Summary
Le malattie del fegato sono indotte da molte cause che promuovono la fibrosi o la cirrosi. Il trapianto è l'unica opzione per recuperare la salute. Tuttavia, data la scarsità di organi trapiantabili, è necessario esplorare alternative. La nostra ricerca propone l'impianto di scaffold di collagene nel tessuto epatico da un modello animale.
Abstract
Le malattie del fegato sono la principale causa di morte in tutto il mondo. Il consumo eccessivo di alcol, una dieta ricca di grassi e l'infezione da virus dell'epatite C promuovono la fibrosi, la cirrosi e / o il carcinoma epatocellulare. Il trapianto di fegato è la procedura clinicamente raccomandata per migliorare e prolungare la durata della vita dei pazienti nelle fasi avanzate della malattia. Tuttavia, solo il 10% dei trapianti ha successo, con disponibilità di organi, procedure prechirurgiche e postchirurgiche e costi elevati direttamente correlati a tale risultato. Gli scaffold a matrice extracellulare (ECM) sono emersi come alternativa per il ripristino dei tessuti. La biocompatibilità e l'accettazione dell'innesto sono le principali caratteristiche benefiche di tali biomateriali. Sebbene la capacità di ripristinare le dimensioni e la corretta funzione del fegato sia stata valutata in modelli di epatectomia epatica, l'uso di scaffold o di qualche tipo di supporto per sostituire il volume della massa epatica estirpata non è stato valutato.
L'epatectomia parziale è stata eseguita in un fegato di ratto con lo xenoimpianto di uno scaffold a matrice di collagene (CMS) da un condilo bovino. Il tessuto del lobo epatico sinistro è stato rimosso (circa il 40%) e una percentuale uguale di CMS è stata impiantata chirurgicamente. I test di funzionalità epatica sono stati valutati prima e dopo la procedura chirurgica. Dopo i giorni 3, 14 e 21, gli animali sono stati sottoposti a eutanasia e sono state eseguite valutazioni macroscopiche e istologiche. Nei giorni 3 e 14, il tessuto adiposo è stato osservato intorno al CMS, senza evidenza clinica di rigetto o infezione, così come la neoformazione dei vasi e il riassorbimento della CMS al giorno 21. C'erano prove istologiche di un processo infiammatorio insignificante e della migrazione delle cellule adiacenti al CMS, osservate con l'ematossilina e l'eosina (H & E) e la colorazione tricroma di Masson. Il CMS ha dimostrato di funzionare bene nel tessuto epatico e potrebbe essere un'alternativa utile per studiare la rigenerazione e la riparazione dei tessuti nelle malattie epatiche croniche.
Introduction
Il fegato è uno degli organi più importanti coinvolti nel mantenimento dell'omeostasi e della produzione di proteine1. Sfortunatamente, la malattia del fegato è la principale causa di morte in tutto il mondo. Nelle fasi avanzate del danno epatico, che includono cirrosi e carcinoma epatocellulare, il trapianto di fegato è la procedura clinicamente raccomandata. Tuttavia, a causa della scarsità di donatori e del basso tasso di trapianti di successo, sono state sviluppate nuove tecniche di ingegneria tissutale (TE) e medicina rigenerativa (RM)2,3.
TE prevede l'uso di cellule staminali, scaffold e fattori dicrescita 4 per promuovere il ripristino di organi e tessuti infiammati, fibrotici ed edematosi1,5,6. I biomateriali utilizzati negli scaffold imitano l'ECM nativo, fornendo i segnali fisici, chimici e biologici per il rimodellamento cellulare guidato7. Il collagene è una delle proteine più abbondanti ottenute dal derma, dal tendine, dall'intestino e dal pericardio8,9. Inoltre, il collagene può essere ottenuto come biopolimero per produrre scaffold bi- e tridimensionali attraverso bioprinting o elettrofilatura10,11. Questo gruppo è il primo a segnalare l'uso di collagene da una fonte ossea per la rigenerazione del tessuto epatico. Un altro studio riporta l'uso di scaffold sintetizzati dal collagene bovino, che è stato ottenuto dalla pelle, con pori omogenei e strettamente situati, senza alcuna comunicazione tra loro12.
La decellularizzazione preserva l'ECM nativo, permettendo la successiva incorporazione di cellule con potenziale di cellule staminali13,14. Tuttavia, questa procedura è ancora in fase sperimentale nel fegato, nel cuore, nei reni, nell'intestino tenue e nella vescica urinaria da topi, ratti, conigli, maiali, pecore, bovini e cavalli3,14. Attualmente, il volume di massa epatica resecato non viene sostituito in nessuno dei modelli di epatectomia animale. Tuttavia, l'uso di un supporto o di una rete aggiuntiva (biomateriali) che consente la proliferazione cellulare e l'angiogenesi potrebbe essere essenziale per il rapido ripristino delle funzioni parenchimali epatiche. Pertanto, gli scaffold potrebbero essere impiegati come approcci alternativi per rigenerare o riparare i tessuti nelle malattie epatiche croniche, a loro volta, eliminando le limitazioni dovute alla donazione e le complicanze cliniche del trapianto di fegato.
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Protocol
La presente ricerca è stata approvata dal comitato etico della Scuola di Medicina (DI/115/2015) presso l'Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) e dal comitato etico dell'Hospital General de Mexico (CI/314/15). L'istituzione soddisfa tutte le specifiche tecniche per la produzione, la cura e l'uso di animali da laboratorio ed è legalmente certificata dalla legge nazionale (NOM-062-ZOO-1999). Ratti Wistar maschi del peso di 150-250 g (6-8 settimane) sono stati ottenuti dalla Laboratory Animal Facility della School of Medicine, UNAM, per questo studio.
1. Ottenere scaffold a matrice di collagene dal femore bovino
- Ottenere il condiolo dal femore bovino da un macello certificato dalle autorità sanitarie e agricole del Messico.
- Sezionare attentamente il grasso del condiolo, il muscolo e la cartilagine con uno strumento chirurgico. Tagliare i frammenti del condilo in frammenti di 3 cm x3 cm usando un taglierino e pulire il grasso e il sangue con un asciugamano. Lavare i frammenti di condiolo con acqua.
- Far bollire (92 °C) i frammenti con 1 L di un detergente anionico (10 g/L) per 30 min. Lavare due volte i frammenti del condiolo per rimuovere eventuali residui del detergente anionico.
- Asciugare i frammenti di condilo per 3 ore utilizzando carta da filtro (0,5 mm).
- Preparare un CMS triangolare (1 cm x1 cm x1 cm) di spessore 0,5 cm dai frammenti menzionati al punto 1.1 (Figura 1A).
- Demineralizzare i frammenti in 100 mL di 0,5 M HCl per 10 min con agitazione costante. Rimuovere l'HCl.
NOTA: Neutralizzare l'HCl con idrossido di sodio (10 M). - Risciacquare i frammenti tre volte con 100 ml di acqua distillata, 15 minuti ogni volta, con agitazione costante. Asciugare il CMS con carta da filtro (0,5 mm) per 1 ora.
- Utilizzare uno stereomicroscopio15 per analizzare le proprietà strutturali del CMS (dimensione dei pori, formazione dei pori e interconnessione porosa) (Figura 1B).
- Utilizzare un microscopio elettronico a scansione16 per analizzare la superficie ruvida delle trabecole CMS (Figura 1C).
- Utilizzare lo strumento di dissezione per la miscelazione e lo stiramento per valutare i cambiamenti meccanici (plasticità e flessibilità) del CMS (Figura 1D).
- Imballare il CMS nella custodia di sterilizzazione e sterilizzarlo con plasma di perossido di idrogeno per 38 minuti. Conservare il CMS sterile nella confezione originale in una zona asciutta a 20-25 °C fino all'uso.
- Demineralizzare i frammenti in 100 mL di 0,5 M HCl per 10 min con agitazione costante. Rimuovere l'HCl.
2. Preparazione dell'area chirurgica e manipolazione e preparazione del modello animale
- Disinfettare l'area chirurgica, il piano di lavoro, il microscopio microchirurgico e il sedile con una soluzione di clorexidina al 2%. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici, spugne chirurgiche, tamponi e teli chirurgici monouso attraverso la sterilizzazione a caldo (121 °C/30 min/100 kPa)
- Assegnare i ratti (n = 5) in tre gruppi di cinque ratti per gruppo: 1. sham, 2. epatectomia e 3. epatectomia più CMS e seguire tutti i gruppi nei giorni 3, 14 e 21 giorni.
- Somministrare ketamina (35 mg/kg) e xilazina (2,5 mg/kg) per via intramuscolare nell'arto posteriore.
NOTA: Il periodo sedativo dura in genere 30-40 minuti. - Rasare la pelle addominale (5 cm x 2 cm) usando sapone chirurgico e una lama a doppio taglio e disinfettare la pelle con una soluzione topica di povidone-iodio al 10% in tre cicli17.
- Posizionare l'animale su una piastra calda in posizione dorsale decubito, con il collo iperesteso per mantenere una via aerea permeabile (Figura 2).
- Valutare la profondità dell'anestesia attraverso il pattern respiratorio e la perdita del riflesso di astinenza negli arti.
- Posizionare un drappo chirurgico monouso intorno alla pelle rasata e praticare un'incisione (2,5 cm) sulla linea degli albous con un bisturi, utilizzando il processo xifoide come punto di riferimento. Evitare il vaso sanguigno della parete addominale per prevenire il sanguinamento.
- Metti il divaricatore addominale in posizione e osserva la cavità addominale. Usando la pinica di dissezione, estrarre il lobo epatico sinistro e posizionarlo sulla piastra metallica (Figura 3A).
NOTA: Nel gruppo fittizio, estrarre solo il lobo epatico sinistro e quindi restituire il fegato alla cavità addominale. Suturare la parete addominale e la pelle con una sutura di nylon 3-0. - Nei gruppi sperimentali con e senza CMS, utilizzare una lama di bisturi e una lama di bisturi sterile (# 15) per eseguire l'epatectomia (circa il 40%) con due tagli. Utilizzare una smussata metallica triangolare (1 cm x 1 cm x 1 cm) per eseguire l'epatectomia (Figura 3B).
- Per prevenire il sanguinamento del fegato, mantenere la compressione chirurgica con un tampone sul bordo del fegato per 5 minuti.
- Idratare il CMS in soluzione salina sterile per 20 minuti prima della procedura chirurgica. Impiantare il CMS nel sito di epatectomia con quattro punti di sutura tra il tessuto epatico e il CMS per prevenire lo spostamento del biomateriale. Utilizzare suture di polipropilene non assorbibili 7-0 (Figura 3C).
NOTA: Non rimuovere le suture in un secondo intervento chirurgico; le suture possono essere utilizzate come riferimento per identificare il sito di impianto del CMS. - Riportare il fegato nella cavità addominale e suturare la parete addominale e la pelle con una sutura di nylon 3-0. Pulire l'incisione chirurgica con una spugna chirurgica imbevuta di iodio in due round. Osservare e monitorare i segni vitali degli animali.
- Somministrare ketamina (35 mg/kg) e xilazina (2,5 mg/kg) per via intramuscolare nell'arto posteriore.
3. Cura postoperatoria
- Somministrare meglumina flunixin (2,5 mg/kg) per via intramuscolare nell'arto posteriore. Somministrare analgesici come approvato dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.
- Per il recupero dell'anestesia, posizionare gli animali in singole scatole di policarbonato con lettiera per animali da laboratorio in un'area priva di rumore con controllo della temperatura (23 ° C).
- Osservare il recupero degli animali e monitorare il loro consumo di acqua e cibo per 2 ore. Monitorare gli animali post-operatoriamente come approvato dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.
4. Valutazione della funzionalità epatica nel siero
- Raccogliere campioni di sangue (500 μL) dalle vene laterali della coda degli animali anestetizzati prima della procedura chirurgica (valori basali) e nei giorni di valutazione 3, 14 e 21.
- Centrifugare i campioni di sangue a 850 × g/10 min a temperatura ambiente (23 °C); separare il siero e conservarlo a -80°C fino all'uso.
- Eseguire un pannello di test di funzionalità epatica: albumina sierica (ALB), fosfatasi alcalina (ALP), alanina aminotransferasi (ALT), aspartato aminotransferasi (AST), bilirubina totale (TB) e bilirubina diretta (DB)(Tabella 1).
5. Eutanasia e gestione dei tessuti
- Anestetizzare gli animali per ogni valutazione (giorni 3, 14 e 21) seguendo il protocollo sopra descritto.
- Eutanasia tramite metodi approvati dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.
- Eseguire un'incisione (5-6 cm) sulla linea degli albous con un bisturi per osservare gli organi della cavità addominale e scattare fotografie dell'area di epatectomia del sham e dei gruppi sperimentali, con e senza cms.
- Prelevare campioni di fegato (2 cm x 2 cm; 0,40-0,45 g) da tutti gli animali del gruppo di studio e metterli in una soluzione di formaldeide al 4% per 24 ore per la successiva valutazione istologica.
6. Analisi istologica
- Preservare i tessuti epatici in formaldeide al 4% e disidratare il tessuto utilizzando una serie di concentrazioni alcoliche (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); metterli in xilene (1h) e incorporarli nella paraffina16.
- Tagliare i blocchi di paraffina con un microtomo in sezioni spesse 4 μm per la preparazione di otto diapositive.
- Eseguire la colorazione tricromatica di H&E e Masson16.
- Osservare le sezioni colorate al microscopio ottico per selezionare le aree rappresentative del fegato, con e senza CMS. Ottenere fotomicrografie con ingrandimento 4x, 10x e 40x ed elaborare le immagini utilizzando l'apposito software18 (vedere la Tabella dei Materiali).
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Representative Results
La demineralizzazione ossea influisce sulle proprietà meccaniche del CMS senza alterare la forma originale o l'interconnessione dei suoi pori. CMS può avere qualsiasi forma e, quindi, può essere regolato in base alle dimensioni e alla forma dell'organo o del tessuto selezionato19. Nel presente protocollo, abbiamo utilizzato un CMS triangolare (Figura 1A-D). Un modello di ratto è stato utilizzato per valutare la capacità rigenerativa dello xenoimplant CMS nel fegato. Sebbene il fegato sia un organo friabile e molle, la procedura chirurgica eseguita in questo protocollo ha assicurato che il CMS rimanesse in posizione (Figura 2 e Figura 3A-C). L'epatectomia parziale del 40% del lobo sinistro ha permesso di valutare una porzione dell'organo, mantenendo intatto il resto del fegato, in modo da poter confrontare i cambiamenti nell'impianto e il parenchima nativo. Inoltre, abbiamo ottenuto campioni di sangue per valutare la funzionalità epatica prima e dopo l'impianto di CMS.
Non ci sono state differenze nelle concentrazioni basali dei parametri biochimici tra il gruppo sham e il gruppo sperimentale con e senza impianto di CMS a 3 e 14 giorni; sono rimasti entro i valori di riferimento (ALB: 0,43-2,41 g/dL; ALP: 134-357,3 U/L; ALT: 41-83,1 UI/L; AST: 61,4-276,2 UI/L; TB: 0,01-0,43 mg/dL; DB: 0,1 mg/dL)20. Inoltre, non ci sono state differenze nei livelli di albumina, ALP, ALT, AST, TB e DB tra il gruppo sham e i gruppi sperimentali a 21 giorni, indicando che il CMS non interrompe la funzionalità epatica (Tabella 1).
Durante l'eutanasia, la laparotomia esplorativa ha rivelato il colore tipico e le dimensioni e la forma corrette del fegato. Nessuna infiammazione o infezione è stata osservata nel sito di impianto in nessuno dei casi. Il giorno 3, non ci sono stati cambiamenti nell'organo in relazione alla cavità addominale (Figura 4A). In una porzione che conteneva tessuto epatico e CMS, è stato osservato che il sangue si è infiltrato nella CMS, con grasso omentale aderente incipiente (Figura 4B). Il giorno 14, la quantità di grasso è aumentata; c'era neoformazione dei vasi sanguigni e l'integrazione del CMS nel tessuto epatico ricevente ma nessun cambiamento nell'intestino tenue o negli organi della cavità addominale (Figura 5A). Il grasso omentale era più alto nella zona anteriore (Figura 5B) rispetto alla zona viscerale (Figura 5C) nel sito di impianto cms. Nel giorno di valutazione 21, l'incorporazione di CMS nel fegato era più evidente (Figura 6A). L'aumento del grasso omentale potrebbe essere utilizzato come indicatore del progresso della rigenerazione, in quanto è una fonte di cellule staminali mesenchimali21. Inoltre, a 21 giorni, il fegato presentava aree dense che corrispondevano alla degradazione e all'assorbimento, modificando le dimensioni e la forma originale (Figura 6B).
Per analizzare la microstruttura del fegato con l'impianto CMS, abbiamo eseguito l'analisi istologica di un frammento rappresentativo di tessuto dal sito di impianto, che è stato confrontato con il tessuto del lobo epatico destro (controllo). Le biopsie eseguite nei giorni 3, 14 e 21 sono state elaborate e sottoposte alla colorazione tricroma di H & E e Masson. La normale struttura del parenchima epatico è stata osservata nel gruppo fittizio al giorno 21 (Figura 7A e Figura 7E). Il giorno 3, l'analisi istologica ha mostrato che la presenza del CMS nel fegato non promuoveva una reazione da corpo estraneo ed è stata osservata la cospicua presenza di tessuto connettivo lassista (Figura 7B e Figura 7F). Nei giorni 14 e 21, il tessuto connettivo lassista era più abbondante, con le trabecole CMS circondate da epatociti, suggerendo che gli epatociti erano migrati verso il CMS (Figura 7C e Figura 7G; Figura 7D e Figura 7H). I risultati hanno anche mostrato aree di epatociti che sono stati irrigati da un vaso (Figura 8A). Un'attenta ispezione ha rivelato che gli epatociti che avevano aderito alle trabecole CMS erano talvolta circondati da tessuto connettivo lassista (Figura 8B-D). Due patologi indipendenti in doppio cieco hanno eseguito l'analisi istopatologica. Sono in corso saggi di immunoistochimica e di reazione a catena della polimerasi per valutare le diverse proteine e geni correlati al processo di rigenerazione epatica.
Pertanto, le osservazioni macroscopiche e microscopiche e i valori biochimici supportano la nostra proposizione che il CMS è un biomateriale ideale per sostenere e promuovere la rigenerazione del fegato. Tuttavia, l'impianto di CMS deve essere valutato per più di 21 giorni per determinarne il tempo di assorbimento e completare il ripristino del tessuto epatico. Inoltre, dovrebbero essere condotti studi che valutano le diverse proteine e geni correlati alla rigenerazione epatica in presenza del CMS.
Figura 1: Campione osseo e CMS. (A) Un campione triangolare del campione osseo è stato utilizzato per preparare il CMS. (B) Una visione dettagliata dei pori e dell'interconnessione o connessione trabecolare del CMS, come osservato al microscopio elettronico. (C) Il CMS, visto sotto uno stereomicroscopio. (D) La manipolazione CMS con uno strumento è stata effettuata per verificare la modifica delle proprietà meccaniche. Abbreviazione: CMS = scaffold a matrice di collagene. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Preparazione dell'animale per l'intervento chirurgico. L'animale si trova nella posizione dorsale del decubito, mostrando la zona addominale rasata, preparata per l'epatectomia e l'impianto di CMS. Abbreviazione: CMS = scaffold a matrice di collagene. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Epatectomia del lobo sinistro del fegato. (A) Il lobo sinistro è stato estratto e posto sulla piastra metallica per eseguire l'epatectomia. (B) L'epatectomia del 40% del lobo sinistro è stata eseguita in forma triangolare, come il CMS. (C) L'area dell'epatectomia è sostituita dal CMS. Abbreviazione: CMS = scaffold a matrice di collagene. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Giorno 3 della valutazione. (A) Osservazione macroscopica del sito di impianto il giorno di valutazione 3. Il fegato impiantato con (stella riempita) il CMS (linea tratteggiata) non è cambiato di colore o dimensioni. L'intestino tenue (stella vuota) e il resto delle strutture addominali non hanno mostrato alterazioni. (B) Campione del fegato (stella riempita) e del CMS (freccia bianca) coperto di grasso omentale (freccia rossa). Abbreviazione: CMS = scaffold a matrice di collagene. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Giorno 14 di valutazione. (A) Osservazione macroscopica del sito di impianto il giorno di valutazione 14. Il tessuto epatico (stella riempita) con il CMS non ha cambiato colore o dimensioni. L'intestino tenue (stella vuota) e il resto delle strutture e degli organi della cavità addominale non hanno mostrato alterazioni. Campione del fegato con il CMS impiantato: (B) vista anteriore; (C) vista posteriore/viscerale. Grasso omentale (freccia rossa) che copre l'area. Il CMS è stato integrato nel tessuto epatico. Il grasso omentale (freccia rossa) copre principalmente l'area nella vista anteriore. La linea tratteggiata indica il sito di impianto del CMS; suture (filo blu). Abbreviazione: CMS = scaffold a matrice di collagene. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Giorno 21 di valutazione. (A) Osservazione macroscopica del sito di impianto al giorno di valutazione 21. Il fegato ricevente (stella riempita) impiantato con il CMS (linea tratteggiata) non ha cambiato colore o dimensione. L'intestino tenue (stella vuota) e il resto delle strutture addominali non hanno mostrato alterazioni. (B) Campione del fegato con il CMS impiantato (linea tratteggiata) che mostra cambiamenti di dimensioni e forma. Abbreviazione: CMS = scaffold a matrice di collagene. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Istologia del fegato e del fegato con CMS. (A) Fegato normale (SHAM) che mostra l'architettura caratteristica del tessuto. (B)Giorno 3 dell'impianto di CMS che mostra tessuto connettivo lassista nelle trabecole del CMS (ovali tratteggiati). (C) Zona di transizione tra il fegato nativo (lato destro) e il CMS (lato sinistro), con le trabecole del CMS (freccia). (D) Fegato nativo a contatto con il CMS (linee tratteggiate) al giorno 21. (E) Fegato normale con colorazione tricroma di Masson. (F) Il CMS impiantato nel fegato; invasione del tessuto connettivo lassista al giorno 3 (ovale tratteggiato). (G) Il giorno 14, fegato nativo con le trabecole CMS, che mostra un'area di epatociti (stella riempita) al di fuori del fegato nativo, indicando che gli epatociti nativi erano migrati attraverso il CMS. (H) Il giorno 21, gli epatociti nativi sono migrati verso il CMS (freccia). A ed E: Barre di scala = 200 μm: 4x, B-D e F-H: Barre di scala = 100 μm: 10x. A-D: colorazione H&E; E-H: Colorazione tricromatica di Masson. Abbreviazioni: CMS = scaffold a matrice di collagene; H&E = ematossilina ed eosina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Istologia del fegato e CMS. (A) Pool di epatociti (freccia bianca) presenti nelle trabecole del CMS (freccia nera). Gli epatociti sono irrigati da un vaso (stella piena). (B) Gli epatociti (freccia bianca) sono migrati e hanno aderito alle trabecole del CMS (freccia nera). (C) Un gruppo di epatociti (cerchio tratteggiato) si osserva tra due trabecole (frecce nere) del CMS. (D) Gli epatociti hanno aderito alle trabecole (frecce nere) della CMS in presenza di tessuto connettivo lassista (ovale tratteggiato). A e C: Barre di scala = 100 μm: 10x. B e D: Barre di scala = 20 μm: 40x. Abbreviazione: CMS = scaffold a matrice di collagene. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Giorni | FINTO | Hepatectomy | Impianto CMS | |
| ALB (g/dL) | 3 | 1.4±0 | 25±01.07 | 1.4±0 |
| 14 | 1.3±0.5 | 07±1.85 | 1.8±0.14 | |
| 21 | 05±1.3 | 1.6±0.1 | 1.7± 0 | |
| ALT (UI/L) | 3 | 73±1,4 | 3.5±0.7 | 54,6±6,4 |
| 14 | 84±0 | 59.5±4.9 | 57±4,2 | |
| 21 | 57±0 | 73,5±14,8 | 73,5±14,8 | |
| AST (UI/L) | 3 | 106±1,4 | 80±6,6 | 90±1,4 |
| 14 | 127±5,5 | 94±21,2 | 83,5±17,6 | |
| 21 | 123,7±27,3 | 92,5±24,7 | 31±101,1 | |
| TB (mg/dL) | 3 | 0.33±0.05 | 0.25±0.07 | 0,3±0 |
| 14 | 0,5±0 | 0,2±0 | 0,15±0 | |
| 21 | 0,3±0 | 0,4±0 | 0.4±0.14 | |
| DB (mg/dL) | 3 | 0,1±0 | 0.05±0.07 | 0,1±0 |
| 14 | 0,1±0 | 0,1±0 | 0,1±0 | |
| 21 | 0,1±0 | 0,1±0 | 0,1±0 |
Tabella 1: Funzionalità epatica. I test di funzionalità epatica sono stati eseguiti per i gruppi fittizi e sperimentali con e senza CMS a 3, 14 e 21 giorni. Abbreviazioni: CMS = scaffold a matrice di collagene; ALB = Albumina; ALP = fosfatasi alcalina; ALT= Alanina aminotransferasi; AST = Aspartato aminotransferasi; TB = Bilirubina totale; DB = bilirubina diretta.
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Discussion
Il trapianto di organi è il pilastro del trattamento nei pazienti con fibrosi epatica o cirrosi. Alcuni pazienti beneficiano di questa procedura, rendendo necessario fornire alternative terapeutiche per i pazienti in lista d'attesa. L'ingegneria tissutale è una strategia promettente che impiega scaffold e cellule con potenziale rigenerativo2,4,13. La rimozione di una porzione del fegato è un passo critico in questa procedura a causa del sanguinamento abbondante di questo organo vascolarizzato. Pertanto, l'emostasi del letto chirurgico deve essere eseguita per prevenire questa complicanza. Inoltre, il legame del tessuto epatico al CMS, che è essenziale per garantire l'interazione tessuto-biomateriale, è facilitato attraverso l'uso di suture. Tuttavia, deve essere fatto con attenzione per evitare di strappare il fegato e causare sanguinamento successivo.
Sebbene il biomateriale qui proposto sia di origine bovina (xenogenico), non ci sono dati di reazione del biomateriale nei ratti, rendendo possibile l'epatectomia selettiva. Al contrario, il modello di epatectomia 2/3 ha dimostrato di causare la morte degli animali a causa della rimozione di una grande quantità di tessutoepatico 14. Inoltre, abbiamo sviluppato un modello metallico in acciaio inossidabile perché abbiamo avuto difficoltà a standardizzare le dimensioni nell'epatectomia e nel CMS. La sterilizzazione del CMS è stata impegnativa perché le tecniche esistenti hanno modificato la struttura del collagene e le sue proprietà biochimiche. Quindi, la sterilizzazione mediante calore, radiazioni gamma e ossido di etilene è stata esplorata come metodi di sterilizzazione prima di determinare che il plasma di perossido di idrogeno era la tecnica ottimale13.
È essenziale determinare la dimensione massima del CMS che potrebbe essere impiantato nel fegato e valutare la risposta biologica a livello sistemico. Inoltre, è necessario ottimizzare e studiare l'efficacia di questa tecnica in una specie animale più grande. Inoltre, è importante indagare gli effetti dell'impianto di CMS nel fegato per un periodo più lungo (>30 giorni), che consentirà la valutazione dell'entità del biosorpoggio della CMS e la rigenerazione del tessuto epatico. Inoltre, gli effetti dell'impianto cms devono essere esaminati in modelli animali con danni al fegato. Questo metodo di impianto ha aperto la porta a strategie che esplorano il ripristino della forma e del volume del tessuto resecato, riducendo così l'anestesia, la durata chirurgica e il tempo di recupero4,13.
Il CMS è stato ottenuto da una fonte naturale e ha conservato le sue proprietà fisiche e chimiche rispetto ai biomateriali sintetici realizzati utilizzando metodologie complesse, come il bioprinting o l'elettrofilatura, che non sono biocompatibili o bioassorbibili2,3. Il componente principale di questo CMS è il collagene di tipo I, che è la principale proteina dell'ECM che consente l'adesione e la proliferazione cellulare22. Inoltre, le trabecole dei pori CMS consentono la migrazione cellulare e il flusso continuo di fattori di crescita, sangue e altri mediatori del processo di rigenerazione. A seconda del tessuto da riparare, questo gruppo di ricerca ha esperienza nella progettazione del CMS in diverse forme, preservandone la struttura 3D. Ad esempio, i CMS cilindrici sono stati impiantati nell'uretra del cane e nel dotto biliare nei suini e hanno prodotto risultati promettenti nella rigenerazione dei tessuti23,24.
L'impianto di questo CMS potrebbe essere un trattamento alternativo per stimolare la rigenerazione dei tessuti e ripristinare l'equilibrio fibrogenesi-fibrolisi nella cirrosi epatica dovuta a diverse eziologie (ad esempio, virus, alcol, fattori metabolici). I saggi di proliferazione, migrazione e infiammazione devono essere eseguiti per identificare i meccanismi molecolari e cellulari innescati dal CMS. In conclusione, questo articolo descrive una procedura riproducibile per l'epatectomia e l'esame del processo di rigenerazione attraverso lo xenoimpianto di biomateriali.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti. Benjamín León-Mancilla è uno studente di dottorato del Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) e ha ricevuto la borsa di studio DGAPA-UNAM.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il personale della Laboratory Animal Facility dell'Unità di Medicina Sperimentale, l'infermiera Carolina Baños G. per il supporto tecnico e chirurgico, Marco E. Gudiño Z. per il supporto in microfotografia e Erick Apo per il supporto nell'istologia epatica. Il Consiglio Nazionale ha sostenuto questa ricerca per la Scienza e la Tecnologia(CONACyT),il numero di sovvenzione SALUD-2016-272579 e il PAPIIT-UNAM TA200515.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anionic detergent | Alconox | Z273228 | |
| Biopsy cassettes | Leica | 3802453 | |
| Camera DMX | Nikon | DXM1200F | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | BD | 372412 | |
| Cover glasses 25 mm x 40 mm | Corning | 2980-224 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 200-M | CAS 17372-87-1 |
| Ethyl alcohol, pure | Sigma-Aldrich | 459836 | CAS 64-17-5 |
| Flunixine meglumide | MSD | Q-0273-035 | |
| Glass slides 75 mm x 25 mm | Corning | 101081022 | |
| Hematoxylin | Merck | H9627 | CAS 571-28-2 |
| Hydrochloric acid 37% | Merck | 339253 | CAS 7647-01-0 |
| Ketamine | Pisa agropecuaria | Q-7833-028 | |
| Light microscope | Nikon | Microphoto-FXA | |
| Microsurgery stereomicroscope | Zeiss | OPMI F170 | |
| Microtainer yellow cape | Beckton Dickinson | 365967 | |
| Microtome | Leica | RM2125 | |
| Model animal: Wistar rats | Universidad Nacional Autónoma de México | ||
| Nylon 3-0 (Dermalon) | Covidien | 1750-41 | |
| Polypropylene 7-0 | Atramat | SE867/2-60 | |
| Povidone-iodine10% cutaneous solution | Diafra SA de CV | 1.37E+86 | |
| Scanning electronic microscope | Zeiss | DSM-950 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J. T. Baker | 3722-01 | CAS 1310-73-2 |
| Software ACT-1 | Nikon | Ver 2.70 | |
| Stereomicroscope | Leica | EZ4Stereo 8X-35X | |
| Sterrad 100S | Johnson and Johnson | 99970 | |
| Surgipath paraplast | Leica | 39601006 | |
| Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm) | SensiMedical | LAN-078-077 | |
| Tissue Processor (Histokinette) | Leica | TP1020 | |
| Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder) | Sakura Finetek USA | 5229 | |
| Trichrome stain kit | Sigma-Aldrich | HT15 | |
| Unicell DxC600 Analyzer | Beckman Coulter | BC 200-10 | |
| Xylazine | Pisa agropecuaria | Q-7833-099 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | CAS 1330-20-7 |
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