Summary
Les maladies du foie sont induites par de nombreuses causes qui favorisent la fibrose ou la cirrhose. La transplantation est la seule option pour retrouver la santé. Cependant, étant donné la rareté des organes transplantables, des alternatives doivent être explorées. Notre recherche propose l’implantation d’échafaudages de collagène dans le tissu hépatique à partir d’un modèle animal.
Abstract
Les maladies du foie sont la principale cause de décès dans le monde. Une consommation excessive d’alcool, un régime riche en graisses et une infection par le virus de l’hépatite C favorisent la fibrose, la cirrhose et / ou le carcinome hépatocellulaire. La transplantation hépatique est la procédure cliniquement recommandée pour améliorer et prolonger la durée de vie des patients à un stade avancé de la maladie. Cependant, seulement 10% des greffes sont réussies, avec la disponibilité des organes, les procédures préchirurgicales et postchirurgicales, et les coûts élevés directement corrélés avec ce résultat. Les échafaudages à matrice extracellulaire (ECM) sont apparus comme une alternative pour la restauration des tissus. La biocompatibilité et l’acceptation des greffons sont les principales caractéristiques bénéfiques de ces biomatériaux. Bien que la capacité de restaurer la taille et la fonction correcte du foie ait été évaluée dans des modèles d’hépatectomie hépatique, l’utilisation d’échafaudages ou d’une sorte de support pour remplacer le volume de la masse hépatique disparue du pays n’a pas été évaluée.
Une hépatectomie partielle a été réalisée dans un foie de rat avec la xénoimplantation d’un échafaudage à matrice de collagène (CMS) d’un condyle bovin. Le tissu du lobe hépatique gauche a été enlevé (environ 40%) et une proportion égale de CMS a été implantée chirurgicalement. Les tests de la fonction hépatique ont été évalués avant et après l’intervention chirurgicale. Après les jours 3, 14 et 21, les animaux ont été euthanasiés et des évaluations macroscopiques et histologiques ont été effectuées. Aux jours 3 et 14, du tissu adipeux a été observé autour de la CMS, sans signe clinique de rejet ou d’infection, tout comme la néoformation des vaisseaux et la réabsorption de la CMS au jour 21. Il y avait des preuves histologiques d’un processus d’inflammation insignifiant et de la migration des cellules adjacentes vers le CMS, observé avec l’hématoxyline et l’éosine (H & E) et la coloration trichrome de Masson. Il a été démontré que le CMS fonctionne bien dans le tissu hépatique et pourrait être une alternative utile pour étudier la régénération et la réparation des tissus dans les maladies hépatiques chroniques.
Introduction
Le foie est l’un des organes les plus importants impliqués dans le maintien de l’homéostasie et de la production de protéines1. Malheureusement, les maladies du foie sont la principale cause de décès dans le monde. Aux stades avancés des lésions hépatiques, qui comprennent la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire, la transplantation hépatique est la procédure cliniquement recommandée. Cependant, en raison de la rareté des donneurs et du faible taux de greffes réussies, de nouvelles techniques en génie tissulaire (TE) et en médecine régénérative (RM) ont été développées2,3.
TE implique l’utilisation de cellules souches, d’échafaudages et de facteurs de croissance4 pour favoriser la restauration des organes et tissus enflammés, fibrotiques et hédémateux1,5,6. Les biomatériaux utilisés dans les échafaudages imitent l’ECM natif, fournissant les indices physiques, chimiques et biologiques pour le remodelage cellulaire guidé7. Le collagène est l’une des protéines les plus abondantes obtenues à partir du derme, du tendon, de l’intestin et du péricarde8,9. De plus, le collagène peut être obtenu sous forme de biopolymère pour produire des échafaudages bidimensionnels et tridimensionnels par bio-impression ou électrofilage10,11. Ce groupe est le premier à signaler l’utilisation de collagène provenant d’une source osseuse pour la régénération du tissu hépatique. Une autre étude rapporte l’utilisation d’échafaudages synthétisés à partir de collagène bovin, qui a été obtenu à partir de peau, avec des pores homogènes et étroitement situés, sans aucune communication entre eux12.
La décellularisation préserve l’ECM natif, permettant l’incorporation ultérieure de cellules à potentiel de cellules souches13,14. Cependant, cette procédure est encore en phase expérimentale dans le foie, le cœur, les reins, l’intestin grêle et la vessie de souris, de rats, de lapins, de porcs, de moutons, de bovins et de chevaux3,14. Actuellement, le volume de masse hépatique réséqué n’est remplacé dans aucun des modèles d’hépatectomie animale. Cependant, l’utilisation d’un support ou d’un réseau supplémentaire (biomatériaux) qui permet la prolifération cellulaire et l’angiogenèse pourrait être essentielle pour la restauration rapide des fonctions parenchymateuses du foie. Ainsi, les échafaudages pourraient être utilisés comme approches alternatives pour régénérer ou réparer les tissus dans les maladies hépatiques chroniques, éliminant ainsi les limitations dues au don et aux complications cliniques de la transplantation hépatique.
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Protocol
La présente recherche a été approuvée par le comité d’éthique de l’École de médecine (DI/115/2015) de l’Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) et le comité d’éthique de l’Hôpital général de Mexico (CI/314/15). L’institution répond à toutes les spécifications techniques pour la production, l’entretien et l’utilisation des animaux de laboratoire et est légalement certifiée par la législation nationale (NOM-062-ZOO-1999). Des rats Wistar mâles pesant de 150 à 250 g (âgés de 6 à 8 semaines) ont été obtenus auprès de l’installation pour animaux de laboratoire de l’École de médecine de l’UNAM pour cette étude.
1. Obtention d’échafaudages à matrice de collagène à partir du fémur bovin
- Obtenir le condyle du fémur bovin dans un abattoir certifié par les autorités sanitaires et agricoles du Mexique.
- Disséquez soigneusement la graisse condyle, le muscle et le cartilage avec un instrument chirurgical. Coupez les fragments de condyle en fragments de 3 cm x 3 cm à l’aide d’un coupe-scie et nettoyez la graisse et le sang avec une serviette. Lavez les fragments de condyle avec de l’eau.
- Faire bouillir (92 °C) les fragments avec 1 L d’un détergent anionique (10 g/L) pendant 30 min. Lavez les fragments de condyle deux fois pour éliminer les restes du détergent anionique.
- Sécher les fragments de condyle pendant 3 h à l’aide de papier filtre (0,5 mm).
- Préparer un CMS triangulaire (1 cm x1 cm x1 cm) d’épaisseur 0,5 cm à partir des fragments mentionnés à l’étape 1.1(Figure 1A).
- Déminéraliser les fragments dans 100 mL de 0,5 M HCl pendant 10 min avec une agitation constante. Retirez le HCl.
REMARQUE: Neutraliser le HCl avec de l’hydroxyde de sodium (10 M). - Rincez les fragments trois fois avec 100 mL d’eau distillée, 15 min à chaque fois, avec une agitation constante. Sécher le CMS avec du papier filtre (0,5 mm) pendant 1 h.
- Utilisez un stéréomicroscope15 pour analyser les propriétés structurelles du CMS (taille des pores, formation des pores et interconnexion poreuse)(Figure 1B).
- Utilisez un microscope électronique à balayage16 pour analyser la surface rugueuse des trabécules CMS (Figure 1C).
- Utilisez l’instrument de dissection pour le mélange et l’étirement afin d’évaluer les changements mécaniques (plasticité et flexibilité) du CMS(Figure 1D).
- Emballez le CMS dans la poche de stérilisation et stérilisez-le avec du plasma de peroxyde d’hydrogène pendant 38 min. Conserver le CMS stérile dans l’emballage d’origine dans un endroit sec à 20-25 °C jusqu’à utilisation.
- Déminéraliser les fragments dans 100 mL de 0,5 M HCl pendant 10 min avec une agitation constante. Retirez le HCl.
2. Préparation de la zone chirurgicale et manipulation et préparation du modèle animal
- Désinfectez la zone chirurgicale, la table de travail, le microscope de microchirurgie et le siège avec une solution de chlorhexidine à 2%. Stériliser tous les instruments chirurgicaux, l’éponge chirurgicale, les écouvillons et le drap chirurgical jetable par stérilisation thermique (121 °C/30 min/100 kPa)
- Assignez les rats (n = 5) en trois groupes de cinq rats par groupe: 1. simulacre, 2. hépatectomie et 3. hépatectomie plus CMS, et suivez tous les groupes les jours 3, 14 et 21 jours.
- Administrer de la kétamine (35 mg/kg) et de la xylazine (2,5 mg/kg) par voie intramusculaire dans le membre postérieur.
REMARQUE: La période sédative dure généralement de 30 à 40 minutes. - Raser la peau abdominale (5 cm x 2 cm) à l’aide de savon chirurgical et d’une lame à double tranchant, et désinfecter la peau à l’aide d’une solution topique de povidone-iode à 10% en trois tours17.
- Placer l’animal sur une plaque chaude en position dorsale décubile, avec le cou hyperétendu pour maintenir des voies respiratoires perméables (Figure 2).
- Évaluer la profondeur de l’anesthésie à travers le schéma respiratoire et la perte du réflexe de sevrage dans les membres.
- Placez un drap chirurgical jetable autour de la peau rasée et faites une incision (2,5 cm) sur la ligne albous avec un scalpel, en utilisant le processus xiphoïde comme point de référence. Évitez le vaisseau sanguin de la paroi abdominale pour prévenir les saignements.
- Mettez le rétracteur abdominal en place et observez la cavité abdominale. À l’aide de la pince à dissection, extraire le lobe hépatique gauche et le placer sur la plaque métallique (Figure 3A).
REMARQUE: Dans le groupe simulé, extrayez uniquement le lobe hépatique gauche, puis retournez le foie dans la cavité abdominale. Suturez la paroi abdominale et la peau avec une suture en nylon 3-0. - Dans les groupes expérimentaux avec et sans CMS, utilisez une lame de scalpel et une lame de scalpel stérile (#15) pour effectuer une hépatectomie (environ 40%) avec deux coupes. Utiliser un gabarit métallique triangulaire (1 cm x 1 cm x 1 cm) pour effectuer l’hépatectomie(Figure 3B).
- Pour prévenir les saignements du foie, maintenez la compression chirurgicale avec un écouvillon sur le bord du foie pendant 5 min.
- Hydrater le CMS dans une solution saline stérile pendant 20 minutes avant l’intervention chirurgicale. Implantez le CMS dans le site de l’hépatectomie avec quatre sutures de points de suture entre le tissu hépatique et le CMS pour éviter le déplacement du biomatériau. Utilisez 7-0 sutures en polypropylène non résorbables(Figure 3C).
REMARQUE: Ne retirez pas les sutures lors d’une deuxième chirurgie; les sutures peuvent être utilisées comme référence pour identifier le site d’implantation de CMS. - Retournez le foie dans la cavité abdominale et suturez la paroi abdominale et la peau avec une suture en nylon 3-0. Nettoyez l’incision chirurgicale avec une éponge chirurgicale imbibée d’iode en deux tours. Observez et surveillez les signes vitaux des animaux.
- Administrer de la kétamine (35 mg/kg) et de la xylazine (2,5 mg/kg) par voie intramusculaire dans le membre postérieur.
3. Soins postopératoires
- Administrer la méglumine flunixine (2,5 mg/kg) par voie intramusculaire dans le membre postérieur. Administrer les analgésiques approuvés par le comité de soins et d’utilisation des animaux de l’établissement.
- Pour la récupération de l’anesthésie, placez les animaux dans des boîtes individuelles en polycarbonate avec litière pour animaux de laboratoire dans une zone sans bruit avec contrôle de la température (23 ° C).
- Observez la récupération des animaux et surveillez leur consommation d’eau et de nourriture pendant 2 h. Surveiller les animaux après l’opération, tel qu’approuvé par le comité de soins et d’utilisation des animaux de l’établissement.
4. Évaluation de la fonction hépatique dans le sérum
- Prélever des échantillons de sang (500 μL) dans les veines latérales de la queue des animaux anesthésiés avant l’intervention chirurgicale (valeurs de base) et aux jours d’évaluation 3, 14 et 21.
- Centrifuger les échantillons de sang à 850 × g/10 min à température ambiante (23 °C); séparer le sérum et le conserver à -80°C jusqu’à utilisation.
- Effectuer un panel de tests de la fonction hépatique : albumine sérique (ALB), phosphatase alcaline (ALP), alanine aminotransférase (ALT), aspartate aminotransférase (AST), bilirubine totale (TB) et bilirubine directe (DB)(Tableau 1).
5. Euthanasie et gestion des tissus
- Anesthésiez les animaux pour chaque évaluation (jours 3, 14 et 21) en suivant le protocole décrit ci-dessus.
- Euthanasier par des méthodes approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux.
- Effectuer une incision (5-6 cm) sur la ligne albous avec un scalpel pour observer les organes de la cavité abdominale et prendre des photos de la zone d’hépatectomie du simulacre et des groupes expérimentaux, avec et sans le CMS.
- Prélever des échantillons de foie (2 cm x 2 cm; 0,40-0,45 g) sur tous les animaux du groupe d’étude et les placer dans une solution de formaldéhyde à 4% pendant 24 h pour une évaluation histologique ultérieure.
6. Analyse histologique
- Préserver les tissus hépatiques dans du formaldéhyde à 4% et déshydrater les tissus en utilisant une série de concentrations d’alcool (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); placez-les dans du xylène (1h) et incrustez-les dans de la paraffine16.
- Coupez les blocs de paraffine avec un microtome en sections de 4 μm d’épaisseur pour la préparation de huit lames.
- Effectuer la coloration trichrome de H&E et Masson16.
- Observez les sections colorées au microscope optique pour sélectionner les zones représentatives du foie, avec et sans CMS. Obtenez des photomicrographies à grossissement 4x, 10x et 40x et traitez les images à l’aide du logiciel approprié18 (voir la Table des matériaux).
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Representative Results
La déminéralisation osseuse affecte les propriétés mécaniques du CMS sans altérer la forme d’origine ou l’interconnexion de sespores. CMS peut avoir n’importe quelle forme, et par conséquent, peut être ajusté à la taille et à la forme de l’organe ou du tissu sélectionné19. Dans le protocole actuel, nous avons utilisé un CMS triangulaire (Figure 1A-D). Un modèle de rat a été utilisé pour évaluer la capacité de régénération du xénoimplant CMS dans le foie. Bien que le foie soit un organe friable et mou, l’intervention chirurgicale effectuée dans ce protocole a permis de s’assurer que le CMS restait en place(Figure 2 et Figure 3A-C). L’hépatectomie partielle de 40% du lobe gauche a permis d’évaluer une partie de l’organe, en gardant le reste du foie intact, de sorte que les changements dans l’implant et le parenchyme natif ont pu être comparés. De plus, nous avons obtenu des échantillons de sang pour évaluer la fonction hépatique avant et après l’implantation de CMS.
Il n’y avait aucune différence dans les concentrations initiales des paramètres biochimiques entre le groupe fictif et le groupe expérimental avec et sans implantation de CMS à 3 et 14 jours; ils sont restés dans les valeurs de référence (ALB: 0,43-2,41 g/dL ; ALP: 134-357,3 U/L; ALT: 41-83.1 UI/L; AST: 61.4-276.2 UI/L ; TUBERCULOSE: 0,01-0,43 mg/dL; DB: 0,1 mg/dL)20. De plus, il n’y avait aucune différence dans les taux d’albumine, d’ALP, d’ALT, d’AST, de TB et de DB entre le groupe simulé et les groupes expérimentaux à 21 jours, ce qui indique que la CMS ne perturbe pas la fonction hépatique(tableau 1).
Au cours de l’euthanasie, la laparotomie exploratoire a révélé la couleur typique et la taille et la forme correctes du foie. Aucune inflammation ou infection n’a été observée au site d’implantation dans aucun des cas. Le jour 3, il n’y avait aucun changement dans l’organe par rapport à la cavité abdominale (Figure 4A). Dans une partie qui contenait du tissu hépatique et de la CMS, on a observé que le sang s’était infiltré dans la CMS, avec de la graisse omentale adhérente naissante (Figure 4B). Le jour 14, la quantité de graisse a augmenté; il y a eu une néoformation des vaisseaux sanguins et l’intégration du CMS dans le tissu hépatique receveur, mais aucun changement dans l’intestin grêle ou les organes de la cavité abdominale (Figure 5A). La graisse omentale était plus élevée dans la zone antérieure (Figure 5B) par rapport à la zone viscérale (Figure 5C) dans le site d’implantation cms. Le jour 21 de l’évaluation, l’incorporation de CMS dans le foie était plus évidente(Figure 6A). L’augmentation de la graisse omentale pourrait être utilisée comme indicateur de la progression de la régénération, car c’est une source de cellules souches mésenchymateuses21. De plus, à 21 jours, le foie présentait des zones denses qui correspondaient à la dégradation et à l’absorption, modifiant la taille et la forme d’origine(figure 6B).
Pour analyser la microstructure du foie avec l’implant CMS, nous avons effectué une analyse histologique d’un fragment représentatif de tissu du site d’implantation, qui a été comparé à un tissu du lobe hépatique droit (contrôle). Les biopsies effectuées aux jours 3, 14 et 21 ont été traitées et soumises à la coloration trichrome de H& E et Masson. La structure normale du parenchyme hépatique a été observée dans le groupe simulé au jour 21(Figure 7A et Figure 7E). Le jour 3, l’analyse histologique a montré que la présence du CMS dans le foie ne favorisait pas une réaction de corps étranger, et la présence visible de tissu conjonctif laxiste a été observée(Figure 7B et Figure 7F). Aux jours 14 et 21, le tissu conjonctif laxiste était plus abondant, les trabécules CMS étant entourées d’hépatocytes, suggérant que les hépatocytes avaient migré vers le CMS(Figure 7C et Figure 7G; Figure 7D et figure 7H). Les résultats ont également montré des zones d’hépatocytes qui ont été irriguées par un vaisseau (Figure 8A). Une inspection minutieuse a révélé que les hépatocytes qui avaient adhéré aux trabécules CMS étaient parfois entourés de tissu conjonctif laxiste (Figure 8B-D). Deux pathologistes indépendants en double aveugle ont effectué l’analyse histopathologique. Des tests basés sur l’immunohistochimie et la réaction en chaîne par polymérase sont en cours pour évaluer les différentes protéines et gènes liés au processus de régénération hépatique.
Ainsi, les observations macroscopiques et microscopiques et les valeurs biochimiques soutiennent notre proposition selon laquelle le CMS est un biomatériau idéal pour soutenir et favoriser la régénération du foie. Néanmoins, l’implantation de CMS doit être évaluée pendant plus de 21 jours pour déterminer son temps d’absorption et la restauration complète du tissu hépatique. En outre, des études évaluant les différentes protéines et gènes liés à la régénération hépatique en présence du CMS doivent être menées.
Figure 1: Spécimen osseux et CMS. (A) Un échantillon triangulaire de l’échantillon osseux a été utilisé pour préparer le CMS. (B) Une vue détaillée des pores et de l’interconnexion ou de la connexion trabéculaire du CMS, telle qu’observée par microscopie électronique. (C) Le CMS, vu sous un stéréomicroscope. (D) La manipulation du CMS avec un instrument a été effectuée pour vérifier la modification des propriétés mécaniques. Abréviation : CMS = échafaudage à matrice de collagène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Préparation de l’animal à la chirurgie. L’animal est en position dorsale décubitaire, montrant la région abdominale rasée, préparée pour l’hépatectomie et l’implantation de CMS. Abréviation : CMS = échafaudage à matrice de collagène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Hépatectomie du lobe gauche du foie. (A) Le lobe gauche a été extrait et placé sur la plaque métallique pour effectuer l’hépatectomie. (B) L’hépatectomie de 40% du lobe gauche a été réalisée dans une forme triangulaire, comme le CMS. (C) La zone de l’hépatectomie est remplacée par le CMS. Abréviation : CMS = échafaudage à matrice de collagène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Jour 3 de l’évaluation. (A) Observation macroscopique du site d’implantation le jour 3 de l’évaluation. Le foie implanté avec (étoile remplie) le CMS (ligne pointillée) n’a pas changé de couleur ou de taille. L’intestin grêle (étoile vide) et le reste des structures abdominales n’ont montré aucune altération. (B) Échantillon du foie (étoile remplie) et du CMS (flèche blanche) recouvert de graisse omentale (flèche rouge). Abréviation : CMS = échafaudage à matrice de collagène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5: Jour 14 de l’évaluation. (A) Observation macroscopique du site d’implantation le jour 14 de l’évaluation. Le tissu hépatique (étoile remplie) avec le CMS n’a pas changé de couleur ou de taille. L’intestin grêle (étoile vide) et le reste des structures et des organes de la cavité abdominale n’ont montré aucune altération. Échantillon du foie avec le CMS implanté: (B) vue antérieure; (C) vue postérieure/viscérale. Graisse omentale (flèche rouge) couvrant la zone. Le CMS a été intégré dans le tissu hépatique. La graisse omentale (flèche rouge) couvre principalement la zone de la vue antérieure. La ligne pointillée indique le site d’implantation de CMS; sutures (fil bleu). Abréviation : CMS = échafaudage à matrice de collagène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6: Jour 21 de l’évaluation. (A) Observation macroscopique du site d’implantation au jour de l’évaluation 21. Le foie receveur (étoile remplie) implanté avec le CMS (ligne pointillée) n’a pas changé de couleur ou de taille. L’intestin grêle (étoile vide) et le reste des structures abdominales n’ont montré aucune altération. (B) Échantillon du foie avec le CMS implanté (ligne pointillée) montrant des changements de taille et de forme. Abréviation : CMS = échafaudage à matrice de collagène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7: Histologie du foie et du foie avec CMS. (A) Foie normal (SHAM) montrant l’architecture tissulaire caractéristique. (B) Jour 3 de l’implantation de CMS montrant un tissu conjonctif laxiste dans les trabécules du CMS (ovales pointillés). (C) Zone de transition entre le foie natif (côté droit) et le CMS (côté gauche), avec les trabécules du CMS (flèche). (D) Foie natif en contact avec le CMS (lignes pointillées) au jour 21. (E) Foie normal avec la tache trichrome de Masson. F)Le CMS implanté dans le foie; invasion du tissu conjonctif laxiste au jour 3 (ovale en pointillés). (G) Le jour 14, foie natif avec les trabécules CMS, montrant une zone d’hépatocytes (étoile remplie) à l’extérieur du foie natif, indiquant que les hépatocytes natifs avaient migré à travers le CMS. (H) Le jour 21, les hépatocytes natifs ont migré vers le CMS (flèche). A et E: Barres d’échelle = 200 μm: 4x, B-D et F-H:Barres d’échelle = 100 μm: 10x. A-D: coloration H & E; E-H : Coloration trichrome de Masson. Abréviations : CMS = échafaudage à matrice de collagène ; H&E = hématoxyline et éosine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8: Histologie du foie et CMS. (A) Pool d’hépatocytes (flèche blanche) présents dans les trabécules de la CMS (flèche noire). Les hépatocytes sont irrigués par un vaisseau (étoile remplie). (B) Les hépatocytes (flèche blanche) ont migré et adhéré aux trabécules du CMS (flèche noire). (C) Un groupe d’hépatocytes (cercle pointillé) est observé entre deux trabécules (flèches noires) du CMS. (D) Les hépatocytes ont adhéré aux trabécules (flèches noires) de CMS en présence de tissu conjonctif laxiste (ovale pointillé). A et C: Barres d’échelle = 100 μm : 10x. B et D : Barres d’échelle = 20 μm : 40x. Abréviation : CMS = échafaudage à matrice de collagène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Jours | FEINTE | Hépatectomie | CMS d’implantation | |
| ALB (g/dL) | 3 | 1.4±0 | 1.25±0.07 | 1.4±0 |
| 14 | 1,3±0,5 | 1,85±0,07 | 1.8±0.14 | |
| 21 | 1.3±05 | 1.6±0.1 | 1,7± 0 | |
| ALT (UI/L) | 3 | 73±1,4 | 3,5±0,7 | 54,6±6,4 |
| 14 | 84±0 | 59,5±4,9 | 57±4.2 | |
| 21 | 57±0 | 73,5±14,8 | 73,5±14,8 | |
| AST (UI/L) | 3 | 106±1,4 | 80±6,6 | 90±1,4 |
| 14 | 127±5,5 | 94±21,2 | 83,5±17,6 | |
| 21 | 123,7±27,3 | 92,5±24,7 | 101±31,1 | |
| TUBERCULOSE (mg/dL) | 3 | 0,33±0,05 | 0,25±0,07 | 0,3±0 |
| 14 | 0,5±0 | 0,2±0 | 0,15±0 | |
| 21 | 0,3±0 | 0,4±0 | 0,4±0,14 | |
| DB (mg/dL) | 3 | 0,1±0 | 0,05±0,07 | 0,1±0 |
| 14 | 0,1±0 | 0,1±0 | 0,1±0 | |
| 21 | 0,1±0 | 0,1±0 | 0,1±0 |
Tableau 1 : Fonction hépatique. Des tests de la fonction hépatique ont été effectués pour les groupes simulés et expérimentaux avec et sans CMS à 3, 14 et 21 jours. Abréviations : CMS = échafaudage à matrice de collagène ; ALB = albumine; ALP = phosphatase alcaline; ALT= Alanine aminotransférase; AST = Aspartate aminotransférase; TB = bilirubine totale; DB = bilirubine directe.
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Discussion
La transplantation d’organes est le pilier du traitement chez les patients atteints de fibrose hépatique ou de cirrhose. Quelques patients bénéficient de cette procédure, ce qui rend nécessaire de fournir des alternatives thérapeutiques aux patients sur la liste d’attente. L’ingénierie tissulaire est une stratégie prometteuse qui utilise des échafaudages et des cellules à potentiel de régénération2,4,13. L’ablation d’une partie du foie est une étape critique de cette procédure en raison du saignement abondant de cet organe vascularisé. Par conséquent, l’hémostase du lit chirurgical doit être effectuée pour prévenir cette complication. En outre, la liaison du tissu hépatique au CMS, qui est essentielle pour assurer l’interaction tissu-biomatériau, est facilitée par l’utilisation de sutures. Cependant, cela doit être fait avec précaution pour éviter de déchirer le foie et de provoquer des saignements ultérieurs.
Bien que le biomatériau proposé ici soit d’origine bovine (xénogénique), il n’existe pas de données sur la réaction du biomatériau chez le rat, ce qui rend possible une hépatectomie sélective. En revanche, il a été démontré que le modèle d’hépatectomie 2/3 provoque la mort des animaux en raison de l’ablation d’une grande quantité de tissu hépatique14. De plus, nous avons développé un gabarit métallique en acier inoxydable car nous avions du mal à standardiser la taille dans l’hépatectomie et le CMS. La stérilisation du CMS a été difficile car les techniques existantes ont modifié la structure du collagène et ses propriétés biochimiques. Par conséquent, la stérilisation par la chaleur, le rayonnement gamma et l’oxyde d’éthylène a été explorée comme méthodes de stérilisation avant de déterminer que le plasma de peroxyde d’hydrogène était la technique optimale13.
Il est essentiel de déterminer la taille maximale du CMS qui pourrait être implanté dans le foie et d’évaluer la réponse biologique au niveau systémique. En outre, il est nécessaire d’optimiser et d’étudier l’efficacité de cette technique chez une espèce animale plus grande. De plus, il est important d’étudier les effets de l’implantation de CMS dans le foie pendant une période plus longue (>30 jours), ce qui permettra d’évaluer l’étendue de la biosorption du CMS et la régénération du tissu hépatique. En outre, les effets de l’implantation de CMS doivent être examinés dans des modèles animaux présentant des lésions hépatiques. Cette méthode d’implantation a ouvert la porte à des stratégies explorant la restauration de la forme et du volume des tissus réséqués, réduisant ainsi l’anesthésie, la durée chirurgicale et le temps de récupération4,13.
Le CMS a été obtenu à partir d’une source naturelle et a conservé ses propriétés physiques et chimiques par rapport aux biomatériaux synthétiques fabriqués à l’aide de méthodologies complexes, telles que la bio-impression ou l’électrofilage, qui ne sont ni biocompatibles ni bioabsorbables2,3. Le composant principal de ce CMS est le collagène de type I, qui est la principale protéine de l’ECM qui permet l’adhésion et la proliférationcellulaires 22. De plus, les trabécules des pores CMS permettent la migration cellulaire et le flux continu des facteurs de croissance, du sang et d’autres médiateurs du processus de régénération. Selon le tissu à réparer, ce groupe de recherche a de l’expérience dans la conception du CMS sous différentes formes, en préservant sa structure 3D. Par exemple, des CMS cylindriques ont été implantés dans l’urètre et les voies biliaires du chien chez les porcs et ont donné des résultats prometteurs dans la régénération tissulaire23,24.
L’implantation de ce CMS pourrait être un traitement alternatif pour stimuler la régénération tissulaire et rétablir l’équilibre fibrogenèse-fibrolyse dans la cirrhose du foie en raison de différentes étiologies (par exemple, virus, alcool, facteurs métaboliques). Des tests de prolifération, de migration et d’inflammation doivent être effectués pour identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires déclenchés par le CMS. En conclusion, cet article décrit une procédure reproductible pour l’hépatectomie ainsi que l’examen du processus de régénération par la xénoimplantation des biomatériaux.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents. Benjamín León-Mancilla est doctorant au Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) et il a reçu une bourse DGAPA-UNAM.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le personnel de l’installation pour animaux de laboratoire de l’unité de médecine expérimentale, l’infirmière Carolina Baños G. pour son soutien technique et chirurgical, Marco E. Gudiño Z. pour son soutien en microphotographies et Erick Apo pour son soutien en histologie du foie. Le Conseil national a soutenu cette recherche pour la science et la technologie(CONACyT),numéro de subvention SALUD-2016-272579 et le PAPIIT-UNAM TA200515.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anionic detergent | Alconox | Z273228 | |
| Biopsy cassettes | Leica | 3802453 | |
| Camera DMX | Nikon | DXM1200F | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | BD | 372412 | |
| Cover glasses 25 mm x 40 mm | Corning | 2980-224 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 200-M | CAS 17372-87-1 |
| Ethyl alcohol, pure | Sigma-Aldrich | 459836 | CAS 64-17-5 |
| Flunixine meglumide | MSD | Q-0273-035 | |
| Glass slides 75 mm x 25 mm | Corning | 101081022 | |
| Hematoxylin | Merck | H9627 | CAS 571-28-2 |
| Hydrochloric acid 37% | Merck | 339253 | CAS 7647-01-0 |
| Ketamine | Pisa agropecuaria | Q-7833-028 | |
| Light microscope | Nikon | Microphoto-FXA | |
| Microsurgery stereomicroscope | Zeiss | OPMI F170 | |
| Microtainer yellow cape | Beckton Dickinson | 365967 | |
| Microtome | Leica | RM2125 | |
| Model animal: Wistar rats | Universidad Nacional Autónoma de México | ||
| Nylon 3-0 (Dermalon) | Covidien | 1750-41 | |
| Polypropylene 7-0 | Atramat | SE867/2-60 | |
| Povidone-iodine10% cutaneous solution | Diafra SA de CV | 1.37E+86 | |
| Scanning electronic microscope | Zeiss | DSM-950 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J. T. Baker | 3722-01 | CAS 1310-73-2 |
| Software ACT-1 | Nikon | Ver 2.70 | |
| Stereomicroscope | Leica | EZ4Stereo 8X-35X | |
| Sterrad 100S | Johnson and Johnson | 99970 | |
| Surgipath paraplast | Leica | 39601006 | |
| Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm) | SensiMedical | LAN-078-077 | |
| Tissue Processor (Histokinette) | Leica | TP1020 | |
| Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder) | Sakura Finetek USA | 5229 | |
| Trichrome stain kit | Sigma-Aldrich | HT15 | |
| Unicell DxC600 Analyzer | Beckman Coulter | BC 200-10 | |
| Xylazine | Pisa agropecuaria | Q-7833-099 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | CAS 1330-20-7 |
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