Summary
Leversygdomme er induceret af mange årsager, der fremmer fibrose eller skrumpelever. Transplantation er den eneste mulighed for at genoprette sundheden. I betragtning af manglen på transplanterbare organer skal alternativer imidlertid undersøges. Vores forskning foreslår implantation af kollagen stilladser i levervæv fra et dyr model.
Abstract
Leversygdomme er den hyppigste dødsårsag på verdensplan. Overdreven alkoholforbrug, en fedtrig kost, og hepatitis C virus infektion fremme fibrose, skrumpelever, og / eller hepatocellulær karcinom. Levertransplantation er den klinisk anbefalede procedure for at forbedre og forlænge levetiden for patienter i fremskredne sygdomsstadier. Men kun 10% af transplantationer er vellykkede, med organ tilgængelighed, presurgiske og postkirurgiske procedurer, og forhøjede omkostninger direkte korreleret med dette resultat. Ekstracellulære matrix (ECM) stilladser har vist sig som et alternativ til væv restaurering. Biokompatibilitet og accept af transplantat er de vigtigste gavnlige egenskaber ved disse biomaterialer. Selv om evnen til at genoprette størrelsen og den korrekte funktion af leveren er blevet evalueret i leveren hepatektomi modeller, brugen af stilladser eller en form for støtte til at erstatte mængden af den udryddede levermasse er ikke blevet vurderet.
Delvis hepatektomi blev udført i en rottelever med xenoimplantation af et kollagenmatrix stillads (CMS) fra en kvægkondyle. Venstre leverlapvæv blev fjernet (ca. 40%), og en tilsvarende andel af CMS blev kirurgisk implanteret. Leverfunktionstest blev evalueret før og efter den kirurgiske procedure. Efter dag 3, 14 og 21 blev dyrene aflivet, og makroskopiske og histologiske evalueringer blev udført. På dag 3 og 14 blev fedtvæv observeret omkring CMS uden kliniske tegn på afvisning eller infektion, ligesom kar neoformation og CMS reabsorption på dag 21. Der var histologiske beviser for en ubetydelig betændelsesproces og migration af tilstødende celler til CMS, observeret med hæmatoxylin og eosin (H &E) og Massons trikrome farvning. CMS viste sig at klare sig godt i levervæv og kunne være et nyttigt alternativ til at studere væv regenerering og reparation i kroniske leversygdomme.
Introduction
Leveren er et af de vigtigste organer, der er involveret i vedligeholdelse af homøostase og proteinproduktion1. Desværre, leversygdom er den hyppigste dødsårsag på verdensplan. I fremskredne stadier af leverskader, som omfatter skrumpelever og hætocellulært karcinom, levertransplantation er den klinisk anbefalede procedure. På grund af knapheden på donorer og den lave sats for vellykkede transplantationer er der imidlertid udviklet nye teknikker inden for vævsteknik (TE) og regenerativ medicin (RM)2,3.
TE indebærer brug af stamceller, stilladser og vækstfaktorer4 for at fremme genoprettelsen af betændte, fibrotiske og ødem organer og væv1,5,6. De biomaterialer, der anvendes i stilladser efterligner den indfødte ECM, giver de fysiske, kemiske og biologiske signaler til guidet cellulær remodeling7. Kollagen er et af de mest rigelige proteiner, der er fremstillet af dermis, senen, tarmen og perikardium8,9. Desuden kan kollagen opnås som en biopolymer til at producere to- og tredimensionelle stilladser gennem bioprinting eller elektrospinning10,11. Denne gruppe er den første til at rapportere brugen af kollagen fra en knoglekilde til regenerering af levervæv. En anden undersøgelse rapporterer brugen af stilladser syntetiseret fra kvæg kollagen, som blev fremstillet af huden, med homogene og tæt beliggende porer, uden nogen kommunikation mellem dem12.
Decellularisering bevarer den oprindelige ECM, så den efterfølgende inkorporering af celler med stamcellepotentiale13,14. Denne procedure er dog stadig i forsøgsfasen i leveren, hjertet, nyrerne, tyndtarmen og urinblæren fra mus, rotter, kaniner, grise, får, kvæg og heste3,14. I øjeblikket erstattes det resected levermassevolumen ikke i nogen af dyrets hepatektomimodeller. Men brugen af yderligere støtte eller netværk (biomaterialer), der muliggør cellespredning og angiogenese, kan være afgørende for hurtig genopretning af leverparenkymale funktioner. Således kan stilladser anvendes som alternative tilgange til regenerere eller reparere væv i kroniske leversygdomme, til gengæld fjerne begrænsninger på grund af donation og de kliniske komplikationer af levertransplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den nuværende forskning blev godkendt af den etiske komité under School of Medicine (DI/115/2015) ved Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) og den etiske komité for hospitalsgeneral de Mexico (CI/314/15). Institutionen opfylder alle tekniske specifikationer for produktion, pleje og anvendelse af forsøgsdyr og er juridisk certificeret i henhold til national lovgivning (NOM-062-ZOO-1999). Hanrotter af 150-250 g (6-8 uger gamle) blev fremstillet af Laboratory Animal Facility of the School of Medicine, UNAM, til denne undersøgelse.
1. Opnåelse af kollagen matrix stilladser fra kvæg lårben
- Få condyle fra kvæg lårben fra et slagteri certificeret af sundhed og landbrugsmyndigheder i Mexico.
- Disseker forsigtigt det kondylte fedt, muskler og brusk med et kirurgisk instrument. Skær bøjningsfragmenterne i 3 cm x 3 cm fragmenter ved hjælp af en savskærer og rengør fedt og blod med et håndklæde. Vask fangefragmenterne med vand.
- Kog (92 °C) fragmenter med 1 L anionisk vaskemiddel (10 g/L) i 30 min. Vask de sammensvorne fragmenter to gange for at fjerne eventuelle rester af det anioniske vaskemiddel.
- Fangefragmenter tørres i 3 timer ved hjælp af filterpapir (0,5 mm).
- Der fremstilles et trekantet CMS på 1 cm x1 cm 0,5 cm fra de fragmenter, der er nævnt i trin 1.1 (figur 1A).
- Demineralisere fragmenter i 100 mL af 0,5 M HCl i 10 min med konstant agitation. Fjern HCl' en.
BEMÆRK: Neutralisere HCl med natriumhydroxid (10 M). - Skyl fragmenter tre gange med 100 mL destilleret vand, 15 min hver gang, med konstant omrøring. CMS tørres med filterpapir (0,5 mm) i 1 time.
- Brug et stereomikroskop15 til at analysere CMS'ens strukturelle egenskaber (porernes størrelse, poredannelse og porøs sammenkobling) (Figur 1B).
- Brug et scanningselektronmikroskop16 til at analysere cms-trabeculaens ru overflade (Figur 1C).
- Brug dissektionsinstrumentet til blanding og strækning til at evaluere cms'ens mekaniske ændringer (plasticitet og fleksibilitet) (figur 1D).
- Pak CMS i sterilisering posen og sterilisere det med hydrogenperoxid plasma i 38 min. Opbevar det sterile CMS i den originale pakning i et tørt område ved 20-25 °C, indtil det er taget i brug.
- Demineralisere fragmenter i 100 mL af 0,5 M HCl i 10 min med konstant agitation. Fjern HCl' en.
2. Forberedelse af det kirurgiske område og håndtering og forberedelse af dyremodellen
- Sanitize det kirurgiske område, arbejdsbord, mikrokirurgi mikroskop, og sæde med 2% chlorhexidin opløsning. Sterilisere alle kirurgiske instrumenter, kirurgisk svamp, podninger, og engangs kirurgisk drapere gennem varme sterilisering (121 °C/30 min/100 kPa)
- Tildel rotterne (n=5) i tre grupper på fem rotter pr. gruppe: 1. fup, 2. hepatektomi og 3. hepatektomi plus CMS, og følg alle grupperne på dag 3, 14 og 21 dage.
- Ketamin (35 mg/kg) og xylazin (2,5 mg/kg) intramuskulært i bagben.
BEMÆRK: Den beroligende periode varer typisk i 30-40 min. - Barber mavehuden (5 cm x 2 cm) ved hjælp af kirurgisk sæbe og et tveægget blad, og desinficer huden ved hjælp af aktuel 10% povidone-jodopløsning i tre runder17.
- Placer dyret på en varm plade i decubitus dorsal position, med halsen hyperextended at opretholde en gennemtrængelig luftvej (Figur 2).
- Vurder dybden af anæstesi gennem åndedrætsmønsteret og tab af abstinenser i lemmerne.
- Placer en engangs kirurgisk drapering omkring den barberede hud og lav et snit (2,5 cm) på albous linje med en skalpel, ved hjælp af xiphoid proces som referencepunkt. Undgå bugvæggen blodkar for at forhindre blødning.
- Sæt abdominal retractor på plads og observere bughulen. Brug dissektionstrationen til at udtrække venstre leverlap og placere den på metalpladen (Figur 3A).
BEMÆRK: I falskgruppen ekstraheres den kun venstre leverlap og returnerer derefter leveren til bughulen. Sutur bugvæggen og huden med en 3-0 nylon sutur. - I de eksperimentelle grupper med og uden CMS skal du bruge et skalpelblad og steril skalpelblad (#15) til at udføre hepatektomi (ca. 40%) med to snit. Brug en trekantet metallisk skabelon (1 cm x 1 cm x 1 cm) til at udføre hepatektomien (Figur 3B).
- For at forhindre blødning i leveren, opretholde kirurgisk kompression med en vatpind på kanten af leveren i 5 min.
- Hydrat CMS i steril saltvandsopløsning i 20 min før den kirurgiske procedure. Implanter CMS i hepatektomistedet med fire stingsypsyturer mellem levervævet og CMS for at forhindre forskydning af biomaterialet. Brug 7-0 ikke-absorberbare polypropylen suturer (Figur 3C).
BEMÆRK: Fjern ikke suturerne i en anden operation; kan bruges som reference til at identificere stedet for CMS-implantation. - Returner leveren til bughulen og sutur bugvæggen og huden med en 3-0 nylon sutur. Rengør det kirurgiske snit med en kirurgisk jod-gennemblødt svamp i to runder. Overhold og overvåg dyrenes vitale tegn.
- Ketamin (35 mg/kg) og xylazin (2,5 mg/kg) intramuskulært i bagben.
3. Postoperativ pleje
- Giv megluminflunixin (2,5 mg/kg) intramuskulært i bagekstremitet. Administrere smertestillende midler som godkendt af den institutionelle dyrepleje og anvendelse udvalg.
- For anæstesi opsving, placere dyrene i individuelle polycarbonat kasser med laboratoriedyr strøelse i et støjfrit område med temperaturkontrol (23 °C).
- Overhold genopretningen af dyrene og overvåge deres vand- og fødevareforbrug i 2 timer. Monitorer dyr postoperativt som godkendt af den institutionelle dyrepleje og brug udvalg.
4. Evaluering af leverfunktion i serum
- Blodprøver (500 μL) fra de anæstesiiserede dyrs sidehaleårer før den kirurgiske procedure (baselineværdier) og ved evalueringsdag 3, 14 og 21.
- Blodprøverne centrifugeres ved 850 × g/10 min ved stuetemperatur (23 °C) serumet og opbevares ved -80 °C, indtil det er i brug.
- Udfør et panel af leverfunktionstest: serumalbumin (ALB), alkalisk fosfatase (ALP), alanin aminotransferase (ALT), aspartat aminotransferase (AST), total bilirubin (TB) og direkte bilirubin (DB) (Tabel 1).
5. Aktiv dødshjælp og vævshåndtering
- Bedøve dyrene for hver evaluering (dag 3, 14 og 21) ved at følge den ovenfor beskrevne protokol.
- Aflive via metoder, der er godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepleje og -anvendelse.
- Udfør et snit (5-6 cm) på den albous linje med en skalpel for at observere organerne i bughulen og tage fotografier af hepatektomi område af sham og de eksperimentelle grupper, med og uden CMS.
- Tag leverprøver (2 cm x 2 cm; 0,40-0,45 g) fra alle forsøgsgruppens dyr og læg dem i en 4% formaldehydopløsning i 24 timer til efterfølgende histologisk evaluering.
6. Histologisk analyse
- Konserver levervævet i 4% formaldehyd og dehydrere vævet ved hjælp af en række alkoholkoncentrationer (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); placere dem i xylen (1h) og indlejret dem i paraffin16.
- Skær paraffinblokkene med en mikrotom i 4 μm tykke sektioner til fremstilling af otte dias.
- Udfør H &E og Massons trikromefarvning 16.
- Overhold de farvede sektioner under et let mikroskop for at vælge de repræsentative områder af leveren, med og uden CMS. Få fotomikrografier ved 4x, 10x og 40x forstørrelse, og behandl billederne ved hjælp af passende software18 (se materialetabellen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Knogledemineralisering påvirker CMS's mekaniske egenskaber uden at ændre den oprindelige form eller sammenkobling af porerne. CMS kan have enhver form, og derfor kan justeres til størrelsen og formen af det valgte organ eller væv19. I den nuværende protokol brugte vi et trekantet CMS(figur 1A-D). En rottemodel blev brugt til at evaluere cms-xenoimplantets regenerative kapacitet i leveren. Selv om leveren er et friable og blødt organ, sikrede den kirurgiske procedure, der udføres i denne protokol, at CMS forblev på plads (figur 2 og figur 3A-C). Den delvise hepatektomi på 40% af venstre lap gjorde det muligt at vurdere en del af organet, hvilket holdt resten af leveren intakt, således at ændringerne i implantatet og den indfødte parenkym kunne sammenlignes. Derudover fik vi blodprøver til at evaluere leverfunktionen før og efter CMS implantation.
Der var ingen forskelle i baselinekoncentrationerne af de biokemiske parametre mellem fupgruppen og forsøgsgruppen med og uden CMS-implantation efter 3 og 14 dage. de holdt sig inden for referenceværdierne (ALB: 0,43-2,41 g/dL; ALP: 134-357,3 U/L; ALT: 41-83.1 UI/L; AST: 61.4-276.2 UI/L; TB: 0,01-0,43 mg/dL; DB: 0,1 mg/dL)20. Derudover var der ingen forskelle i albumin-, ALP-, ALT-, AST-, TB- og DB-niveauerne mellem fupgruppen og de eksperimentelle grupper efter 21 dage, hvilket indikerer, at CMS ikke forstyrrer leverfunktionen (tabel 1).
Under aktiv dødshjælp afslørede sonderende laparotomi den typiske farve og korrekte størrelse og form af leveren. Der blev ikke observeret betændelse eller infektion på implantationsstedet i nogen af tilfældene. På dag 3 var der ingen ændringer i organet i forhold til bughulen (Figur 4A). I en del, der indeholdt levervæv og CMS, blev blod observeret at have infiltreret CMS, med begyndende klæbende varentalt fedt (Figur 4B). På dag 14 steg mængden af fedt; der var neoformation af blodkar og integration af CMS i modtagerlevervæv, men ingen ændringer i tyndtarmen eller organerne i bughulen (Figur 5A). Omentalt fedt var højere i den forreste zone (Figur 5B) sammenlignet med visceralzonen (Figur 5C) på CMS-implantationsstedet. På evalueringsdag 21 var CMS-inkorporeringen i leveren mere tydelig (figur 6A). Stigningen i varslertalt fedt kan anvendes som indikator for fremskridtene med regenerering, da det er en kilde til mesenkymale stamceller21. Desuden præsenterede leveren efter 21 dage tætte områder, der svarede til nedbrydning og absorption, og ændrede størrelsen og den oprindelige form (Figur 6B).
For at analysere leverens mikrostruktur med CMS-implantatet udførte vi histologisk analyse af et repræsentativt fragment af væv fra implantationsstedet, som blev sammenlignet med væv fra højre leverlap (kontrol). Biopsier udført på dag 3, 14 og 21 blev behandlet og udsat for H &E og Massons trikrome farvning. Den normale struktur af leverparenchyma blev observeret i falskgruppen på dag 21 (figur 7A og figur 7E). På dag 3 viste den histologiske analyse, at CMS'ernes tilstedeværelse i leveren ikke fremmede en fremmedlegemereaktion, og den iøjnefaldende tilstedeværelse af slapt bindevæv blev observeret (Figur 7B og Figur 7F). På dag 14 og 21 var det slappe bindevæv mere rigeligt, med CMS trabeculae omgivet af hepatocytter, hvilket tyder på, at hepatocytter var migreret til CMS (figur 7C og figur 7G; Figur 7D og figur 7H). Resultaterne viste også områder med hepatocytter, der blev vandet af et fartøj (figur 8A). En nøje inspektion viste, at hepatocytterne, der havde klæbet til CMS trabeculae undertiden var omgivet af slap bindevæv (Figur 8B-D). To dobbeltblindede uafhængige patologer udførte den histopatologiske analyse. Immunohistochemistry og polymerase kædereaktion-baserede assays er i gang for at evaluere de forskellige proteiner og gener relateret til leverregenerering proces.
Således understøtter de makroskopiske og mikroskopiske observationer og de biokemiske værdier vores forslag om, at CMS er et ideelt biomateriale til støtte og fremme af leverregenerering. Ikke desto mindre skal CMS implantation evalueres i mere end 21 dage for at bestemme absorptionstiden og fuldstændig gendannelse af levervæv. Derudover bør der udføres undersøgelser, der evaluerer de forskellige proteiner og gener relateret til leverregenerering i cms'ens tilstedeværelse.
Figur 1: Knogleprøven og CMS. (A) Der blev anvendt en trekantet prøve af knogleprøven til fremstilling af CMS. (B) En detaljeret oversigt over porerne og sammenkoblingen eller den traditionelle tilslutning af CMS, som observeret ved elektronmikroskopi. (C) CMS, som det ses under et stereomikroskop. (D) CMS manipulation med et instrument blev udført for at kontrollere ændringen af mekaniske egenskaber. Forkortelse: CMS = kollagen matrix stillads. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Forberedelse af dyret til operation. Dyret er i decubitus dorsal position, der viser det barberede abdominale område, forberedt til hepatektomi og CMS implantation. Forkortelse: CMS = kollagen matrix stillads. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Hepatektomi af leverens venstre lap. (A) Den venstre lap blev udvundet og placeret på metalpladen for at udføre hepatektomien. (B) Hepatektomi på 40% af venstre lap blev udført i trekantet form, ligesom CMS. (C) Arealet af hepatektomi erstattes af CMS. Forkortelse: CMS = kollagen matrix stillads. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Dag 3 i evalueringen. (A) Makroskopisk observation af implantationsstedet på evalueringsdag 3. Leveren implanteret med (fyldt stjerne) CMS (stiplede linje) ikke ændre sig i farve eller størrelse. Tyndtarmen (tom stjerne) og resten af mavestrukturerne viste ingen ændringer. (B) Prøve af leveren (fyldt stjerne) og CMS (hvid pil), der er dækket af varslet fedt (rød pil). Forkortelse: CMS = kollagen matrix stillads. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Dag 14 i evalueringen. (A) Makroskopisk observation af implantationsstedet på evalueringsdag 14. Levervævet (fyldt stjerne) med CMS ændrede sig ikke i farve eller størrelse. Tyndtarmen (tom stjerne) og resten af strukturerne og organerne i bughulen viste ingen ændringer. Prøve af leveren med det implanterede CMS: (B) forreste syn; (C) posterior/visceral visning. Varentalt fedt (rød pil), der dækker området. CMS'en blev integreret i levervævet. Det omentale fedt (rød pil) dækker hovedsageligt området i den forreste visning. Den stiplede linje angiver stedet for CMS implantation; suturer (blå tråd). Forkortelse: CMS = kollagen matrix stillads. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Dag 21 i evalueringen. (A) Makroskopisk observation af implantationsstedet på evalueringsdag 21. Modtageren lever (fyldt stjerne) implanteret med CMS (prikket linje) ikke ændre farve eller størrelse. Tyndtarmen (tom stjerne) og resten af mavestrukturerne viste ingen ændringer. (B) Prøve af leveren med den implanterede CMS (stiplede linje), der viser ændringer i størrelse og form. Forkortelse: CMS = kollagen matrix stillads. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Histologi af leveren og leveren med CMS. (A) Normal lever (SHAM), der viser den karakteristiske vævsarkitektur. (B) Dag 3 af CMS implantation, der viser slap bindevæv i trabeculae af CMS (stiplede ovaler). (C) Overgangszone mellem den oprindelige lever (højre side) og CMS (venstre side) med trabeculae af CMS (pil). (D) Lever i hjemmehørende lever i kontakt med CMS (stiplede linjer) på dag 21. (E) Normal lever med Massons trikrome plet. (F) Cms implanteret i leveren; invasion af slap bindevæv på dag 3 (stiplet oval). (G) På dag 14, indfødte lever med CMS trabeculae, der viser et område af hepatocytter (fyldt stjerne) uden for den indfødte lever, hvilket tyder på, at de indfødte hepatocytter havde migreret gennem CMS. (H) På dag 21 har de indfødte hepatocytter migreret mod CMS (pilen). A og E: Skalastænger = 200 μm: 4x, B-D og F-H: Skalastænger = 100 μm: 10x. A-D: H&E farvning; E-H: Massons trikrome farvning. Forkortelser: CMS = kollagen matrix stillads; H&E = hæmatoxylin og eosin. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Histologi af leveren og CMS. (A) Pulje af hepatocytter (hvid pil) til stede i trabeculae af CMS (sort pil). Hepatocytterne vandes af et fartøj (fyldt stjerne). (B) Hepatocytter (hvid pil) har migreret og klæbet til cms -trabeculaen (sort pil). (C) Der observeres en gruppe hepatocytter (stiplet cirkel) mellem to trabeculae (sorte pile) af CMS. (D) Hepatocytter har klæbet til trabeculae (sorte pile) af CMS i nærværelse af slap bindevæv (stiplet oval). A og C: Skalastænger = 100 μm: 10x. B og D: Skalastænger = 20 μm: 40x. Forkortelse: CMS = kollagen matrix stillads. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Dage | SHAM | Hepatektomi | Implantation CMS | |
| ALB (g/dL) | 3 | 1.4±0 | 1.25±0.07 | 1.4±0 |
| 14 | 1.3±0.5 | 1.85±0.07 | 1.8±0.14 | |
| 21 | 1.3±05 | 1.6±0.1 | 1.7± 0 | |
| ALT (IU/L) | 3 | 73±1.4 | 3.5±0.7 | 54.6±6.4 |
| 14 | 84±0 | 59.5±4.9 | 57±4.2 | |
| 21 | 57±0 | 73.5±14.8 | 73.5±14.8 | |
| AST (IU/L) | 3 | 106±1,4 | 80±6,6 | 90±1.4 |
| 14 | 127±5,5 | 94±21.2 | 83.5±17.6 | |
| 21 | 123.7±27.3 | 92.5±24.7 | 101±31.1 | |
| TB (mg/dL) | 3 | 0.33±0.05 | 0.25±0.07 | 0,3±0 |
| 14 | 0,5±0 | 0,2±0 | 0.15±0 | |
| 21 | 0,3±0 | 0,4±0 | 0,4±0.14 | |
| DB (mg/dL) | 3 | 0.1±0 | 0,05±0,07 | 0.1±0 |
| 14 | 0.1±0 | 0.1±0 | 0.1±0 | |
| 21 | 0.1±0 | 0.1±0 | 0.1±0 |
Tabel 1: Leverfunktion. Leverfunktionstest blev udført for falske og eksperimentelle grupper med og uden CMS efter 3, 14 og 21 dage. Forkortelser: CMS = kollagen matrix stillads; ALB = Albumin; ALP = Alkalisk fosfatase; ALT= Alanin aminotransferase; AST = Aspartat aminotransferase; TB = Bilirubin i alt; DB = Direkte bilirubin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Organtransplantation er grundpillen i behandlingen hos patienter med leverfibrose eller skrumpelever. Nogle få patienter nyder godt af denne procedure, hvilket gør det nødvendigt at give terapeutiske alternativer til patienter på ventelisten. Vævsteknik er en lovende strategi, der anvender stilladser og celler med regenerativt potentiale2,4,13. Fjernelsen af en del af leveren er et kritisk skridt i denne procedure på grund af den voldsomme blødning af dette vaskulære organ. Derfor skal hæmostasis af den kirurgiske seng udføres for at forhindre denne komplikation. Desuden lettes bindingen af levervævet til CMS, som er afgørende for at sikre væv-biomaterialeinteraktion, ved brug af suturer. Det skal dog gøres omhyggeligt for at undgå at rive leveren og forårsage senere blødning.
Selv om det biomateriale, der foreslås heri, er af kvægoprindelse (xenogen), findes der ingen data om biomaterialereaktion hos rotter, hvilket gør selektiv hepatektomi mulig. I modsætning hertil har 2/3 hepatektomimodellen vist sig at forårsage dyrenes død på grund af fjernelsen af en stor mængde levervæv14. Desuden udviklede vi en metallisk skabelon i rustfrit stål, fordi vi havde svært ved at standardisere størrelsen i hepatektomi og CMS. Sterilisering af CMS var udfordrende, fordi de eksisterende teknikker ændrede strukturen af kollagen og dens biokemiske egenskaber. Derfor blev sterilisering ved varme, gammastråling og ethylenoxid undersøgt som steriliseringsmetoder, før det blev fastslået, at plasmaet af hydrogenperoxid var den optimale teknik13.
Det er vigtigt at bestemme den maksimale størrelse af CMS, der kunne implanteres i leveren og evaluere den biologiske respons på et systemisk niveau. Desuden er det nødvendigt at optimere og undersøge effekten af denne teknik i en større dyreart. Desuden er det vigtigt at undersøge virkningerne af CMS implantation i leveren i en længere periode (>30 dage), hvilket vil gøre det muligt at vurdere omfanget af biosorption af CMS og regenerering af levervævet. Endvidere skal virkningerne af CMS-implantationen undersøges i dyremodeller med leverskader. Denne implantationsmetode har åbnet døren for strategier, der udforsker restaureringen af formen og mængden af resected væv, hvilket reducerer anæstesi, kirurgisk varighed og restitutionstid4,13.
CMS blev fremstillet af en naturlig kilde og bevarede sine fysiske og kemiske egenskaber sammenlignet med syntetiske biomaterialer fremstillet ved hjælp af komplekse metoder, såsom bioprint eller elektrospinning, som ikke er biokompatible eller bioabsorberbare2,3. Den primære komponent i dette CMS er kollagentype I, som er det vigtigste protein i ECM, der muliggør celle vedhæftning og spredning22. Derudover muliggør trabeculae af CMS porerne cellemigration og den fortsatte strøm af vækstfaktorer, blod og andre mæglere i regenereringsprocessen. Ifølge det væv, der skal repareres, har denne forskningsgruppe erfaring med at designe CMS i forskellige former og bevare sin 3D-struktur. For eksempel blev cylindrisk CMS implanteret i hundeudrøret og galdegangen hos svin og gav lovende resultater i vævsregenerering23,24.
Implantationen af dette CMS kunne være en alternativ behandling for at stimulere væv regenerering og genoprette fibrogenese-fibrolyse balance i leveren skrumpelever på grund af forskellige ætiologier (f.eks virus, alkohol, metaboliske faktorer). Spredning, migration, og betændelse assays skal udføres for at identificere de molekylære og cellulære mekanismer udløst af CMS. Afslutningsvis beskriver dette dokument en reproducerbar procedure for hepatektomi samt undersøgelse af regenereringsprocessen gennem xenoimplantation af biomaterialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser. Benjamín León-Mancilla er ph.d.-studerende fra Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), og han modtog DGAPA-UNAM stipendium.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke personalet i Laboratory Animal Facility of the Experimental Medicine Unit, Nurse Carolina Baños G. for teknisk og kirurgisk støtte, Marco E. Gudiño Z. for støtte i mikrofotografier, og Erick Apo for støtte i lever histologi. Det nationale råd støttede denne forskning for videnskab og teknologi (CONACyT),bevillingsnummer SALUD-2016-272579 og PAPIIT-UNAM TA200515.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anionic detergent | Alconox | Z273228 | |
| Biopsy cassettes | Leica | 3802453 | |
| Camera DMX | Nikon | DXM1200F | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | BD | 372412 | |
| Cover glasses 25 mm x 40 mm | Corning | 2980-224 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 200-M | CAS 17372-87-1 |
| Ethyl alcohol, pure | Sigma-Aldrich | 459836 | CAS 64-17-5 |
| Flunixine meglumide | MSD | Q-0273-035 | |
| Glass slides 75 mm x 25 mm | Corning | 101081022 | |
| Hematoxylin | Merck | H9627 | CAS 571-28-2 |
| Hydrochloric acid 37% | Merck | 339253 | CAS 7647-01-0 |
| Ketamine | Pisa agropecuaria | Q-7833-028 | |
| Light microscope | Nikon | Microphoto-FXA | |
| Microsurgery stereomicroscope | Zeiss | OPMI F170 | |
| Microtainer yellow cape | Beckton Dickinson | 365967 | |
| Microtome | Leica | RM2125 | |
| Model animal: Wistar rats | Universidad Nacional Autónoma de México | ||
| Nylon 3-0 (Dermalon) | Covidien | 1750-41 | |
| Polypropylene 7-0 | Atramat | SE867/2-60 | |
| Povidone-iodine10% cutaneous solution | Diafra SA de CV | 1.37E+86 | |
| Scanning electronic microscope | Zeiss | DSM-950 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J. T. Baker | 3722-01 | CAS 1310-73-2 |
| Software ACT-1 | Nikon | Ver 2.70 | |
| Stereomicroscope | Leica | EZ4Stereo 8X-35X | |
| Sterrad 100S | Johnson and Johnson | 99970 | |
| Surgipath paraplast | Leica | 39601006 | |
| Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm) | SensiMedical | LAN-078-077 | |
| Tissue Processor (Histokinette) | Leica | TP1020 | |
| Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder) | Sakura Finetek USA | 5229 | |
| Trichrome stain kit | Sigma-Aldrich | HT15 | |
| Unicell DxC600 Analyzer | Beckman Coulter | BC 200-10 | |
| Xylazine | Pisa agropecuaria | Q-7833-099 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | CAS 1330-20-7 |
References
- Li, N., Hua, J.
- Langer, R., Vacanti, J.
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Shafiee, A., Atla, A. Tissue engineering: Toward a new era of medicine. Annual Review of Medicine. 68, 29-40 (2017).
- Hu, C., Zhao, L., Wu, Z., Li, L. Transplantation of mesenchymal stem cells and their derivatives effectively promotes liver regeneration to attenuate acetaminophen-induced liver injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 88 (2020).
- Sancho-Bru, P. Therapeutic possibilities of stem cells in the treatment of liver diseases. Gastroenterologia y Hepatologia. 34 (10), 701-710 (2011).
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Freedman, B. R., Mooney, D. J. Biomaterials to mimic and heal connective tissues. Advanced Materials. 31 (19), 1806695 (2019).
- Meyer, M. Processing of collagen based biomaterials and the resulting materials properties. Biomedical Engineering Online. 18 (1), 24 (2019).
- El Baz, H., et al. Transplant of hepatocytes, undifferentiated mesenchymal stem cells, and in vitro hepatocyte-differentiated mesenchymal stem cells in a chronic lver failure experimental model: a comparative study. Experimental and Clinical Transplantation. 16 (1), 81-89 (2018).
- Nedjari, S., Awaja, F., Guarino, R., Gugutkov, D., Altankov, G. Establishing multiple osteogenic differentiation pathways of mesenchymal stem cells through different scaffold configurations. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (10), 1428-1437 (2020).
- Chan, E. C., et al. Three dimensional collagen scaffold promotes intrinsic vascularisation for tissue engineering applications. PLoS One. 11 (2), 0149799 (2016).
- Arenas-Herrera, J. E., Ko, I. K., Atala, A., Yoo, J. J. Decellularization for whole organ bioengineering. Biomedical Materials. 8 (1), 014106 (2013).
- Parmaksiz, M., Dogan, A., Odabas, S., Elçin, A. E., Elçin, Y. M. Clinical applications of decellularized extracellular matrices for tissue engineering and regenerative medicine. Biomedical Materials. 11 (2), 022003 (2016).
- Gacek, G.
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
- The University of Texas at Austin Institutional Animal Care and Use Committee. Guidelines for the Use of Chemical Depilatory Agents on Laboratory Animals. , https://research.utexas.edu (2021).
- Sivridis, L., Kotini, A., Anninos, P. The process of learning in neural net models with Poisson and Gauss connectivities. Neural Networks. 21 (1), 28-35 (2008).
- León-Mancilla, B. H., Araiza-Téllez, M. A., Flores-Flores, J. O., Piña-Barba, M. C. Physico-chemical characterization of collagen scaffolds for tissue engineering. Journal of Applied Research and Technology. 14 (1), 77-85 (2016).
- León, A., et al. Hematological and biochemical parameters in Sprague Dawley laboratory rats breed in CENPALAB, Cenp:SPRD. Revista Electronica de Veterinaria. 12, 1-10 (2011).
- Tsuchiya, A., et al. Mesenchymal stem cell therapies for liver cirrhosis: MSCs as "conducting cells" for improvement of liver fibrosis and regeneration. Inflammation and Regeneration. 39, 18 (2019).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
- Acevedo, G. C. Xenoimplante de colágena en uretra de perro. Universidad Nacional Autónoma de México. , Specialty of Urology thesis (2011).
- Montalvo-Jave, E. E., et al. Absorbable bioprosthesis for the treatment of bile duct injury in an experimental model. International Journal of Surgery. 20, 163-169 (2015).
