sutura de nylon 3-0. - En los grupos experimentales con y sin CMS, use una cuchilla de bisturí y una hoja de bisturí estéril (# 15) para realizar la hepatectomía (aproximadamente el 40%) con dos cortes. Utilice una plantilla metálica triangular (1 cm x 1 cm x 1 cm) para realizar la hepatectomía (Figura 3B).
- Para prevenir el sangrado del hígado, mantenga la compresión quirúrgica con un hisopo en el borde del hígado durante 5 min.
- Hidratar el CMS en solución salina estéril durante 20 minutos antes del procedimiento quirúrgico. Implantar el CMS en el sitio de la hepatectomía con cuatro suturas de puntos entre el tejido hepático y el CMS para evitar el desplazamiento del biomaterial. Utilice 7-0 suturas de polipropileno no absorbibles(Figura 3C).
NOTA: No retire las suturas en una segunda cirugía; las suturas se pueden utilizar como referencia para identificar el sitio de implantación de CMS. - Devuelva el hígado a la cavidad abdominal y suture la pared abdominal y la piel con una sutura de nylon 3-0. Limpie la incisión quirúrgica con una esponja quirúrgica empapada de yodo en dos rondas. Observar y vigilar los signos vitales de los animales.
- Administrar ketamina (35 mg/kg) y xilazina (2,5 mg/kg) por vía intramuscular en la extremidad posterior.
3. Cuidados postoperatorios
- Administrar meglumina flunixina (2,5 mg/kg) por vía intramuscular en la extremidad posterior. Administrar analgésicos según lo aprobado por el comité institucional de cuidado y uso de animales.
- Para la recuperación de la anestesia, coloque a los animales en cajas individuales de policarbonato con ropa de cama de animales de laboratorio en un área libre de ruido con control de temperatura (23 ° C).
- Observar la recuperación de los animales y controlar su consumo de agua y alimentos durante 2 h. Monitorear a los animales después de la operación según lo aprobado por el comité institucional de cuidado y uso de animales.
4. Evaluación de la función hepática en suero
- Recolectar muestras de sangre (500 μL) de las venas laterales de la cola de los animales anestesiados antes del procedimiento quirúrgico (valores basales) y en los días de evaluación 3, 14 y 21.
- Centrifugar las muestras de sangre a 850 × g/10 min a temperatura ambiente (23 °C); separar el suero y almacenarlo a -80°C hasta su uso.
- Realizar un panel de pruebas de función hepática: albúmina sérica (ALB), fosfatasa alcalina (ALP), alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), bilirrubina total (TB) y bilirrubina directa (DB) (Tabla 1).
5. Eutanasia y manejo de tejidos
- Anestesiar a los animales para cada evaluación (días 3, 14 y 21) siguiendo el protocolo descrito anteriormente.
- La eutanasia a través de métodos aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales.
- Realizar una incisión (5-6 cm) en la línea albous con un bisturí para observar los órganos de la cavidad abdominal y tomar fotografías de la zona de hepatectomía de los grupos simulado y experimental, con y sin el CMS.
- Tomar muestras de hígado (2 cm x 2 cm; 0,40-0,45 g) de todos los animales del grupo de estudio y colocarlas en una solución de formaldehído al 4% durante 24 h para su posterior evaluación histológica.
6. Análisis histológico
- Preservar los tejidos hepáticos en formaldehído al 4% y deshidratar el tejido utilizando una serie de concentraciones de alcohol (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); colóquelos en xileno (1h) y colóquelos en parafina16.
- Cortar los bloques de parafina con un microtomo en secciones de 4 μm de espesor para la preparación de ocho portaobjetos.
- Realizar tinción tricrómica de H&E y Masson16.
- Observe las secciones teñidas bajo un microscopio de luz para seleccionar las áreas representativas del hígado, con y sin CMS. Obtenga fotomicrografías a un aumento de 4x, 10x y 40x y procese las imágenes utilizando el software apropiado18 (consulte la Tabla de Materiales).
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Representative Results
La desmineralización ósea afecta las propiedades mecánicas de CMS sin alterar la forma original o la interconexión de susporos. CmS puede tener cualquier forma, y por lo tanto, se puede ajustar al tamaño y forma del órgano o tejido seleccionado19. En el presente protocolo, utilizamos un CMS triangular(Figura 1A-D). Se utilizó un modelo de rata para evaluar la capacidad regenerativa del xenoimplante CMS en el hígado. Aunque el hígado es un órgano friable y blando, el procedimiento quirúrgico realizado en este protocolo aseguró que el CMS permaneciera en su lugar(Figura 2 y Figura 3A-C). La hepatectomía parcial del 40% del lóbulo izquierdo permitió evaluar una porción del órgano, manteniendo intacto el resto del hígado, de modo que se pudieron comparar los cambios en el implante y el parénquima nativo. Además, obtuvimos muestras de sangre para evaluar la función hepática antes y después de la implantación de CMS.
No hubo diferencias en las concentraciones basales de los parámetros bioquímicos entre el grupo simulado y el grupo experimental con y sin implantación de CMS a los 3 y 14 días; se mantuvieron dentro de los valores de referencia (ALB: 0,43-2,41 g/dL; ALP: 134-357.3 U/L; ALT: 41-83.1 UI/L; AST: 61.4-276.2 UI/L; TB: 0.01-0.43 mg/dL; DB: 0,1 mg/dL)20. Además, no hubo diferencias en los niveles de albúmina, ALP, ALT, AST, TB y DB entre el grupo simulado y los grupos experimentales a los 21 días, lo que indica que el CMS no altera la función hepática(Tabla 1).
Durante la eutanasia, la laparotomía exploratoria reveló el color típico y el tamaño y la forma correctos del hígado. No se observó inflamación o infección en el sitio de implantación en ninguno de los casos. En el día 3, no hubo cambios en el órgano en relación con la cavidad abdominal (Figura 4A). En una porción que contenía tejido hepático y CMS, se observó que la sangre se había infiltrado en el CMS, con incipiente grasa omental adherente(Figura 4B). El día 14, la cantidad de grasa aumentó; hubo neoformación de los vasos sanguíneos y la integración del CMS en el tejido hepático receptor, pero no hubo cambios en el intestino delgado ni en los órganos de la cavidad abdominal (Figura 5A). La grasa omental fue mayor en la zona anterior(Figura 5B)en comparación con la zona visceral(Figura 5C)en el sitio de implantación del CMS. En el día 21 de la evaluación, la incorporación de CMS en el hígado fue más evidente (Figura 6A). El aumento de la grasa omental podría utilizarse como indicador del progreso de la regeneración, ya que es una fuente de células madre mesenquimales21. Además, a los 21 días, el hígado presentó áreas densas que correspondían a degradación y absorción, cambiando el tamaño y la forma original (Figura 6B).
Para analizar la microestructura del hígado con el implante CMS, se realizó un análisis histológico de un fragmento representativo de tejido del sitio de implantación, que se comparó con tejido del lóbulo hepático derecho (control). Las biopsias realizadas en los días 3, 14 y 21 fueron procesadas y sometidas a la tinción tricrómica de H&E y Masson. La estructura normal del parénquima hepático se observó en el grupo simulado en el día 21(Figura 7A y Figura 7E). En el día 3, el análisis histológico mostró que la presencia del CMS en el hígado no promovió una reacción de cuerpo extraño, y se observó la presencia conspicua de tejido conectivo laxo(Figura 7B y Figura 7F). En los días 14 y 21, el tejido conectivo laxo fue más abundante, con las trabéculas del CMS rodeadas de hepatocitos, lo que sugiere que los hepatocitos habían migrado al CMS(Figura 7C y Figura 7G; Figura 7D y Figura 7H). Los resultados también mostraron áreas de hepatocitos que fueron irrigadas por un vaso(Figura 8A). Una inspección minuciosa reveló que los hepatocitos que se habían adherido a las trabéculas cmséricos a veces estaban rodeados de tejido conectivo laxo(Figura 8B-D). Dos patólogos independientes doble ciego realizaron el análisis histopatológico. Se están realizando ensayos basados en la inmunohistoquímica y la reacción en cadena de la polimerasa para evaluar las diferentes proteínas y genes relacionados con el proceso de regeneración hepática.
Por lo tanto, las observaciones macroscópicas y microscópicas y los valores bioquímicos apoyan nuestra proposición de que el CMS es un biomaterial ideal para apoyar y promover la regeneración hepática. Sin embargo, la implantación de CMS debe evaluarse durante más de 21 días para determinar su tiempo de absorción y la restauración completa del tejido hepático. Además, se deben realizar estudios que evalúen las diferentes proteínas y genes relacionados con la regeneración hepática en presencia del CMS.
Figura 1: Muestra ósea y el CMS. ( A ) Se utilizóunamuestra triangular del espécimen óseo para preparar el CMS. (B)Una vista detallada de los poros y la interconexión o conexión trabecular del CMS, según lo observado por microscopía electrónica. (C) El CMS, visto bajo un microscopio estereoscópico. (D) La manipulación de CMS con un instrumento se llevó a cabo para verificar la modificación de las propiedades mecánicas. Abreviatura: CMS = andamio de matriz de colágeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Preparación del animal para la cirugía. El animal se encuentra en posición dorsal decúbito, mostrando la zona abdominal afeitada, preparada para la hepatectomía y la implantación de CMS. Abreviatura: CMS = andamio de matriz de colágeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Hepatectomía del lóbulo izquierdo del hígado. (A) Se extrajo el lóbulo izquierdo y se colocó sobre la placa metálica para realizar la hepatectomía. (B) La hepatectomía del 40% del lóbulo izquierdo se realizó en forma triangular, como el CMS. (C) El área de la hepatectomía es reemplazada por el CMS. Abreviatura: CMS = andamio de matriz de colágeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Día 3 de evaluación. (A) Observación macroscópica del sitio de implantación en el día de evaluación 3. El hígado implantado con (estrella llena) el CMS (línea punteada) no cambió de color ni de tamaño. El intestino delgado (estrella vacía) y el resto de las estructuras abdominales no mostraron alteraciones. (B) Muestra del hígado (estrella llena) y el CMS (flecha blanca) cubierto de grasa omental (flecha roja). Abreviatura: CMS = andamio de matriz de colágeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Día 14 de evaluación. (A) Observación macroscópica del sitio de implantación en el día de evaluación 14. El tejido hepático (estrella llena) con el CMS no cambió de color o tamaño. El intestino delgado (estrella vacía) y el resto de las estructuras y órganos de la cavidad abdominal no mostraron alteraciones. Muestra del hígado con el CMS implantado: (B) vista anterior; (C) vista posterior/visceral. Grasa omental (flecha roja) que cubre el área. El CMS se integró en el tejido hepático. La grasa omental (flecha roja) cubre principalmente el área en la vista anterior. La línea punteada indica el sitio de implantación de CMS; suturas (hilo azul). Abreviatura: CMS = andamio de matriz de colágeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Día 21 de evaluación. (A) Observación macroscópica del lugar de implantación en el día de evaluación 21. El hígado receptor (estrella llena) implantado con el CMS (línea punteada) no cambió de color ni de tamaño. El intestino delgado (estrella vacía) y el resto de las estructuras abdominales no mostraron alteraciones. (B) Muestra del hígado con el CMS implantado (línea punteada) que muestra cambios en el tamaño y la forma. Abreviatura: CMS = andamio de matriz de colágeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Histología del hígado y del hígado con CMS. (A) Hígado normal (SHAM) que muestra la arquitectura tisular característica. (B) Día 3 de implantación de CMS que muestra tejido conectivo laxo en las trabéculas del CMS (óvalos discontinuos). (C) Zona de transición entre el hígado nativo (lado derecho) y el CMS (lado izquierdo), con las trabéculas del CMS (flecha). (D) Hígado nativo en contacto con el CMS (líneas punteadas) en el día 21. (E) Hígado normal con tinción tricrómica de Masson. (F) El CMS implantado en el hígado; invasión de tejido conectivo laxo en el día 3 (óvalo discontinuo). (G) El día 14, hígado nativo con las trabéculas CMS, mostrando un área de hepatocitos (estrella llena) fuera del hígado nativo, lo que indica que los hepatocitos nativos habían migrado a través del CMS. (H) En el día 21, los hepatocitos nativos han migrado hacia el CMS (flecha). A y E: Barras de escala = 200 μm: 4x, B-D y F-H: Barras de escala = 100 μm: 10x. A-D: Tinción H&E; E-H: Tinción tricrómica de Masson. Abreviaturas: CMS = andamio de matriz de colágeno; H&E = hematoxilina y eosina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Histología del hígado y CMS. (A) Pool de hepatocitos (flecha blanca) presentes en las trabéculas del CMS (flecha negra). Los hepatocitos son irrigados por un vaso (estrella llena). (B) Los hepatocitos (flecha blanca) han migrado y se han adherido a las trabéculas del CMS (flecha negra). (C) Se observa un grupo de hepatocitos (círculo discontinuo) entre dos trabéculas (flechas negras) del CMS. (D) Los hepatocitos se han adherido a las trabéculas (flechas negras) de CMS en presencia de tejido conectivo laxo (óvalo discontinuo). A y C: Barras de escala = 100 μm: 10x. B y D: Barras de escala = 20 μm: 40x. Abreviatura: CMS = andamio de matriz de colágeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Días | FINGIR | Hepatectomía | Implantación CMS | |
| ALB (g/dL) | 3 | 1.4±0 | 1.25±0.07 | 1.4±0 |
| 14 | 1.3±0.5 | 1.85±0.07 | 1.8±0.14 | |
| 21 | 1.3±05 | 1.6±0.1 | 1,7± 0 | |
| ALT (UI/L) | 3 | 73±1,4 | 3.5±0.7 | 54,6±6,4 |
| 14 | 84±0 | 59,5±4,9 | 57±4.2 | |
| 21 | 57±0 | 73,5±14,8 | 73,5±14,8 | |
| AST (UI/L) | 3 | 106±1.4 | 80±6,6 | 90±1,4 |
| 14 | 127±5,5 | 94±21.2 | 83,5±17,6 | |
| 21 | 123,7±27,3 | 92,5±24,7 | 101±31.1 | |
| TB (mg/dL) | 3 | 0.33±0.05 | 0,25±0,07 | 0,3±0 |
| 14 | 0,5±0 | 0,2±0 | 0,15±0 | |
| 21 | 0,3±0 | 0,4±0 | 0.4±0.14 | |
| DB (mg/dL) | 3 | 0,1±0 | 0.05±0.07 | 0,1±0 |
| 14 | 0,1±0 | 0,1±0 | 0,1±0 | |
| 21 | 0,1±0 | 0,1±0 | 0,1±0 |
Tabla 1: Función hepática. Se realizaron pruebas de función hepática para los grupos simulados y experimentales con y sin CMS a los 3, 14 y 21 días. Abreviaturas: CMS = andamio de matriz de colágeno; ALB = Albúmina; ALP = fosfatasa alcalina; ALT= Alanina aminotransferasa; AST = Aspartato aminotransferasa; TB = Bilirrubina total; DB = Bilirrubina directa.
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Discussion
El trasplante de órganos es el pilar del tratamiento en pacientes con fibrosis hepática o cirrosis. Algunos pacientes se benefician de este procedimiento, por lo que es necesario proporcionar alternativas terapéuticas para los pacientes en lista de espera. La ingeniería de tejidos es una estrategia prometedora que emplea andamios y células con potencial regenerativo2,4,13. La extirpación de una porción del hígado es un paso crítico en este procedimiento debido al sangrado profuso de este órgano vascularizado. Por lo tanto, se debe realizar la hemostasia del lecho quirúrgico para prevenir esta complicación. Además, la unión del tejido hepático al CMS, que es esencial para garantizar la interacción tejido-biomaterial, se facilita mediante el uso de suturas. Sin embargo, debe hacerse con cuidado para evitar desgarrar el hígado y causar sangrado posterior.
Aunque el biomaterial propuesto aquí es de origen bovino (xenogénico), no existen datos de reacción de biomateriales en ratas, lo que hace posible la hepatectomía selectiva. Por el contrario, se ha demostrado que el modelo de hepatectomía 2/3 causa la muerte de los animales debido a la eliminación de una gran cantidad de tejido hepático14. Además, desarrollamos una plantilla metálica de acero inoxidable porque tuvimos dificultades para estandarizar el tamaño en la hepatectomía y el CMS. La esterilización del CMS fue un desafío porque las técnicas existentes modificaron la estructura del colágeno y sus propiedades bioquímicas. Por lo tanto, la esterilización por calor, radiación gamma y óxido de etileno se exploró como métodos de esterilización antes de determinar que el plasma de peróxido de hidrógeno era la técnica óptima13.
Es esencial determinar el tamaño máximo del CMS que podría implantarse en el hígado y evaluar la respuesta biológica a nivel sistémico. Además, es necesario optimizar e investigar la eficacia de esta técnica en una especie animal más grande. Además, es importante investigar los efectos de la implantación del CMS en el hígado durante un período más largo (>30 días), lo que permitirá evaluar el alcance de la biosorción del CMS y la regeneración del tejido hepático. Además, los efectos de la implantación de CMS deben examinarse en modelos animales con daño hepático. Este método de implantación ha abierto la puerta a estrategias que exploran la restauración de la forma y el volumen del tejido reseado, reduciendo así la anestesia, la duración quirúrgica y el tiempo de recuperación4,13.
El CMS se obtuvo de una fuente natural y conservó sus propiedades físicas y químicas en comparación con los biomateriales sintéticos fabricados utilizando metodologías complejas, como la bioimpresión o el electrospinning, que no son biocompatibles ni bioabsorbibles2,3. El componente principal de este CMS es el colágeno tipo I, que es la principal proteína de la ECM que permite la adhesión y proliferación celular22. Además, las trabéculas de los poros cmsículas permiten la migración celular y el flujo continuo de factores de crecimiento, sangre y otros mediadores del proceso de regeneración. Según el tejido a reparar, este grupo de investigación tiene experiencia diseñando el CMS en diferentes formas, preservando su estructura 3D. Por ejemplo, los CMS cilíndricos se implantaron en la uretra y el conducto biliar del perro en cerdos y arrojaron resultados prometedores en la regeneración de tejidos23,24.
La implantación de este CMS podría ser un tratamiento alternativo para estimular la regeneración tisular y restaurar el equilibrio fibrogénesis-fibrólisis en la cirrosis hepática debido a diferentes etiologías (por ejemplo, virus, alcohol, factores metabólicos). Se deben realizar ensayos de proliferación, migración e inflamación para identificar los mecanismos moleculares y celulares desencadenados por el CMS. En conclusión, este trabajo describe un procedimiento reproducible para la hepatectomía, así como el examen del proceso de regeneración a través de la xenoimplantación de biomateriales.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos. Benjamín León-Mancilla es estudiante de doctorado del Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) y recibió la beca DGAPA-UNAM.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al personal del Centro de Animales de Laboratorio de la Unidad de Medicina Experimental, a la enfermera Carolina Baños G. por el apoyo técnico y quirúrgico, a Marco E. Gudiño Z. por el apoyo en microfotografías y a Erick Apo por el apoyo en histología hepática. El Consejo Nacional apoyó esta investigación para la Ciencia y la Tecnología(CONACyT),número de subvención SALUD-2016-272579 y el PAPIIT-UNAM TA200515.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anionic detergent | Alconox | Z273228 | |
| Biopsy cassettes | Leica | 3802453 | |
| Camera DMX | Nikon | DXM1200F | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | BD | 372412 | |
| Cover glasses 25 mm x 40 mm | Corning | 2980-224 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 200-M | CAS 17372-87-1 |
| Ethyl alcohol, pure | Sigma-Aldrich | 459836 | CAS 64-17-5 |
| Flunixine meglumide | MSD | Q-0273-035 | |
| Glass slides 75 mm x 25 mm | Corning | 101081022 | |
| Hematoxylin | Merck | H9627 | CAS 571-28-2 |
| Hydrochloric acid 37% | Merck | 339253 | CAS 7647-01-0 |
| Ketamine | Pisa agropecuaria | Q-7833-028 | |
| Light microscope | Nikon | Microphoto-FXA | |
| Microsurgery stereomicroscope | Zeiss | OPMI F170 | |
| Microtainer yellow cape | Beckton Dickinson | 365967 | |
| Microtome | Leica | RM2125 | |
| Model animal: Wistar rats | Universidad Nacional Autónoma de México | ||
| Nylon 3-0 (Dermalon) | Covidien | 1750-41 | |
| Polypropylene 7-0 | Atramat | SE867/2-60 | |
| Povidone-iodine10% cutaneous solution | Diafra SA de CV | 1.37E+86 | |
| Scanning electronic microscope | Zeiss | DSM-950 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J. T. Baker | 3722-01 | CAS 1310-73-2 |
| Software ACT-1 | Nikon | Ver 2.70 | |
| Stereomicroscope | Leica | EZ4Stereo 8X-35X | |
| Sterrad 100S | Johnson and Johnson | 99970 | |
| Surgipath paraplast | Leica | 39601006 | |
| Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm) | SensiMedical | LAN-078-077 | |
| Tissue Processor (Histokinette) | Leica | TP1020 | |
| Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder) | Sakura Finetek USA | 5229 | |
| Trichrome stain kit | Sigma-Aldrich | HT15 | |
| Unicell DxC600 Analyzer | Beckman Coulter | BC 200-10 | |
| Xylazine | Pisa agropecuaria | Q-7833-099 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | CAS 1330-20-7 |
References
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