Summary
Lebererkrankungen werden durch viele Ursachen verursacht, die Fibrose oder Zirrhose fördern. Die Transplantation ist die einzige Option zur Wiederherstellung der Gesundheit. Angesichts des Mangels an transplantierbaren Organen müssen jedoch Alternativen erforscht werden. Unsere Forschung schlägt die Implantation von Kollagengerüsten in Lebergewebe aus einem Tiermodell vor.
Abstract
Lebererkrankungen sind weltweit die häufigste Todesursache. Übermäßiger Alkoholkonsum, eine fettreiche Ernährung und eine Hepatitis-C-Virusinfektion fördern Fibrose, Zirrhose und / oder hepatozelluläres Karzinom. Die Lebertransplantation ist das klinisch empfohlene Verfahren zur Verbesserung und Verlängerung der Lebensdauer von Patienten in fortgeschrittenen Krankheitsstadien. Allerdings sind nur 10% der Transplantationen erfolgreich, wobei die Verfügbarkeit von Organen, prächirurgische und postoperative Eingriffe und erhöhte Kosten direkt mit diesem Ergebnis korrelieren. Extrazelluläre Matrix (ECM) -Gerüste haben sich als Alternative für die Gewebewiederherstellung herausgestellt. Biokompatibilität und Transplantatakzeptanz sind die wichtigsten vorteilhaften Eigenschaften dieser Biomaterialien. Obwohl die Fähigkeit, die Größe und korrekte Funktion der Leber wiederherzustellen, in Leberhepatektomiemodellen bewertet wurde, wurde die Verwendung von Gerüsten oder einer Art Unterstützung, um das Volumen der ausgedienten Lebermasse zu ersetzen, nicht bewertet.
Die partielle Hepatektomie wurde in einer Rattenleber mit der Xenoimplantation eines Kollagenmatrix-Gerüsts (CMS) aus einem Rinderkondylus durchgeführt. Linkes Leberlappengewebe wurde entfernt (ca. 40%), und ein gleicher Anteil von CMS wurde chirurgisch implantiert. Leberfunktionstests wurden vor und nach dem chirurgischen Eingriff ausgewertet. Nach den Tagen 3, 14 und 21 wurden die Tiere eingeschläfert und makroskopische und histologische Auswertungen durchgeführt. An den Tagen 3 und 14 wurde Fettgewebe um das CMS herum beobachtet, ohne klinische Hinweise auf Abstoßung oder Infektion, ebenso wie die Gefäßneubildung und die CMS-Reabsorption an Tag 21. Es gab histologische Hinweise auf einen unbedeutenden Entzündungsprozess und die Migration benachbarter Zellen zum CMS, beobachtet mit dem Hämatoxylin und Eosin (H & E) und der Trichromfärbung von Masson. Es wurde gezeigt, dass das CMS im Lebergewebe gut funktioniert und eine nützliche Alternative für die Untersuchung der Geweberegeneration und -reparatur bei chronischen Lebererkrankungen sein könnte.
Introduction
Die Leber ist eines der wichtigsten Organe, die an der Aufrechterhaltung der Homöostase und der Proteinproduktion beteiligt sind1. Leider sind Lebererkrankungen weltweit die häufigste Todesursache. In fortgeschrittenen Stadien der Leberschädigung, zu denen Zirrhose und hepatozelluläres Karzinom gehören, ist die Lebertransplantation das klinisch empfohlene Verfahren. Aufgrund des Mangels an Spendern und der geringen Rate erfolgreicher Transplantationen wurden jedoch neue Techniken im Tissue Engineering (TE) und in der regenerativen Medizin (RM) entwickelt2,3.
TE beinhaltet die Verwendung von Stammzellen, Gerüsten und Wachstumsfaktoren4, um die Wiederherstellung entzündeter, fibrotischer und ödematöser Organe und Gewebe zu fördern1,5,6. Die in Gerüsten verwendeten Biomaterialien ahmen das native ECM nach und liefern die physikalischen, chemischen und biologischen Hinweise für den geführten zellulären Umbau7. Kollagen ist eines der am häufigsten vorkommenden Proteine, die aus der Dermis, der Sehne, dem Darm und dem Perikard gewonnen werden8,9. Weiterhin kann Kollagen als Biopolymer erhalten werden, um durch Bioprinting oder Elektrospinnen zwei- und dreidimensionale Gerüste herzustellen10,11. Diese Gruppe ist die erste, die über die Verwendung von Kollagen aus einer Knochenquelle für die Regeneration von Lebergewebe berichtet. Eine andere Studie berichtet über die Verwendung von Gerüsten, die aus Rinderkollagen synthetisiert wurden, das aus der Haut gewonnen wurde, mit homogenen und eng gelegenen Poren, ohne jegliche Kommunikation zwischen ihnen12.
Die Dezellularisation bewahrt das native ECM und ermöglicht den anschließenden Einbau von Zellen mit Stammzellpotential13,14. Dieses Verfahren befindet sich jedoch noch in der experimentellen Phase in Leber, Herz, Niere, Dünndarm und Harnblase von Mäusen, Ratten, Kaninchen, Schweinen, Schafen, Rindern undPferden3,14. Derzeit wird das resezierte Lebermassenvolumen in keinem der tierexperimentellen Hepatektomiemodelle ersetzt. Die Verwendung zusätzlicher Unterstützung oder eines Netzwerks (Biomaterialien), das die Zellproliferation und Angiogenese ermöglicht, könnte jedoch für die sofortige Wiederherstellung der Leberparenchymfunktionen unerlässlich sein. So könnten Gerüste als alternative Ansätze zur Regeneration oder Reparatur von Gewebe bei chronischen Lebererkrankungen eingesetzt werden, wodurch Wiederum Einschränkungen aufgrund von Spenden und klinischen Komplikationen der Lebertransplantation beseitigt werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Die vorliegende Forschung wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät (DI/115/2015) der Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) und der Ethikkommission des Hospital General de Mexico (CI/314/15) genehmigt. Die Einrichtung erfüllt alle technischen Spezifikationen für die Produktion, Pflege und Verwendung von Versuchstieren und ist nach nationalem Recht gesetzlich zertifiziert (NOM-062-ZOO-1999). Männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 150-250 g (6-8 Wochen alt) wurden für diese Studie von der Labortiereinrichtung der School of Medicine, UNAM, erhalten.
1. Kollagenmatrix-Gerüste aus Rinder-Femur erhalten
- Beziehen Sie den Kondylen aus rinderem Femur von einem Schlachthof, der von den Gesundheits- und Landwirtschaftsbehörden Mexikos zertifiziert ist.
- Sezieren Sie vorsichtig das Kondylenfett, den Muskel und den Knorpel mit einem chirurgischen Instrument. Schneiden Sie die Kondylfragmente mit einem Sägeschneider in 3 cm x3 cm große Fragmente und reinigen Sie das Fett und Blut mit einem Handtuch. Waschen Sie die Kondylfragmente mit Wasser.
- Die Fragmente mit 1 L eines anionischen Detergens (10 g/L) 30 min kochen (92 °C) kochen. Waschen Sie die Kondylfragmente zweimal, um Reste des anionischen Reinigungsmittels zu entfernen.
- Trocknen Sie die Kondylfragmente 3 h lang mit Filterpapier (0,5 mm).
- Bereiten Sie ein dreieckiges (1 cm x1 cm x1 cm) CMS mit einer Dicke von 0,5 cm aus den in Schritt 1.1 genannten Fragmenten vor (Abbildung 1A).
- Entmineralisieren Sie die Fragmente in 100 mL 0,5 M HCl für 10 min unter ständiger Bewegung. Entfernen Sie die HCl.
HINWEIS: Neutralisieren Sie das HCl mit Natriumhydroxid (10 M). - Spülen Sie die Fragmente dreimal mit 100 ml destilliertem Wasser, jeweils 15 min, unter ständiger Bewegung. Trocknen Sie das CMS mit Filterpapier (0,5 mm) für 1 h.
- Verwenden Sie ein Stereomikroskop15, um die strukturellen Eigenschaften des CMS (Größe der Poren, Porenbildung und poröse Verbindung) zu analysieren (Abbildung 1B).
- Verwenden Sie ein Rasterelektronenmikroskop16, um die raue Oberfläche der CMS-Trabekeln zu analysieren (Abbildung 1C).
- Verwenden Sie das Dissektionsinstrument zum Mischen und Dehnen, um die mechanischen Änderungen (Plastizität und Flexibilität) des CMS zu bewerten (Abbildung 1D).
- Verpacken Sie das CMS in den Sterilisationsbeutel und sterilisieren Sie es mit Wasserstoffperoxidplasma für 38 min. Lagern Sie das sterile CMS in der Originalverpackung in einem trockenen Bereich bei 20-25 °C bis zum Gebrauch.
- Entmineralisieren Sie die Fragmente in 100 mL 0,5 M HCl für 10 min unter ständiger Bewegung. Entfernen Sie die HCl.
2. Vorbereitung des Operationsbereichs und Handhabung und Vorbereitung des Tiermodells
- Desinfizieren Sie den Operationsbereich, den Arbeitstisch, das Mikrochirurgiemikroskop und den Sitz mit 2% iger Chlorhexidinlösung. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente, chirurgischen Schwämme, Tupfer und chirurgischen Einwegvorhänge durch Hitzesterilisation (121 °C/30 min/100 kPa)
- Ordnen Sie die Ratten (n = 5) in drei Gruppen von fünf Ratten pro Gruppe ein: 1. Schein, 2. Hepatektomie und 3. Hepatektomie plus CMS, und folgen Sie allen Gruppen an den Tagen 3, 14 und 21 Tagen.
- Ketamin (35 mg/kg) und Xylazin (2,5 mg/kg) intramuskulär in der Hintergliedmaße verabreichen.
HINWEIS: Die Beruhigungsphase dauert in der Regel 30-40 Minuten. - Rasieren Sie die Bauchhaut (5 cm x 2 cm) mit chirurgischer Seife und einer zweischneidigen Klinge und desinfizieren Sie die Haut mit topischer 10% iger Povidon-Jod-Lösung in drei Runden17.
- Legen Sie das Tier auf eine warme Platte in der dorsalen Position des Dekubitus, wobei der Hals überdehnt ist, um einen durchlässigen Atemweg aufrechtzuerhalten (Abbildung 2).
- Bewerten Sie die Tiefe der Anästhesie durch das Atemmuster und den Verlust des Entzugsreflexes in den Gliedmaßen.
- Legen Sie einen chirurgischen Einwegvorhang um die rasierte Haut und machen Sie einen Schnitt (2,5 cm) auf der Albous-Linie mit einem Skalpell, wobei Sie den Xiphoid-Prozess als Referenzpunkt verwenden. Vermeiden Sie das Blutgefäß der Bauchdecke, um Blutungen zu vermeiden.
- Setzen Sie den Bauchretraktor ein und beobachten Sie die Bauchhöhle. Extrahieren Sie mit der Dissektionszange den linken Leberlappen und legen Sie ihn auf die Metallplatte (Abbildung 3A).
HINWEIS: Extrahieren Sie in der Scheingruppe nur den linken Leberlappen und bringen Sie dann die Leber in die Bauchhöhle zurück. Nähen Sie die Bauchdecke und die Haut mit einer 3-0 Nylonnaht. - Verwenden Sie in den experimentellen Gruppen mit und ohne CMS eine Skalpellklinge und eine sterile Skalpellklinge (# 15), um eine Hepatektomie (ca. 40%) mit zwei Schnitten durchzuführen. Verwenden Sie eine dreieckige Metallschablone (1 cm x 1 cm x 1 cm), um die Hepatektomie durchzuführen (Abbildung 3B).
- Um Blutungen der Leber zu verhindern, halten Sie die chirurgische Kompression mit einem Tupfer am Leberrand für 5 Minuten aufrecht.
- Hydratisieren Sie das CMS in steriler Kochsalzlösung für 20 minuten vor dem chirurgischen Eingriff. Implantieren Sie das CMS in die Hepatektomiestelle mit vier Stichnähten zwischen dem Lebergewebe und dem CMS, um eine Verschiebung des Biomaterials zu verhindern. Verwenden Sie 7-0 nicht resorbierbare Polypropylennähte (Abbildung 3C).
HINWEIS: Entfernen Sie die Nähte nicht in einer zweiten Operation; Nähte können als Referenz verwendet werden, um die Stelle der CMS-Implantation zu identifizieren. - Bringen Sie die Leber in die Bauchhöhle zurück und nähen Sie die Bauchdecke und die Haut mit einer 3-0 Nylonnaht. Reinigen Sie den chirurgischen Schnitt mit einem chirurgischen jodgetränkten Schwamm in zwei Runden. Beobachten und überwachen Sie die Vitalfunktionen der Tiere.
- Ketamin (35 mg/kg) und Xylazin (2,5 mg/kg) intramuskulär in der Hintergliedmaße verabreichen.
3. Postoperative Versorgung
- Meglumin Flunixin (2,5 mg/kg) intramuskulär in der Hintergliedmaße verabreichen. Verabreichen Sie Analgetika, wie vom institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss genehmigt.
- Zur Wiederherstellung der Anästhesie legen Sie die Tiere in einzelne Polycarbonatboxen mit Labortiereinstreu in einem geräuschfreien Bereich mit Temperaturkontrolle (23 °C).
- Beobachten Sie die Erholung der Tiere und überwachen Sie ihren Wasser- und Futterverbrauch für 2 h. Überwachen Sie tiere postoperativ, wie vom institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss genehmigt.
4. Beurteilung der Leberfunktion im Serum
- Sammeln Sie Blutproben (500 μL) aus den seitlichen Schwanzvenen der anästhesierten Tiere vor dem chirurgischen Eingriff (Ausgangswerte) und an den Bewertungstagen 3, 14 und 21.
- Zentrifugieren Sie die Blutproben bei 850 × g/10 min bei Raumtemperatur (23 °C); Trennen Sie das Serum und lagern Sie es bis zur Verwendung bei -80 °C.
- Führen Sie ein Panel von Leberfunktionstests durch: Serumalbumin (ALB), alkalische Phosphatase (ALP), Alaninaminotransferase (ALT), Aspartataminotransferase (AST), Gesamtbilirubin (TB) und direktes Bilirubin (DB) (Tabelle 1).
5. Euthanasie und Gewebemanagement
- Betäuben Sie die Tiere für jede Bewertung (Tage 3, 14 und 21), indem Sie das oben beschriebene Protokoll befolgen.
- Einschläfern sie mit Methoden, die vom institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss genehmigt wurden.
- Führen Sie einen Schnitt (5-6 cm) an der Albous-Linie mit einem Skalpell durch, um die Organe der Bauchhöhle zu beobachten, und fotografieren Sie den Hepatektomiebereich des Scheins und der experimentellen Gruppen mit und ohne CMS.
- Nehmen Sie Leberproben (2 cm x 2 cm; 0,40-0,45 g) von allen Tieren der Studiengruppe und geben Sie sie für 24 h in eine 4% ige Formaldehydlösung zur anschließenden histologischen Beurteilung.
6. Histologische Analyse
- Konservieren Sie das Lebergewebe in 4% Formaldehyd und dehydrieren Sie das Gewebe mit einer Reihe von Alkoholkonzentrationen (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); legen Sie sie in Xylol (1h) und betten Sie sie in Paraffin16ein.
- Schneiden Sie die Paraffinblöcke mit einem Mikrotom in 4 μm dicke Abschnitte für die Vorbereitung von acht Objektträgern.
- Führen Sie die trichrome Färbung von H&E und Massondurch 16.
- Beobachten Sie die gefärbten Abschnitte unter einem Lichtmikroskop, um die repräsentativen Bereiche der Leber mit und ohne CMS auszuwählen. Erhalten Sie Mikroaufnahmen mit 4-facher, 10-facher und 40-facher Vergrößerung und verarbeiten Sie die Bilder mit entsprechender Software18 (siehe Materialtabelle).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Knochendemineralisierung beeinflusst die mechanischen Eigenschaften von CMS, ohne die ursprüngliche Form oder Verbindung seiner Poren zuverändern. CMS kann jede Beliebige Form haben und kann daher an die Größe und Form des ausgewählten Organs oder Gewebes angepasst werden19. Im vorliegenden Protokoll haben wir ein dreieckiges CMS verwendet (Abbildung 1A-D). Ein Rattenmodell wurde verwendet, um die Regenerationsfähigkeit des CMS-Xenoimplantats in der Leber zu bewerten. Obwohl die Leber ein brüchiges und weiches Organ ist, stellte der in diesem Protokoll durchgeführte chirurgische Eingriff sicher, dass das CMS an Ort und Stelle blieb (Abbildung 2 und Abbildung 3A-C). Die partielle Hepatektomie von 40% des linken Lappens ermöglichte es, einen Teil des Organs zu beurteilen, wobei der Rest der Leber intakt blieb, so dass die Veränderungen des Implantats und des nativen Parenchyms verglichen werden konnten. Zusätzlich erhielten wir Blutproben, um die Leberfunktion vor und nach der CMS-Implantation zu bewerten.
Es gab keine Unterschiede in den Ausgangskonzentrationen der biochemischen Parameter zwischen der Scheingruppe und der experimentellen Gruppe mit und ohne CMS-Implantation nach 3 und 14 Tagen; sie blieben innerhalb der Referenzwerte (ALB: 0,43-2,41 g/dl; ALP: 134-357,3 U/L; ALT: 41-83.1 UI/L; AST: 61.4-276.2 UI / L; TB: 0,01-0,43 mg / dl; DB: 0,1 mg/dl)20. Darüber hinaus gab es keine Unterschiede in den Albumin-, ALP-, ALT-, AST-, TB- und DB-Spiegeln zwischen der Scheingruppe und den experimentellen Gruppen nach 21 Tagen, was darauf hindeutet, dass das CMS die Leberfunktion nicht stört (Tabelle 1).
Während der Euthanasie zeigte die explorative Laparotomie die typische Farbe und korrekte Größe und Form der Leber. In keinem der Fälle wurde eine Entzündung oder Infektion an der Implantationsstelle beobachtet. An Tag 3 gab es keine Veränderungen im Organ in Bezug auf die Bauchhöhle (Abbildung 4A). In einem Teil, der Lebergewebe und CMS enthielt, wurde beobachtet, dass Blut das CMS mit beginnendem adhärentem Omentalfett infiltriert hat (Abbildung 4B). Am Tag 14 nahm die Fettmenge zu; es gab eine Neubildung der Blutgefäße und die Integration des CMS in das Empfängerlebergewebe, aber keine Veränderungen im Dünndarm oder in den Organen der Bauchhöhle (Abbildung 5A). Omentales Fett war in der vorderen Zone höher (Abbildung 5B) als in der viszeralen Zone (Abbildung 5C) in der CMS-Implantationsstelle. Am Evaluationstag 21 war der CMS-Einbau in die Leber deutlicher (Abbildung 6A). Der Anstieg des omentalen Fettes könnte als Indikator für den Fortschritt der Regeneration verwendet werden, da es eine Quelle für mesenchymale Stammzellen ist21. Darüber hinaus zeigte die Leber nach 21 Tagen dichte Bereiche, die dem Abbau und der Absorption entsprachen und die Größe und die ursprüngliche Form veränderten (Abbildung 6B).
Um die Mikrostruktur der Leber mit dem CMS-Implantat zu analysieren, führten wir eine histologische Analyse eines repräsentativen Gewebefragments von der Implantationsstelle durch, das mit Gewebe aus dem rechten Leberlappen verglichen wurde (Kontrolle). Biopsien, die an den Tagen 3, 14 und 21 durchgeführt wurden, wurden verarbeitet und der trichromen Färbung von H & E und Masson unterzogen. Die normale Struktur des Leberparenchyms wurde in der Scheingruppe am Tag 21 beobachtet (Abbildung 7A und Abbildung 7E). Am Tag 3 zeigte die histologische Analyse, dass das Vorhandensein des CMS in der Leber keine Fremdkörperreaktion förderte und das auffällige Vorhandensein von laxem Bindegewebe beobachtet wurde (Abbildung 7B und Abbildung 7F). An den Tagen 14 und 21 war das laxe Bindegewebe häufiger, wobei die CMS-Trabekulae von Hepatozyten umgeben waren, was darauf hindeutet, dass Hepatozyten zum CMS gewandert waren (Abbildung 7C und Abbildung 7G; Abbildung 7D und Abbildung 7H). Die Ergebnisse zeigten auch Bereiche von Hepatozyten, die von einem Gefäß bewässert wurden (Abbildung 8A). Eine genaue Untersuchung ergab, dass die Hepatozyten, die an den CMS-Trabekeln haften, manchmal von laxem Bindegewebe umgeben waren (Abbildung 8B-D). Zwei doppelblinde unabhängige Pathologen führten die histopathologische Analyse durch. Immunhistochemie und Polymerase-Kettenreaktion-basierte Assays sind im Gange, um die verschiedenen Proteine und Gene im Zusammenhang mit dem hepatischen Regenerationsprozess zu bewerten.
So unterstützen die makroskopischen und mikroskopischen Beobachtungen und die biochemischen Werte unsere These, dass das CMS ein ideales Biomaterial zur Unterstützung und Förderung der Leberregeneration ist. Dennoch muss die CMS-Implantation länger als 21 Tage ausgewertet werden, um die Absorptionszeit und die vollständige Wiederherstellung des Lebergewebes zu bestimmen. Darüber hinaus sollten Studien durchgeführt werden, die die verschiedenen Proteine und Gene im Zusammenhang mit der Hepatenregeneration in Gegenwart des CMS bewerten.
Abbildung 1: Knochenprobe und CMS. (A) Zur Vorbereitung des CMS wurde eine dreieckige Probe der Knochenprobe verwendet. (B) Eine detaillierte Ansicht der Poren und der Verbindung oder trabekulären Verbindung des CMS, wie sie durch Elektronenmikroskopie beobachtet wird. (C) Das CMS, wie es unter einem Stereomikroskop gesehen wird. (D) CMS-Manipulation mit einem Gerät wurde durchgeführt, um die Änderung der mechanischen Eigenschaften zu überprüfen. Abkürzung: CMS = Collagen Matrix Scaffold. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Vorbereitung des Tieres auf die Operation. Das Tier befindet sich in der dorsalen Position des Dekubitus und zeigt den rasierten Bauchbereich, der für die Hepatektomie und CMS-Implantation vorbereitet ist. Abkürzung: CMS = Collagen Matrix Scaffold. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Hepatektomie des linken Leberlappens. (A) Der linke Lappen wurde extrahiert und auf die metallische Platte gelegt, um die Hepatektomie durchzuführen. (B) Die Hepatektomie von 40% des linken Lappens wurde in einer dreieckigen Form durchgeführt, wie die CMS. C) Der Bereich der Hepatektomie wird durch das CMS ersetzt. Abkürzung: CMS = Collagen Matrix Scaffold. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Tag 3 der Beurteilung. (A) Makroskopische Beobachtung der Implantationsstelle am Auswertungstag 3. Die Leber, die mit dem CMS (gefüllter Stern) (gepunktete Linie) implantiert wurde, änderte sich nicht in Farbe oder Größe. Der Dünndarm (leerer Stern) und der Rest der Bauchstrukturen zeigten keine Veränderungen. (B) Probe der Leber (gefüllter Stern) und des CMS (weißer Pfeil), die mit Omenfett bedeckt sind (roter Pfeil). Abkürzung: CMS = Collagen Matrix Scaffold. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Tag 14 der Beurteilung. (A) Makroskopische Beobachtung der Implantationsstelle am Auswertungstag 14. Das Lebergewebe (gefüllter Stern) mit dem CMS veränderte sich nicht in Farbe oder Größe. Der Dünndarm (leerer Stern) und der Rest der Strukturen und Organe der Bauchhöhle zeigten keine Veränderungen. Probe der Leber mit dem implantierten CMS: (B) vordere Ansicht; (C) posteriore/viszerale Ansicht. Omentalfett (roter Pfeil), das den Bereich bedeckt. Das CMS wurde in das Lebergewebe integriert. Das Omentalfett (roter Pfeil) bedeckt hauptsächlich den Bereich in der Vorderansicht. Die gepunktete Linie zeigt den Ort der CMS-Implantation an; Nähte (blauer Faden). Abkürzung: CMS = Collagen Matrix Scaffold. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Tag 21 der Bewertung. (A) Makroskopische Beobachtung der Implantationsstelle am Bewertungstag 21. Die mit dem CMS (gepunktete Linie) implantierte Empfängerleber (gefüllter Stern) änderte weder Farbe noch Größe. Der Dünndarm (leerer Stern) und der Rest der Bauchstrukturen zeigten keine Veränderungen. (B) Probe der Leber mit der implantierten CMS (gepunktete Linie), die Veränderungen in Größe und Form zeigt. Abkürzung: CMS = Collagen Matrix Scaffold. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Histologie der Leber und der Leber mit CMS. (A) Normale Leber (SHAM) mit der charakteristischen Gewebearchitektur. (B) Tag 3 der CMS-Implantation mit laxem Bindegewebe in den Trabeculae des CMS (gestrichelte Ovale). (C) Übergangszone zwischen der nativen Leber (rechte Seite) und dem CMS (linke Seite), mit den Trabeculae des CMS (Pfeil). (D) Einheimische Leber in Kontakt mit dem CMS (gepunktete Linien) am Tag 21. (E) Normale Leber mit Massons trichromer Färbung. F)Das in die Leber implantierte CMS; Invasion des laxen Bindegewebes an Tag 3 (gestricheltes Oval). (G) Am Tag 14 zeigte die einheimische Leber mit den CMS-Trabekulae einen Bereich von Hepatozyten (gefüllter Stern) außerhalb der einheimischen Leber, was darauf hindeutet, dass die einheimischen Hepatozyten durch das CMS gewandert waren. (H) Am Tag 21 sind die nativen Hepatozyten in Richtung CMS gewandert (Pfeil). A und E: Maßstabsbalken = 200 μm: 4x, B-D und F-H:Maßstabsbalken = 100 μm: 10x. A-D: H&E-Färbung; E-H: Massons trichrome Färbung. Abkürzungen: CMS = collagen matrix scaffold; H& E = Hämatoxylin und Eosin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Histologie der Leber und cms. (A) Pool von Hepatozyten (weißer Pfeil), die in den Trabekeln des CMS (schwarzer Pfeil) vorhanden sind. Die Hepatozyten werden von einem Gefäß (gefüllter Stern) bewässert. (B) Hepatozyten (weißer Pfeil) sind gewandert und haben sich an die Trabekeln des CMS (schwarzer Pfeil) geklebt. (C) Eine Gruppe von Hepatozyten (gestrichelter Kreis) wird zwischen zwei Trabekeln (schwarze Pfeile) des CMS beobachtet. (D) Hepatozyten haben sich in Gegenwart von laxem Bindegewebe (gestricheltes Oval) an Trabeculae (schwarze Pfeile) von CMS geklebt. A und C: Maßstabsbalken = 100 μm: 10x. B und D: Maßstabsbalken = 20 μm: 40x. Abkürzung: CMS = Collagen Matrix Scaffold. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Tage | SCHEIN | Hepatektomie | Implantation CMS | |
| ALB (g/dl) | 3 | 1,4±0 | 1.25±0.07 | 1,4±0 |
| 14 | 1,3±0,5 | 1.85±0.07 Uhr | 1,8±0,14 | |
| 21 | 1,3±05 | 1,6±0,1 | 1,7± 0 | |
| ALT (IU/L) | 3 | 73±1,4 | 3,5±0,7 | 54,6±6,4 |
| 14 | 84±0 | 59,5±4,9 | 57±4,2 | |
| 21 | 57±0 Uhr | 73,5±14,8 | 73,5±14,8 | |
| AST (IE/L) | 3 | 106±1,4 | 80±6,6 | 90±1,4 |
| 14 | 127±5,5 | 94±21,2 | 83,5±17,6 | |
| 21 | 123,7±27,3 | 92,5±24,7 | 101±31,1 | |
| TB (mg/dl) | 3 | 0,33±0,05 | 0,25±0,07 | 0,3±0 |
| 14 | 0,5±0 | 0,2±0 | 0,15±0 | |
| 21 | 0,3±0 | 0,4±0 | 0,4±0,14 | |
| DB (mg/dl) | 3 | 0,1±0 | 0.05±0.07 | 0,1±0 |
| 14 | 0,1±0 | 0,1±0 | 0,1±0 | |
| 21 | 0,1±0 | 0,1±0 | 0,1±0 |
Tabelle 1: Leberfunktion. Leberfunktionstests wurden für die Schein- und experimentellen Gruppen mit und ohne CMS nach 3, 14 und 21 Tagen durchgeführt. Abkürzungen: CMS = collagen matrix scaffold; ALB = Albumin; ALP = Alkalische Phosphatase; ALT= Alaninaminotransferase; AST = Aspartataminotransferase; TB = Gesamtbilirubin; DB = Direktes Bilirubin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Organtransplantation ist die Hauptstütze der Behandlung bei Patienten mit Leberfibrose oder Leberzirrhose. Einige wenige Patienten profitieren von diesem Verfahren, so dass es notwendig ist, therapeutische Alternativen für Patienten auf der Warteliste bereitzustellen. Tissue Engineering ist eine vielversprechende Strategie, die Gerüste und Zellen mit regenerativem Potenzialeinsetzt 2,4,13. Die Entfernung eines Teils der Leber ist ein kritischer Schritt in diesem Verfahren wegen der starken Blutung dieses vaskularisierten Organs. Daher muss eine Hämostase des Operationsbettes durchgeführt werden, um diese Komplikation zu vermeiden. Darüber hinaus wird die Bindung des Lebergewebes an das CMS, die für die Sicherstellung der Gewebe-Biomaterial-Interaktion unerlässlich ist, durch den Einsatz von Nähten erleichtert. Es muss jedoch sorgfältig durchgeführt werden, um zu vermeiden, dass die Leber reißt und spätere Blutungen verursacht werden.
Obwohl das hierin vorgeschlagene Biomaterial rinderischen Ursprungs (xenogen) ist, liegen keine Daten zur Biomaterialreaktion bei Ratten vor, was eine selektive Hepatektomie ermöglicht. Im Gegensatz dazu hat sich gezeigt, dass das 2/3-Hepatektomie-Modell den Tod der Tiere aufgrund der Entfernung einer großen Menge an Lebergewebe verursacht14. Darüber hinaus haben wir eine Metallschablone aus Edelstahl entwickelt, da wir Schwierigkeiten hatten, die Größe in der Hepatektomie und im CMS zu standardisieren. Die Sterilisation des CMS war eine Herausforderung, da die bestehenden Techniken die Struktur des Kollagens und seine biochemischen Eigenschaften veränderten. Daher wurde die Sterilisation durch Hitze, Gammastrahlung und Ethylenoxid als Sterilisationsmethoden untersucht, bevor festgestellt wurde, dass das Plasma von Wasserstoffperoxid die optimale Technik war13.
Es ist wichtig, die maximale Größe des CMS zu bestimmen, das in die Leber implantiert werden könnte, und die biologische Reaktion auf systemischer Ebene zu bewerten. Darüber hinaus ist es notwendig, die Wirksamkeit dieser Technik bei einer größeren Tierart zu optimieren und zu untersuchen. Darüber hinaus ist es wichtig, die Auswirkungen der CMS-Implantation in die Leber über einen längeren Zeitraum (>30 Tage) zu untersuchen, was die Beurteilung des Ausmaßes der Biosorption des CMS und der Regeneration des Lebergewebes ermöglicht. Weiterhin müssen die Auswirkungen der CMS-Implantation in Tiermodellen mit Leberschäden untersucht werden. Diese Implantationsmethode hat die Tür zu Strategien geöffnet, die die Wiederherstellung der Form und des Volumens des resezierten Gewebes erforschen und dadurch die Anästhesie, die Operationsdauer und die Erholungszeitverkürzen 4,13.
Das CMS wurde aus einer natürlichen Quelle gewonnen und bewahrte seine physikalischen und chemischen Eigenschaften im Vergleich zu synthetischen Biomaterialien, die mit komplexen Methoden wie Bioprinting oder Elektrospinnen hergestellt wurden, die nicht biokompatibel oder bioabsorbierbar sind2,3. Die Hauptkomponente dieses CMS ist Kollagen Typ I, das Hauptprotein des ECM, das die Zelladhäsion und -proliferation ermöglicht22. Darüber hinaus ermöglichen die Trabeculae der CMS-Poren die Zellmigration und den kontinuierlichen Fluss von Wachstumsfaktoren, Blut und anderen Mediatoren des Regenerationsprozesses. Entsprechend dem zu reparierenden Gewebe hat diese Forschungsgruppe Erfahrung in der Gestaltung des CMS in verschiedenen Formen unter Beibehaltung seiner 3D-Struktur. Zum Beispiel wurden zylindrische CMS in die Harnröhre und den Gallengang von Hunden bei Schweinen implantiert und lieferten vielversprechende Ergebnisse bei der Geweberegeneration23,24.
Die Implantation dieses CMS könnte eine alternative Behandlung sein, um die Geweberegeneration zu stimulieren und das Fibrogenese-Fibrolyse-Gleichgewicht bei Leberzirrhose aufgrund verschiedener Ätiologien (z. B. Virus, Alkohol, Stoffwechselfaktoren) wiederherzustellen. Proliferations-, Migrations- und Entzündungsassays müssen durchgeführt werden, um die molekularen und zellulären Mechanismen zu identifizieren, die durch das CMS ausgelöst werden. Abschließend beschreibt diese Arbeit ein reproduzierbares Verfahren zur Hepatektomie sowie die Untersuchung des Regenerationsprozesses durch die Xenoimplantation von Biomaterialien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben. Benjamín León-Mancilla ist Doktorand des Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) und erhielt ein DGAPA-UNAM-Stipendium.
Acknowledgments
Die Autoren danken dem Personal der Laboratory Animal Facility der Experimental Medicine Unit, nurse Carolina Baños G. für technische und chirurgische Unterstützung, Marco E. Gudiño Z. für die Unterstützung bei Mikrofotografien und Erick Apo für die Unterstützung in der Leberhistologie. Der Nationalrat unterstützte diese Forschung für Wissenschaft und Technologie (CONACyT), Förderkennzeichen SALUD-2016-272579 und die PAPIIT-UNAM TA200515.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anionic detergent | Alconox | Z273228 | |
| Biopsy cassettes | Leica | 3802453 | |
| Camera DMX | Nikon | DXM1200F | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | BD | 372412 | |
| Cover glasses 25 mm x 40 mm | Corning | 2980-224 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 200-M | CAS 17372-87-1 |
| Ethyl alcohol, pure | Sigma-Aldrich | 459836 | CAS 64-17-5 |
| Flunixine meglumide | MSD | Q-0273-035 | |
| Glass slides 75 mm x 25 mm | Corning | 101081022 | |
| Hematoxylin | Merck | H9627 | CAS 571-28-2 |
| Hydrochloric acid 37% | Merck | 339253 | CAS 7647-01-0 |
| Ketamine | Pisa agropecuaria | Q-7833-028 | |
| Light microscope | Nikon | Microphoto-FXA | |
| Microsurgery stereomicroscope | Zeiss | OPMI F170 | |
| Microtainer yellow cape | Beckton Dickinson | 365967 | |
| Microtome | Leica | RM2125 | |
| Model animal: Wistar rats | Universidad Nacional Autónoma de México | ||
| Nylon 3-0 (Dermalon) | Covidien | 1750-41 | |
| Polypropylene 7-0 | Atramat | SE867/2-60 | |
| Povidone-iodine10% cutaneous solution | Diafra SA de CV | 1.37E+86 | |
| Scanning electronic microscope | Zeiss | DSM-950 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J. T. Baker | 3722-01 | CAS 1310-73-2 |
| Software ACT-1 | Nikon | Ver 2.70 | |
| Stereomicroscope | Leica | EZ4Stereo 8X-35X | |
| Sterrad 100S | Johnson and Johnson | 99970 | |
| Surgipath paraplast | Leica | 39601006 | |
| Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm) | SensiMedical | LAN-078-077 | |
| Tissue Processor (Histokinette) | Leica | TP1020 | |
| Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder) | Sakura Finetek USA | 5229 | |
| Trichrome stain kit | Sigma-Aldrich | HT15 | |
| Unicell DxC600 Analyzer | Beckman Coulter | BC 200-10 | |
| Xylazine | Pisa agropecuaria | Q-7833-099 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | CAS 1330-20-7 |
References
- Li, N., Hua, J.
- Langer, R., Vacanti, J.
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Shafiee, A., Atla, A. Tissue engineering: Toward a new era of medicine. Annual Review of Medicine. 68, 29-40 (2017).
- Hu, C., Zhao, L., Wu, Z., Li, L. Transplantation of mesenchymal stem cells and their derivatives effectively promotes liver regeneration to attenuate acetaminophen-induced liver injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 88 (2020).
- Sancho-Bru, P. Therapeutic possibilities of stem cells in the treatment of liver diseases. Gastroenterologia y Hepatologia. 34 (10), 701-710 (2011).
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Freedman, B. R., Mooney, D. J. Biomaterials to mimic and heal connective tissues. Advanced Materials. 31 (19), 1806695 (2019).
- Meyer, M. Processing of collagen based biomaterials and the resulting materials properties. Biomedical Engineering Online. 18 (1), 24 (2019).
- El Baz, H., et al. Transplant of hepatocytes, undifferentiated mesenchymal stem cells, and in vitro hepatocyte-differentiated mesenchymal stem cells in a chronic lver failure experimental model: a comparative study. Experimental and Clinical Transplantation. 16 (1), 81-89 (2018).
- Nedjari, S., Awaja, F., Guarino, R., Gugutkov, D., Altankov, G. Establishing multiple osteogenic differentiation pathways of mesenchymal stem cells through different scaffold configurations. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (10), 1428-1437 (2020).
- Chan, E. C., et al. Three dimensional collagen scaffold promotes intrinsic vascularisation for tissue engineering applications. PLoS One. 11 (2), 0149799 (2016).
- Arenas-Herrera, J. E., Ko, I. K., Atala, A., Yoo, J. J. Decellularization for whole organ bioengineering. Biomedical Materials. 8 (1), 014106 (2013).
- Parmaksiz, M., Dogan, A., Odabas, S., Elçin, A. E., Elçin, Y. M. Clinical applications of decellularized extracellular matrices for tissue engineering and regenerative medicine. Biomedical Materials. 11 (2), 022003 (2016).
- Gacek, G.
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
- The University of Texas at Austin Institutional Animal Care and Use Committee. Guidelines for the Use of Chemical Depilatory Agents on Laboratory Animals. , https://research.utexas.edu (2021).
- Sivridis, L., Kotini, A., Anninos, P. The process of learning in neural net models with Poisson and Gauss connectivities. Neural Networks. 21 (1), 28-35 (2008).
- León-Mancilla, B. H., Araiza-Téllez, M. A., Flores-Flores, J. O., Piña-Barba, M. C. Physico-chemical characterization of collagen scaffolds for tissue engineering. Journal of Applied Research and Technology. 14 (1), 77-85 (2016).
- León, A., et al. Hematological and biochemical parameters in Sprague Dawley laboratory rats breed in CENPALAB, Cenp:SPRD. Revista Electronica de Veterinaria. 12, 1-10 (2011).
- Tsuchiya, A., et al. Mesenchymal stem cell therapies for liver cirrhosis: MSCs as "conducting cells" for improvement of liver fibrosis and regeneration. Inflammation and Regeneration. 39, 18 (2019).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
- Acevedo, G. C. Xenoimplante de colágena en uretra de perro. Universidad Nacional Autónoma de México. , Specialty of Urology thesis (2011).
- Montalvo-Jave, E. E., et al. Absorbable bioprosthesis for the treatment of bile duct injury in an experimental model. International Journal of Surgery. 20, 163-169 (2015).
