Summary
Заболевания печени вызваны многими причинами, которые способствуют фиброзу или циррозу. Трансплантация является единственным вариантом восстановления здоровья. Однако, учитывая нехватку трансплантируемых органов, необходимо изучить альтернативы. Наше исследование предлагает имплантацию коллагеновых каркасов в ткань печени с животной модели.
Abstract
Заболевания печени являются основной причиной смерти во всем мире. Чрезмерное потребление алкоголя, диета с высоким содержанием жиров и вирусная инфекция гепатита С способствуют фиброзу, циррозу и / или гепатоцеллюлярной карциноме. Трансплантация печени является клинически рекомендуемой процедурой для улучшения и продления продолжительности жизни пациентов на поздних стадиях заболевания. Тем не менее, только 10% трансплантаций являются успешными, с наличием органов, предоперационными и послеоперационными процедурами, а высокие затраты напрямую коррелируют с этим результатом. Каркасы внеклеточного матрикса (ECM) появились в качестве альтернативы для восстановления тканей. Биосовместимость и прием трансплантата являются основными полезными характеристиками этих биоматериалов. Хотя способность восстанавливать размер и правильную функцию печени была оценена в моделях гепатэктомии печени, использование каркасов или какой-либо поддержки для замены объема истребленной массы печени не оценивалось.
Частичную гепатэктомию проводили в печени крысы с ксеноимплантацией каркаса коллагеновой матрицы (CMS) из мыщелка крупного рогатого готья. Ткань левой доли печени была удалена (примерно 40%), и равная доля CMS была имплантирована хирургическим путем. Тесты функции печени оценивались до и после хирургической процедуры. Через 3, 14 и 21 дни животных усыплены, проведены макроскопические и гистологические оценки. На 3 и 14 днях наблюдалась жировая ткань, окружающая CMS, без клинических признаков отторжения или инфекции, как и неоформация сосудов и реабсорбция CMS на 21-й день. Были гистологические доказательства незначительного воспалительного процесса и миграции соседних клеток в CMS, наблюдаемого с гематоксилином и эозином (H&E) и трихромным окрашиванием Массона. Было показано, что CMS хорошо работает в ткани печени и может быть полезной альтернативой для изучения регенерации и восстановления тканей при хронических заболеваниях печени.
Introduction
Печень является одним из наиболее важных органов, участвующих в поддержании гомеостаза и выработке белка1. К сожалению, заболевания печени являются основной причиной смерти во всем мире. На поздних стадиях поражения печени, которые включают цирроз и гепатоцеллюлярную карциному, трансплантация печени является клинически рекомендуемой процедурой. Однако из-за дефицита доноров и низкого уровня успешных трансплантаций были разработаны новые методы в тканевой инженерии (ТЭ) и регенеративной медицине (РМ)2,3.
ТЭ предполагает использование стволовых клеток, каркасов и факторов роста4 для содействия восстановлению воспаленных, фиброзных и отечные органы и ткани1,5,6. Биоматериалы, используемые в каркасах, имитируют нативный ECM, обеспечивая физические, химические и биологические сигналы для управляемого клеточного ремоделирования7. Коллаген является одним из наиболее распространенных белков, получаемых из дермы, сухожилия, кишечника и перикарда8,9. Кроме того, коллаген может быть получен в виде биополимера для получения двух- и трехмерных каркасов посредством биопечати или электроспиннинга10,11. Эта группа первой сообщила об использовании коллагена из костного источника для регенерации ткани печени. В другом исследовании сообщается об использовании каркасов, синтезированных из бычьего коллагена, который был получен из кожи, с однородными и близко расположенными порами, без какой-либо связи между ними12.
Децеллюляризация сохраняет нативную ECM, позволяя впоследствии включать клетки с потенциалом стволовых клеток13,14. Тем не менее, эта процедура все еще находится в экспериментальной фазе в печени, сердце, почках, тонкой кишке и мочевом пузыре от мышей, крыс, кроликов, свиней, овец, крупного рогатого скота и лошадей3,14. В настоящее время резецированный объем массы печени не заменяется ни в одной из моделей гепатэктомии животных. Тем не менее, использование дополнительной поддержки или сети (биоматериалов), которая обеспечивает пролиферацию клеток и ангиогенез, может иметь важное значение для быстрого восстановления паренхиматозных функций печени. Таким образом, каркасы могут быть использованы в качестве альтернативных подходов к регенерации или восстановлению тканей при хронических заболеваниях печени, в свою очередь, устраняя ограничения из-за донорства и клинических осложнений трансплантации печени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Настоящее исследование было одобрено комитетом по этике Медицинского факультета (DI/115/2015) в Национальном университете национальной авиационной медицины (UNAM) и комитетом по этике Главной больницы Мексики (CI/314/15). Учреждение выполняет все технические спецификации на производство, уход и использование лабораторных животных и юридически сертифицировано национальным законодательством (NOM-062-ZOO-1999). Самцы крыс Wistar весом 150-250 г (6-8 недель) были получены из Лаборатории лабораторных животных Медицинской школы UNAM для этого исследования.
1. Получение коллагеновых матричных каркасов из бедренной кости крупного рогатого готья
- Получите мыщелок из бедренной кости крупного рогатого готья на скотобойне, сертифицированной органами здравоохранения и сельского хозяйства Мексики.
- Тщательно рассекте мыщелковый жир, мышцы и хрящи хирургическим инструментом. Разрежьте фрагменты мыщелка на фрагменты 3 см х3 см с помощью пилорамы и очистите жир и кровь полотенцем. Вымойте фрагменты мыщелка водой.
- Отварить (92 °C) фрагменты с 1 л арионного моющего средства (10 г/л) в течение 30 мин. Дважды вымойте фрагменты мыщелка, чтобы удалить остатки антионного моющего средства.
- Высушите фрагменты мыщелка в течение 3 ч с помощью фильтровальной бумаги (0,5 мм).
- Подготовьте треугольную (1 см х1 см х1 см) CMS толщиной 0,5 см из фрагментов, упомянутых на шаге 1.1(рисунок 1A).
- Деминерализуют фрагменты в 100 мл 0,5 М HCl в течение 10 мин с постоянным перемешиванием. Удалите HCl.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нейтрализуют HCl гидроксидом натрия (10 М). - Смойте фрагменты три раза 100 мл дистиллированной воды, по 15 мин каждый раз, с постоянным перемешиванием. Высушите CMS фильтровальной бумагой (0,5 мм) в течение 1 ч.
- Используйте стереомикроскоп15 для анализа структурных свойств CMS (размер пор, порообразование и порообразное соединение)(фиг.1B).
- Используйте сканирующий электронный микроскоп16 для анализа шероховатой поверхности трабекул CMS(фиг.1С).
- Используйте инструмент рассечения для смешивания и растяжения для оценки механических изменений (пластичности и гибкости) CMS(рисунок 1D).
- Упакуйте CMS в стерилизационный мешочек и стерилизуйте его плазмой перекиси водорода в течение 38 мин. Храните стерильную CMS в оригинальной упаковке в сухом месте при 20-25 °C до использования.
- Деминерализуют фрагменты в 100 мл 0,5 М HCl в течение 10 мин с постоянным перемешиванием. Удалите HCl.
2. Подготовка хирургической области и обработка и подготовка животной модели
- Продезинфицируйте хирургическую зону, рабочий стол, микрохирургический микроскоп и сиденье 2% раствором хлоргексидина. Стерилизовать все хирургические инструменты, хирургическую губку, тампоны и одноразовые хирургические драпировки путем тепловой стерилизации (121 °C /30 мин/100 кПа)
- Назначьте крыс (n = 5) в три группы по пять крыс в группе: 1. фиктивная, 2. гепатэктомия и 3. гепатэктомия плюс CMS, и следите за всеми группами в дни 3, 14 и 21 день.
- Вводят кетамин (35 мг/кг) и ксилазин (2,5 мг/кг) внутримышечно в заднюю конечность.
ПРИМЕЧАНИЕ: Седативный период обычно длится 30-40 минут. - Сбрить кожу живота (5 см х 2 см) с помощью хирургического мыла и обоюдоострого лезвия, а также продезинфицировать кожу с помощью местного 10% раствора повидона-йода в три раундапо 17.
- Поместите животное на теплую тарелку в продольном положении, с гиперпротянутой шеей для поддержания проницаемых дыхательных путей(рисунок 2).
- Оцените глубину анестезии через дыхательный паттерн и потерю рефлекса отмены в конечностях.
- Поместите одноразовую хирургическую драпировку вокруг бритой кожи и сделайте разрез (2,5 см) на линии альбуса скальпелем, используя в качестве ориентира кистоидный отрочек. Избегайте кровеносных сосудов брюшной стенки, чтобы предотвратить кровотечение.
- Поставьте брюшной ретрактор на место и наблюдайте за брюшной полостью. Используя рассеченные щипцы, извлеките левую мочку печени и поместите ее на металлическую пластину(рисунок 3А).
ПРИМЕЧАНИЕ: В фиктивной группе извлекают только левую мочку печени, а затем возвращают печень в брюшную полость. За швы брюшной стенки и кожи нейлоновым швом 3-0. - В экспериментальных группах с CMS и без нее используйте лезвие скальпеля и стерильное лезвие скальпеля (No 15) для выполнения гепатэктомии (примерно 40%) с двумя разрезами. Используйте треугольный металлический шаблон (1 см х 1 см х 1 см) для выполнения гепатэктомии(рисунок 3B).
- Для предотвращения кровотечения печени поддерживают хирургическую компрессию тампоном на краю печени в течение 5 мин.
- Гидратировать CMS в стерильном физиологическом растворе за 20 мин до хирургической процедуры. Имплантировать CMS в место гепатэктомии с четырьмя швами швов между тканью печени и CMS для предотвращения смещения биоматериала. Используйте 7-0 нерассасывающихся полипропиленовых швов(Рисунок 3С).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не снимайте швы во второй операции; Швы могут быть использованы в качестве ориентира для идентификации места имплантации CMS. - Вернуть печень в брюшную полость и зашвить брюшную стенку и кожу 3-0 нейлоновым швом. Очистите хирургический разрез хирургической губкой, пропитанной йодом, в два раунда. Наблюдайте и контролируйте жизненно важные показатели животных.
- Вводят кетамин (35 мг/кг) и ксилазин (2,5 мг/кг) внутримышечно в заднюю конечность.
3. Послеоперационный уход
- Вводят меглюмин флуниксин (2,5 мг/кг) внутримышечно в заднюю конечность. Вводите анальгетики в том виде, в как это одобрено институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию.
- Для восстановления анестезии поместите животных в индивидуальные поликарбонатные ящики с подстилкой для лабораторных животных в бесшумной зоне с контролем температуры (23 °C).
- Наблюдайте за выздоровлением животных и контролируйте их потребление воды и пищи в течение 2 ч. Мониторинг животных после операции в том случае, если это одобрено институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию.
4. Оценка функции печени в сыворотке крови
- Забор образцов крови (500 мкл) из боковых хвостовых вен анестезированных животных перед хирургической процедурой (исходные значения) и на 3, 14 и 21 день оценки.
- Центрифугировать образцы крови при 850 × г/10 мин при комнатной температуре (23 °C); отделите сыворотку и храните ее при -80°C до использования.
- Выполняют панельных функциональных тестов печени: сывороточный альбумин (ALB), щелочная фосфатаза (ALP), аланинаминотрансфераза (ALT), аспартатаминотрансфераза (AST), общий билирубин (TB) и прямой билирубин (DB)(таблица 1).
5. Эвтаназия и управление тканями
- Анестезировать животных для каждой оценки (дни 3, 14 и 21), следуя протоколу, описанному выше.
- Эвтаназия с помощью методов, утверждаемых институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию.
- Выполняют разрез (5-6 см) на линии альбуса скальпелем для наблюдения за органами брюшной полости и фотографирования области гепатэктомии фиктивной и экспериментальной групп, с CMS и без нее.
- Берут образцы печени (2 см х 2 см; 0,40-0,45 г) у всех животных исследуемой группы и помещают их в 4% раствор формальдегида на 24 ч для последующей гистологической оценки.
6. Гистологический анализ
- Сохранить ткани печени в 4% формальдегиде и обезвоживать ткани с помощью ряда концентраций алкоголя (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); поместите их в ксилол (1ч) и поместите в парафин16.
- Парафиновые блоки микротомом разрезать на участки толщиной 4 мкм для подготовки восьми слайдов.
- Выполните трихромное окрашивание H&E и Masson16.
- Наблюдайте за окрашенными участками под световым микроскопом, чтобы выбрать репрезентативные области печени, с CMS и без нее. Получайте фотофотографии с увеличением 4x, 10x и 40x и обрабатывайте изображения с помощью соответствующего программного обеспечения18 (см. Таблицу материалов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Деминерализация кости влияет на механические свойства CMS без изменения первоначальной формы или взаимосвязи еепор. CMS может иметь любую форму, а значит, может быть скорректирована под размер и форму выбранного органа илиткани 19. В настоящем протоколе мы использовали треугольную CMS(рисунок 1A-D). Модель крысы использовалась для оценки регенеративной способности ксеноимплантатов CMS в печени. Хотя печень является рыхлым и мягким органом, хирургическая процедура, выполненная в этом протоколе, обеспечила, чтобы CMS оставалась на месте(Рисунок 2 и Рисунок 3A-C). Частичная гепатэктомия 40% левой доли позволила оценить часть органа, сохранив остальную часть печени нетронутой, чтобы можно было сравнить изменения в имплантате и нативной паренхиме. Кроме того, мы получили образцы крови для оценки функции печени до и после имплантации CMS.
Не было выявлено различий в исходных концентрациях биохимических показателей между фиктивной группой и экспериментальной группой с имплантацией CMS и без нее через 3 и 14 дней; они оставались в пределах контрольныхзначений (ALB:0,43-2,41 г/дл; ALP: 134-357.3 U/L; ALT: 41-83.1 UI/L; АСТ: 61.4-276.2 UI/L; ТБ:0,01-0,43 мг/дл; ДБ: 0,1мг/дл) 20. Кроме того, не было выявлено различий в уровнях альбумина, ALP, ALT, AST, TB и DB между фиктивной группой и экспериментальными группами в течение 21 дня, что указывает на то, что CMS не нарушает функцию печени(таблица 1).
Во время эвтаназии исследовательская лапаротомия выявила типичный цвет и правильный размер и форму печени. Ни в одном из случаев в месте имплантации не наблюдалось воспаления или инфекции. На 3 день не наблюдалось никаких изменений в органе по отношению к брюшной полости(рисунок 4А). В части, которая содержала ткань печени и CMS, кровь проникла в CMS с зарождающимся адгезионным сальником(рисунок 4B). На 14 день количество жира увеличилось; наблюдалась неоформация кровеносных сосудов и интеграция CMS в ткань печени реципиента, но не было изменений в тонком кишечнике или органах брюшной полости(рисунок 5A). Сальмендальный жир был выше в передней зоне(Рисунок 5B)по сравнению с висцеральной зоной(Рисунок 5C)в месте имплантации CMS. На 21-й день оценки включение CMS в печень было более очевидным(рисунок 6A). Увеличение сальника может быть использовано как показатель прогресса регенерации, так как он является источником мезенхимальных стволовых клеток21. Более того, через 21 день печень представила плотные участки, которые соответствовали деградации и всасыванию, изменив размер и первоначальную форму(рисунок 6В).
Для анализа микроструктуры печени с помощью имплантата CMS мы провели гистологический анализ репрезентативного фрагмента ткани из места имплантации, который сравнивали с тканью из правой доли печени (контроль). Биопсии, выполненные на 3, 14 и 21 день, были обработаны и подвергнуты трихромному окрашиванию H&E и Masson. Нормальная структура паренхимы печени наблюдалась в фиктивной группе на 21 день(Фиг.7А и Фиг.7Е). На 3 день гистологический анализ показал, что присутствие CMS в печени не способствует реакции инородного тела, и наблюдалось заметное присутствие слабой соединительнойткани (Рисунок 7B и Рисунок 7F). На 14 и 21 день слабая соединительная ткань была более обильной, причем трабекулы CMS были окружены гепатоцитами, что свидетельствует о том, что гепатоциты мигрировали в CMS(рисунок 7C и рисунок 7G; Рисунок 7D и рисунок 7H). Результаты также показали участки гепатоцитов, которые орошались сосудом(рисунок 8А). Тщательный осмотр показал, что гепатоциты, которые прилипали к trabeculae CMS, иногда были окружены слабой соединительной тканью(рисунок 8B-D). Два двойных слепых независимых патологоанатома провели гистопатологический анализ. В настоящее время проводятся анализы иммуногистохимии и полимеразной цепной реакции для оценки различных белков и генов, связанных с процессом регенерации печенки.
Таким образом, макроскопические и микроскопические наблюдения и биохимические значения подтверждают наше предположение о том, что CMS является идеальным биоматериалом для поддержки и стимулирования регенерации печени. Тем не менее, имплантация CMS должна оцениваться более 21 дня, чтобы определить время ее всасывания и полное восстановление ткани печени. Кроме того, следует проводить исследования, которые оценивают различные белки и гены, связанные с регенерацией печенки в присутствии CMS.
Рисунок 1:Образец кости и CMS. (A) Треугольный образец образца кости был использован для подготовки CMS. (B) Подробное представление пор и взаимосвязи или трабекулярного соединения CMS, наблюдаемого с помощью электронной микроскопии. (C) CMS, как видно под стереомикроскопом. (D)Манипуляции CMS с прибором проводились для проверки модификации механических свойств. Аббревиатура: CMS = каркас коллагеновой матрицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Подготовка животного к операции. Животное находится в продольном дорсальном положении, показывая бритую область живота, подготовленную к гепатэктомии и имплантации CMS. Аббревиатура: CMS = каркас коллагеновой матрицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Гепатэктомия левой доли печени. (A)Левую мочку извлекали и помещали на металлическую пластину для выполнения гепатэктомии. Гепатэктомия 40% левой доли проводилась в треугольной форме, как и CMS. (С) Область гепатэктомии заменяется КМВ. Аббревиатура: CMS = каркас коллагеновой матрицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:День 3 оценки. (A) Макроскопическое наблюдение места имплантации на оценке 3-й день. Печень, имплантированная (заполненная звезда) CMS (пунктирная линия), не изменилась ни по цвету, ни по размеру. Толая кишка (пустая звезда) и остальные брюшные структуры не показали никаких изменений. (B) Образец печени (заполненная звезда) и CMS (белая стрелка), покрытая сальниным жиром (красная стрелка). Аббревиатура: CMS = каркас коллагеновой матрицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:День 14 оценки. (A) Макроскопическое наблюдение места имплантации на 14-й день оценки. Ткань печени (заполненная звезда) с CMS не изменилась ни по цвету, ни по размеру. Толая кишка (пустая звезда) и остальные структуры и органы брюшной полости не показали никаких изменений. Образец печени с имплантированной CMS:(B)передний вид; (C)задний/висцеральный вид. Сальменный жир (красная стрелка), покрывающий область. CMS была интегрирована в ткань печени. Сальменный жир (красная стрелка) в основном покрывает область в переднем виде. Пунктирная линия указывает на место имплантации CMS; швы (синяя нить). Аббревиатура: CMS = каркас коллагеновой матрицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:День 21 оценки. (A) Макроскопическое наблюдение места имплантации на 21-й день оценки. Печень реципиента (заполненная звезда), имплантированная с ПОМОЩЬЮ CMS (пунктирная линия), не меняла цвет или размер. Толая кишка (пустая звезда) и остальные брюшные структуры не показали никаких изменений. (B) Образец печени с имплантированной CMS (пунктирная линия), показывающий изменения в размерах и форме. Аббревиатура: CMS = каркас коллагеновой матрицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7:Гистология печени и печени с КМВ. (A) Нормальная печень (SHAM), показывающая характерную тканевую архитектуру. (B) День 3 имплантации CMS, показывающий слабую соединительную ткань в трабекулах CMS (пунктирные овалы). (C) Переходная зона между нативной печенью (правая сторона) и CMS (левая сторона), с трабекулами CMS (стрелка). (D) Нативная печень в контакте с CMS (пунктирные линии) на 21-й день. (E) Нормальная печень с трихромным окрашиванием Массона. (F)CMS, имплантированная в печень; инвазия в слабую соединительную ткань на 3 день (пунктирный овал). На14-й день нативная печень с трабекулами CMS, показывающая область гепатоцитов (заполненная звезда) вне нативной печени, указывая на то, что нативные гепатоциты мигрировали через CMS. На21-й день нативные гепатоциты мигрировали в сторону CMS (стрелка). A и E: Шкала стержней = 200 мкм: 4x, B-D и F-H: Шкала стержней = 100 мкм: 10x. A-D: окрашивание H&E; E-H: трихромное окрашивание Массона. Сокращения: CMS = каркас коллагеновой матрицы; H&E = гематоксилин и эозин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8:Гистология печени и CMS. (A)Пул гепатоцитов (белая стрелка), присутствующих в трабекулах CMS (черная стрелка). Гепатоциты орошаются сосудом (заполненной звездой). (B)Гепатоциты (белая стрелка) мигрировали и прилипли к трабекулам CMS (черная стрелка). (C) Группа гепатоцитов (пунктирный круг) наблюдается между двумя трабекулами (черными стрелками) CMS. (D)Гепатоциты прилипли к трабекулам (черным стрелкам) CMS в присутствии слабеющей соединительной ткани (пунктирного овала). A и C: Шкала стержней = 100 мкм: 10x. B и D: Шкала стержней = 20 мкм: 40x. Аббревиатура: CMS = каркас коллагеновой матрицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Дни недели | ПРИТВОРСТВО | Гепатэктомия | Имплантация CMS | |
| АЛБ (г/дл) | 3 | 1.4±0 | 1.25±0.07 | 1.4±0 |
| 14 | 1.3±0.5 | 1.85±0.07 | 1.8±0.14 | |
| 21 | 1.3±05 | 1.6±0.1 | 1.7± 0 | |
| ALT (МЕ/Л) | 3 | 73±1,4 | 3,5±0,7 | 54.6±6.4 |
| 14 | 84±0 | 59,5±4,9 9 г. | 57±4,2 | |
| 21 | 57±0 | 73,5±14,8 8 г. | 73,5±14,8 8 г. | |
| АСТ (МЕ/Л) | 3 | 106±1,4 г. | 80±6,6 6 г. | 90±1,4 |
| 14 | 127±5,5 5 м. | 94±21,2 | 83,5±17,6 | |
| 21 | 123,7±27,3 | 92,5±24,7 | 101±31,1 г. | |
| ТБ (мг/дл) | 3 | 0.33±0.05 | 0.25±0.07 | 0,3±0 |
| 14 | 0,5±0 | 0,2±0 | 0.15±0 | |
| 21 | 0,3±0 | 0,4±0 | 0.4±0.14 | |
| БД (мг/дл) | 3 | 0,1±0 | 0.05±0.07 | 0,1±0 |
| 14 | 0,1±0 | 0,1±0 | 0,1±0 | |
| 21 | 0,1±0 | 0,1±0 | 0,1±0 |
Таблица 1: Функция печени. Тесты функции печени проводились для фиктивных и экспериментальных групп с CMS и без нее через 3, 14 и 21 день. Сокращения: CMS = каркас коллагеновой матрицы; ALB = Альбумин; ALP = щелочная фосфатаза; АЛТ = аланинаминотрансфераза; АСТ = аспартатаминотрансфераза; TB = Общий билирубин; DB = Прямой билирубин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Трансплантация органов является основой лечения у пациентов с фиброзом печени или циррозом печени. Несколько пациентов получают пользу от этой процедуры, что делает необходимым предоставление терапевтических альтернатив для пациентов, ожидающих. Тканевая инженерия является перспективной стратегией, в которой используются каркасы и клетки с регенеративным потенциалом2,4,13. Удаление части печени является критическим шагом в этой процедуре из-за обильного кровотечения этого васкуляризированного органа. Поэтому гемостаз хирургической кровати необходимо проводить, чтобы предотвратить это осложнение. Кроме того, связывание ткани печени с CMS, что необходимо для обеспечения взаимодействия тканей и биоматериала, облегчается за счет использования швов. Тем не менее, это должно быть сделано осторожно, чтобы избежать разрыва печени и последующего кровотечения.
Хотя биоматериал, предложенный в настоящем описании, имеет бычий по происхождению (ксеногенный), нет данных о реакции биоматериала у крыс, что делает возможной селективную гепатэктомию. Напротив, было показано, что модель гепатэктомии 2/3 вызывает смерть животных из-за удаления большого количества ткани печени14. Кроме того, мы разработали металлический шаблон из нержавеющей стали, потому что у нас были трудности со стандартизацией размера в гепатэктомии и CMS. Стерилизация CMS была сложной задачей, потому что существующие методы модифицировали структуру коллагена и его биохимические свойства. Следовательно, стерилизация теплом, гамма-излучением и окисью этилена была исследована в качестве методов стерилизации, прежде чем определить, что плазма перекиси водорода является оптимальным методом13.
Важно определить максимальный размер CMS, который может быть имплантирован в печень, и оценить биологический ответ на системном уровне. Кроме того, необходимо оптимизировать и исследовать эффективность этого метода у более крупных видов животных. Кроме того, важно исследовать эффекты имплантации CMS в печени в течение более длительного периода (>30 дней), что позволит оценить степень биосорбции CMS и регенерацию печеночной ткани. Кроме того, эффекты имплантации CMS должны быть изучены на животных моделях с повреждением печени. Этот метод имплантации открыл дверь для стратегий, исследующих восстановление формы и объема резецированной ткани, тем самым уменьшая анестезию, продолжительность операции и время восстановления4,13.
CMS была получена из природного источника и сохранила свои физические и химические свойства по сравнению с синтетическими биоматериалами, изготовленными с использованием сложных методологий, таких как биопечать или электроспиннинг, которые не являются биосовместимыми или биоабсорбируемыми2,3. Основным компонентом этой CMS является коллаген типа I, который является основным белком ECM, который обеспечивает адгезию и пролиферацию клеток22. Кроме того, трабекулы пор CMS обеспечивают миграцию клеток и непрерывный поток факторов роста, крови и других медиаторов процесса регенерации. В соответствии с тканью, которая должна быть восстановлена, эта исследовательская группа имеет опыт проектирования CMS в разных формах, сохраняя ее 3D-структуру. Например, цилиндрические CMS были имплантированы в уретру собаки и желчные протоки у свиней и дали многообещающие результаты в регенерации тканей23,24.
Имплантация этой CMS может быть альтернативным методом лечения для стимуляции регенерации тканей и восстановления баланса фиброгенеза-фибролиза при циррозе печени из-за различных этиологий (например, вирус, алкоголь, метаболические факторы). Анализы пролиферации, миграции и воспаления должны быть выполнены для выявления молекулярных и клеточных механизмов, запускаемых CMS. В заключение в данной работе описана воспроизводимая процедура гепатэктомии, а также исследование процесса регенерации посредством ксеноимплантации биоматериалов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов. Бенхалин Леон-Мансилья является докторантом Программы докторантуры биомедицины Национального университета Мексики (УНАМ), и он получил стипендию DGAPA-UNAM.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить персонал Лаборатории животных Отделения экспериментальной медицины, медсестру Каролину Баньос Г. за техническую и хирургическую поддержку, Марко Э. Гудиньо З. за поддержку в микрофотографии и Эрика Апо за поддержку в гистологии печени. Национальный совет поддержал это исследование в области науки и техники(CONACyT),номер гранта SALUD-2016-272579 и PAPIIT-UNAM TA200515.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anionic detergent | Alconox | Z273228 | |
| Biopsy cassettes | Leica | 3802453 | |
| Camera DMX | Nikon | DXM1200F | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | BD | 372412 | |
| Cover glasses 25 mm x 40 mm | Corning | 2980-224 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 200-M | CAS 17372-87-1 |
| Ethyl alcohol, pure | Sigma-Aldrich | 459836 | CAS 64-17-5 |
| Flunixine meglumide | MSD | Q-0273-035 | |
| Glass slides 75 mm x 25 mm | Corning | 101081022 | |
| Hematoxylin | Merck | H9627 | CAS 571-28-2 |
| Hydrochloric acid 37% | Merck | 339253 | CAS 7647-01-0 |
| Ketamine | Pisa agropecuaria | Q-7833-028 | |
| Light microscope | Nikon | Microphoto-FXA | |
| Microsurgery stereomicroscope | Zeiss | OPMI F170 | |
| Microtainer yellow cape | Beckton Dickinson | 365967 | |
| Microtome | Leica | RM2125 | |
| Model animal: Wistar rats | Universidad Nacional Autónoma de México | ||
| Nylon 3-0 (Dermalon) | Covidien | 1750-41 | |
| Polypropylene 7-0 | Atramat | SE867/2-60 | |
| Povidone-iodine10% cutaneous solution | Diafra SA de CV | 1.37E+86 | |
| Scanning electronic microscope | Zeiss | DSM-950 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J. T. Baker | 3722-01 | CAS 1310-73-2 |
| Software ACT-1 | Nikon | Ver 2.70 | |
| Stereomicroscope | Leica | EZ4Stereo 8X-35X | |
| Sterrad 100S | Johnson and Johnson | 99970 | |
| Surgipath paraplast | Leica | 39601006 | |
| Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm) | SensiMedical | LAN-078-077 | |
| Tissue Processor (Histokinette) | Leica | TP1020 | |
| Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder) | Sakura Finetek USA | 5229 | |
| Trichrome stain kit | Sigma-Aldrich | HT15 | |
| Unicell DxC600 Analyzer | Beckman Coulter | BC 200-10 | |
| Xylazine | Pisa agropecuaria | Q-7833-099 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | CAS 1330-20-7 |
References
- Li, N., Hua, J.
- Langer, R., Vacanti, J.
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Shafiee, A., Atla, A. Tissue engineering: Toward a new era of medicine. Annual Review of Medicine. 68, 29-40 (2017).
- Hu, C., Zhao, L., Wu, Z., Li, L. Transplantation of mesenchymal stem cells and their derivatives effectively promotes liver regeneration to attenuate acetaminophen-induced liver injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 88 (2020).
- Sancho-Bru, P. Therapeutic possibilities of stem cells in the treatment of liver diseases. Gastroenterologia y Hepatologia. 34 (10), 701-710 (2011).
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Freedman, B. R., Mooney, D. J. Biomaterials to mimic and heal connective tissues. Advanced Materials. 31 (19), 1806695 (2019).
- Meyer, M. Processing of collagen based biomaterials and the resulting materials properties. Biomedical Engineering Online. 18 (1), 24 (2019).
- El Baz, H., et al. Transplant of hepatocytes, undifferentiated mesenchymal stem cells, and in vitro hepatocyte-differentiated mesenchymal stem cells in a chronic lver failure experimental model: a comparative study. Experimental and Clinical Transplantation. 16 (1), 81-89 (2018).
- Nedjari, S., Awaja, F., Guarino, R., Gugutkov, D., Altankov, G. Establishing multiple osteogenic differentiation pathways of mesenchymal stem cells through different scaffold configurations. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (10), 1428-1437 (2020).
- Chan, E. C., et al. Three dimensional collagen scaffold promotes intrinsic vascularisation for tissue engineering applications. PLoS One. 11 (2), 0149799 (2016).
- Arenas-Herrera, J. E., Ko, I. K., Atala, A., Yoo, J. J. Decellularization for whole organ bioengineering. Biomedical Materials. 8 (1), 014106 (2013).
- Parmaksiz, M., Dogan, A., Odabas, S., Elçin, A. E., Elçin, Y. M. Clinical applications of decellularized extracellular matrices for tissue engineering and regenerative medicine. Biomedical Materials. 11 (2), 022003 (2016).
- Gacek, G.
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
- The University of Texas at Austin Institutional Animal Care and Use Committee. Guidelines for the Use of Chemical Depilatory Agents on Laboratory Animals. , https://research.utexas.edu (2021).
- Sivridis, L., Kotini, A., Anninos, P. The process of learning in neural net models with Poisson and Gauss connectivities. Neural Networks. 21 (1), 28-35 (2008).
- León-Mancilla, B. H., Araiza-Téllez, M. A., Flores-Flores, J. O., Piña-Barba, M. C. Physico-chemical characterization of collagen scaffolds for tissue engineering. Journal of Applied Research and Technology. 14 (1), 77-85 (2016).
- León, A., et al. Hematological and biochemical parameters in Sprague Dawley laboratory rats breed in CENPALAB, Cenp:SPRD. Revista Electronica de Veterinaria. 12, 1-10 (2011).
- Tsuchiya, A., et al. Mesenchymal stem cell therapies for liver cirrhosis: MSCs as "conducting cells" for improvement of liver fibrosis and regeneration. Inflammation and Regeneration. 39, 18 (2019).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
- Acevedo, G. C. Xenoimplante de colágena en uretra de perro. Universidad Nacional Autónoma de México. , Specialty of Urology thesis (2011).
- Montalvo-Jave, E. E., et al. Absorbable bioprosthesis for the treatment of bile duct injury in an experimental model. International Journal of Surgery. 20, 163-169 (2015).
