Summary
מחלות כבד נגרמות על ידי גורמים רבים המקדמים פיברוזיס או שחמת הכבד. השתלה היא האפשרות היחידה להחלים בריאות. עם זאת, בהתחשב במחסור באיברים הניתנים להשתלה, יש לחקור חלופות. המחקר שלנו מציע השתלת פיגומי קולגן ברקמת הכבד ממודל של בעלי חיים.
Abstract
מחלות כבד הן הגורם המוביל למוות ברחבי העולם. צריכת אלכוהול מופרזת, דיאטה עתירת שומן, זיהום וירוס הפטיטיס C לקדם פיברוזיס, שחמת הכבד, ו/או קרצינומה hepatocellular. השתלת כבד היא ההליך המומלץ קלינית כדי לשפר ולהאריך את תוחלת החיים של חולים בשלבי מחלה מתקדמים. עם זאת, רק 10% מההשתלות מצליחות, עם זמינות איברים, הליכים פרהיסטוריים ופוסט-כירורגיים, ועלויות גבוהות מתואמות ישירות עם תוצאה זו. פיגומים מטריצה חוץ תאית (ECM) הופיעו כחלופה לשיקום רקמות. תאימות ביולוגית וקבלת שתל הם המאפיינים המועילים העיקריים של אותם ביו-חומרים. למרות היכולת לשחזר את הגודל ואת הפונקציה הנכונה של הכבד כבר מוערך במודלים hepatectomy הכבד, השימוש פיגומים או איזה תמיכה כדי להחליף את נפח מסת הכבד extirpated לא הוערך.
כריתת חזה חלקית בוצעה בכבד חולדה עם קסנוימפלנטייה של פיגום מטריצת קולגן (CMS) מקונדיל בקר. רקמת האונה השמאלית של הכבד הוסרה (כ-40%), וחלק שווה של CMS הושתל בניתוח. בדיקות תפקודי כבד הוערכו לפני ואחרי ההליך הכירורגי. לאחר ימים 3, 14 ו - 21, בעלי החיים הומתו, והערכות מקרוסקופיות והיסטולוגיות בוצעו. בימים 3 ו -14, רקמת שומן נצפתה סביב CMS, ללא ראיות קליניות של דחייה או זיהום, כמו גם neoformation כלי ו CMS reabsorption ביום 21. היו עדויות היסטולוגיות לתהליך דלקת חסר משמעות ונדידה של תאים סמוכים ל- CMS, שנצפו עם ההמטוקסילין והאאוזין (H&E) והכתמת הטריכרום של מאסון. ה- CMS הוכח כביצועים טובים ברקמת הכבד ויכול להיות חלופה שימושית לחקר התחדשות רקמות ותיקון במחלות כבד כרוניות.
Introduction
הכבד הוא אחד האיברים החשובים ביותר המעורבים בשמירה על הומאוסטזיס וייצור חלבון1. למרבה הצער, מחלת כבד היא הגורם המוביל למוות ברחבי העולם. בשלבים מתקדמים של נזק לכבד, הכוללים שחמת הכבד וקרצינומה hepatocellular, השתלת כבד היא ההליך המומלץ קלינית. עם זאת, בשל המחסור של תורמים ואת השיעור הנמוך של השתלות מוצלחות, טכניקות חדשות בהנדסתרקמות(TE) ורפואה רגנרטיבית (RM) פותחו 2,3.
TE כרוך בשימוש בתאי גזע, פיגומים וגורמי גדילה4 כדי לקדם את השיקום של איברים ובטטות מודלקים, פיברוטיים ובדים1,5,6. הביו-חומרים המשמשים בפיגומים מחקים את ה- ECM המקומי, ומספקים את הרמזים הפיזיים, הכימיים והביולוגיים לשיפוץ תאי מודרך7. קולגן הוא אחד החלבונים הנפוצים ביותר המתקבלים מהדרמיס, הגיד, המעי וקרום הלב8,9. יתר על כן, קולגן ניתן להשיג כמו ביופולימר לייצר פיגומים דו-ממדיים ותלת ממדיים באמצעות ביו הדפסה או electrospinning10,11. קבוצה זו היא הראשונה לדווח על השימוש בקולגן ממקור עצם להתחדשות של רקמת הכבד. מחקר אחר מדווח על שימוש בפיגומים מסונתזים מקולגן בקר, אשר הושג מהעור, עם נקבוביות הומוגניות הממוקמות מקרוב, ללא כל תקשורתביניהם 12.
Decellularization משמר את ECM המקורי, המאפשר שילוב הבא של תאים עם פוטנציאל לתאי גזע13,14. עם זאת, הליך זה הוא עדיין בשלב הניסוי בכבד, בלב, בכליות, המעי הדק, ושלפוחית השתן מעכברים, חולדות, ארנבות, חזירים, כבשים, בקר, וסוסים3,14. נכון לעכשיו, נפח מסת הכבד שנקטף אינו מוחלף באף אחד מהדגמים של כריתת הפטקטומיה של בעלי חיים. עם זאת, השימוש בתמיכה נוספת או ברשת (ביו-חומרים) המאפשרת התפשטות תאים ואנגיוגנזה יכול להיות חיוני לשיקום מהיר של פונקציות פרנשימאליות בכבד. לכן, פיגומים יכולים להיות מועסקים כגישות חלופיות כדי לחדש או לתקן רקמה במחלות כבד כרוניות, בתורו, ביטול מגבלות עקב תרומה ואת הסיבוכים הקליניים של השתלת כבד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
המחקר הנוכחי אושר על ידי ועדת האתיקה של בית הספר לרפואה (DI/115/2015) באוניברסיטת נאסיונאל אוטונומה דה מקסיקו (UNAM) וועדת האתיקה של בית החולים הכללי של מקסיקו (CI/314/15). המוסד ממלא את כל המפרטים הטכניים לייצור, טיפול ושימוש בחיות מעבדה ומאושר על פי חוק לאומי (NOM-062-ZOO-1999). חולדות ויסטאר זכר במשקל 150-250 גרם (6-8 שבועות) התקבלו ממתקן החיות במעבדה של בית הספר לרפואה, UNAM, למחקר זה.
1. השגת פיגומי מטריצת קולגן מגוף הירך
- להשיג את ההסתה מעצם הירך של בקר מבית מטבחיים המאושר על ידי רשויות הבריאות והחקלאות של מקסיקו.
- בזהירות לנתח את שומן condyle, שריר, וסחוס עם מכשיר כירורגי. חותכים את שברי הקונדיליה לרסיסי 3 ס"מ x3 ס"מ באמצעות חותך מסור ומנקים את השומן והדם במגבת. לשטוף את שברי הקונדיליה עם מים.
- מרתיחים (92 °C) את השברים עם 1 ליטר של חומר ניקוי אניוני (10 גרם / ליטר) במשך 30 דקות. לשטוף את שברי התיל פעמיים כדי להסיר כל שרידים של חומר הניקוי אניוני.
- יבשו את שברי השען למשך 3 שעות באמצעות נייר סינון (0.5 מ"מ).
- הכן CMS משולש (1 ס"מ x1 ס"מ x1 ס"מ) בעובי 0.5 ס"מ מהשברים המוזכרים בשלב 1.1 (איור 1A).
- Demineralize את השברים ב 100 מ"ל של 0.5 M HCl במשך 10 דקות עם עצבנות מתמדת. הסר את HCL.
הערה: לנטרל את HCl עם נתרן הידרוקסיד (10 M). - לשטוף את השברים שלוש פעמים עם 100 מ"ל של מים מזוקקים, 15 דקות בכל פעם, עם עצבנות מתמדת. יבש את ה- CMS בנייר סינון (0.5 מ"מ) למשך שעה אחת.
- השתמש במיקרוסקופ סטריאו15 כדי לנתח את המאפיינים המבניים של ה- CMS (גודל הנקבוביות, היווצרות הנקבוביות והיחסים הנקבוביים) (איור 1B).
- השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק16 כדי לנתח את פני השטח המחוספסים של trabeculae CMS (איור 1C).
- השתמש בכלי ההפצה למיזוג ומתיחות כדי להעריך את השינויים המכניים (פלסטיות וגמישות) של ה- CMS (איור 1D).
- לארוז את CMS לתוך כיס עיקור ולחטא אותו עם פלזמה מי חמצן במשך 38 דקות. יש לאחסן את ה-CMS הסטרילי באריזה המקורית באזור יבש ב-20-25 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- Demineralize את השברים ב 100 מ"ל של 0.5 M HCl במשך 10 דקות עם עצבנות מתמדת. הסר את HCL.
2. הכנת התחום הכירורגי וטיפול והכנת מודל בעלי החיים
- לחטא את האזור הכירורגי, שולחן העבודה, מיקרוסקופ מיקרוכירורגיה, ואת המושב עם פתרון 2% כלורהקסידין. לחטא את כל המכשירים הכירורגיים, ספוג כירורגי, מטליות, וילון כירורגי חד פעמי באמצעות עיקור חום (121 °C /30 דקות / 100 kPa)
- הקצה את החולדות (n = 5) לשלוש קבוצות של חמש חולדות לכל קבוצה: 1. זיוף, 2. כריתת הפטקטומיה, ו -3. כריתת הפטקטומיה פלוס CMS, ועקוב אחר כל הקבוצות בימים 3, 14 ו -21 ימים.
- יש לנהל קטמין (35 מ"ג/ק"ג) וקסילאסין (2.5 מ"ג/ק"ג) תוך שרירית בגפה האחורית.
הערה: תקופת ההרגעה נמשכת בדרך כלל 30-40 דקות. - גילחו את עור הבטן (5 ס"מ על 2 ס"מ) באמצעות סבון כירורגי ולהב דו-צדדי, וחטאו את העור באמצעות תמיסת פוידון-יוד אקטואלי 10% בשלושה סיבובים17.
- מניחים את החיה על צלחת חמה בתנוחת הגב דקוביטוס, כשהצוואר מודגש יתר על המידה כדי לשמור על דרכי הנשימה החודרות(איור 2).
- להעריך את עומק ההרדמה באמצעות דפוס הנשימה ואובדן רפלקס הנסיגה בגפיים.
- מניחים וילון כירורגי חד פעמי סביב העור המגולח ומבצעים חתך (2.5 ס"מ) על הקו האלבי עם אזמל, תוך שימוש בתהליך xiphoid כנקודת התייחסות. הימנע מכלי הדם בדופן הבטן כדי למנוע דימום.
- שים את מפסק הבטן במקום להתבונן בחלל הבטן. בעזרת מלקחיים, לחלץ את אונת הכבד השמאלית ומניחים אותו על צלחת המתכת(איור 3A).
הערה: בקבוצת זיוף, רק לחלץ את האונה הכבד השמאלי ולאחר מכן להחזיר את הכבד לחלל הבטן. לתפור את דופן הבטן ואת העור עם תפל ניילון 3-0. - בקבוצות הניסוי עם ובלי CMS, השתמש בלהב אזמל ולהב אזמל סטרילי (#15) כדי לבצע כריתת הפטקטומיה (כ -40%) עם שני חתכים. השתמש בתבנית מתכתית משולשת (1 ס"מ x 1 ס"מ x 1 ס"מ) כדי לבצע את כריתת ההפטקטומיה(איור 3B).
- כדי למנוע דימום של הכבד, לשמור על דחיסה כירורגית עם ספוגית על קצה הכבד במשך 5 דקות.
- יש להרטיב את ה-CMS בתמיסת מלח סטרילית למשך 20 דקות לפני ההליך הכירורגי. השתילו את ה-CMS באתר כריתת ההפטקטומיה עם ארבעה תפרים בין רקמת הכבד ל- CMS כדי למנוע תזוזה של הביו-חומרים. השתמשו ב-7-0 תפרי פוליפרופילן שאינם נספגים(איור 3C).
הערה: אין להסיר את התפרים בניתוח שני; תפרים יכולים לשמש כהפניה לזיהוי האתר של השתלת CMS. - להחזיר את הכבד לחלל הבטן ולתפור את דופן הבטן ואת העור עם תבר ניילון 3-0. נקה את החתך הכירורגי עם ספוג ספוג יוד כירורגי בשני סיבובים. התבונן ונטר את הסימנים החיוניים של בעלי החיים.
- יש לנהל קטמין (35 מ"ג/ק"ג) וקסילאסין (2.5 מ"ג/ק"ג) תוך שרירית בגפה האחורית.
3. טיפול לאחר הניתוח
- יש לנהל פלוניקסין מגלומינים (2.5 מ"ג/ק"ג) תוך שרירית בגפה האחורית. לנהל את המכאים כפי שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש.
- להתאוששות הרדמה, למקם את בעלי החיים בקופסאות פוליקרבונט בודדים עם מצעים בעלי חיים במעבדה באזור ללא רעש עם בקרת טמפרטורה (23 °C (23 °F).
- שים לב להתאוששות של בעלי החיים ולעקוב אחר צריכת המים והמזון שלהם במשך 2 שעות. פיקוח על בעלי חיים פוסט אופרטיבי כפי שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש.
4. הערכת תפקוד הכבד בסרום
- לאסוף דגימות דם (500 μL) מן הוורידים הזנב לרוחב של בעלי החיים המרידים לפני ההליך הכירורגי (ערכים בסיסיים) ובימי הערכה 3, 14, ו 21.
- צנטריפוגות דגימות הדם ב 850 × g/ 10 דקות בטמפרטורת החדר (23 °F); מפרידים את הסרום ומאחסנים אותו ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- בצע פאנל של בדיקות תפקוד כבד: אלבומין בסרום (ALB), אלקליין פוספטאז (ALP), אלנין אמינו טרנספראז (ALT), אספרטט aminotransferase (AST), בילירובין הכולל (TB), ובילירובין ישיר (DB) (טבלה 1).
5. המתת חסד וניהול רקמות
- למרדים את בעלי החיים עבור כל הערכה (ימים 3, 14 ו-21) על-ידי ביצוע הפרוטוקול המתואר לעיל.
- המתת חסד באמצעות שיטות המאשרות על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש.
- בצע חתכים (5-6 ס"מ) על הקו הלבבי עם אזמל כדי לצפות באיברי חלל הבטן ולצלם את אזור כריתת ההפטקטומיה של ה- sham וקבוצות הניסוי, עם ובלי CMS.
- קח דגימות כבד (2 ס"מ x 2 ס"מ; 0.40-0.45 גרם) מכל בעלי החיים בקבוצת המחקר והנח אותם בתמיסת פורמלדהיד 4% עבור 24 שעות להערכה היסתולוגית לאחר מכן.
6. ניתוח היסתולוגי
- לשמר את רקמות הכבד ב 4% פורמלדהיד ולייבש את הרקמה באמצעות סדרה של ריכוזי אלכוהול (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); מניחים אותם בקסילן (1h) ומטביעים אותם בפרפין16.
- חותכים את בלוקי הפרפין עם מיקרוטום ל-4 חלקים בעובי מיקרומטר להכנת שמונה שקופיות.
- בצעו את טריכרום H&E ו-Masson מכתים16.
- שים לב לחלקים המוכתמים תחת מיקרוסקופ אור כדי לבחור את האזורים היציגים של הכבד, עם ובלי CMS. השג פוטומיקרוגרוגרפיות בהגדלה של פי 4, פי 10 ו- 40 ועיבוד התמונות באמצעות תוכנה מתאימה18 (ראה טבלת החומרים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
demineralization העצם משפיע על המאפיינים המכניים של CMS מבלי לשנות את הצורה המקורית או חיבור של הנקבוביות שלה. CMS יכול להיות כל צורה, ולכן, ניתן להתאים לגודל ולצורה של האיבר או הרקמה שנבחר19. בפרוטוקול הנוכחי, השתמשנו ב- CMS משולש (איור 1A-D). מודל חולדה שימש להערכת היכולת המתחדשת של קסנוימפלנט CMS בכבד. למרות שהכבד הוא איבר פריך ורך, ההליך הכירורגי שבוצע בפרוטוקול זה הבטיח שה-CMS יישאר במקומו(איור 2 ואיור 3A-C). כריתת ההפטקטומיה החלקית של 40% מהאונה השמאלית אפשרה להעריך חלק מהאיבר, תוך שמירה על שאר הכבד שלם, כך שניתן להשוות את השינויים בשתל ובפרנצ'ימה המקומית. בנוסף, השגנו דגימות דם כדי להעריך את תפקוד הכבד לפני ואחרי השתלת CMS.
לא היו הבדלים בריכוזים הבסיסיים של הפרמטרים הביוכימיים בין קבוצת השאיפה לבין קבוצת הניסוי עם ובלי השתלת CMS ב 3 ו 14 ימים; הם נשארו בתוך ערכי הייחוס (ALB: 0.43-2.41 g/dL; ALP: 134-357.3 U/L; ALT: 41-83.1 ממשק משתמש/L; AST: 61.4-276.2 ממשק משתמש/L; TB: 0.01-0.43 מ"ג /ד"ל; DB: 0.1 מ"ג / ד"ל)20. בנוסף, לא היו הבדלים ברמות האלבומן, ה- ALP, ALT, AST, TB ו- DB בין קבוצת ה- Sham לבין קבוצות הניסוי ב - 21 יום, מה שמצביע על כך שה- CMS אינו משבש את תפקוד הכבד (טבלה 1).
במהלך המתת חסד, לפרוסטומיה חקרנית חשפה את הצבע הטיפוסי ואת הגודל והצורה הנכונים של הכבד. לא נצפתה דלקת או זיהום באתר ההשתלה באף אחד מהמקרים. ביום השלישי לא חלו שינויים באיבר ביחס לחלל הבטן (איור 4A). בחלק שהכיל רקמת כבד ו-CMS, נצפתה דגימת דם שחדר ל-CMS, עם שומן דמנטי דבק(איור 4B). ביום 14, כמות השומן גדלה; היה ניאופורמציה של כלי הדם ושילוב ה-CMS ברקמת הכבד של המטופל, אך לא חלו שינויים במעי הדק או באיברים של חלל הבטן (איור 5A). שומן אומנטלי היה גבוה יותר באזור החלק העליון (איור 5B)בהשוואה לאזור הקרביים (איור 5C) באתר ההשתלה CMS. ביום ההערכה 21, שילוב CMS בכבד היה ברור יותר(איור 6A). הגידול בשומן omental יכול לשמש אינדיקטור של התקדמות ההתחדשות, כפי שהוא מקור של תאי גזע mesenchymal21. יתר על כן, ב 21 ימים, הכבד הציג אזורים צפופים התואמים השפלה וספיגה, שינוי הגודל ואת הצורה המקורית (איור 6B).
כדי לנתח את מבנה המיקרו של הכבד עם שתל CMS, ביצענו ניתוח היסתולוגי של שבר מייצג של רקמה מאתר ההשתלה, אשר הושווה לרקמה מאונה הכבד הימנית (שליטה). ביופסיות שבוצעו בימים 3, 14 ו -21 עובדו ונחשפו להכתמת הטריכרום של H&E ו- Masson. המבנה הרגיל של פרנצ'ימה בכבד נצפה בקבוצת השאופה ביום 21(איור 7A ואיור 7E). ביום השלישי, הניתוח ההסטולוגי הראה כי נוכחות ה- CMS בכבד לא עודד תגובת גוף זרה, ונצפתה נוכחות בולטת של רקמת חיבור רופפת (איור 7B ואיור 7F). בימים 14 ו-21, רקמת החיבור הרופפת הייתה שופעת יותר, כאשר הטרבקולה CMS מוקפת בהפטוציטים, מה שמרמז על כך שהפאטוציטים היגרו ל-CMS (איור 7C ואיור 7G; איור 7D ואיור 7H). התוצאות הראו גם אזורים של הפטוציטים שהושקו על ידי כלי שיט(איור 8A). בדיקה מדוקדקת העלתה כי ההפטוציטים שדבקו בטרבקולה CMS היו מוקפים לעתים ברקמת חיבוררופפת (איור 8B-D). שני פתולוגים עצמאיים כפולי סמיות ביצעו את הניתוח ההיסטופתולוגי. אימונוהיסטוכימיה ובסיס תגובת שרשרת פולימראז מתבצעות כדי להעריך את החלבונים והגנים השונים הקשורים לתהליך התחדשות הכבד.
לפיכך, התצפיות המקרוסקופיות והמיקרוסקופיות והערכים הביוכימיים תומכים בטענה שלנו כי CMS הוא ביו-חומרים אידיאליים לתמיכה וקידום התחדשות הכבד. עם זאת, השתלת CMS חייבת להיות מוערכת במשך יותר מ -21 ימים כדי לקבוע את זמן הקליטה שלה ולשחזר את רקמת הכבד המלאה. בנוסף, יש לבצע מחקרים המעריכים את החלבונים והגנים השונים הקשורים להתחדשות הכבד בנוכחות ה- CMS.
איור 1: דגימת עצם ו- CMS. (A)נעשה שימוש במדגם משולש של דגימת העצם להכנת ה- CMS. (B)מבט מפורט על הנקבוביות והחיבור ההדדי או הטראבולרי של ה- CMS, כפי שנצפה על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים. (C)ה- CMS, כפי שניתן לראות תחת מיקרוסקופ סטריאו. (D)מניפולציה CMS עם מכשיר בוצעה כדי לאמת את השינוי של תכונות מכניות. קיצור: CMS = פיגום מטריצת קולגן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הכנת החיה לניתוח. החיה נמצאת בתנוחת שריר הבטן דקוביטוס, מראה את אזור הבטן המגולח, מוכן כריתת hepatectomy והשתלת CMS. קיצור: CMS = פיגום מטריצת קולגן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: כריתת ההפטקטומיה של האונה השמאלית של הכבד. (א)האונה השמאלית חולצה והונחה על הלוח המתכתי כדי לבצע את כריתת ההפטקטומיה. (B)כריתת הפטקטומיה של 40% מהאונה השמאלית בוצעה בצורה משולשת, כמו ה- CMS. (C) אזור כריתת ההפטיקטומיה מוחלף על ידי CMS. קיצור: CMS = פיגום מטריצת קולגן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: יום 3 להערכה. (א)התבוננות מקרוסקופית באתר ההשתלה ביום ההערכה 3. הכבד המושתל (כוכב מלא) CMS (קו מנוקד) לא השתנה בצבע או בגודל. המעי הדק (כוכב ריק) ושאר מבני הבטן לא הראו שינויים. (B)דגימה של הכבד (כוכב מלא) ואת CMS (חץ לבן) מכוסה שומן omental (חץ אדום). קיצור: CMS = פיגום מטריצת קולגן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: יום 14 להערכה. (א)התבוננות מקרוסקופית באתר ההשתלה ביום ההערכה 14. רקמת הכבד (כוכב מלא) עם CMS לא השתנתה בצבע או בגודל. המעי הדק (כוכב ריק) ושאר המבנים והאיברים של חלל הבטן לא הראו שינויים. מדגם של הכבד עם CMS מושתל: (B) מבט מהדורה: (C)נוף אחורי / קרבי. שומן אומנטלי (חץ אדום) המכסה את האזור. ה-CMS שולבו ברקמת הכבד. השומן השוט (חץ אדום) מכסה בעיקר את האזור בתצוגה צפונית. הקו המקווקו מציין את האתר של השתלת CMS; תפרים (חוט כחול). קיצור: CMS = פיגום מטריצת קולגן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: יום 21 להערכה. (א)תצפית מקרוסקופית על אתר ההשתלה ביום ההערכה 21. הכבד הנמען (כוכב מלא) שהושתל ב- CMS (קו מנוקד) לא שינה צבע או גודל. המעי הדק (כוכב ריק) ושאר מבני הבטן לא הראו שינויים. (B)דגימה של הכבד עם CMS מושתל (קו מנוקד) מראה שינויים בגודל ובצורה. קיצור: CMS = פיגום מטריצת קולגן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: היסתולוגיה של הכבד והכבד עם CMS. (A)כבד רגיל (SHAM) המציג את ארכיטקטורת הרקמות האופיינית. (B)יום 3 של השתלת CMS המציג רקמת חיבור רופפת בטרבקולה של ה- CMS (אליפסות מקווקו). (C)אזור מעבר בין הכבד המקומי (צד ימין) לבין CMS (צד שמאל), עם trabeculae של CMS (חץ). (D)כבד מקומי במגע עם CMS (קווים מנוקדים) ביום 21. כבדרגיל עם כתם טריכרום של מאסון. (ו)ה- CMS המושתל בכבד; פלישה של רקמת חיבור רופפים ביום 3 (אליפסה מקווקו). (ז)ביום 14, כבד מקומי עם trabeculae CMS, מראה אזור של hepatocytes (כוכב מלא) מחוץ לכבד המקומי, המציין כי hepatocytes המקומיים היגרו דרך CMS. (ח)ביום 21, ההפטוציטים המקומיים עברו לכיוון ה- CMS (חץ). A ו- E: מוטות קנה מידה = 200 מיקרומטר: 4x, B-D ו- F-H: מוטות קנה מידה = 100 מיקרומטר: 10x. A-D: H&E כתמים; מכתיםטריכרום שלמאסון. קיצורים: CMS = פיגום מטריצת קולגן; H&E = המטוקסילין ואוסין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: היסתולוגיה של הכבד וה- CMS. (A)בריכת הפטוציטים (חץ לבן) הנמצאת בטרבקולה של ה- CMS (חץ שחור). ההפטוציטים מושקים על ידי כלי שיט (כוכב מלא). (B)הפטוציטים (חץ לבן) היגרו ודבקו בטרבקולה של ה- CMS (חץ שחור). (C)קבוצה של hepatocytes (עיגול מקווקו) נצפים בין שני trabeculae (חצים שחורים) של CMS. (D)Hepatocytes דבקו trabeculae (חצים שחורים) של CMS בנוכחות רקמת חיבור רופפת (אליפסה מקווקו). A ו- C: סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר: 10x. B ו- D: סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר: 40x. קיצור: CMS = פיגום מטריצת קולגן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| ימים | שאם | כריתת הפטקטומיה | ס"מ של השתלה | |
| ALB (g/dL) | 3 | 1.4±0 | 1.25±0.07 | 1.4±0 |
| 14 | 1.3±0.5 | 1.85±0.07 | 1.8±0.14 | |
| 21 | 1.3±05 | 1.6±0.1 | 1.7± 0 | |
| ALT (IU/L) | 3 | 73±1.4 | 3.5±0.7 | 54.6±6.4 |
| 14 | 84±0 | 59.5±4.9 | 57±4.2 | |
| 21 | 57±0 | 73.5±14.8 | 73.5±14.8 | |
| AST (IU/L) | 3 | 106±1.4 | 80±6.6 | 90±1.4 |
| 14 | 127±5.5 | 94±21.2 | 83.5±17.6 | |
| 21 | 123.7±27.3 | 92.5±24.7 | 101±31.1 | |
| שחפה (מ"ג/ד"ל) | 3 | 0.33±0.05 | 0.25±0.07 | 0.3±0 |
| 14 | 0.5±0 | 0.2±0 | 0.15±0 | |
| 21 | 0.3±0 | 0.4±0 | 0.4±0.14 | |
| DB (מ"ג/ד"ל) | 3 | 0.1±0 | 0.05±0.07 | 0.1±0 |
| 14 | 0.1±0 | 0.1±0 | 0.1±0 | |
| 21 | 0.1±0 | 0.1±0 | 0.1±0 |
טבלה 1: תפקוד כבד. בדיקות תפקודי כבד בוצעו עבור קבוצות מזויפות וניסיוניות עם ובלי CMS ב 3, 14, ו 21 ימים. קיצורים: CMS = פיגום מטריצת קולגן; ALB = אלבומין; ALP = פוספטאז אלקליין; ALT= אלנין אמינוטרנספראז; AST = אספרטט אמינוסטרנספראז; TB = סה"כ בילירובין; DB = Direct bilirubin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השתלת איברים היא עמוד התווך של הטיפול בחולים עם פיברוזיס בכבד או שחמת הכבד. כמה חולים נהנים מהליך זה, מה שהופך את הצורך לספק חלופות טיפוליות עבור חולים ברשימת ההמתנה. הנדסת רקמות היא אסטרטגיה מבטיחה המעסיקה פיגומים ותאים עם פוטנציאל התחדשות2,4,13. הסרת חלק מהכבד היא צעד קריטי בהליך זה בגלל הדימום השופיע של איבר זה כלי דם. לכן, hemostasis של המיטה הכירורגית חייב להתבצע כדי למנוע את הסיבוך הזה. יתר על כן, כריכת רקמת הכבד ל- CMS, החיונית להבטחת אינטראקציה ביו-חומרית של רקמות, מקלה באמצעות שימוש בתפרים. עם זאת, זה חייב להיעשות בזהירות כדי למנוע קריעת הכבד ולגרום לדימום מאוחר יותר.
למרות biomaterial המוצע להלן הוא ממוצא בקר (קסנוגני), אין נתונים של תגובה ביו-חומרים בחולדות, מה שהופך את כריתת ההפטקטומיה הסלקטיבית אפשרית. לעומת זאת, מודל 2/3 hepatectomy הוכח לגרום למותם של בעלי החיים בגלל הסרת כמות גדולה של רקמת כבד14. יתר על כן, פיתחנו תבנית מתכתית מפלדת אל-חלד מכיוון שהתקשינו לתקנן את הגודל בהפטקטומיה וב- CMS. עיקור ה- CMS היה מאתגר מכיוון שהטכניקות הקיימות שינו את מבנה הקולגן ואת תכונותיו הביוכימיות. לפיכך, עיקור על ידי חום, קרינת גמא ותחמוצת אתילן נחקר כשיטות עיקור לפני שקבע כי הפלזמה של מי חמצן הייתה הטכניקה האופטימלית13.
זה חיוני כדי לקבוע את הגודל המרבי של CMS שיכול להיות מושתל בכבד ולהעריך את התגובה הביולוגית ברמה מערכתית. יתר על כן, יש צורך לייעל ולחקור את היעילות של טכניקה זו במין בעלי חיים גדול יותר. יתר על כן, חשוב לחקור את ההשפעות של השתלת CMS בכבד לתקופה ארוכה יותר (>30 ימים), אשר יאפשר את הערכת היקף הביוסורפטציה של CMS ואת התחדשות רקמת הכבד. יתר על כן, יש לבחון את ההשפעות של השתלת CMS במודלים של בעלי חיים עם נזק לכבד. שיטת השתלה זו פתחה את הדלת לאסטרטגיות הבוחנות את שיקום הצורה והנפח של הרקמה הנתכת, ובכך הפחתת הרדמה, משך כירורגיוזמןהתאוששות 4,13.
ה- CMS הושג ממקור טבעי ושימר את תכונותיו הפיזיות והכימיות בהשוואה לביו-חומרים סינתטיים המיוצרים באמצעות מתודולוגיות מורכבות, כגון הדפסה ביולוגית או אלקטרוספין, שאינן תואמות ביולוגית או ביו-אבסוריות2,3. המרכיב העיקרי של CMS זה הוא קולגן מסוג I, שהוא החלבון העיקרי של ECM המאפשר הידבקות תאים והתפשטות תאים22. בנוסף, trabeculae של נקבוביות CMS לאפשר נדידת תאים ואת הזרימה המתמשכת של גורמי גדילה, דם, ומתווכים אחרים של תהליך ההתחדשות. על פי הרקמה שיש לתקן, לקבוצת מחקר זו יש ניסיון בעיצוב CMS בצורות שונות, שמירה על המבנה 3D שלה. לדוגמה, CMS גלילי הושתלו בשופכה של כלב וצינור מרה בחזירים והניבו תוצאות מבטיחות בהתחדשותרקמות 23,24.
ההשתלה של CMS זה יכול להיות טיפול חלופי כדי לעורר התחדשות רקמות ולשחזר את איזון פיברוגנזה-פיברוליזה בשחמת הכבד עקב אטיולוגיות שונות (למשל, וירוס, אלכוהול, גורמים מטבוליים). בדיקות התפשטות, הגירה ודלקת חייבות להתבצע כדי לזהות את המנגנונים המולקולריים והתאים המופעלים על ידי CMS. לסיכום, מאמר זה מתאר הליך לשחזור עבור hepatectomy, כמו גם את הבדיקה של תהליך ההתחדשות באמצעות xenoimplantation של ביו-חומרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. בנג'אמין לאון-מנסילה הוא דוקטורנט מ-Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Óiversidad Nacional Autónoma de México (UNAM) וקיבל מלגת DGAPA-UNAM.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לאנשי מתקן חיות המעבדה של היחידה לרפואה ניסיונית, האחות קרולינה באניוס G. על תמיכה טכנית וניתוחית, מרקו א Gudiño Z. על תמיכה מיקרופוטוגרפים, ואריק אפו לתמיכה היסתולוגיה בכבד. המועצה הלאומית תמכה במחקר זה למדע וטכנולוגיה (CONACyT), מספר המענק SALUD-2016-272579 ו- PAPIIT-UNAM TA200515.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anionic detergent | Alconox | Z273228 | |
| Biopsy cassettes | Leica | 3802453 | |
| Camera DMX | Nikon | DXM1200F | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | BD | 372412 | |
| Cover glasses 25 mm x 40 mm | Corning | 2980-224 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 200-M | CAS 17372-87-1 |
| Ethyl alcohol, pure | Sigma-Aldrich | 459836 | CAS 64-17-5 |
| Flunixine meglumide | MSD | Q-0273-035 | |
| Glass slides 75 mm x 25 mm | Corning | 101081022 | |
| Hematoxylin | Merck | H9627 | CAS 571-28-2 |
| Hydrochloric acid 37% | Merck | 339253 | CAS 7647-01-0 |
| Ketamine | Pisa agropecuaria | Q-7833-028 | |
| Light microscope | Nikon | Microphoto-FXA | |
| Microsurgery stereomicroscope | Zeiss | OPMI F170 | |
| Microtainer yellow cape | Beckton Dickinson | 365967 | |
| Microtome | Leica | RM2125 | |
| Model animal: Wistar rats | Universidad Nacional Autónoma de México | ||
| Nylon 3-0 (Dermalon) | Covidien | 1750-41 | |
| Polypropylene 7-0 | Atramat | SE867/2-60 | |
| Povidone-iodine10% cutaneous solution | Diafra SA de CV | 1.37E+86 | |
| Scanning electronic microscope | Zeiss | DSM-950 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J. T. Baker | 3722-01 | CAS 1310-73-2 |
| Software ACT-1 | Nikon | Ver 2.70 | |
| Stereomicroscope | Leica | EZ4Stereo 8X-35X | |
| Sterrad 100S | Johnson and Johnson | 99970 | |
| Surgipath paraplast | Leica | 39601006 | |
| Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm) | SensiMedical | LAN-078-077 | |
| Tissue Processor (Histokinette) | Leica | TP1020 | |
| Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder) | Sakura Finetek USA | 5229 | |
| Trichrome stain kit | Sigma-Aldrich | HT15 | |
| Unicell DxC600 Analyzer | Beckman Coulter | BC 200-10 | |
| Xylazine | Pisa agropecuaria | Q-7833-099 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | CAS 1330-20-7 |
References
- Li, N., Hua, J.
- Langer, R., Vacanti, J.
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Shafiee, A., Atla, A. Tissue engineering: Toward a new era of medicine. Annual Review of Medicine. 68, 29-40 (2017).
- Hu, C., Zhao, L., Wu, Z., Li, L. Transplantation of mesenchymal stem cells and their derivatives effectively promotes liver regeneration to attenuate acetaminophen-induced liver injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 88 (2020).
- Sancho-Bru, P. Therapeutic possibilities of stem cells in the treatment of liver diseases. Gastroenterologia y Hepatologia. 34 (10), 701-710 (2011).
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Freedman, B. R., Mooney, D. J. Biomaterials to mimic and heal connective tissues. Advanced Materials. 31 (19), 1806695 (2019).
- Meyer, M. Processing of collagen based biomaterials and the resulting materials properties. Biomedical Engineering Online. 18 (1), 24 (2019).
- El Baz, H., et al. Transplant of hepatocytes, undifferentiated mesenchymal stem cells, and in vitro hepatocyte-differentiated mesenchymal stem cells in a chronic lver failure experimental model: a comparative study. Experimental and Clinical Transplantation. 16 (1), 81-89 (2018).
- Nedjari, S., Awaja, F., Guarino, R., Gugutkov, D., Altankov, G. Establishing multiple osteogenic differentiation pathways of mesenchymal stem cells through different scaffold configurations. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (10), 1428-1437 (2020).
- Chan, E. C., et al. Three dimensional collagen scaffold promotes intrinsic vascularisation for tissue engineering applications. PLoS One. 11 (2), 0149799 (2016).
- Arenas-Herrera, J. E., Ko, I. K., Atala, A., Yoo, J. J. Decellularization for whole organ bioengineering. Biomedical Materials. 8 (1), 014106 (2013).
- Parmaksiz, M., Dogan, A., Odabas, S., Elçin, A. E., Elçin, Y. M. Clinical applications of decellularized extracellular matrices for tissue engineering and regenerative medicine. Biomedical Materials. 11 (2), 022003 (2016).
- Gacek, G.
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
- The University of Texas at Austin Institutional Animal Care and Use Committee. Guidelines for the Use of Chemical Depilatory Agents on Laboratory Animals. , https://research.utexas.edu (2021).
- Sivridis, L., Kotini, A., Anninos, P. The process of learning in neural net models with Poisson and Gauss connectivities. Neural Networks. 21 (1), 28-35 (2008).
- León-Mancilla, B. H., Araiza-Téllez, M. A., Flores-Flores, J. O., Piña-Barba, M. C. Physico-chemical characterization of collagen scaffolds for tissue engineering. Journal of Applied Research and Technology. 14 (1), 77-85 (2016).
- León, A., et al. Hematological and biochemical parameters in Sprague Dawley laboratory rats breed in CENPALAB, Cenp:SPRD. Revista Electronica de Veterinaria. 12, 1-10 (2011).
- Tsuchiya, A., et al. Mesenchymal stem cell therapies for liver cirrhosis: MSCs as "conducting cells" for improvement of liver fibrosis and regeneration. Inflammation and Regeneration. 39, 18 (2019).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
- Acevedo, G. C. Xenoimplante de colágena en uretra de perro. Universidad Nacional Autónoma de México. , Specialty of Urology thesis (2011).
- Montalvo-Jave, E. E., et al. Absorbable bioprosthesis for the treatment of bile duct injury in an experimental model. International Journal of Surgery. 20, 163-169 (2015).
