Summary
लिवर की बीमारियां कई कारणों से प्रेरित होती हैं जो फाइब्रोसिस या सिरोसिस को बढ़ावा देती हैं। स्वास्थ्य ठीक करने के लिए प्रत्यारोपण ही एकमात्र विकल्प है। हालांकि, प्रत्यारोपण योग्य अंगों की कमी को देखते हुए, विकल्प ों का पता लगाया जाना चाहिए । हमारे शोध एक पशु मॉडल से जिगर के ऊतकों में कोलेजन मचान के प्रत्यारोपण का प्रस्ताव है ।
Abstract
दुनिया भर में लिवर की बीमारियां मौत का प्रमुख कारण हैं। अत्यधिक शराब की खपत, एक उच्च वसा वाले आहार, और हेपेटाइटिस सी वायरस संक्रमण फाइब्रोसिस, सिरोसिस, और/या हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा को बढ़ावा देते हैं । लिवर प्रत्यारोपण उन्नत रोग चरणों में रोगियों के जीवन काल में सुधार और विस्तार करने के लिए चिकित्सकीय अनुशंसित प्रक्रिया है। हालांकि, प्रत्यारोपण के केवल 10% सफल रहे हैं, अंग की उपलब्धता, presurgical और पोस्टर्जिकल प्रक्रियाओं के साथ, और ऊंचा लागत सीधे उस परिणाम के साथ सहसंबद्ध । ऊतक बहाली के लिए एक विकल्प के रूप में अतिरिक्त सेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) मचान उभरे हैं। जैव अनुकूलता और भ्रष्टाचार स्वीकृति उन बायोमैटेरियल्स की मुख्य लाभकारी विशेषताएं हैं। यद्यपि यकृत के आकार और सही कार्य को बहाल करने की क्षमता का मूल्यांकन यकृत हेपेटेक्टॉमी मॉडल में किया गया है, लेकिन एक्सटिरेटेड यकृत द्रव्यमान की मात्रा को बदलने के लिए मचान या किसी प्रकार के समर्थन का उपयोग मूल्यांकन नहीं किया गया है।
एक चूहे के जिगर में एक गोजातीय कोंडील से कोलेजन मैट्रिक्स पाड़ (सीएमएस) के ज़ेनोइम्प्लांटेशन के साथ आंशिक हेपेटेक्टोमी किया गया था। बाएं जिगर पालि ऊतक हटा दिया गया था (लगभग ४०%), और सीएमएस का एक समान अनुपात शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपित किया गया था । सर्जिकल प्रक्रिया से पहले और बाद में लिवर फंक्शन परीक्षणों का मूल्यांकन किया गया था। 3, 14 और 21 दिनों के बाद, जानवरों को इच्छामृत्यु दी गई, और स्थूल और हिस्टोलॉजिक मूल्यांकन किए गए। 3 और 14 दिनों में, सीएमएस के आसपास आदिपोज ऊतक देखा गया था, जिसमें अस्वीकृति या संक्रमण का कोई नैदानिक सबूत नहीं था, जैसा कि 21 दिन में पोत नियोफॉर्मेशन और सीएमएस पुनर्अभवितरण था। हेमटॉक्सीलिन और ियोसिन (एच एंड ई) और मैसन के ट्राइक्रोम स्टेनिंग के साथ मनाया गया, सीएमएस में एक तुच्छ सूजन प्रक्रिया और आसन्न कोशिकाओं के प्रवास का हिस्टोलॉजिक सबूत था। सीएमएस जिगर के ऊतकों में अच्छा प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया था और ऊतक उत्थान और पुरानी जिगर की बीमारियों में मरंमत का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी विकल्प हो सकता है ।
Introduction
लिवर होरोस्टेसिस और प्रोटीन उत्पादन को बनाए रखने में शामिल सबसे महत्वपूर्ण अंगों में से एक है1. दुर्भाग्य से, जिगर की बीमारी दुनिया भर में मौत का प्रमुख कारण है। यकृत क्षति के उन्नत चरणों में, जिसमें सिरोसिस और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा शामिल हैं, यकृत प्रत्यारोपण चिकित्सकीय रूप से अनुशंसित प्रक्रिया है। हालांकि, दानदाताओं की कमी और सफल प्रत्यारोपण की कम दर के कारण, ऊतक इंजीनियरिंग (टीई) और पुनर्योजी चिकित्सा (आरएम) में नई तकनीकोंको 2,3विकसित किया गया है।
टीई में सूजन, फाइब्रोटिक, और एडेमेटस अंगों और ऊतकों की बहाली को बढ़ावा देने के लिए स्टेम सेल, मचान और विकास कारकों4 का उपयोग शामिल है1,5,6। मचान में उपयोग किए जाने वाले बायोमैटेरियल्स देशी ईसीएम की नकल करते हैं, जो निर्देशित सेलुलर रिमॉडलिंग7के लिए भौतिक, रासायनिक और जैविक संकेत प्रदान करते हैं। कोलेजन डर्मिस, टेंडन, आंत और पेरिकार्डियम8, 9से प्राप्त सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीनमेंसे एक है। इसके अलावा, बायोप्रिंटिंग या इलेक्ट्रोस्पिनिंग10, 11के माध्यम से दो और त्रि-आयामी मचानों का उत्पादन करने के लिए कोलेजन को बायोपॉलिमर के रूप में प्राप्त किया जासकताहै। यह समूह जिगर के ऊतकों के उत्थान के लिए हड्डी के स्रोत से कोलेजन के उपयोग की रिपोर्ट करने वाला पहला समूह है। एक अन्य अध्ययन में गोजातीय कोलेजन से संश्लेषित मचानों के उपयोग की रिपोर्ट की गई है, जो त्वचा से प्राप्त किया गया था, सजातीय और बारीकी से स्थित छिद्रों के साथ, उनके बीच किसी भी संचार के बिना12।
डिसेलुलराइजेशन देशी ईसीएम को संरक्षित करता है, जिससे स्टेम सेल क्षमता13,14के साथ कोशिकाओं के बाद के समावेश की अनुमति होती है। हालांकि, यह प्रक्रिया अभी भी चूहों, चूहों, खरगोशों, सूअरों, भेड़, मवेशियों और घोड़ों3,14से यकृत, हृदय, गुर्दे, छोटी आंत और मूत्राशय में प्रायोगिक चरण में है। वर्तमान में, पुनः प्राप्त जिगर द्रव्यमान की मात्रा को किसी भी पशु हेपेटेक्टॉमी मॉडल में प्रतिस्थापित नहीं किया जाता है। हालांकि, अतिरिक्त सहायता या नेटवर्क (बायोमैटेरियल्स) का उपयोग जो सेल प्रसार और एंजियोजेनेसिस को सक्षम बनाता है, यकृत पैरान्चिमल कार्यों की त्वरित बहाली के लिए आवश्यक हो सकता है। इस प्रकार, मचानों को पुराने यकृत रोगों में ऊतकों को पुनर्जीवित करने या मरम्मत करने के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में नियोजित किया जा सकता है, बदले में, दान और यकृत प्रत्यारोपण की नैदानिक जटिलताओं के कारण सीमाओं को नष्ट करना।
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Protocol
वर्तमान शोध को यूनीवर्सिड नैसिनल ऑटोनोमा डी मक्सीको (यूएनएएम) और अस्पताल जनरल डी मैक्सिको (सीआई/314/15) की आचार समिति (डीआई/115/2015) की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था । संस्था प्रयोगशाला जानवरों के उत्पादन, देखभाल और उपयोग के लिए सभी तकनीकी विनिर्देशों को पूरा करती है और कानूनी रूप से राष्ट्रीय कानून (एनओएम-062-चिड़ियाघर-1999) द्वारा प्रमाणित है। इस अध्ययन के लिए 150-250 ग्राम (6-8 सप्ताह पुराना) वजनी नर विस्टार चूहों को स्कूल ऑफ मेडिसिन, यूएनएएम की प्रयोगशाला पशु सुविधा से प्राप्त किया गया था।
1. गोजातीय फीमर से कोलेजन मैट्रिक्स मचान प्राप्त करना
- मेक्सिको के स्वास्थ्य और कृषि अधिकारियों द्वारा प्रमाणित एक कसाईघर से गोजातीय फीमर से condyle प्राप्त करें।
- एक शल्य चिकित्सा उपकरण के साथ कोंडील वसा, मांसपेशी और उपास्थि को सावधानी से विच्छेदन करें। एक आरी कटर का उपयोग करके 3 सेमी x3 सेमी टुकड़ों में कोंडील के टुकड़ों को काटें और वसा और रक्त को तौलिया से साफ करें। कोंडील के टुकड़ों को पानी से धो लें।
- 30 मिनट के लिए एक एनियोनिक डिटर्जेंट (10 ग्राम/एल) के 1 एल के साथ टुकड़ों को उबालें (92 डिग्री सेल्सियस) । एनियोनिक डिटर्जेंट के किसी भी अवशेष को हटाने के लिए कोंडील के टुकड़ों को दो बार धोएं।
- फिल्टर पेपर (0.5 मिमी) का उपयोग करके 3 घंटे के लिए कोंडील के टुकड़ों को सुखा लें।
- चरण 1.1 (चित्रा 1 ए) में उल्लिखित टुकड़ों से मोटाई 0.5 सेमी के त्रिकोणीय(1सेमी x1 सेमी x1 सेमी) सीएमएस तैयार करें।
- लगातार आंदोलन के साथ 10 मिनट के लिए 0.5 एम एचसीएल के 100 एमएल में टुकड़ों को डिमिनेरलाइज करें। एचसीएल को हटा दें।
नोट: सोडियम हाइड्रोक्साइड (10 एम) के साथ एचसीएल को बेअसर करें। - लगातार आंदोलन के साथ, हर बार 15 मिनट, आसुत पानी के 100 मिलील के साथ तीन बार टुकड़ों को कुल्ला। 1 घंटे के लिए फिल्टर पेपर (0.5 मिमी) के साथ सीएमएस को सुखा लें।
- सीएमएस (छिद्रों का आकार, ताकना गठन, और छिद्रपूर्ण इंटरकनेक्शन)(चित्रा 1 बी) के संरचनात्मक गुणों का विश्लेषण करने के लिए स्टीरियो-माइक्रोस्कोप15 काउपयोग करें।
- सीएमएस ट्रैबेकुला(चित्रा 1C)की किसी न किसी सतह का विश्लेषण करने के लिए स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप16 का उपयोग करें।
- सीएमएस(चित्रा 1डी)के यांत्रिक परिवर्तनों (प्लास्टिसिटी और लचीलेपन) का मूल्यांकन करने के लिए सम्मिश्रण और खींचने के लिए विच्छेदन उपकरण का उपयोग करें।
- सीएमएस को नसबंदी थैली में पैक करें और इसे 38 मिनट के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड प्लाज्मा के साथ स्टरलाइज करें। उपयोग होने तक 20-25 डिग्री सेल्सियस पर एक शुष्क क्षेत्र में मूल पैक में बाँझ सीएमएस स्टोर करें।
- लगातार आंदोलन के साथ 10 मिनट के लिए 0.5 एम एचसीएल के 100 एमएल में टुकड़ों को डिमिनेरलाइज करें। एचसीएल को हटा दें।
2. सर्जिकल क्षेत्र की तैयारी और पशु मॉडल की हैंडलिंग और तैयारी
- सर्जिकल क्षेत्र, वर्कटेबल, माइक्रोसर्जरी माइक्रोस्कोप, और 2% क्लोरहेक्सिडीन समाधान के साथ सीट को साफ करें। गर्मी नसबंदी के माध्यम से सभी सर्जिकल उपकरणों, सर्जिकल स्पंज, झाड़ू, और डिस्पोजेबल सर्जिकल कपड़ा बंध्याकरण (121 डिग्री सेल्सियस/30 मिनट/100 kPa)
- चूहों (n=5) को प्रति समूह पांच चूहों के तीन समूहों में असाइन करें: 1. दिखावा, 2. हेपेटेक्टॉमी, और 3. हेपेटेक्टॉमी प्लस सीएमएस, और 3, 14 और 21 दिनों के दिनों में सभी समूहों का पालन करें।
- केटामाइन (35 मिलीग्राम/किलो) और जाइलाज़ीन (2.5 मिलीग्राम/किलो) को हिंद अंग में इंट्रामस्कुलर रूप से प्रशासित करें।
नोट: शामक अवधि आम तौर पर 30-40 मिनट के लिए रहता है । - सर्जिकल साबुन और एक दोधारी ब्लेड का उपयोग करके पेट की त्वचा (5 सेमी x 2 सेमी) को शेव करें, और तीन राउंड17में सामयिक 10% पोविडोन-आयोडीन समाधान का उपयोग करके त्वचा को कीटाणुरहित करें।
- एक पारमी वायुमार्ग(चित्रा 2)को बनाए रखने के लिए गर्दन हाइपरएक्सटेंडेड गर्दन के साथ, डेकुबिटस पृष्ठीय स्थिति में एक गर्म प्लेट पर जानवर रखें।
- श्वसन पैटर्न और अंगों में निकासी पलटा की हानि के माध्यम से संज्ञाहरण की गहराई का मूल्यांकन करें।
- मुंडा त्वचा के चारों ओर एक डिस्पोजेबल सर्जिकल कपड़ा रखें और एक संदर्भ बिंदु के रूप में xiphoid प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, एक स्केलपेल के साथ एल्बस लाइन पर एक चीरा (2.5 सेमी) बनाते हैं। रक्तस्राव को रोकने के लिए पेट की दीवार रक्त वाहिका से बचें।
- पेट के पीछे हटने वाले को जगह-जगह लगाएं और पेट की गुहा का पालन करें। विच्छेदन संदंश का उपयोग करके, बाएं यकृत पालि को निकालें और इसे धातु की प्लेट(चित्रा 3A)पर रखें।
नोट: नकली समूह में, केवल बाएं जिगर पालि निकालने और फिर पेट गुहा को जिगर वापस । सीवन पेट की दीवार और त्वचा को 3-0 नायलॉन सीवन के साथ। - सीएमएस के साथ और उसके बिना प्रयोगात्मक समूहों में, दो कटौती के साथ हेपेटेक्टॉमी (लगभग 40%) प्रदर्शन करने के लिए स्केलपेल ब्लेड और बाँझ स्केलपेल ब्लेड (# 15) का उपयोग करें। हेपेटेक्टोमी(चित्रा 3 B)प्रदर्शन करने के लिए त्रिकोणीय धातु टेम्पलेट (1 सेमी x 1 सेमी x 1 सेमी) का उपयोग करें।
- जिगर के रक्तस्राव को रोकने के लिए, 5 मिनट के लिए जिगर के किनारे पर एक झाड़ू के साथ सर्जिकल संपीड़न बनाए रखें।
- सर्जिकल प्रक्रिया से पहले 20 मिनट के लिए बाँझ खारा समाधान में सीएमएस हाइड्रेट। बायोमैटेरियल के विस्थापन को रोकने के लिए लिवर टिश्यू और सीएमएस के बीच चार टांके टांके के साथ हेपेटेक्टॉमी साइट में सीएमएस को प्रत्यारोपित करें। 7-0 गैर-अवशोषित पॉलीप्रोपाइलीन टांके(चित्रा 3 सी) काउपयोग करें।
नोट: एक दूसरी सर्जरी में टांके को न हटाएं; टांके सीएमएस प्रत्यारोपण की साइट की पहचान करने के लिए एक संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। - पेट की गुहा को जिगर लौटाएं और 3-0 नायलॉन सीवन के साथ पेट की दीवार और त्वचा को सीवन करें। सर्जिकल आयोडीन से लथपथ स्पंज से सर्जिकल चीरा को दो राउंड में साफ करें। जानवरों के महत्वपूर्ण संकेतों का निरीक्षण और निगरानी करें।
- केटामाइन (35 मिलीग्राम/किलो) और जाइलाज़ीन (2.5 मिलीग्राम/किलो) को हिंद अंग में इंट्रामस्कुलर रूप से प्रशासित करें।
3. पश्चात देखभाल
- हिंद अंग में मेग्लुमीन फ्लूनिक्स (2.5 मिलीग्राम/किलो) को इंट्रामस्क्युलर रूप से प्रशासित करें। संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित एनाल्जेसिक का प्रशासन करें।
- संज्ञाहरण वसूली के लिए, जानवरों को तापमान नियंत्रण (23 डिग्री सेल्सियस) के साथ शोर मुक्त क्षेत्र में प्रयोगशाला पशु बिस्तर के साथ व्यक्तिगत पॉली कार्बोनेट बक्से में रखें।
- जानवरों की वसूली का निरीक्षण करें और 2 घंटे के लिए उनके पानी और भोजन की खपत की निगरानी करें। संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित के रूप में ऑपरेटिव पोस्ट जानवरों की निगरानी करें ।
4. सीरम में जिगर समारोह का मूल्यांकन
- सर्जिकल प्रक्रिया (आधारभूत मूल्यों) से पहले और मूल्यांकन के दिनों में 3, 14, और 21 से पहले एनेस्थेटाइज्ड जानवरों की पार्श्व पूंछ नसों से रक्त के नमूने (500 μL) एकत्र करें।
- कमरे के तापमान (23 डिग्री सेल्सियस) पर 850 × ग्राम/10 मिनट पर रक्त के नमूनों को अपकेंद्रित्र करें; सीरम को अलग करें और उपयोग होने तक इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- जिगर समारोह परीक्षणों का एक पैनल प्रदर्शन: सीरम एल्बुमिन (ALB), क्षारीय फॉस्फेट (एएलपी), एलेनिन अमीनोट्रांसफरेज (एएलटी), एस्पार्टेट अमीनोट्रांसफरेज (एएसटी), कुल बिलिरुबिन (टीबी), और प्रत्यक्ष बिलिरुबिन (डीबी)(तालिका 1)।
5. इच्छामृत्यु और ऊतक प्रबंधन
- ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करके प्रत्येक मूल्यांकन (दिन 3, 14 और 21) के लिए जानवरों को एनेस्थेटाइज करें।
- तरीकों के माध्यम से इच्छामृत्यु संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदन ।
- पेट की गुहा के अंगों का निरीक्षण करने और सीएमएस के साथ और बिना नकली और प्रयोगात्मक समूहों के हेपेटेक्टॉमी क्षेत्र की तस्वीरें लेने के लिए एक स्केलपेल के साथ एल्बस लाइन पर एक चीरा (5-6 सेमी) करें।
- सभी अध्ययन समूह जानवरों से यकृत के नमूने (2 सेमी x 2 सेमी; 0.40-0.45 ग्राम) लें और बाद में हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए उन्हें 24 घंटे के लिए 4% फॉर्मलडिहाइड समाधान में रखें।
6. हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण
- 4% फॉर्मलडिहाइड में यकृत ऊतकों को संरक्षित करें और अल्कोहल सांद्रता (60%, 70%, 80%, 90%, 100%) की एक श्रृंखला का उपयोग करके ऊतक को निर्जलित करें; उन्हें जाइलीन (1h) में रखें और पैराफिन16में उन्हें एम्बेडेड ।
- आठ स्लाइड की तैयारी के लिए एक माइक्रोटॉम के साथ पैराफिन ब्लॉक को 4 माइक्रोम-मोटी वर्गों में काट लें।
- एचएंडई और मैसन के ट्राइक्रोम स्टेनिंग16को परफॉर्म करें ।
- सीएमएस के साथ और बिना जिगर के प्रतिनिधि क्षेत्रों का चयन करने के लिए एक हल्के माइक्रोस्कोप के तहत दाग वर्गों का निरीक्षण करें। 4x, 10x, और 40x आवर्धन पर फोटोमाइक्रोग्राफ प्राप्त करें और उपयुक्तसॉफ्टवेयर 18 का उपयोग करके छवियों को संसाधित करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
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Representative Results
बोन डिमिनेरलाइजेशन अपने छिद्रों के मूल आकार या इंटरकनेक्शन को बदले बिना सीएमएस के यांत्रिक गुणों को प्रभावित करताहै । सीएमएस किसी भी आकार हो सकता है, और इसलिए, आकार और चयनित अंग या ऊतक19के आकार के लिए समायोजित किया जा सकता है । वर्तमान प्रोटोकॉल में, हमने एक त्रिकोणीय सीएमएस(चित्रा 1A-D)का उपयोग किया। लिवर में सीएमएस ज़ेनोइम्प्लांट की पुनर्योजी क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एक चूहा मॉडल का उपयोग किया गया था। हालांकि जिगर एक तपस्वी और नरम अंग है, इस प्रोटोकॉल में की गई सर्जिकल प्रक्रिया ने यह सुनिश्चित किया कि सीएमएस जगह में रहे(चित्रा 2 और चित्रा 3A-सी)। बाएं पालि के 40% के आंशिक हेपेटेक्टॉमी ने अंग के एक हिस्से का आकलन किया, बाकी लिवर को बरकरार रखते हुए, ताकि इंप्लांट और देशी परेन्चिमा में बदलाव की तुलना की जा सके। इसके अतिरिक्त, हमने सीएमएस प्रत्यारोपण से पहले और बाद में यकृत समारोह का मूल्यांकन करने के लिए रक्त के नमूने प्राप्त किए।
नकली समूह और 3 और 14 दिनों में सीएमएस प्रत्यारोपण के बिना और बिना प्रायोगिक समूह के बीच जैव रासायनिक मापदंडों की आधारभूत सांद्रता में कोई अंतर नहीं था; वे संदर्भ मूल्यों के भीतर रहे(ALB:0.43-2.41 g/dL; एएलपी:134-357.3 U/L; ALT:41-83.1 UI/L; AST:61.4-276.2 UI/L; टीबी:0.01-0.43 मिलीग्राम/डीएल; डीबी:0.1 मिलीग्राम/डीएल)20। इसके अलावा, 21 दिनों में नकली समूह और प्रायोगिक समूहों के बीच एल्बुमिन, एएलपी, एएलटी, ओएसटी, टीबी और डीबी स्तर में कोई अंतर नहीं था, यह दर्शाता है कि सीएमएस यकृत समारोह(तालिका 1)को बाधित नहीं करता है।
इच्छामृत्यु के दौरान, अन्वेषणात्मक लेप्रोटॉमी ने जिगर के विशिष्ट रंग और सही आकार और आकार का खुलासा किया। किसी भी मामले में प्रत्यारोपण स्थल पर कोई सूजन या संक्रमण नहीं देखा गया। 3 दिन, पेट गुहा(चित्रा 4A)के संबंध में अंग में कोई परिवर्तन नहीं थे । एक हिस्से में जिसमें यकृत ऊतक और सीएमएस थे, रक्त को सीएमएस में घुसपैठ करते हुए देखा गया था, जिसमें प्रारंभिक अनुयायी ओमेंटल फैट(चित्रा 4B)था। 14 दिन, वसा की मात्रा में वृद्धि हुई; रक्त वाहिका नियोफॉर्मेशन और सीएमएस का प्राप्तकर्ता यकृत ऊतक में एकीकरण था लेकिन पेट की गुहा(चित्र 5 ए)की छोटी आंत या अंगों में कोई परिवर्तन नहीं हुआ। ओमेंटल फैट पूर्वकाल क्षेत्र(चित्रा 5B)में सीएमएस प्रत्यारोपण स्थल में आंत क्षेत्र(चित्रा 5C)की तुलना में अधिक था। मूल्यांकन दिवस 21 पर, जिगर में सीएमएस निगमन अधिक स्पष्ट था(चित्रा 6A)। ओमेंटल फैट में वृद्धि का उपयोग पुनर्जनन की प्रगति के संकेतक के रूप में किया जा सकता है, क्योंकि यह मेसेंचिमल स्टेम सेल21का स्रोत है। इसके अलावा, 21 दिनों में, जिगर ने घने क्षेत्रों को प्रस्तुत किया जो गिरावट और अवशोषण से मेल खाते थे, आकार और मूल आकार(चित्रा 6B) को बदलते थे।
सीएमएस प्रत्यारोपण के साथ जिगर की सूक्ष्म संरचना का विश्लेषण करने के लिए, हम प्रत्यारोपण साइट है, जो सही जिगर पालि (नियंत्रण) से ऊतक के साथ तुलना की गई थी से ऊतक के एक प्रतिनिधि टुकड़ा के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण प्रदर्शन किया । 3, 14 और 21 दिनों में किए गए बायोप्सी को संसाधित किया गया और एचएंडई और मैसन के ट्राइक्रोम धुंधला के अधीन किया गया । 21 दिन(चित्रा 7A और चित्रा 7E) में नकली समूह में जिगर परेन्चिमा की सामान्य संरचना देखी गईथी। 3 दिन, हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण से पता चला है कि जिगर में सीएमएस की उपस्थिति एक विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया को बढ़ावा नहीं दिया, और ढीला संयोजी ऊतक की विशिष्ट उपस्थिति(चित्रा 7B और चित्रा 7F)मनाया गया था । 14 और 21 दिनों में, ढीला संयोजी ऊतक अधिक प्रचुर मात्रा में था, सीएमएस ट्रैबेकुला के साथ हेपेटोसाइट्स से घिरा हुआ था, यह सुझाव देता है कि हेपेटोसाइट्स सीएमएस(चित्रा 7C और चित्रा 7G)में चले गए थे; चित्रा 7D और चित्रा 7H)। परिणामों में हेपेटोसाइट्स के क्षेत्रों को भी दिखाया गया है जो एक पोत(चित्रा 8A)द्वारा सिंचित थे । एक करीबी निरीक्षण से पता चला है कि हेपेटोसाइट्स ने सीएमएस ट्रैबेकुले का पालन किया था, कभी-कभी ढीले संयोजी ऊतक(चित्रा 8B-D)से घिरे होते थे। दो डबल-अंधा स्वतंत्र रोगविज्ञानियों ने हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण किया। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और पॉलीमेरेज चेन रिएक्शन-आधारित परख हेपेटिक पुनर्जनन प्रक्रिया से संबंधित विभिन्न प्रोटीन और जीन का मूल्यांकन करने के लिए चल रहे हैं ।
इस प्रकार, स्थूल और सूक्ष्म टिप्पणियों और जैव रासायनिक मूल्यों हमारे प्रस्ताव का समर्थन करते हैं कि सीएमएस जिगर के उत्थान के समर्थन और संवर्धन के लिए एक आदर्श बायोमटेरियल है। फिर भी, सीएमएस प्रत्यारोपण से अधिक 21 दिनों के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए इसके अवशोषण समय और पूरा जिगर ऊतक बहाली निर्धारित करने के लिए । इसके अलावा, सीएमएस की उपस्थिति में हेपेटिक पुनर्जनन से संबंधित विभिन्न प्रोटीन और जीन का मूल्यांकन करने वाले अध्ययन किए जाने चाहिए।
चित्र 1:हड्डी का नमूना और सीएमएस। (ए)सीएमएस को तैयार करने के लिए हड्डी के नमूने का एक त्रिकोणीय नमूना उपयोग किया गया था। (ख)इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाए गए छिद्रों और इंटरकनेक्शन या सीएमएस के ट्रैबेक्यूलर कनेक्शन का विस्तृत दृश्य । (ग)सीएमएस, जैसा कि स्टीरियो-माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जाता है । })सीएमएस एक उपकरण के साथ हेरफेर यांत्रिक गुणों के संशोधन को सत्यापित करने के लिए किया गया था। संक्षिप्त नाम: सीएमएस = कोलेजन मैट्रिक्स पाड़। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2:सर्जरी के लिए जानवर तैयार करना। जानवर डेकुबिटस पृष्ठीय स्थिति में है, जो मुंडा पेट क्षेत्र दिखाता है, जो हेपेटेक्टोमी और सीएमएस प्रत्यारोपण के लिए तैयार किया जाता है। संक्षिप्त नाम: सीएमएस = कोलेजन मैट्रिक्स पाड़। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3:जिगर के बाएं पालि की हेपेटेक्टॉमी। (क)हेपेटेक्टॉमी करने के लिए बाएं पालि को निकाला गया और धातु की प्लेट पर रखा गया । (ख)बाएं पालि के 40% हेपेटेक्टॉमी को सीएम की तरह त्रिकोणीय आकार में किया गया था। (ग) हेपेटेक्टॉमी का क्षेत्रफल सीएमएस द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। संक्षिप्त नाम: सीएमएस = कोलेजन मैट्रिक्स पाड़। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 4:मूल्यांकन का तीसरा दिन। (ए)मूल्यांकन के दिन 3 पर प्रत्यारोपण स्थल का स्थूल अवलोकन । (भरा सितारा) सीएमएस (बिंदीदार रेखा) के साथ प्रत्यारोपित जिगर रंग या आकार में परिवर्तन नहीं किया । छोटी आंत (खाली तारा) और पेट की बाकी संरचनाओं में कोई बदलाव नहीं दिखा। (ख)ओमेंटल फैट (लाल तीर) से ढके लिवर (भरे तारे) और सीएमएस (सफेद तीर) का नमूना। संक्षिप्त नाम: सीएमएस = कोलेजन मैट्रिक्स पाड़। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 5:मूल्यांकन का दिन 14. (ए)मूल्यांकन दिवस 14 पर प्रत्यारोपण स्थल का स्थूल अवलोकन । सीएमएस के साथ लिवर टिश्यू (भरा सितारा) रंग या आकार में नहीं बदलता था। छोटी आंत (खाली तारा) और पेट की गुहा की बाकी संरचनाओं और अंगों में कोई बदलाव नहीं दिखा। प्रत्यारोपित सीएमएस के साथ जिगर का नमूना:(ख)पूर्वकाल दृश्य; (C)पीछे/आंत का दृश्य । क्षेत्र को कवर करने वाले ओमेंटल फैट (लाल तीर) । सीएमएस जिगर के ऊतकों में एकीकृत किया गया था। ओमेंटल फैट (लाल तीर) मुख्य रूप से पूर्वकाल दृश्य में क्षेत्र को कवर करता है। बिंदीदार रेखा सीएमएस प्रत्यारोपण की साइट को इंगित करती है; टांके (नीला धागा) । संक्षिप्त नाम: सीएमएस = कोलेजन मैट्रिक्स पाड़। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 6:मूल्यांकन का दिन 21 । {मूल्यांकन दिवस 21 पर प्रत्यारोपण स्थल का स्थूल अवलोकन। प्राप्तकर्ता जिगर (भरा सितारा) सीएमएस (बिंदीदार लाइन) के साथ प्रत्यारोपित रंग या आकार में परिवर्तन नहीं किया । छोटी आंत (खाली तारा) और पेट की बाकी संरचनाओं में कोई बदलाव नहीं दिखा। (ख)प्रत्यारोपित सीएमएस (बिंदीदार रेखा) के साथ जिगर का नमूना आकार और आकार में परिवर्तन दिखा । संक्षिप्त नाम: सीएमएस = कोलेजन मैट्रिक्स पाड़। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 7:सीएमएस के साथ जिगर और जिगर की हिस्ता। (A)सामान्य जिगर (शम) विशेषता ऊतक वास्तुकला दिखा रहा है। (ख)सीएमएस प्रत्यारोपण के दिन 3 सीएमएस (धराशायी अंडाकार) के trabeculae में ढीला संयोजी ऊतक दिखा । (C)देशी जिगर (दाईं ओर) और सीएमएस (बाईं ओर) के बीच संक्रमण क्षेत्र, सीएमएस (तीर) के trabeculae के साथ । (घ)21 दिन में सीएमएस (बिंदीदार लाइनों) के संपर्क में देशी जिगर । (ई)मैसन के ट्राइक्रोम दाग के साथ सामान्य जिगर। (च)सीएमएस जिगर में प्रत्यारोपित; 3 दिन (धराशायी अंडाकार) पर ढीला संयोजी ऊतक का आक्रमण। (जी)14 दिन, सीएमएस trabeculae के साथ देशी जिगर, देशी जिगर के बाहर हेपेटोसाइट्स (भरा सितारा) के एक क्षेत्र दिखा, यह दर्शाता है कि देशी hepatocytes सीएमएस के माध्यम से चले गए थे । (ज)21 दिन, देशी हेपेटोसाइट्स सीएमएस (तीर) की ओर चले गए हैं। ए और ई: स्केल बार = 200 माइक्रोन: 4x, बी-डी और एफ-एच:स्केल बार = 100 माइक्रोन: 10x. A-डी: एच एंड ई धुंधला; ई-एच: मैसन के ट्राइक्रोम धुंधला। संक्षिप्त: सीएमएस = कोलेजन मैट्रिक्स पाड़; एचएंडई = हेमेटॉक्सीलिन और ियोसिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 8:जिगर और सीएमएस की हिस्टोलॉजी। (एक)सीएम (काला तीर) के ट्राबेकुले में मौजूद हेपेटोसाइट्स (सफेद तीर) का पूल। हेपेटोसाइट्स को एक पोत (भरे हुए तारे) द्वारा सिंचित किया जाता है। (ख)हेपेटोसाइट्स (सफेद तीर) ने पलायन कर सीएमएस (काला तीर) के ट्राबेकुले का पालन किया है। (ग)सीएम के दो ट्राबेकुले (काले तीर) के बीच हेपेटोसाइट्स (धराशायी सर्कल) का एक समूह मनाया जाता है। (घ)हेपेटोसाइट्स ने ढीले संयोजी ऊतक (धराशायी अंडाकार) की उपस्थिति में सीएमएस के ट्राबेकुला (काले तीर) का पालन किया है। ए और सी:स्केल बार = 100 माइक्रोन: 10x. बी और डी: स्केल बार = 20 माइक्रोन: 40x। संक्षिप्त नाम: सीएमएस = कोलेजन मैट्रिक्स पाड़। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| दिन | धोखा | हेपेटेक्टॉमी | प्रत्यारोपण सीएमएस | |
| एएलबी (जी/एलएएल) | 3 | 1.4±0 | 1.25±0.07 | 1.4±0 |
| 14 | 1.3±0.5 | 1.85±0.07 | 1.8±0.14 | |
| 21 | 1.3±05 | 1.6±0.1 | 1.7± 0 | |
| एएलटी (आईयू/एल) | 3 | 73±1.4 | 3.5±0.7 | 54.6±6.4 |
| 14 | 84±0 | 59.5±4.9 | 57±4.2 | |
| 21 | 57±0 | 73.5±14.8 | 73.5±14.8 | |
| AST (IU/L) | 3 | 106±1.4 | 80±6.6 | 90±1.4 |
| 14 | 127±5.5 | 94±21.2 | 83.5±17.6 | |
| 21 | 123.7±27.3 | 92.5±24.7 | 101±31.1 | |
| टीबी (मिलीग्राम/डीएल) | 3 | 0.33±0.05 | 0.25±0.07 | 0.3±0 |
| 14 | 0.5±0 | 0.2±0 | 0.15±0 | |
| 21 | 0.3±0 | 0.4±0 | 0.4±0.14 | |
| डीबी (मिलीग्राम/डीएल) | 3 | 0.1±0 | 0.05±0.07 | 0.1±0 |
| 14 | 0.1±0 | 0.1±0 | 0.1±0 | |
| 21 | 0.1±0 | 0.1±0 | 0.1±0 |
तालिका 1: जिगर समारोह। जिगर समारोह परीक्षण के साथ और 3, 14, और 21 दिनों में सीएमएस के बिना नकली और प्रयोगात्मक समूहों के लिए प्रदर्शन किया गया । संक्षिप्त: सीएमएस = कोलेजन मैट्रिक्स पाड़; ALB = एल्बरिन; एएलपी = क्षारीय फॉस्फेट; एएलटी = एलेनिन अमीनोट्रांसफेरेज; एएसटी = एस्पार्टेट अमीनोट्रांसफेरेज; टीबी = कुल बिलीरुबिन; डीबी = डायरेक्ट बिलीरुबिन।
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Discussion
अंग प्रत्यारोपण लिवर फाइब्रोसिस या सिरोसिस वाले मरीजों में इलाज का मुख्य आधार है। कुछ रोगियों को इस प्रक्रिया से लाभ होता है, जिससे प्रतीक्षा सूची में रोगियों के लिए चिकित्सीय विकल्प प्रदान करना आवश्यक हो जाता है। टिश्यू इंजीनियरिंग एक आशाजनक रणनीति है जो पाड़ों और कोशिकाओं को पुनर्योजी क्षमतावाले 2,4,13 केसाथ रोजगार देती है । इस संवहनी अंग के विपुल रक्तस्राव के कारण यकृत के एक हिस्से को हटाना इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है। इसलिए, इस जटिलता को रोकने के लिए सर्जिकल बिस्तर के हेमेसिस किए जाने चाहिए। इसके अलावा, सीएमएस के लिए जिगर के ऊतकों की बाध्यकारी, जो ऊतक-जैव सामग्री बातचीत सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है, टांके के उपयोग के माध्यम से सुविधा है । हालांकि, यह ध्यान से किया जाना चाहिए जिगर फाड़ से बचने के लिए और बाद में खून बह रहा है कारण ।
यद्यपि यहां प्रस्तावित बायोमटेरियल गोजातीय मूल (ज़ेनोजेनिक) का है, चूहों में बायोमटेरियल प्रतिक्रिया का कोई डेटा नहीं है, जिससे चयनात्मक हेपेटेक्टोमी संभव हो जाता है। इसके विपरीत, 2/3 हेपेटेक्टॉमी मॉडल को बड़ी मात्रा में यकृत ऊतक14को हटाने के कारण जानवरों की मौत का कारण दिखाया गया है। इसके अलावा, हमने एक स्टेनलेस स्टील धातु टेम्पलेट विकसित किया क्योंकि हमें हेपेटेक्टोमी और सीएमएस में आकार को मानकीकृत करने में कठिनाई हुई थी। सीएमएस की नसबंदी चुनौतीपूर्ण थी क्योंकि मौजूदा तकनीकों ने कोलेजन और उसके जैव रासायनिक गुणों की संरचना को संशोधित किया। इसलिए, गर्मी, गामा विकिरण, और एथिलीन ऑक्साइड द्वारा नसबंदी को यह निर्धारित करने से पहले नसबंदी विधियों के रूप में खोजा गया था कि हाइड्रोजन पेरोक्साइड का प्लाज्मा इष्टतम तकनीक13था।
यह सीएमएस के अधिकतम आकार है कि जिगर में प्रत्यारोपित किया जा सकता है और एक प्रणालीगत स्तर पर जैविक प्रतिक्रिया का मूल्यांकन निर्धारित करने के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, एक बड़ी जानवरों की प्रजातियों में इस तकनीक की प्रभावकारिता को अनुकूलित और जांच करना आवश्यक है। इसके अलावा, लंबी अवधि (>30 दिनों) के लिए यकृत में सीएमएस प्रत्यारोपण के प्रभावों की जांच करना महत्वपूर्ण है, जो सीएमएस के बायोसोर्पेशन की सीमा और हेपेटिक ऊतक के पुनर्जनन के आकलन की अनुमति देगा। इसके अलावा, सीएमएस प्रत्यारोपण के प्रभाव जिगर की क्षति के साथ पशु मॉडल में जांच की जानी चाहिए। इस प्रत्यारोपण विधि ने पुनः प्राप्त ऊतकों के आकार और मात्रा की बहाली की खोज करने वाली रणनीतियों के लिए दरवाजा खोल दिया है, जिससे संज्ञाहरण, शल्य अवधि और वसूली समय4,13को कम किया जा सकता है।
सीएमएस को एक प्राकृतिक स्रोत से प्राप्त किया गया था और इसके भौतिक और रासायनिक गुणों को जटिल पद्धतियों जैसे बायोप्रिंटिंग या इलेक्ट्रोस्पिनिंग का उपयोग करके बनाए गए सिंथेटिक बायोमैटेरियल्स की तुलना मेंसंरक्षितकिया गया था, जो जैव संगत या जैव-स्रोत2, 3नहीं हैं। इस सीएमएस का प्राथमिक घटक कोलेजन प्रकार I है, जो ईसीएम का मुख्य प्रोटीन है जो सेल आसंजन और प्रसार22को सक्षम बनाता है। इसके अतिरिक्त, सीएमएस छिद्रों के ट्रैबेकुला सेल माइग्रेशन और पुनर्जनन प्रक्रिया के विकास कारकों, रक्त और अन्य मध्यस्थों के निरंतर प्रवाह को सक्षम करते हैं। ऊतक की मरम्मत के अनुसार, इस शोध समूह के पास सीएमएस को विभिन्न आकृतियों में डिजाइन करने, अपनी 3डी संरचना को संरक्षित करने का अनुभव है। उदाहरण के लिए, बेलनाकार सीएमएस को कुत्ते मूत्रमार्ग और सूअरों में पित्त नली में प्रत्यारोपित किया गया और ऊतक उत्थान23,24में आशाजनक परिणाम मिले ।
इस सीएमएस का प्रत्यारोपण ऊतक उत्थान को प्रोत्साहित करने और विभिन्न एटिओलॉजी (जैसे, वायरस, अल्कोहल, मेटाबोलिक कारकों) के कारण लिवर सिरोसिस में फाइब्रोजेनेसिस-फाइब्रोलिसिस संतुलन को बहाल करने के लिए एक वैकल्पिक उपचार हो सकता है। सीएमएस द्वारा ट्रिगर किए गए आणविक और सेलुलर तंत्र की पहचान करने के लिए प्रसार, प्रवासन और सूजन परख किया जाना चाहिए। अंत में, यह पेपर हेपेटेक्टॉमी के लिए एक प्रजनन योग्य प्रक्रिया के साथ-साथ बायोमैटेरियल्स के ज़ेनोइम्प्लांटेशन के माध्यम से पुनर्जनन प्रक्रिया की परीक्षा का वर्णन करता है।
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Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है । बेंजामिन लियोन-मानसिला प्रोग्रामा डी डॉक्टराडो एन सिन्सियस बायोमेडिस, यूनीवर्सिड नैसिनल ऑटोनोमा डी मेक्सीको (यूएनएएम) से डॉक्टरेट छात्र हैं और उन्हें डीजीपीए-यूएनएएम फेलोशिप मिली।
Acknowledgments
लेखकों को प्रायोगिक चिकित्सा इकाई की प्रयोगशाला पशु सुविधा के कर्मियों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, नर्स कैरोलिना Baños जी तकनीकी और शल्य चिकित्सा समर्थन के लिए, मार्को ई. Gudiño जेड microphotos में समर्थन के लिए, और एरिक अपो जिगर हिस्टोलॉजी में समर्थन के लिए । राष्ट्रीय परिषद ने विज्ञान और प्रौद्योगिकी के लिए इस शोध(CONACyT),अनुदान संख्या SALUD-2016-272579 और PAPIIT-UNAM TA200515 का समर्थन किया ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anionic detergent | Alconox | Z273228 | |
| Biopsy cassettes | Leica | 3802453 | |
| Camera DMX | Nikon | DXM1200F | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | BD | 372412 | |
| Cover glasses 25 mm x 40 mm | Corning | 2980-224 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 200-M | CAS 17372-87-1 |
| Ethyl alcohol, pure | Sigma-Aldrich | 459836 | CAS 64-17-5 |
| Flunixine meglumide | MSD | Q-0273-035 | |
| Glass slides 75 mm x 25 mm | Corning | 101081022 | |
| Hematoxylin | Merck | H9627 | CAS 571-28-2 |
| Hydrochloric acid 37% | Merck | 339253 | CAS 7647-01-0 |
| Ketamine | Pisa agropecuaria | Q-7833-028 | |
| Light microscope | Nikon | Microphoto-FXA | |
| Microsurgery stereomicroscope | Zeiss | OPMI F170 | |
| Microtainer yellow cape | Beckton Dickinson | 365967 | |
| Microtome | Leica | RM2125 | |
| Model animal: Wistar rats | Universidad Nacional Autónoma de México | ||
| Nylon 3-0 (Dermalon) | Covidien | 1750-41 | |
| Polypropylene 7-0 | Atramat | SE867/2-60 | |
| Povidone-iodine10% cutaneous solution | Diafra SA de CV | 1.37E+86 | |
| Scanning electronic microscope | Zeiss | DSM-950 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J. T. Baker | 3722-01 | CAS 1310-73-2 |
| Software ACT-1 | Nikon | Ver 2.70 | |
| Stereomicroscope | Leica | EZ4Stereo 8X-35X | |
| Sterrad 100S | Johnson and Johnson | 99970 | |
| Surgipath paraplast | Leica | 39601006 | |
| Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm) | SensiMedical | LAN-078-077 | |
| Tissue Processor (Histokinette) | Leica | TP1020 | |
| Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder) | Sakura Finetek USA | 5229 | |
| Trichrome stain kit | Sigma-Aldrich | HT15 | |
| Unicell DxC600 Analyzer | Beckman Coulter | BC 200-10 | |
| Xylazine | Pisa agropecuaria | Q-7833-099 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | CAS 1330-20-7 |
References
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