Summary
Karaciğer hastalıkları fibrozis veya sirozun teşvik ettiği birçok nedenden kaynaklanır. Sağlığın iyileşmesi için tek seçenek transplantasyondur. Bununla birlikte, nakledilebilir organların kıtlığı göz önüne alındığında, alternatifler araştırılmalıdır. Araştırmamız, karaciğer dokusuna bir hayvan modelinden kollajen iskelelerin yerleştirilmesini önermektedir.
Abstract
Karaciğer hastalıkları dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir. Aşırı alkol tüketimi, yüksek yağlı bir diyet ve hepatit C virüs enfeksiyonu fibrozis, siroz ve/veya hepatosellüler karsinomu teşvik eder. Karaciğer nakli, ileri hastalık evrelerinde hastaların yaşam süresini iyileştirmek ve uzatmak için klinik olarak önerilen prosedürdür. Bununla birlikte, organ mevcudiyeti, presurgical ve postsurgical prosedürler ve bu sonuçla doğrudan ilişkili yüksek maliyetler ile nakillerin sadece% 10'u başarılıdır. Hücre dışı matris (ECM) iskeleleri doku restorasyonu için bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Biyouyumbilite ve greft kabulü bu biyomalzemelerin temel faydalı özellikleridir. Karaciğer hepatektomi modellerinde karaciğerin boyutunu ve doğru işlevini geri kazanma kapasitesi değerlendirilmiş olsa da, extirpated karaciğer kütlesinin hacmini değiştirmek için iskelelerin veya bir tür desteğin kullanımı değerlendirilmemiştir.
Bir sıçan karaciğerinde, bir sığır kondylesinden kollajen matrisli bir iskelenin (CMS) ksinoimplantasyonu ile kısmi hepatektomi yapıldı. Sol karaciğer lob dokusu alındı (yaklaşık %40) ve eşit oranda CMS cerrahi olarak yerleştirildi. Karaciğer fonksiyon testleri cerrahi işlem öncesi ve sonrası değerlendirildi. 3, 14 ve 21. 3 ve 14. günlerde, CMS'yi çevreleyen yağ dokusu gözlendi, 21. Hematoksilin ve eozin (H&E) ve Masson'un üç renkli lekelenmesi ile gözlenen önemsiz bir iltihaplanma süreci ve bitişik hücrelerin CMS'ye göçünün histolojik kanıtları vardı. CMS'nin karaciğer dokusunda iyi performans gösterdiği ve kronik karaciğer hastalıklarında doku yenilenmesi ve onarımı için yararlı bir alternatif olabileceği gösterilmiştir.
Introduction
Karaciğer homeostaz ve protein üretiminin sürdürülmesinde rol oynayan en önemli organlardan biridir1. Ne yazık ki, karaciğer hastalığı dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir. Siroz ve hepatosellüler karsinom içeren karaciğer hasarının ileri evrelerinde karaciğer nakli klinik olarak önerilen işlemdir. Ancak donörlerin azlığı ve başarılı nakil oranının düşük olması nedeniyle doku mühendisliği (TE) ve rejeneratif tıpta (RM) yeni teknikler geliştirilmiştir2,3.
TE, iltihaplı, fibrotik ve ödemli organ ve dokuların restorasyonu için kök hücrelerin, iskelelerin ve büyüme faktörlerinin4 kullanımını içerir1,5,6. İskelelerde kullanılan biyomalzemeler, kılavuzlu hücresel yeniden şekillendirme için fiziksel, kimyasal ve biyolojik ipuçları sağlayan yerelECM'yitaklit eder 7 . Kollajen dermis, tendon, bağırsak ve perikarddan elde edilen en bol proteinlerden biridir8,9. Ayrıca, kollajen biyobaskı veya elektrospinning yoluyla iki ve üç boyutlu iskeleler üretmek için bir biyopolimer olarak elde edilebilir10,11. Bu grup, karaciğer dokusunun yenilenmesi için bir kemik kaynağından kollajen kullanımını bildiren ilk gruptır. Başka bir çalışma, deriden elde edilen sığır kollajeninden sentezlenen iskelelerin homojen ve yakından yerleşmiş gözeneklerle, aralarında herhangi bir iletişim olmadan kullanıldığını bildirmektedir12.
Hücreden arındırma, yerel ECM'yi korur ve kök hücre potansiyeli13,14olan hücrelerin daha sonrabirleştirilmesineizin verir. Bununla birlikte, bu prosedür hala farelerden, sıçanlardan, tavşanlardan, domuzlardan, koyunlardan, sığırlardan ve atlardan karaciğer, kalp, böbrek, ince bağırsak ve idrar kesesinde deneyselaşamadadır 3,14. Şu anda, resected karaciğer kitle hacmi hayvan hepatektomi modellerinin hiçbirinde değiştirilmez. Bununla birlikte, hücre çoğalmasını ve anjiogenez sağlayan ek destek veya ağ (biyomalzemeler) kullanımı karaciğer parenkimal fonksiyonlarının hızlı restorasyonu için gerekli olabilir. Böylece, iskeleler kronik karaciğer hastalıklarında dokuyu yenilemek veya onarmak için alternatif yaklaşımlar olarak kullanılabilir, bu da bağış ve karaciğer naklinin klinik komplikasyonlarına bağlı sınırlamaları ortadan kaldırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu araştırma, Universidad Nacional Autónoma de México'daki (UNAM) Tıp Fakültesi etik komitesi (DI/115/2015) ve General de Mexico Hastanesi etik komitesi (CI/314/15) tarafından onaylanmıştır. Kurum, laboratuvar hayvanlarının üretimi, bakımı ve kullanımı için tüm teknik şartnameleri yerine getirmektedir ve ulusal yasalar (NOM-062-ZOO-1999) tarafından yasal olarak onaylanmıştır. Bu çalışma için UNAM Tıp Fakültesi Laboratuvar Hayvan Tesisinden 150-250 g (6-8 haftalık) ağırlığında erkek Wistar sıçanları elde edilmiştir.
1. Sığır femurundan kollajen matris iskeleleri elde etmek
- Kondyle'u sığır femurundan Meksika sağlık ve tarım otoriteleri tarafından onaylanmış bir mezbahadan alın.
- Kondyle yağı, kası ve kıkırdağı cerrahi bir aletle dikkatlice parçalara ayrıştırın. Testere kesici kullanarak kondyle parçalarını 3 cm x3 cm parçalar halinde kesin ve yağ ve kanı bir havlu ile temizleyin. Kondyle parçalarını suyla yıkayın.
- Parçaları (92 °C) 1 L anionik deterjanla (10 g/L) 30 dakika kaynatın. Aniyonik deterjan kalıntılarını çıkarmak için kondyle parçalarını iki kez yıkayın.
- Kondyle parçalarını filtre kağıdı (0,5 mm) kullanarak 3 saat kurutun.
- Adım 1.1'de belirtilen parçalardan 0,5 cm kalınlığında üçgen (1 cm x1 cm x1 cm) CMS hazırlayın (Şekil 1A).
- Parçaları 100 mL 0,5 M HCl'de 10 dakika boyunca sürekli ajitasyonla demineralize edin. HCl'yi çıkarın.
NOT: HCl'yi sodyum hidroksit (10 M) ile nötralize edin. - Parçaları her seferinde 15 dakika, sürekli ajitasyonla 100 mL damıtılmış su ile üç kez durulayın. CMS'i filtre kağıdıyla (0,5 mm) 1 saat kurulayın.
- CMS'nin yapısal özelliklerini (gözeneklerin büyüklüğü, gözenek oluşumu ve gözenekli ara bağlantı) analiz etmek için stereo mikroskop15 kullanın (Şekil 1B).
- CMS trabeculae'nin pürüzlü yüzeyini analiz etmek için taramalı elektron mikroskobu16 kullanın (Şekil 1C).
- CMS'nin mekanik değişikliklerini (plastisite ve esneklik) değerlendirmek için karıştırma ve germe için diseksiyon aletini kullanın (Şekil 1D).
- CMS'yi sterilizasyon torbasına paketleyin ve hidrojen peroksit plazma ile 38 dakika sterilize edin. Steril CMS'yi orijinal pakette kullanıma kadar 20-25 °C kuru bir alanda saklayın.
- Parçaları 100 mL 0,5 M HCl'de 10 dakika boyunca sürekli ajitasyonla demineralize edin. HCl'yi çıkarın.
2. Cerrahi alanın hazırlanması ve hayvan modelinin taşınması ve hazırlanması
- Cerrahi bölgeyi, çalışma masasını, mikrocerrahi mikroskobu ve koltuğu% 2 klorheksidin çözeltisi ile sterilize edin. Isı sterilizasyonu yoluyla tüm cerrahi aletleri, cerrahi süngeri, sürüntü örneklerini ve tek kullanımlık cerrahi örtüleri sterilize edin (121 °C/30 dk/100 kPa)
- Sıçanları (n=5) grup başına beş sıçandan oluşan üç gruba atayın: 1. sham, 2. hepatektomi ve 3. hepatektomi artı CMS ve tüm grupları 3, 14 ve 21 gün boyunca takip edin.
- Ketamin (35 mg/kg) ve ksilazin (2,5 mg/kg) intramüsküler olarak arka ekstuzda uygulanır.
NOT: Yatıştırıcı süresi genellikle 30-40 dakika sürer. - Cerrahi sabun ve çift kenarlı bir bıçak kullanarak karın derisini (5 cm x 2 cm) tıraş edin ve üç turda topikal% 10 povidon-iyot çözeltisi kullanarak cildi dezenfekte edin17.
- Hayvanı, geçirgen bir hava yolunu korumak için boynu aşırı uzamış olan decubitus dorsal pozisyonunda ılık bir tabağayerleştirin (Şekil 2).
- Anestezinin derinliğini solunum düzeni ve uzuvlardaki çekilme refleksinin kaybı ile değerlendirin.
- Tıraş edilen cildin etrafına tek kullanımlık bir cerrahi örtü yerleştirin ve xiphoid işlemini referans noktası olarak kullanarak neşterle albous hattına bir kesi (2,5 cm) yapın. Kanamayı önlemek için karın duvarı kan damarı kaçının.
- Karın retraktörini yerine koyun ve karın boşluğunu gözlemleyin. Diseksiyon apsesini kullanarak, sol karaciğer lobu çıkarın ve metal plakaya yerleştirin (Şekil 3A).
NOT: Sham grubunda, sadece sol karaciğer lobını çıkarın ve ardından karaciğeri karın boşluğuna geri döndürün. Karın duvarını ve cildi 3-0 naylon dikiş ile dikin. - CMS'li ve CMS'siz deney gruplarında, iki kesikle hepatektomi (yaklaşık% 40) yapmak için neşter bıçağı ve steril neşter bıçağı (#15) kullanın. Hepatektomiyi(Şekil 3B)gerçekleştirmek için üçgen metalik bir şablon (1 cm x 1 cm x 1 cm) kullanın.
- Karaciğerin kanamasını önlemek için, karaciğerin kenarında bir bezle cerrahi kompresyonun 5 dakika boyunca sürdürülmesini sağlayın.
- Cerrahi işlemden önce CMS'yi steril salin çözeltisinde 20 dakika nemlendirin. Biyomalzemenin yer değiştirmesini önlemek için karaciğer dokusu ile CMS arasında dört dikiş dikişi ile CMS'yi hepatektomi bölgesine takın. 7-0 emilemez polipropilen dikiş kullanın (Şekil 3C).
NOT: İkinci bir ameliyatta dikişleri çıkarmayın; dikişler CMS implantasyon bölgesini tanımlamak için referans olarak kullanılabilir. - Karaciğeri karın boşluğuna geri koyun ve karın duvarını ve cildi 3-0 naylon dikiş ile dikin. Cerrahi kesiği cerrahi iyotla ıslatılmış bir süngerle iki tur halinde temizleyin. Hayvanların yaşamsal belirtilerini gözlemleyin ve izleyin.
- Ketamin (35 mg/kg) ve ksilazin (2,5 mg/kg) intramüsküler olarak arka ekstuzda uygulanır.
3. Ameliyat sonrası bakım
- Arka uzuvda meglumine flunixin (2.5 mg/kg) intramüsküler olarak verin. Analjezikleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylandığı şekilde yönetin.
- Anestezi geri kazanımı için, hayvanları sıcaklık kontrolü (23 °C) ile gürültüsüz bir alana laboratuvar hayvan yatakları ile bireysel polikarbonat kutularına yerleştirin.
- Hayvanların geri kazanımını gözlemleyin ve su ve yiyecek tüketimini 2 saat boyunca izleyin. Kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylandığı şekilde hayvanları ameliyat sonrası izleyin.
4. Serumda karaciğer fonksiyonlarının değerlendirilmesi
- Cerrahi işlemden önce anestezi yapılan hayvanların lateral kuyruk damarlarından (500 μL) ve değerlendirme günleri 3, 14 ve 21'de kan örnekleri toplayın.
- Kan örneklerini oda sıcaklığında (23 °C) 850 × g/10 dk'da santrifüjlayın; serumu ayırın ve kullanıma kadar -80°C'de saklayın.
- Karaciğer fonksiyon testlerinden oluşan bir panel gerçekleştirin: serum albümin (ALB), alkalin fosfataz (ALP), alanin aminotransferaz (ALT), aspartat aminotransferaz (AST), total bilirubin (TB) ve doğrudan bilirubin (DB) (Tablo 1).
5. Ötenazi ve doku yönetimi
- Yukarıda açıklanan protokole uyarak hayvanları her değerlendirme için (3, 14 ve 21. günler) uyuşturun.
- Kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylayan yöntemlerle ötenazi.
- Karın boşluğunun organlarını gözlemlemek ve CMS ile ve CMS olmadan, sham ve deneysel grupların hepatektomi alanının fotoğraflarını çekmek için neşterle albous hattında bir kesi (5-6 cm) yapın.
- Tüm çalışma grubu hayvanlardan karaciğer örnekleri (2 cm x 2 cm; 0,40-0,45 g) alın ve sonraki histolojik değerlendirme için 24 saat boyunca% 4 formaldehit çözeltisine yerleştirin.
6. Histolojik analiz
- Karaciğer dokularını% 4 formaldehitte koruyun ve bir dizi alkol konsantrasyonu kullanarak dokuyu susuz bırakır (%60, %70, %80, %90, %100); onları ksilen (1h) içine yerleştirin ve parafin16içine gömülü .
- Parafin bloklarını bir mikrotom ile sekiz slaytın hazırlanması için 4 μm kalınlığında bölümlere kesin.
- H&E ve Masson'un üç renkli boyama16'sınıgerçekleştirin.
- CMS'li ve CMS'siz karaciğerin temsili bölgelerini seçmek için lekeli bölümleri hafif bir mikroskop altında gözlemleyin. Fotomikrografları 4x, 10x ve 40x büyütme ile elde edin ve görüntüleri uygun yazılım18 kullanarak işleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kemik demineralizasyonu, gözeneklerinin orijinal şeklini veya ara bağlantısını değiştirmeden CMS'nin mekanik özelliklerinietkiler. CMS herhangi bir şekle sahip olabilir ve bu nedenle seçilen organın veya dokunun büyüklüğüne ve şekline ayarlanabilir19. Mevcut protokolde üçgen CMS ( Şekil1A-D) kullandık. Karaciğerdeki CMS ksnoimplantının rejeneratif kapasitesini değerlendirmek için bir sıçan modeli kullanılmıştır. Karaciğer kırılgan ve yumuşak bir organ olmasına rağmen, bu protokolde yapılan cerrahi işlem CMS'nin yerinde kalmasını sağlamıştır (Şekil 2 ve Şekil 3A-C). Sol lobun % 40'ının kısmi hepatektomi, organın bir kısmının değerlendirilmesini sağladı, karaciğerin geri kalanını sağlam tuttu, böylece implant ve yerli parenkimdeki değişiklikler karşılaştırılabilirdi. Ayrıca CMS implantasyonu öncesi ve sonrası karaciğer fonksiyonlarını değerlendirmek için kan örnekleri aldık.
3 ve 14 gün cms implantasyonu olan ve olmayan sham grubu ile deney grubu arasındaki biyokimyasal parametrelerin temel konsantrasyonlarında herhangi bir fark yoktu; referans değerler içinde kaldılar (ALB: 0.43-2.41 g/dL; ALP: 134-357.3 U/L; ALT: 41-83.1 Kullanıcı Arabirimi/L; AST: 61.4-276.2 Kullanıcı Arabirimi/L; TB: 0.01-0.43 mg/dL; DB: 0.1 mg/dL)20. Ayrıca 21 günde sham grubu ile deney grupları arasında albümin, ALP, ALT, AST, TB ve DB düzeylerinde fark olmaması CMS'nin karaciğer fonksiyonlarını aksatmadığını gösterir(Tablo 1).
Ötenazi sırasında, keşif laparotomi karaciğerin tipik rengini ve doğru boyutunu ve şeklini ortaya koydu. İmplantasyon bölgesinde hiçbir olguda inflamasyon veya enfeksiyon görülmedi. 3. günde, karın boşluğu ile ilgili olarak organda herhangi bir değişiklik olmadı (Şekil 4A). Karaciğer dokusu ve CMS içeren bir kısımda, kanın CMS'ye insipient yandaş omental yağ ile sızdığı gözlenmiştir (Şekil 4B). 14. günde, yağ miktarı arttı; kan damarı neoformasyonu ve CMS'nin alıcı karaciğer dokusuna entegrasyonu vardı, ancak ince bağırsakta veya karın boşluğunun organlarında herhangi bir değişiklik olmadı (Şekil 5A). Omental yağ, CMS implantasyon bölgesindeki viseral bölgeye(Şekil 5C)kıyasla ön bölgede (Şekil5B)daha yüksekti. Değerlendirme günü 21, KARACIĞERE CMS indüksiyon daha belirgindi (Şekil 6A). Omental yağdaki artış, mezenkimal kök hücre kaynağı olduğu için yenilenmenin ilerlemesinin bir göstergesi olarak kullanılabilir21. Ayrıca, 21 günde, karaciğer, boyutunu ve orijinal şeklini değiştirerek bozulma ve emilime karşılık gelen yoğun alanlar sundu (Şekil 6B).
CMS implantı ile karaciğerin mikro yapısını analiz etmek için, implantasyon bölgesinden gelen ve sağ karaciğer lobundan (kontrol) alınan doku ile karşılaştırılan temsili bir doku parçasının histolojik analizini yaptık. 3, 14 ve 21. günlerde yapılan biyopsiler işlenerek H&E ve Masson'un üç renkli lekelerine maruz kaldı. Karaciğer parenkiminin normal yapısı 21. günde şem grubunda gözlenmiştir(Şekil 7A ve Şekil 7E). 3. günde, histolojik analiz karaciğerde CMS varlığının yabancı bir cisim reaksiyonunu desteklemediğini ve gevşek bağ dokusunun göze çarpan varlığının gözlendiğini göstermiştir (Şekil 7B ve Şekil 7F). 14 ve 21. günlerde, gevşek bağ dokusu daha boldu, CMS trabeculae hepatositlerle çevriliydi, bu da hepatositlerin CMS'ye göç ettiğini düşündürdü (Şekil 7C ve Şekil 7G; Şekil 7D ve Şekil 7H). Sonuçlar ayrıca bir gemi tarafından sulanan hepatosit alanlarını da göstermiştir (Şekil 8A). Yakın bir inceleme, CMS trabeculae'ye yapışan hepatositlerin bazen gevşek bağ dokusu ile çevrili olduğunu ortaya çıkardı (Şekil 8B-D). İki çift kör bağımsız patolog histopatolojik analizi yaptı. Hepatik rejenerasyon süreci ile ilgili farklı protein ve genlerin değerlendirilmesi için immünhistokimya ve polimeraz zincir reaksiyon bazlı tahliller devam etmektedir.
Bu nedenle, makroskopik ve mikroskobik gözlemler ve biyokimyasal değerler, CMS'nin karaciğer yenilenmesini desteklemek ve teşvik etmek için ideal bir biyomalzeme olduğu önermemizi desteklememektedir. Bununla birlikte, EMILIM süresini belirlemek ve karaciğer dokusu restorasyonunu tamamlamak için CMS implantasyonu 21 günden fazla değerlendirilmelidir. Ayrıca CMS varlığında hepatik rejenerasyon ile ilgili farklı protein ve genleri değerlendiren çalışmalar yapılmalıdır.
Şekil 1: Kemik örneği ve CMS. (A) CMS'yi hazırlamak için kemik örneğinin üçgen bir örneği kullanılmıştır. (B) Elektron mikroskopisi ile gözlemlendiği gibi, CMS'nin gözeneklerinin ve ara bağlantısının veya trabeküler bağlantısının ayrıntılı bir görünümü. (C) CMS, stereo-mikroskop altında görüldüğü gibi. (D) Mekanik özelliklerin değiştirilmesini doğrulamak için bir aletle CMS manipülasyonu gerçekleştirildi. Kısaltma: CMS = kollajen matris iskelesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hayvanın ameliyata hazırlanması. Hayvan, hepatektomi ve CMS implantasyonu için hazırlanan tıraşlı karın bölgesini gösteren decubitus dorsal pozisyondadır. Kısaltma: CMS = kollajen matris iskelesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Karaciğerin sol lobunun hepatektomi. (A) Sol lob çıkarılır ve hepatektomi yapmak için metalik plakaya yerleştirilir. (B) Sol lobun %40'ının hepatektomisi CMS gibi üçgen şeklinde yapıldı. (C) Hepatektomi alanı CMS ile değiştirilir. Kısaltma: CMS = kollajen matris iskelesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Değerlendirmenin 3. günü. (A) Değerlendirme gününde implantasyon bölgesinin makroskopik gözlemi 3. CMS (noktalı çizgi) ile implante edilen karaciğerin rengi veya boyutu değişmedi. İnce bağırsak (boş yıldız) ve karın yapılarının geri kalanında herhangi bir değişiklik göstermedi. (B) Karaciğer örneği (dolgulu yıldız) ve omental yağ (kırmızı ok) ile kaplı CMS (beyaz ok). Kısaltma: CMS = kollajen matris iskelesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Değerlendirmenin 14. günü. (A) İmplantasyon bölgesinin değerlendirme gününde makroskopik gözlemi 14. CMS ile karaciğer dokusu (dolgulu yıldız) renk veya boyut değişmedi. İnce bağırsak (boş yıldız) ve karın boşluğunun diğer yapı ve organlarının hiçbir değişiklik göstermedi. İmplant edilen CMS ile karaciğer örneği: (B) ön görünüm; (C) arka/visseral görünüm. Bölgeyi kaplayan omental yağ (kırmızı ok). CMS karaciğer dokusuna entegre edildi. Omental yağ (kırmızı ok) esas olarak ön görünümdeki alanı kapsar. Noktalı çizgi CMS implantasyon bölgesini gösterir; dikişler (mavi iplik). Kısaltma: CMS = kollajen matris iskelesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Değerlendirmenin 21. (A) Değerlendirme günü 21'de implantasyon bölgesinin makroskopik gözlemi. CMS (noktalı çizgi) ile yerleştirilen alıcı karaciğer (dolgulu yıldız) renk veya boyut değiştirmedi. İnce bağırsak (boş yıldız) ve karın yapılarının geri kalanında herhangi bir değişiklik göstermedi. (B) İmplantlı CMS (noktalı çizgi) ile karaciğerin boyut ve şekil değişikliklerini gösteren örneği. Kısaltma: CMS = kollajen matris iskelesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Karaciğer histolojisi ve CMS ile karaciğer. (A)Karakteristik doku mimarisini gösteren normal karaciğer (SHAM). (B) CMS'nin trabeculae'sinde gevşek bağ dokusu gösteren CMS implantasyonunun 3. (C) Yerli karaciğer (sağ taraf) ve CMS (sol taraf) arasındaki geçiş bölgesi, CMS'nin trabeculae'si (ok). (D) 21. günde CMS (noktalı çizgiler) ile temas eden yerli karaciğer. (E) Masson'un üç renkli lekesi ile normal karaciğer. (F) Karaciğere yerleştirilen CMS; 3. günde gevşek bağ dokusunun istilası (kesik oval). (G) 14. günde, CMS trabeculae ile yerli karaciğer, yerli karaciğerin dışında hepatrositlerin (dolgulu yıldız) bir alanını göstererek, yerli hepatatitlerin CMS'den göç ettiğini gösterir. (H) 21. günde, yerli hepatositler CMS'ye (ok) doğru göç etti. A ve E: Ölçek çubukları = 200 μm: 4x, B-D ve F-H: Ölçek çubukları = 100 μm: 10x. A-D: H&E boyama; E-H: Masson'un üç renkli lekesi. Kısaltmalar: CMS = kollajen matrisi iskelesi; H&E = hematoksilin ve eozin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Karaciğer histolojisi ve CMS. (A) CMS'nin trabeculaesinde (siyah ok) bulunan hepatosit havuzu (beyaz ok). Hepatositler bir gemi (dolgulu yıldız) tarafından sulanır. (B) Hepatositler (beyaz ok) göç etmiş ve CMS'nin (siyah ok) trabeculae'sine yapışmıştır. (C) CMS'nin iki trabeculae (siyah ok) arasında bir grup hepatosit (kesik daire) gözlenir. (D) Hepatositler gevşek bağ dokusu (kesik oval) varlığında CMS'nin trabeculae 'sine (siyah oklar) yapışmıştır. A ve C: Ölçek çubukları = 100 μm: 10x. B ve D: Ölçek çubukları = 20 μm: 40x. Kısaltma: CMS = kollajen matris iskelesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Gün | SHAM | Hepatektomi | İmplantasyon CMS | |
| ALB (g/dL) | 3 | 1.4±0 | 1,25±0,07 | 1.4±0 |
| 14 | 1,3±0,5 | 1,85±0,07 | 1,8±0,14 | |
| 21 | 1,3±05 | 1,6±0,1 | 1.7± 0 | |
| ALT (IU/L) | 3 | 73±1,4 | 3,5±0,7 | 54,6±6,4 |
| 14 | 84±0 | 59,5±4,9 | 57±4,2 | |
| 21 | 57±0 | 73,5±14,8 | 73,5±14,8 | |
| AST (IU/L) | 3 | 106±1,4 | 80±6,6 | 90±1,4 |
| 14 | 127±5,5 | 94±21,2 | 83,5±17,6 | |
| 21 | 123.7±27.3 | 92,5±24,7 | 101±31,1 | |
| TB (mg/dL) | 3 | 0,33±0,05 | 0,25±0,07 | 0,3±0 |
| 14 | 0,5±0 | 0,2±0 | 0,15±0 | |
| 21 | 0,3±0 | 0,4±0 | 0,4±0,14 | |
| Veritabanı (mg/dL) | 3 | 0,1±0 | 0,05±0,07 | 0,1±0 |
| 14 | 0,1±0 | 0,1±0 | 0,1±0 | |
| 21 | 0,1±0 | 0,1±0 | 0,1±0 |
Tablo 1: Karaciğer fonksiyonu. 3, 14 ve 21 günlük CMS'li ve CMS'siz sham ve deneysel gruplar için karaciğer fonksiyon testleri yapıldı. Kısaltmalar: CMS = kollajen matrisi iskelesi; ALB = Albümin; ALP = Alkali fosfataz; ALT= Alanine aminotransferaz; AST = Aspartat aminotransfenaz; TB = Toplam bilirubin; DB = Doğrudan bilirubin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Organ nakli karaciğer fibrozisi veya sirozlu hastalarda tedavinin temel dayanağıdır. Birkaç hasta bu işlemden yararlanarak bekleme listesindeki hastalar için terapötik alternatifler sunmayı zorunlu hale getirir. Doku mühendisliği, rejeneratif potansiyele sahip iskeleleri ve hücreleri kullanan umut verici bir stratejidir2,4,13. Karaciğerin bir kısmının alınması, bu damarlı organın bol kanaması nedeniyle bu işlemde kritik bir adımdır. Bu nedenle bu komplikasyonu önlemek için cerrahi yatağın hemostazı yapılmalıdır. Ayrıca, doku-biyomalzeme etkileşiminin sağlanması için gerekli olan karaciğer dokusunun CMS'ye bağlanması dikişlerin kullanılması ile kolaylaştırılmıştır. Bununla birlikte, karaciğerin yırtılmasını ve daha sonra kanamaya neden olmaması için dikkatlice yapılmalıdır.
Burada önerilen biyomalzeme sığır kökenli (ksinojenik) olmasına rağmen, sıçanlarda biyomalzeme reaksiyonu verisi yoktur, bu da seçici hepatektomiyi mümkün kilmektedir. Buna karşılık, 2/3 hepatektomi modelinin çok miktarda karaciğer dokusunun alınması nedeniyle hayvanların ölümüne neden olduğu gösterilmiştir14. Ayrıca, hepatektomi ve CMS'deki boyutu standartlaştırmakta zorlandığımız için paslanmaz çelik metalik bir şablon geliştirdik. CMS'nin sterilizasyonu zordu, çünkü mevcut teknikler kollajenin yapısını ve biyokimyasal özelliklerini değiştirdi. Bu nedenle, hidrojen peroksit plazmasının en uygun teknik olduğu belirlenmeden önce ısı, gama radyasyonu ve etilen oksit ile sterilizasyon sterilizasyon yöntemleri olarak araştırılmıştır13.
Karaciğere yerleştirilebilen CMS'nin maksimum boyutunu belirlemek ve biyolojik yanıtı sistemik düzeyde değerlendirmek esastır. Ayrıca, bu tekniğin daha büyük bir hayvan türünde etkinliğini optimize etmek ve araştırmak gerekir. Ayrıca, CMS implantasyonunun karaciğerdeki etkilerinin daha uzun bir süre (>30 gün) araştırılması önemlidir, bu da CMS'nin biyosorpsiyonunun kapsamının ve hepatik dokunun yenilenmesinin değerlendirilmesini sağlayacaktır. Ayrıca, CMS implantasyonunun etkileri karaciğer hasarı olan hayvan modellerinde incelenmelidir. Bu implantasyon yöntemi, reseptif dokunun şeklinin ve hacminin restorasyonunu araştıran stratejilere kapı açmıştır, böylece anesteziyi, cerrahi süreyi ve iyileşme süresiniazaltır 4,13.
CMS doğal bir kaynaktan elde edildi ve biyouyumlu veya biyoyararörlü olmayan biyobaskı veya elektrospinning gibi karmaşık metodolojiler kullanılarak yapılan sentetik biyomalzemelere kıyasla fiziksel ve kimyasal özelliklerini korudu2,3. Bu CMS'nin birincil bileşeni, HÜCRE YAPILANMASINI VE ÇOĞALMASINI SAĞLAYAN ECM'nin ana proteini olan kollajen tipiI'dir 22. Ek olarak, CMS gözeneklerinin trabeculae'si hücre göçünü ve büyüme faktörlerinin, kanın ve rejenerasyon sürecinin diğer aracılarının sürekli akışını sağlar. Onarılacak dokuya göre, bu araştırma grubu CMS'yi farklı şekillerde tasarlama, 3D yapısını koruma deneyimine sahiptir. Örneğin, domuzlarda köpek üretrası ve safra kanalına silindirik CMS yerleştirildi ve doku yenilenmesinde umut verici sonuçlar verdi23,24.
Bu CMS'nin implantasyonu, doku yenilenmesini teşvik etmek ve farklı etiyolojiler (örneğin, virüs, alkol, metabolik faktörler) nedeniyle karaciğer sirozundaki fibrogenez-fibroliz dengesini geri kazandırmak için alternatif bir tedavi olabilir. CMS tarafından tetiklenen moleküler ve hücresel mekanizmaları tanımlamak için çoğalma, göç ve inflamasyon tahlilleri yapılmalıdır. Sonuç olarak, bu makalede hepatektomi için tekrarlanabilir bir prosedür ve biyomalzemelerin ksenoimplantasyonu yoluyla rejenerasyon sürecinin incelenmesi açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler. Benjamín León-Mancilla, Program de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) doktora öğrencisidir ve DGAPA-UNAM bursu almıştır.
Acknowledgments
Yazarlar, Deneysel Tıp Birimi Laboratuvar Hayvan Tesisi personeline, teknik ve cerrahi destek için Hemşire Carolina Baños G.'ye, mikrofotoğrafçılıktaki destek için Marco E. Gudiño Z.'ye ve karaciğer histolojislerindeki destek için Erick Apo'ya teşekkür etmek istiyor. Ulusal Konsey, BILIM ve Teknoloji(CONACyT),SALUD-2016-272579 ve PAPIIT-UNAM TA200515 hibe numarasını destekledi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anionic detergent | Alconox | Z273228 | |
| Biopsy cassettes | Leica | 3802453 | |
| Camera DMX | Nikon | DXM1200F | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | BD | 372412 | |
| Cover glasses 25 mm x 40 mm | Corning | 2980-224 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 200-M | CAS 17372-87-1 |
| Ethyl alcohol, pure | Sigma-Aldrich | 459836 | CAS 64-17-5 |
| Flunixine meglumide | MSD | Q-0273-035 | |
| Glass slides 75 mm x 25 mm | Corning | 101081022 | |
| Hematoxylin | Merck | H9627 | CAS 571-28-2 |
| Hydrochloric acid 37% | Merck | 339253 | CAS 7647-01-0 |
| Ketamine | Pisa agropecuaria | Q-7833-028 | |
| Light microscope | Nikon | Microphoto-FXA | |
| Microsurgery stereomicroscope | Zeiss | OPMI F170 | |
| Microtainer yellow cape | Beckton Dickinson | 365967 | |
| Microtome | Leica | RM2125 | |
| Model animal: Wistar rats | Universidad Nacional Autónoma de México | ||
| Nylon 3-0 (Dermalon) | Covidien | 1750-41 | |
| Polypropylene 7-0 | Atramat | SE867/2-60 | |
| Povidone-iodine10% cutaneous solution | Diafra SA de CV | 1.37E+86 | |
| Scanning electronic microscope | Zeiss | DSM-950 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J. T. Baker | 3722-01 | CAS 1310-73-2 |
| Software ACT-1 | Nikon | Ver 2.70 | |
| Stereomicroscope | Leica | EZ4Stereo 8X-35X | |
| Sterrad 100S | Johnson and Johnson | 99970 | |
| Surgipath paraplast | Leica | 39601006 | |
| Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm) | SensiMedical | LAN-078-077 | |
| Tissue Processor (Histokinette) | Leica | TP1020 | |
| Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder) | Sakura Finetek USA | 5229 | |
| Trichrome stain kit | Sigma-Aldrich | HT15 | |
| Unicell DxC600 Analyzer | Beckman Coulter | BC 200-10 | |
| Xylazine | Pisa agropecuaria | Q-7833-099 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | CAS 1330-20-7 |
References
- Li, N., Hua, J.
- Langer, R., Vacanti, J.
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Shafiee, A., Atla, A. Tissue engineering: Toward a new era of medicine. Annual Review of Medicine. 68, 29-40 (2017).
- Hu, C., Zhao, L., Wu, Z., Li, L. Transplantation of mesenchymal stem cells and their derivatives effectively promotes liver regeneration to attenuate acetaminophen-induced liver injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 88 (2020).
- Sancho-Bru, P. Therapeutic possibilities of stem cells in the treatment of liver diseases. Gastroenterologia y Hepatologia. 34 (10), 701-710 (2011).
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Freedman, B. R., Mooney, D. J. Biomaterials to mimic and heal connective tissues. Advanced Materials. 31 (19), 1806695 (2019).
- Meyer, M. Processing of collagen based biomaterials and the resulting materials properties. Biomedical Engineering Online. 18 (1), 24 (2019).
- El Baz, H., et al. Transplant of hepatocytes, undifferentiated mesenchymal stem cells, and in vitro hepatocyte-differentiated mesenchymal stem cells in a chronic lver failure experimental model: a comparative study. Experimental and Clinical Transplantation. 16 (1), 81-89 (2018).
- Nedjari, S., Awaja, F., Guarino, R., Gugutkov, D., Altankov, G. Establishing multiple osteogenic differentiation pathways of mesenchymal stem cells through different scaffold configurations. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (10), 1428-1437 (2020).
- Chan, E. C., et al. Three dimensional collagen scaffold promotes intrinsic vascularisation for tissue engineering applications. PLoS One. 11 (2), 0149799 (2016).
- Arenas-Herrera, J. E., Ko, I. K., Atala, A., Yoo, J. J. Decellularization for whole organ bioengineering. Biomedical Materials. 8 (1), 014106 (2013).
- Parmaksiz, M., Dogan, A., Odabas, S., Elçin, A. E., Elçin, Y. M. Clinical applications of decellularized extracellular matrices for tissue engineering and regenerative medicine. Biomedical Materials. 11 (2), 022003 (2016).
- Gacek, G.
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
- The University of Texas at Austin Institutional Animal Care and Use Committee. Guidelines for the Use of Chemical Depilatory Agents on Laboratory Animals. , https://research.utexas.edu (2021).
- Sivridis, L., Kotini, A., Anninos, P. The process of learning in neural net models with Poisson and Gauss connectivities. Neural Networks. 21 (1), 28-35 (2008).
- León-Mancilla, B. H., Araiza-Téllez, M. A., Flores-Flores, J. O., Piña-Barba, M. C. Physico-chemical characterization of collagen scaffolds for tissue engineering. Journal of Applied Research and Technology. 14 (1), 77-85 (2016).
- León, A., et al. Hematological and biochemical parameters in Sprague Dawley laboratory rats breed in CENPALAB, Cenp:SPRD. Revista Electronica de Veterinaria. 12, 1-10 (2011).
- Tsuchiya, A., et al. Mesenchymal stem cell therapies for liver cirrhosis: MSCs as "conducting cells" for improvement of liver fibrosis and regeneration. Inflammation and Regeneration. 39, 18 (2019).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
- Acevedo, G. C. Xenoimplante de colágena en uretra de perro. Universidad Nacional Autónoma de México. , Specialty of Urology thesis (2011).
- Montalvo-Jave, E. E., et al. Absorbable bioprosthesis for the treatment of bile duct injury in an experimental model. International Journal of Surgery. 20, 163-169 (2015).
