Summary
Leverziekten worden veroorzaakt door vele oorzaken die fibrose of cirrose bevorderen. Transplantatie is de enige optie om de gezondheid te herstellen. Gezien de schaarste aan transplanteerbare organen moeten echter alternatieven worden onderzocht. Ons onderzoek stelt de implantatie van collageensteigers in leverweefsel voor vanuit een diermodel.
Abstract
Leverziekten zijn wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak. Overmatig alcoholgebruik, een vetrijk dieet en hepatitis C-virusinfectie bevorderen fibrose, cirrose en / of hepatocellulair carcinoom. Levertransplantatie is de klinisch aanbevolen procedure om de levensduur van patiënten in gevorderde ziektestadia te verbeteren en te verlengen. Slechts 10% van de transplantaties is echter succesvol, met orgaanbeschikbaarheid, prechirurgische en postoperatieve procedures en verhoogde kosten die direct gecorreleerd zijn met dat resultaat. Extracellulaire matrix (ECM) steigers zijn naar voren gekomen als een alternatief voor weefselherstel. Biocompatibiliteit en entacceptatie zijn de belangrijkste gunstige eigenschappen van die biomaterialen. Hoewel het vermogen om de grootte en de juiste functie van de lever te herstellen is geëvalueerd in leverhepatectomiemodellen, is het gebruik van steigers of een soort ondersteuning ter vervanging van het volume van de uitgeroeste levermassa niet beoordeeld.
Gedeeltelijke hepatectomie werd uitgevoerd in een rattenlever met de xeno-implantatie van een collageenmatrixsteiger (CMS) van een rundercondylus. Linker leverkwabweefsel werd verwijderd (ongeveer 40%) en een gelijk deel van CMS werd chirurgisch geïmplanteerd. Leverfunctietests werden geëvalueerd voor en na de chirurgische ingreep. Na dag 3, 14 en 21 werden de dieren geëuthanaseerd en werden macroscopische en histologische evaluaties uitgevoerd. Op dag 3 en 14 werd vetweefsel rond het CMS waargenomen, zonder klinisch bewijs van afstoting of infectie, net als vaatneoformatie en CMS-reabsorptie op dag 21. Er was histologisch bewijs van een onbeduidend ontstekingsproces en migratie van aangrenzende cellen naar het CMS, waargenomen met de hematoxyline en eosine (H & E) en Masson's trichrome kleuring. Het CMS bleek goed te presteren in leverweefsel en zou een nuttig alternatief kunnen zijn voor het bestuderen van weefselregeneratie en -herstel bij chronische leverziekten.
Introduction
De lever is een van de belangrijkste organen die betrokken zijn bij het handhaven van homeostase en eiwitproductie1. Helaas is leverziekte wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak. In gevorderde stadia van leverschade, waaronder cirrose en hepatocellulair carcinoom, is levertransplantatie de klinisch aanbevolen procedure. Vanwege de schaarste aan donoren en het lage aantal succesvolle transplantaties zijn echter nieuwe technieken in tissue engineering (TE) en regeneratieve geneeskunde (RM) ontwikkeld2,3.
TE omvat het gebruik van stamcellen, steigers en groeifactoren4 om het herstel van ontstoken, fibrotische en oedemateuze organen en weefsels te bevorderen1,5,6. De biomaterialen die in steigers worden gebruikt, bootsen de inheemse ECM na en bieden de fysische, chemische en biologische aanwijzingen voor geleide cellulaire remodellering7. Collageen is een van de meest voorkomende eiwitten verkregen uit de dermis, pees, darm en pericard8,9. Bovendien kan collageen worden verkregen als een biopolymeer om twee- en driedimensionale steigers te produceren door middel van bioprinting of elektrospinning10,11. Deze groep is de eerste die het gebruik van collageen uit een botbron voor de regeneratie van leverweefsel meldt. Een andere studie meldt het gebruik van steigers gesynthetiseerd uit rundercollageen, dat werd verkregen uit de huid, met homogene en dicht bij elkaar gelegen poriën, zonder enige communicatie tussen hen12.
Decellularisatie behoudt de inheemse ECM, waardoor de daaropvolgende integratie van cellen met stamcelpotentiaal13,14mogelijk is. Deze procedure bevindt zich echter nog steeds in de experimentele fase in de lever, het hart, de nieren, de dunne darm en de urineblaas van muizen, ratten, konijnen, varkens, schapen, runderen en paarden3,14. Momenteel wordt het gereseceerde levermassavolume niet vervangen in een van de dierhepatectomiemodellen. Het gebruik van extra ondersteuning of netwerk (biomaterialen) dat celproliferatie en angiogenese mogelijk maakt, kan echter essentieel zijn voor het snelle herstel van leverparenchymale functies. Steigers kunnen dus worden gebruikt als alternatieve benaderingen om weefsel te regenereren of te herstellen bij chronische leverziekten, waardoor beperkingen als gevolg van donatie en de klinische complicaties van levertransplantatie worden geëlimineerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het huidige onderzoek werd goedgekeurd door de ethische commissie van de School of Medicine (DI/115/2015) aan de Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) en de ethische commissie van het Hospital General de Mexico (CI/314/15). De instelling voldoet aan alle technische specificaties voor de productie, verzorging en het gebruik van proefdieren en is wettelijk gecertificeerd door de nationale wetgeving (NOM-062-ZOO-1999). Mannelijke Wistar-ratten met een gewicht van 150-250 g (6-8 weken oud) werden voor deze studie verkregen van de Laboratory Animal Facility van de School of Medicine, UNAM.
1. Collageenmatrixsteigers verkrijgen uit runderdijbeen
- Verkrijg de condyle van runderdijbeen uit een slachthuis dat is gecertificeerd door de gezondheids- en landbouwautoriteiten van Mexico.
- Ontleed zorgvuldig het condylevet, de spier en het kraakbeen met een chirurgisch instrument. Snijd de condylefragmenten met een zaagsnijder in fragmenten van 3 cm x3 cm en reinig het vet en bloed met een handdoek. Was de condylefragmenten met water.
- Kook (92 °C) de fragmenten met 1 l anionisch des wasmiddel (10 g/L) gedurende 30 minuten. Was de condylefragmenten tweemaal om eventuele resten van het anionische reinigingsmiddel te verwijderen.
- Droog de condylefragmenten gedurende 3 uur met filtreerpapier (0,5 mm).
- Bereid een driehoekig (1 cm x 1 cm x1 cm) CMS van dikte 0,5 cm uit de fragmenten vermeld in stap 1.1 (Figuur 1A).
- Demineraliseer de fragmenten in 100 ml van 0,5 M HCl gedurende 10 minuten met constante agitatie. Verwijder de HCl.
OPMERKING: Neutraliseer de HCl met natriumhydroxide (10 M). - Spoel de fragmenten drie keer met 100 ml gedestilleerd water, telkens 15 minuten, met constante agitatie. Droog het CMS met filtreerpapier (0,5 mm) gedurende 1 uur.
- Gebruik een stereomicroscoop15 om de structurele eigenschappen van het CMS te analyseren (grootte van de poriën, porievorming en poreuze interconnectie) (Figuur 1B).
- Gebruik een scanning elektronenmicroscoop16 om het ruwe oppervlak van de CMS trabeculae te analyseren(Figuur 1C).
- Gebruik het dissectie-instrument voor mengen en uitrekken om de mechanische veranderingen (plasticiteit en flexibiliteit) van het CMS te evalueren(figuur 1D).
- Verpak het CMS in het sterilisatiezakje en steriliseer het gedurende 38 minuten met waterstofperoxideplasma. Bewaar het steriele CMS in de originele verpakking in een droge ruimte bij 20-25 °C tot gebruik.
- Demineraliseer de fragmenten in 100 ml van 0,5 M HCl gedurende 10 minuten met constante agitatie. Verwijder de HCl.
2. Voorbereiding van het operatiegebied en behandeling en voorbereiding van het diermodel
- Ontsmet het operatiegebied, de werktafel, de microchirurgische microscoop en de zitting met 2% chloorhexidine-oplossing. Steriliseer alle chirurgische instrumenten, chirurgische spons, wattenstaafjes en wegwerpchirurgisch gordijn door middel van warmtesterilisatie (121 °C/30 min/100 kPa)
- Wijs de ratten (n= 5) toe aan drie groepen van vijf ratten per groep: 1. sham, 2. hepatectomie en 3. hepatectomie plus CMS, en volg alle groepen op dag 3, 14 en 21 dagen.
- Dien ketamine (35 mg/kg) en xylazine (2,5 mg/kg) intramusculair toe in de achterpoot.
OPMERKING: De kalmerende periode duurt meestal 30-40 minuten. - Scheer de buikhuid (5 cm x 2 cm) met chirurgische zeep en een tweesnijdend mes en desinfecteer de huid met actuele 10% povidon-jodiumoplossing in drie rondes17.
- Plaats het dier op een warme plaat in de dorsale positie van de decubitus, met de nek hyperextended om een doorlaatbare luchtweg te behouden (figuur 2).
- Evalueer de diepte van de anesthesie door het ademhalingspatroon en het verlies van de ontwenningsreflex in de ledematen.
- Plaats een wegwerpchirurgisch gordijn rond de geschoren huid en maak een incisie (2,5 cm) op de albeuze lijn met een scalpel, met het xiphoid-proces als referentiepunt. Vermijd het bloedvat van de buikwand om bloedingen te voorkomen.
- Plaats de abdominale retractor op zijn plaats en observeer de buikholte. Gebruik de dissectie-tang om de linker leverkwab te extraheren en op de metalen plaat te plaatsen(figuur 3A).
OPMERKING: In de schijngroep, extraheer alleen de linker leverkwab en breng de lever vervolgens terug naar de buikholte. Hecht de buikwand en huid met een 3-0 nylon hechting. - Gebruik in de experimentele groepen met en zonder CMS een scalpelmes en steriel scalpelmes (# 15) om hepatectomie (ongeveer 40%) uit te voeren met twee sneden. Gebruik een driehoekige metalen sjabloon (1 cm x 1 cm x 1 cm) om de hepatectomie uit te voeren(figuur 3B).
- Om bloedingen van de lever te voorkomen, handhaaft u de chirurgische compressie met een wattenstaafje aan de rand van de lever gedurende 5 minuten.
- Hydrateer het CMS in steriele zoutoplossing gedurende 20 minuten vóór de chirurgische ingreep. Implanteer het CMS op de hepatectomieplaats met vier hechtingen tussen het leverweefsel en het CMS om verplaatsing van het biomateriaal te voorkomen. Gebruik 7-0 niet-absorbeerbare polypropyleen hechtingen(figuur 3C).
OPMERKING: Verwijder de hechtingen niet bij een tweede operatie; hechtingen kunnen worden gebruikt als referentie om de plaats van CMS-implantatie te identificeren. - Breng de lever terug naar de buikholte en hecht de buikwand en de huid met een 3-0 nylon hechting. Reinig de chirurgische incisie met een chirurgische jodium-gedrenkte spons in twee rondes. Observeer en bewaak de vitale functies van de dieren.
- Dien ketamine (35 mg/kg) en xylazine (2,5 mg/kg) intramusculair toe in de achterpoot.
3. Postoperatieve zorg
- Dien meglumine flunixine (2,5 mg/kg) intramusculair toe in de achterpoot. Analgetica toedienen zoals goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierverzorging en -gebruik.
- Voor anesthesieherstel plaatst u de dieren in individuele polycarbonaatdozen met laboratoriumdierstrooisel in een geruisvrije ruimte met temperatuurregeling (23 °C).
- Observeer het herstel van de dieren en controleer hun water- en voedselconsumptie gedurende 2 uur. Bewaak dieren postoperatief zoals goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierverzorging en -gebruik.
4. Evaluatie van de leverfunctie in serum
- Verzamel bloedmonsters (500 μL) van de laterale staartaderen van de verdoofde dieren vóór de chirurgische ingreep (uitgangswaarden) en op evaluatiedagen 3, 14 en 21.
- Centrifugeer de bloedmonsters bij 850 × g/10 min bij kamertemperatuur (23 °C); scheid het serum en bewaar het bij -80°C tot gebruik.
- Voer een panel van leverfunctietests uit: serumalbumine (ALB), alkalische fosfatase (ALP), alanineaminotransferase (ALAT), aspartaataminotransferase (ASAT), totaal bilirubine (TB) en direct bilirubine (DB) (tabel 1).
5. Euthanasie en weefselmanagement
- Verdoof de dieren voor elke evaluatie (dag 3, 14 en 21) door het hierboven beschreven protocol te volgen.
- Euthanaseer via methoden die zijn goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierverzorging en -gebruik.
- Voer een incisie (5-6 cm) uit op de albeuze lijn met een scalpel om de organen van de buikholte te observeren en foto's te maken van het hepatectomiegebied van de sham en de experimentele groepen, met en zonder het CMS.
- Neem levermonsters (2 cm x 2 cm; 0,40-0,45 g) van alle dieren in de onderzoeksgroep en plaats ze gedurende 24 uur in een 4% formaldehyde-oplossing voor daaropvolgende histologische evaluatie.
6. Histologische analyse
- Bewaar de leverweefsels in 4% formaldehyde en droger het weefsel uit met behulp van een reeks alcoholconcentraties (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); plaats ze in xyleen (1 uur) en ingebed ze in paraffine16.
- Snijd de paraffineblokken met een microtoom in 4 μm dikke secties voor de voorbereiding van acht dia's.
- Voer H&E en Masson's trichrome kleuringuit 16.
- Observeer de gekleurde secties onder een lichtmicroscoop om de representatieve gebieden van de lever te selecteren, met en zonder CMS. Verkrijg fotomicrografen met een vergroting van 4x, 10x en 40x en verwerk de afbeeldingen met behulp van de juiste software18 (zie de tabel met materialen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Botdemineralisatie beïnvloedt de mechanische eigenschappen van CMS zonder de oorspronkelijke vorm of interconnectie van de poriën te veranderen. CMS kan elke vorm hebben en kan daarom worden aangepast aan de grootte en vorm van het geselecteerde orgaan of weefsel19. In het huidige protocol gebruikten we een driehoekig CMS (Figuur 1A-D). Een rattenmodel werd gebruikt om het regeneratieve vermogen van de CMS-xeno-implantaat in de lever te evalueren. Hoewel de lever een brokkelig en zacht orgaan is, zorgde de chirurgische ingreep die in dit protocol werd uitgevoerd ervoor dat het CMS op zijn plaats bleef(figuur 2 en figuur 3A-C). De partiële hepatectomie van 40% van de linkerkwab maakte het mogelijk om een deel van het orgaan te beoordelen, waarbij de rest van de lever intact bleef, zodat de veranderingen in het implantaat en het inheemse parenchym konden worden vergeleken. Daarnaast hebben we bloedmonsters verkregen om de leverfunctie voor en na CMS-implantatie te evalueren.
Er waren geen verschillen in uitgangsconcentraties van de biochemische parameters tussen de schijngroep en de experimentele groep met en zonder CMS-implantatie na 3 en 14 dagen; zij bleven binnen de referentiewaarden (ALB: 0,43-2,41 g/dL; ALP: 134-357.3 U/L; ALT:41-83.1 UI / L; AST:61.4-276.2 UI / L; TB:0,01-0,43 mg / dL; DB:0,1 mg / dL)20. Bovendien waren er geen verschillen in de albumine-, ALP-, ALT-, AST-, TB- en DB-niveaus tussen de schijngroep en de experimentele groepen na 21 dagen, wat aangeeft dat het CMS de leverfunctie niet verstoort(tabel 1).
Tijdens euthanasie onthulde verkennende laparotomie de typische kleur en de juiste grootte en vorm van de lever. Er werd in geen van de gevallen een ontsteking of infectie waargenomen op de implantatieplaats. Op dag 3 waren er geen veranderingen in het orgaan ten opzichte van de buikholte(figuur 4A). In een deel dat leverweefsel en CMS bevatte, werd waargenomen dat bloed het CMS had geïnfiltreerd, met beginnend aanhangend omentaal vet(figuur 4B). Op dag 14 nam de hoeveelheid vet toe; er was bloedvatneoformatie en de integratie van het CMS in het ontvangende leverweefsel, maar geen veranderingen in de dunne darm of organen van de buikholte (figuur 5A). Omentaal vet was hoger in de voorste zone (figuur 5B) in vergelijking met de viscerale zone (figuur 5C) op de CMS-implantatieplaats. Op evaluatiedag 21 was cms-integratie in de lever duidelijker(figuur 6A). De toename van omentaal vet kan worden gebruikt als een indicator van de voortgang van regeneratie, omdat het een bron is van mesenchymale stamcellen21. Bovendien presenteerde de lever na 21 dagen dichte gebieden die overeenkwamen met afbraak en absorptie, waardoor de grootte en oorspronkelijke vorm veranderden(figuur 6B).
Om de microstructuur van de lever met het CMS-implantaat te analyseren, voerden we histologische analyse uit van een representatief weefselfragment van de implantatieplaats, dat werd vergeleken met weefsel uit de rechter leverkwab (controle). Biopsieën uitgevoerd op dag 3, 14 en 21 werden verwerkt en onderworpen aan H & E en Masson's trichrome kleuring. De normale structuur van het leverparenchym werd waargenomen in de schijngroep op dag 21 (figuur 7A en figuur 7E). Op dag 3 toonde de histologische analyse aan dat de aanwezigheid van het CMS in de lever geen reactie van het vreemde lichaam bevorderde en de opvallende aanwezigheid van laks bindweefsel werd waargenomen (figuur 7B en figuur 7F). Op dag 14 en 21 was het lakse bindweefsel overvloediger, met de CMS-trabeculae omringd door hepatocyten, wat suggereert dat hepatocyten naar het CMS waren gemigreerd (figuur 7C en figuur 7G; Figuur 7D en figuur 7H). De resultaten toonden ook gebieden van hepatocyten die door een vat werden geïrrigeerd(figuur 8A). Een nauwkeurige inspectie bracht aan het licht dat de hepatocyten die zich aan de CMS-trabeculae hadden gehecht, soms omgeven waren door laks bindweefsel (figuur 8B-D). Twee dubbelblinde onafhankelijke pathologen voerden de histopathologische analyse uit. Immunohistochemie en polymerasekettingreactie-gebaseerde assays zijn aan de gang om de verschillende eiwitten en genen gerelateerd aan het leverregeneratieproces te evalueren.
De macroscopische en microscopische waarnemingen en de biochemische waarden ondersteunen dus onze stelling dat het CMS een ideaal biomateriaal is voor het ondersteunen en bevorderen van leverregeneratie. Niettemin moet CMS-implantatie gedurende meer dan 21 dagen worden geëvalueerd om de absorptietijd en het volledige herstel van leverweefsel te bepalen. Bovendien moeten studies worden uitgevoerd die de verschillende eiwitten en genen evalueren die verband houden met leverregeneratie in aanwezigheid van het CMS.
Figuur 1: Botmonster en het CMS. (A) Een driehoekig monster van het botmonster werd gebruikt om het CMS voor te bereiden. B)Een gedetailleerd overzicht van de poriën en de onderlinge verbinding of trabeculaire verbinding van het CMS, zoals waargenomen door elektronenmicroscopie. (C) Het CMS, gezien onder een stereo-microscoop. (D) CMS-manipulatie met een instrument werd uitgevoerd om de wijziging van mechanische eigenschappen te verifiëren. Afkorting: CMS = collageen matrix scaffold. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Het dier voorbereiden op een operatie. Het dier bevindt zich in de dorsale positie van de decubitus en toont de geschoren buikstreek, voorbereid op hepatectomie en CMS-implantatie. Afkorting: CMS = collageen matrix scaffold. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Hepatectomie van de linkerkwab van de lever. (A) De linkerkwab werd geëxtraheerd en op de metalen plaat geplaatst om de hepatectomie uit te voeren. (B) Hepatectomie van 40% van de linkerkwab werd uitgevoerd in een driehoekige vorm, zoals het CMS. (C) Het gebied van de hepatectomie wordt vervangen door het CMS. Afkorting: CMS = collageen matrix scaffold. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Dag 3 van de evaluatie. (A) Macroscopische observatie van de implantatieplaats op evaluatiedag 3. De lever geïmplanteerd met (gevulde ster) het CMS (stippellijn) veranderde niet in kleur of grootte. De dunne darm (lege ster) en de rest van de abdominale structuren vertoonden geen veranderingen. (B) Monster van de lever (gevulde ster) en het CMS (witte pijl) bedekt met omentaal vet (rode pijl). Afkorting: CMS = collageen matrix scaffold. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Dag 14 van de evaluatie. (A) Macroscopische observatie van de implantatieplaats op evaluatiedag 14. Het leverweefsel (gevulde ster) met het CMS veranderde niet in kleur of grootte. De dunne darm (lege ster) en de rest van de structuren en organen van de buikholte vertoonden geen veranderingen. Monster van de lever met het geïmplanteerde CMS: (B) vooraanzicht; (C) achterste/viscerale weergave. Omentaal vet (rode pijl) die het gebied bedekt. Het CMS werd geïntegreerd in het leverweefsel. Het voorentale vet (rode pijl) bedekt voornamelijk het gebied in het voorste zicht. De stippellijn geeft de plaats van CMS-implantatie aan; hechtingen (blauwe draad). Afkorting: CMS = collageen matrix scaffold. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Dag 21 van de evaluatie. (A) Macroscopische observatie van de implantatieplaats op evaluatiedag 21. De ontvangende lever (gevulde ster) geïmplanteerd met het CMS (stippellijn) veranderde niet van kleur of grootte. De dunne darm (lege ster) en de rest van de abdominale structuren vertoonden geen veranderingen. (B)Monster van de lever met het geïmplanteerde CMS (stippellijn) met veranderingen in grootte en vorm. Afkorting: CMS = collageen matrix scaffold. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Histologie van de lever en de lever met CMS. (A) Normale lever (SHAM) met de karakteristieke weefselarchitectuur. (B) Dag 3 van CMS-implantatie met laks bindweefsel in de trabeculae van de CMS (onderbroken ovalen). (C) Overgangszone tussen de oorspronkelijke lever (rechterkant) en de CMS (linkerkant), met de trabeculae van het CMS (pijl). (D) Inheemse lever in contact met het CMS (stippellijnen) op dag 21. (E) Normale lever met Masson's trichrome vlek. (F)Het CMS geïmplanteerd in de lever; invasie van laks bindweefsel op dag 3 (gestreept ovaal). (G)Op dag 14, inheemse lever met de CMS trabeculae, met een gebied van hepatocyten (gevulde ster) buiten de inheemse lever, wat aangeeft dat de inheemse hepatocyten door het CMS waren gemigreerd. (H) Op dag 21 zijn de inheemse hepatocyten gemigreerd naar het CMS (pijl). A en E: Schaalstaven = 200 μm: 4x, B-D en F-H: Schaalstaven = 100 μm: 10x. A-D: H&E kleuring; E-H: Masson's trichrome kleuring. Afkortingen: CMS = collagen matrix scaffold; H&E = hematoxyline en eosine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Histologie van de lever en CMS. (A) Pool van hepatocyten (witte pijl) aanwezig in de trabeculae van het CMS (zwarte pijl). De hepatocyten worden geïrrigeerd door een vat (gevulde ster). (B) Hepatocyten (witte pijl) zijn gemigreerd en hebben zich gehecht aan de trabeculae van het CMS (zwarte pijl). (C) Een groep hepatocyten (onderbroken cirkel) wordt waargenomen tussen twee trabeculae (zwarte pijlen) van het CMS. (D) Hepatocyten hebben zich gehecht aan trabeculae (zwarte pijlen) van CMS in aanwezigheid van laks bindweefsel (stippel ovaal). A en C: Schaalbalken = 100 μm: 10x. B en D: Schaalbalken = 20 μm: 40x. Afkorting: CMS = collageen matrix scaffold. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Dagen | VOORWENDEN | Hepatectomie | Implantatie CMS | |
| ALB (g/dL) | 3 | 1,4±0 | 1.25±0.07 uur | 1,4±0 |
| 14 | 1,3±0,5 | 1.85±0.07 uur | 1.8±0.14 uur | |
| 21 | 1,3±05 | 1.6±0.1. | 1.7± 0 | |
| ALT (IE/L) | 3 | 73±1,4 s | 3,5±0,7 | 54,6±6,4 |
| 14 | 84±0 | 59,5±4,9 | 57.4±2. | |
| 21 | 57±0 | 73,5±14,8 | 73,5±14,8 | |
| AST (IE/L) | 3 | 106±1,4 | 80±6,6 | 90±1,4 |
| 14 | 5±127,5 | 21.94.94.21± | 83,5±17,6 | |
| 21 | 123,7±27,3 | 92,5±24,7 | 31±101.1 | |
| TB (mg/dL) | 3 | 0.33±0.05 uur | 0.25±0.07 uur | 0,3±0 |
| 14 | 0,5±0 | 0,2±0 | 0±15±0 uur | |
| 21 | 0,3±0 | 0,4±0 | 0,4±0,14 | |
| DB (mg/dL) | 3 | 0,1±0 | 0.05±0.07 uur | 0,1±0 |
| 14 | 0,1±0 | 0,1±0 | 0,1±0 | |
| 21 | 0,1±0 | 0,1±0 | 0,1±0 |
Tabel 1: Leverfunctie. Leverfunctietests werden uitgevoerd voor de schijn- en experimentele groepen met en zonder CMS na 3, 14 en 21 dagen. Afkortingen: CMS = collagen matrix scaffold; ALB = Albumine; ALP = Alkalische fosfatase; ALT= Alanineaminotransferase; ASAT = Aspartaataminotransferase; TB = totaal bilirubine; DB = Direct bilirubine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Orgaantransplantatie is de steunpilaar van de behandeling bij patiënten met leverfibrose of cirrose. Enkele patiënten hebben baat bij deze procedure, waardoor het noodzakelijk is om therapeutische alternatieven te bieden voor patiënten op de wachtlijst. Tissue engineering is een veelbelovende strategie die gebruik maakt van steigers en cellen met regeneratief potentieel2,4,13. Het verwijderen van een deel van de lever is een kritieke stap in deze procedure vanwege de overvloedige bloeding van dit gevasculariseerde orgaan. Daarom moet hemostase van het chirurgische bed worden uitgevoerd om deze complicatie te voorkomen. Bovendien wordt de binding van het leverweefsel aan het CMS, dat essentieel is voor het waarborgen van weefsel-biomateriaalinteractie, vergemakkelijkt door het gebruik van hechtingen. Het moet echter zorgvuldig worden gedaan om te voorkomen dat de lever scheurt en later bloedt.
Hoewel het hierin voorgestelde biomateriaal van runderoorsprong (xenogeen) is, zijn er geen gegevens over de biomateriaalreactie bij ratten, waardoor selectieve hepatectomie mogelijk is. Daarentegen is aangetoond dat het 2/3 hepatectomiemodel de dood van de dieren veroorzaakt vanwege de verwijdering van een grote hoeveelheid leverweefsel14. Bovendien hebben we een roestvrijstalen metalen sjabloon ontwikkeld omdat we moeite hadden met het standaardiseren van de grootte in de hepatectomie en het CMS. Sterilisatie van het CMS was een uitdaging omdat de bestaande technieken de structuur van collageen en zijn biochemische eigenschappen veranderden. Vandaar dat sterilisatie door warmte, gammastraling en ethyleenoxide werd onderzocht als sterilisatiemethoden voordat werd vastgesteld dat het plasma van waterstofperoxide de optimale techniek was13.
Het is essentieel om de maximale grootte van het CMS te bepalen dat in de lever kan worden geïmplanteerd en de biologische respons op systemisch niveau te evalueren. Verder is het noodzakelijk om de effectiviteit van deze techniek bij een grotere diersoort te optimaliseren en te onderzoeken. Verder is het belangrijk om de effecten van de CMS-implantatie in de lever gedurende een langere periode (>30 dagen) te onderzoeken, waardoor de omvang van de biossorptie van het CMS en de regeneratie van het leverweefsel kunnen worden beoordeeld. Verder moeten de effecten van de CMS-implantatie worden onderzocht in diermodellen met leverschade. Deze implantatiemethode heeft de deur geopend naar strategieën die het herstel van de vorm en het volume van gereseceerd weefsel onderzoeken, waardoor anesthesie, chirurgische duur en hersteltijd worden verminderd4,13.
Het CMS is verkregen uit een natuurlijke bron en heeft zijn fysische en chemische eigenschappen behouden in vergelijking met synthetische biomaterialen gemaakt met behulp van complexe methodologieën, zoals bioprinting of electrospinning, die niet biocompatibel of bioabsorbeerbaar zijn2,3. De primaire component van dit CMS is collageen type I, het belangrijkste eiwit van de ECM dat celadhesie en proliferatie mogelijk maakt22. Bovendien maken de trabeculae van de CMS-poriën celmigratie en de continue stroom van groeifactoren, bloed en andere mediatoren van het regeneratieproces mogelijk. Volgens het te repareren weefsel heeft deze onderzoeksgroep ervaring met het ontwerpen van het CMS in verschillende vormen, met behoud van de 3D-structuur. Cilindrische CMS werden bijvoorbeeld geïmplanteerd in de urethra en galwegen van honden bij varkens en leverden veelbelovende resultaten op in weefselregeneratie23,24.
De implantatie van dit CMS zou een alternatieve behandeling kunnen zijn om weefselregeneratie te stimuleren en de fibrogenese-fibrolysebalans bij levercirrose te herstellen als gevolg van verschillende etiologieën (bijv. Virus, alcohol, metabole factoren). Proliferatie-, migratie- en ontstekingstests moeten worden uitgevoerd om de moleculaire en cellulaire mechanismen te identificeren die door het CMS worden geactiveerd. Concluderend beschrijft dit artikel een reproduceerbare procedure voor hepatectomie en het onderzoek van het regeneratieproces door de xeno-implantatie van biomaterialen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben. Benjamín León-Mancilla is een doctoraatsstudent van het Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) en hij ontving dgapa-unam fellowship.
Acknowledgments
De auteurs willen het personeel van de Laboratory Animal Facility van de Experimental Medicine Unit, verpleegster Carolina Baños G. voor technische en chirurgische ondersteuning, Marco E. Gudiño Z. voor ondersteuning bij microfotografen en Erick Apo voor ondersteuning in lever histologie bedanken. De Nationale Raad ondersteunde dit onderzoek voor Wetenschap en Technologie(CONACyT),subsidienummer SALUD-2016-272579 en de PAPIIT-UNAM TA200515.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anionic detergent | Alconox | Z273228 | |
| Biopsy cassettes | Leica | 3802453 | |
| Camera DMX | Nikon | DXM1200F | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | BD | 372412 | |
| Cover glasses 25 mm x 40 mm | Corning | 2980-224 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 200-M | CAS 17372-87-1 |
| Ethyl alcohol, pure | Sigma-Aldrich | 459836 | CAS 64-17-5 |
| Flunixine meglumide | MSD | Q-0273-035 | |
| Glass slides 75 mm x 25 mm | Corning | 101081022 | |
| Hematoxylin | Merck | H9627 | CAS 571-28-2 |
| Hydrochloric acid 37% | Merck | 339253 | CAS 7647-01-0 |
| Ketamine | Pisa agropecuaria | Q-7833-028 | |
| Light microscope | Nikon | Microphoto-FXA | |
| Microsurgery stereomicroscope | Zeiss | OPMI F170 | |
| Microtainer yellow cape | Beckton Dickinson | 365967 | |
| Microtome | Leica | RM2125 | |
| Model animal: Wistar rats | Universidad Nacional Autónoma de México | ||
| Nylon 3-0 (Dermalon) | Covidien | 1750-41 | |
| Polypropylene 7-0 | Atramat | SE867/2-60 | |
| Povidone-iodine10% cutaneous solution | Diafra SA de CV | 1.37E+86 | |
| Scanning electronic microscope | Zeiss | DSM-950 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J. T. Baker | 3722-01 | CAS 1310-73-2 |
| Software ACT-1 | Nikon | Ver 2.70 | |
| Stereomicroscope | Leica | EZ4Stereo 8X-35X | |
| Sterrad 100S | Johnson and Johnson | 99970 | |
| Surgipath paraplast | Leica | 39601006 | |
| Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm) | SensiMedical | LAN-078-077 | |
| Tissue Processor (Histokinette) | Leica | TP1020 | |
| Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder) | Sakura Finetek USA | 5229 | |
| Trichrome stain kit | Sigma-Aldrich | HT15 | |
| Unicell DxC600 Analyzer | Beckman Coulter | BC 200-10 | |
| Xylazine | Pisa agropecuaria | Q-7833-099 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | CAS 1330-20-7 |
References
- Li, N., Hua, J.
- Langer, R., Vacanti, J.
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Shafiee, A., Atla, A. Tissue engineering: Toward a new era of medicine. Annual Review of Medicine. 68, 29-40 (2017).
- Hu, C., Zhao, L., Wu, Z., Li, L. Transplantation of mesenchymal stem cells and their derivatives effectively promotes liver regeneration to attenuate acetaminophen-induced liver injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 88 (2020).
- Sancho-Bru, P. Therapeutic possibilities of stem cells in the treatment of liver diseases. Gastroenterologia y Hepatologia. 34 (10), 701-710 (2011).
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Freedman, B. R., Mooney, D. J. Biomaterials to mimic and heal connective tissues. Advanced Materials. 31 (19), 1806695 (2019).
- Meyer, M. Processing of collagen based biomaterials and the resulting materials properties. Biomedical Engineering Online. 18 (1), 24 (2019).
- El Baz, H., et al. Transplant of hepatocytes, undifferentiated mesenchymal stem cells, and in vitro hepatocyte-differentiated mesenchymal stem cells in a chronic lver failure experimental model: a comparative study. Experimental and Clinical Transplantation. 16 (1), 81-89 (2018).
- Nedjari, S., Awaja, F., Guarino, R., Gugutkov, D., Altankov, G. Establishing multiple osteogenic differentiation pathways of mesenchymal stem cells through different scaffold configurations. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (10), 1428-1437 (2020).
- Chan, E. C., et al. Three dimensional collagen scaffold promotes intrinsic vascularisation for tissue engineering applications. PLoS One. 11 (2), 0149799 (2016).
- Arenas-Herrera, J. E., Ko, I. K., Atala, A., Yoo, J. J. Decellularization for whole organ bioengineering. Biomedical Materials. 8 (1), 014106 (2013).
- Parmaksiz, M., Dogan, A., Odabas, S., Elçin, A. E., Elçin, Y. M. Clinical applications of decellularized extracellular matrices for tissue engineering and regenerative medicine. Biomedical Materials. 11 (2), 022003 (2016).
- Gacek, G.
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
- The University of Texas at Austin Institutional Animal Care and Use Committee. Guidelines for the Use of Chemical Depilatory Agents on Laboratory Animals. , https://research.utexas.edu (2021).
- Sivridis, L., Kotini, A., Anninos, P. The process of learning in neural net models with Poisson and Gauss connectivities. Neural Networks. 21 (1), 28-35 (2008).
- León-Mancilla, B. H., Araiza-Téllez, M. A., Flores-Flores, J. O., Piña-Barba, M. C. Physico-chemical characterization of collagen scaffolds for tissue engineering. Journal of Applied Research and Technology. 14 (1), 77-85 (2016).
- León, A., et al. Hematological and biochemical parameters in Sprague Dawley laboratory rats breed in CENPALAB, Cenp:SPRD. Revista Electronica de Veterinaria. 12, 1-10 (2011).
- Tsuchiya, A., et al. Mesenchymal stem cell therapies for liver cirrhosis: MSCs as "conducting cells" for improvement of liver fibrosis and regeneration. Inflammation and Regeneration. 39, 18 (2019).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
- Acevedo, G. C. Xenoimplante de colágena en uretra de perro. Universidad Nacional Autónoma de México. , Specialty of Urology thesis (2011).
- Montalvo-Jave, E. E., et al. Absorbable bioprosthesis for the treatment of bile duct injury in an experimental model. International Journal of Surgery. 20, 163-169 (2015).
