Summary
Bu protokol, NuTRAP fare modelini kullanarak hücre tipine özgü çeviri ribozomal mRNA'ları izole etmeyi amaçlamaktadır.
Abstract
Hücresel heterojenlik, transkriptom düzeyinde karmaşık dokuların işlevini anlamada zorluklar yaratır. Hücre tipine özgü RNA'ların kullanılması, dokuların heterojenliğinin neden olduğu potansiyel tuzakları önler ve güçlü transkriptom analizini serbest bırakır. Burada açıklanan protokol, ribozoma bağlı RNA'ları, hücre sıralaması olmadan karmaşık bir dokudaki az miktarda EGFP eksprese eden hücrelerden izole etmek için Translating Ribozom Afinite Saflaştırma (TRAP) yönteminin nasıl kullanılacağını göstermektedir. Bu protokol, yakın zamanda mevcut olan NuTRAP fare modelini kullanarak hücre tipine özgü RNA'ları izole etmek için uygundur ve RNA'ları herhangi bir EGFP eksprese eden hücreden izole etmek için de kullanılabilir.
Introduction
RNA dizilimi (RNA-seq) ve mikroarray dahil olmak üzere yüksek verimli yaklaşımlar, gen ekspresyon profillerinin genom çapında sorgulanmasını mümkün kılmıştır. Kalp, beyin ve testis gibi karmaşık dokular için, hücre tipine özgü veriler, RNA'ların tüm dokudaki kullanımını karşılaştıran daha fazla ayrıntı sağlayacaktır 1,2,3. Hücresel heterojenliğin etkisinin üstesinden gelmek için, Translating Ribozom Afinite Saflaştırma (TRAP) yöntemi 2010'ların başından berigeliştirilmiştir4. TRAP, ribozoma bağlı RNA'ları doku ayrışması olmadan spesifik hücre tiplerinden izole edebilir. Bu yöntem, Drosophila embriyoları5'te son derece nadir görülen bir kas hücresi popülasyonunu hedeflemek, Arabidopsis thaliana6 model bitkisindeki farklı kök hücreleri incelemek ve memelilerde endotel hücrelerinin transkriptom analizini yapmak da dahil olmak üzere farklı organizmalarda translatom (çeviri için ribozoma alınan mRNA'lar) analizi için kullanılmıştır7.
TRAP, bir model organizmanın ribozomunu etiketlemek için genetik bir modifikasyon gerektirir. Evan Rosen ve meslektaşları yakın zamanda Jackson Laboratuvarı'nda 2017'den beri mevcut olan Nükleer etiketleme ve Çeviri Ribozom Afinite Saflaştırma (NuTRAP) fare8 adlı bir fare modeli geliştirdiler. Bir Cre fare çizgisiyle geçerek, araştırmacılar bu NuTRAP fare modelini, ribozom bağlı RNA'ları ve hücre çekirdeklerini, hücre sıralama olmadan Cre-eksprese eden hücrelerden izole etmek için kullanabilirler. NuTRAP alelini de taşıyan Cre-eksprese eden hücrelerde, EGFP / L10a etiketli ribozom, afinite pulldown tahlilleri kullanarak mRNA'ların çevrilmesinin izolasyonuna izin verir. Aynı hücrede, aynı zamanda mCherry pozitif olan biyotin ligaz tanıma peptidi (BLRP) etiketli nükleer membran, afinite veya floresan bazlı saflaştırma kullanarak nükleer izolasyona izin verir. Aynı araştırma ekibi, nükleer membranın sadece biyotin8 içermeyen mCherry ile etiketlendiği benzer bir fare hattı da üretti. Genetiği değiştirilmiş bu iki fare çizgisi, ilgilenilen belirli hücre tiplerinin eşleştirilmiş epigenomik ve transkriptomik profillerini karakterize etmek için erişim sağlar.
Kirpi (Hh) sinyal yolu doku gelişiminde kritik bir rol oynar9. GLI ailesinin bir üyesi olan GLI1, transkripsiyonel bir aktivatör görevi görür ve Hh sinyaline aracılık eder. Gli1 + hücreleri, adrenal bez ve testis de dahil olmak üzere birçok hormon salgılayan organda bulunabilir. NuTRAP fare modelini kullanarak hücre tipine özgü DNA'ları ve RNA'ları Gli1 + hücrelerinden izole etmek için, Gli1-CreERT2 fareleri NuTRAP fareleri ile çaprazlandı. Shh-CreERT2 fareleri, sonik kirpi (Shh) eksprese eden hücreleri izole etmeyi amaçlayan NuTRAP fareleri ile de geçti. Aşağıdaki protokol Gli1-CreERT2'nin nasıl kullanılacağını gösterir; NuTRAP fareleri, yetişkin fare testislerinde ribozoma bağlı RNA'ları Gli1 + hücrelerinden izole etmek için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yapılan tüm hayvan deneyleri, Auburn Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (IACUC) tarafından onaylanan protokolleri takip etti.
NOT: Aşağıdaki protokol, Gli1-CreERT2'den P28'de bir testis (yaklaşık 100 mg) kullanır; NuTRAP fareleri (Mus musculus). Reaktiflerin hacimlerinin, numune tiplerine ve doku sayısına göre ayarlanması gerekebilir.
1. Doku toplama
- Bir CO2 odası kullanarak fareleri ötenazileştirin,% 70 etanol ile karın yüzeyini sterilize edin.
- Alt karın bölgesini makasla açın ve testisleri çıkarın. Testisleri hemen çıtçıtlamak için sıvı azot (LN2) kullanın.
- Numuneleri kullanıma kadar LN2'nin buhar fazında saklayın.
2. Reaktifler ve boncuk hazırlama
- Homojenizasyon stok çözeltisini hazırlayın: 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, %1 NP-40 ve 1 mg/mL heparin ekleyin. Çözeltiyi kullanıma kadar 4 ° C'de saklayın (1 aya kadar).
- Homojenizasyon çalışma tamponunu kullanımdan önce stok çözeltisinden (adım 2.1) taze olarak hazırlayın: Homojenizasyon çalışma tamponunun gerekli miktarını yapmak için homojenizasyon stok çözeltisine DTT (son konsantrasyon: 1 mM), sikloheksimid (son konsantrasyon: 100 μg / mL), rekombinant ribonükleaz (son konsantrasyon: 200 ünite / mL) ve proteaz inhibitörü kokteyli (son konsantrasyon: 1x) ekleyin. Taze hazırlanmış çalışma tamponunu kullanana kadar buz üzerinde saklayın.
- Düşük tuzlu ve yüksek tuzlu yıkama tamponlarını hazırlayın:
- Düşük tuzlu yıkama tamponu hazırlamak için 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl ve% 1 NP-40 karışımı. Kullanmadan önce DTT (son konsantrasyon: 1 mM) ve sikloheksimid (son konsantrasyon: 100 μg / mL) ekleyin.
- Yüksek tuzlu yıkama tamponu karışımı hazırlamak için 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl,% 1 NP-40. Kullanmadan önce DTT (son konsantrasyon: 2 mM) ve Sikloheksimid (son konsantrasyon: 100 μg / mL) ekleyin.
- Protein G boncukları hazırlayın (Malzeme Tablosu):
- Her numunenin 50 μL protein G boncuğuna ihtiyacı olacaktır. Gerekli miktarda boncuğu 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpe yerleştirin ve tüpü rafta 30-60 s bırakarak manyetik bir raf kullanarak boncukları çözeltiden ayırın.
- Süpernatantı pipetle ile çıkarın. Boncukları her seferinde 1 mL buz gibi soğuk düşük tuzlu yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.
3. Doku lizisi ve homojenizasyon
- Bir cam doku öğütücü setine 2 mL buz gibi soğuk homojenizasyon çalışma tamponu (adım 2.2'den itibaren taze hazırlanmış) ekleyin. Dondurulmuş numuneyi hızlı bir şekilde öğütücüye yerleştirin ve gevşek bir havane kullanarak dokuyu buz üzerinde 30 vuruşla homojenleştirin.
- Homojenatı 2 mL'lik yuvarlak tabanlı bir boruya aktarın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın.
- Süpernatantı yeni bir 2 mL tüpe aktarın. "Giriş" olarak 1,5 mL'lik bir tüpe 100 μL kaydedin.
- 2 mL tüpteki süpernatantı 4 °C'de anti-GFP antikoru (5 μg / mL; 1:400) ile gece boyunca uçtan uca bir rotatörde (24 rpm) inkübe edin.
4. İmmünsüpresipitasyon
- Homojenat/antikor karışımını, adım 2.4'ten itibaren yıkanmış protein G boncuklarını içeren yeni bir 2 mL yuvarlak tabanlı tüpe aktarın. 4 °C'de uçtan uca bir rotatörde (24 rpm) 2 saat boyunca inkübe edin.
- Manyetik boncukları bir mıknatıs rafı kullanarak süpernatanttan ayırın. Süpernatantı "negatif fraksiyon" olarak kaydedin. Negatif fraksiyon (1) EGFP-negatif hücrelerdeki RNA'ları ve (2) ribozomlara bağlı olmayan EGFP-pozitif hücrelerdeki RNA'ları içerir.
- Boncuklara 1 mL yüksek tuzlu yıkama tamponu ekleyin ve boncukları yıkamak için tüpü kısaca vorteksleyin. Tüpü bir mıknatıs rafına yerleştirin.
- Yıkama tamponunu çıkarın. Yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın. Boncuklar şimdi EGFP-pozitif hücrelerden boncuk-ribozom-RNA kompleksini içeriyor.
5. RNA ekstraksiyonu
NOT: Aşağıdaki adımlar RNA izolasyon kitinden uyarlanmıştır (Malzeme Tablosu). Her fraksiyonu (yani girdi, pozitif ve negatif) bağımsız bir örnek olarak ele alın ve RNA'ları bağımsız olarak izole edin.
- RNA'ları boncuklardan serbest bırakmak için 4.4. adımdaki boncukları bir termomikserde (42 ° C, 500 rpm) 50 μL Ekstraksiyon Tamponu (RNA izolasyon kitinden) ile 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Boncukları bir mıknatıs rafı ile ayırın, boncuk-ribozom-RNA kompleksini içeren süpernatantı 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Tüpü 2 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj edin, ardından süpernatantı yeni bir 1,5 mL tüpe pipetleyin. Bu tüp TRAP adımının "pozitif fraksiyonunu" içerir.
NOT: Giriş ve negatif fraksiyonlar için, 1 mL Ekstraksiyon Tamponu kullanarak 25 μL numuneden RNA ekstrakte edin. Bir termomikserde (42 °C, 500 rpm) 30 dakika boyunca inkübe edin. - RNA saflaştırma kolonunun ön koşulu: Saflaştırma kolonuna 250 μL Koşullandırma Tamponu pipeti. Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika kuluçkaya yatırın. Kolonu 1 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüj yapın.
- Pipet, adım 5.3'ten itibaren süpernatanta eşit hacimde% 70 EtOH (pozitif fraksiyon için% 70 EtOH'nin yaklaşık 50 μL'si ve giriş ve negatif fraksiyonlar için% 70 EtOH'nin 1 mL'si). Yukarı ve aşağı pipetle çekerek iyice karıştırın.
- Karışımı adım 5.4'ten itibaren sütuna pipetleyin.
- RNA'nın kolondaki zara bağlanmasına izin vermek için kolonu 2 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj yapın, ardından hemen 30 s boyunca 16.000 x g'de santrifüje devam edin. Akış akışını atın.
NOT: Giriş ve negatif fraksiyonlar için, her seferinde kolona 250 μL karışım ekleyin. Tüm karışımlar kullanılıncaya kadar 5.6 ve 5.7 numaralı adımları tekrarlayın. - Pipet 100 μL Yıkama Tamponu 1 (W1) kolona ve 1 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj yapın. Akış akışını atın.
- 75 μL DNaz çözeltisi pipeti doğrudan arıtma kolon membranına karışır. RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Pipet, kolona 40 μL W1 ve 30 s için 8.000 x g'de santrifüj yapın. Akış akışını atın.
- Pipet kolona 100 μL Yıkama Tamponu 2 (W2) ve 1 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj yapın. Akış akışını atın.
- Pipet kolona 100 μL W2 ve 2 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüj yapın. Akış akışını atın. Elüsyon adımından önce tüm yıkama tamponu izlerini gidermek için aynı sütunu 16.000 x g'da 1 dakika boyunca yeniden santrifüj edin.
- Kolonu yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Pipet, 12 μL RNaz içermeyen suyu doğrudan arıtma kolonunun membranına yerleştirin. Pipet ucu membrana temas etmemelidir. RT'de 1 dakika boyunca inkübe edin ve 1 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj yapın. Daha sonra RNA'yı etkisiz hale getirmek için 1 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüjlemeye devam edin.
6. RNA konsantrasyonu ve kalitesi
- Ekstrakte edilen RNA10'un kalitesini ve miktarını değerlendirmek için bir biyoanalizör kullanın.
7. Depolama ve daha fazla analiz
- RNA'yı daha fazla analize kadar -80 ° C'de (1 yıla kadar) saklayın (örneğin, mikrodizi, kantitatif PCR (qPCR) ve RNA-sek, vb.).
NOT: cDNA sentezi de dahil olmak üzere qPCR analizinin ayrıntıları için Lyu ve ark.11'e bakınız. qPCR için astarlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gli1-CreERT2 fare (Jackson Lab Stok Numarası: 007913) ilk olarak çift mutant fareler üretmek için NuTRAP muhabir faresi (Jackson Lab Stok Numarası: 029899) ile çaprazlandı. Her iki genetiği değiştirilmiş gen alellerini (yani, Gli1-CreERT2 ve NuTRAP) taşıyan farelere, üç enjeksiyon için günde bir kez, her gün tamoksifen enjekte edildi. Doku örnekleri, enjeksiyonun 1. gününden sonraki 7. günde toplandı. İmmünofloresan analizi, EGFP'nin testislerdeki interstisyel hücrelerde eksprese edildiğini göstermiştir (Şekil 1). Adrenal bez kapsülünün Gli112,13 pozitif başka bir hücre popülasyonu olduğu bilinmektedir. EGFP ayrıca Gli1-CreERT2'deki adrenal kapsüler hücrelerde de bulundu; NuTRAP fareleri (Şekil 1). Laboratuvarımız ayrıca Shh-CreERT2; NuTRAP fareleri. Shh-CreERT2'de; NuTRAP fareleri, EGFP + hücre popülasyonu, kapsülün altındaki adrenal bezin dış korteksinde bulunur (Şekil 1), adrenal bezdeki Shh + bölgesindeki EGFP + hücrelerinin aynı ekspresyon bölgesi13, Cre-eksprese eden hücrelerde EGFP ekspresyonunu doğrular.
Hücre tipine özgü RNA'ların ekstraksiyonundan sonra, iki bağımsız ekstraksiyondan (her ekstraksiyonda kullanılan bir testis) her fraksiyondaki izole RNA'ların miktarı ve kalitesi, bir biyoanalizör kullanılarak değerlendirildi (Şekil 2). Biyoanalizör sonucu, bu protokolün her üç fraksiyondan da yüksek kaliteli RNA'lar elde edebildiğini gösterdi. Tüm fraksiyonlar benzer bir RNA Bütünlük Numarasına (RIN) sahipti.
Ekstrakte edilen RNA'nın hücre tipine özgü olup olmadığını daha fazla test etmek için, ekstrakte edilen RNA, ticari bir mikroarray hizmeti kullanılarak mikroarray analizi için gönderildi (bkz. Mikroarray sonucu, negatif fraksiyona kıyasla pozitif fraksiyonda yaklaşık 4.000 genin zenginleştirildiğini, negatif fraksiyonda ise yaklaşık 3.000 genin zenginleştirildiğini göstermiştir (Şekil 3). Diferansiyel olarak eksprese edilen bu genler arasında, Leydig hücresi ile ilişkili genler Hsd11b1 ve Hsd3b614,15, pozitif fraksiyonda zenginleştirilmiştir. Negatif fraksiyonda, Sertoli hücre ile ilişkili genler Dhh ve Gstm616,17 zenginleştirildi. Negatif fraksiyonu girdi ile karşılaştırırken sadece birkaç farklı şekilde ifade edilen gen tanımlanmıştır.
Gerçek zamanlı kantitatif RT-PCR (qPCR), pozitif fraksiyondaki ve negatif fraksiyondaki anahtar genlerin ekspresyonunu doğrulamak için de kullanıldı. Mikroarray testinde bulunanlara benzer şekilde, steroidojenik enzimler 3β-Hidroksisteroid dehidrogenaz ( Hsd3b tarafından kodlanmış) ve kolesterol yan zincir bölünme enzimi ( Cyp11a1 tarafından kodlanmış) pozitif fraksiyonda zenginleştirilmiştir. Sertoli hücre belirteci Sox9 (SRY-box Transkripsiyon Faktörü 9) ve germ hücre belirteci Sycp3 (Sinaptonemal Kompleks Protein 3) negatif fraksiyonda zenginleştirilmiştir (Şekil 4). Bu veriler birlikte, Gli1 + hücrelerindeki transkriptomların yukarıdaki protokolle başarılı bir şekilde aşağı çekildiğini ve zenginleştirildiğini göstermiştir.
Şekil 1: NuTRAP muhabir fare modellerinde EGFP ekspresyonunun immünofloresan görüntüleri. Gli1-CreERT2; NuTRAP ve Shh-CreERT2; NuTRAP fareleri, EGFP ekspresyonunu aktive etmek için tamoksifen ile tedavi edildi. Testiste, Gli1 + hücreleri interstisyumdayken, adrenal bezde, Gli1 + hücreleri adrenal kapsüldeydi. Adrenal bezde, kapsülün altındaki hücreler SHH pozitifti (Shh-CreERT2'deki EGFP + hücreleri; NuTRAP fareleri). SHH, Gli1 + kapsüler hücrelerinde işlevini ortaya çıkaran SHH sinyal yolunun ligandıdır13. Ölçek çubukları: 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: TRAP ekstraksiyonundan RNA kalitesi ve miktarı. Pozitif fraksiyonun, negatif fraksiyonun ve girdinin RNA'ları bir biyoanalizör kullanılarak değerlendirildi. Pozitif fraksiyon, GFP antikoru ile inkübasyondan sonra protein G boncuklarından ekstrakte edilen RNA'ları içerir (adım 4.1). Negatif fraksiyon, adım 4.2'de süpernatantta kalan RNA'ları içerir. Giriş, homojenattan RNA'lar içerir (adım 3.3). Elektroferogramda, alt işaretleyicinin konsantrasyonları (X ekseninde gösterilen numunelerin migrasyon süresinin 20-25 s'sinde ilk tepe noktası olarak gösterilir) ve merdiven (bu elektroferogramlarda gösterilmeyen) bilindiğinden, her numunenin konsantrasyonu hesaplanabilir. 40-50 s'deki iki büyük zirve 18S ve 28S rRNA'yı temsil eder. Ribozomal oran (Y ekseninde gösterilen floresan yoğunluğuna dayanarak), RNA örneğinin bütünlüğünü belirlemek için kullanılır. Her numunenin RNA Bütünlük Numarası (RIN), her grafiğin sağ üst köşesinde gösterilir. Nokta grafiğindeki her nokta, tek bir testisten çıkarılan RNA miktarını temsil eder. Negatif fraksiyondaki her bir numunenin RNA miktarı ve girdi, 25 μL numuneden ekstrakte edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: TRAP numuneleri için mikroarray analizi. İki ekstraksiyonun sonuçları (her biri bir testis) gösterilmiştir. Mikroarray analizi, iki bağımsız ekstraksiyondan (Testis A ve Testis B) benzer sayıda farklı şekilde eksprese edilen genleri tanımladı. Pozitif fraksiyonda yaklaşık 4.000 gen zenginleştirildi (kırmızı noktalar), negatif fraksiyonda ~ 3.000 gen zenginleştirildi (yeşil noktalar). Hsd11b1 ve Hsd3b6 pozitif fraksiyonlarla zenginleştirildi. Dhh ve Gstm6 negatif fraksiyonlarla zenginleştirildi. Sadece birkaç gen, negatif fraksiyon ve girdi arasında farklı şekilde ifade edilen genler olarak tanımlanmıştır, bu da testisin sadece çok az sayıda Gli1 + hücresi içerdiğini düşündürmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: TRAP numuneleri için qPCR analizi. qPCR analizi, pozitif fraksiyonda ve negatif fraksiyonda hücre tipine özgü genlerin göreceli ekspresyonunu göstermiştir. Her genin ekspresyonu ilk olarak Actb ile normalleştirildi. Pozitif fraksiyon içindeki genlerin göreceli ifadeleri daha sonra Sox9'un ekspresyonuna (10 olarak ayarlanmış) dayanarak hesaplandı. Negatif fraksiyon için, göreceli ifadeyi normalleştirmek için Cyp11a1 (10 olarak ayarlanmış) kullanılmıştır. Hedef genlerin göreceli ekspresyonunun yalnızca her fraksiyon içinde karşılaştırılabileceğini unutmayın. Steroidojenik enzimleri (Hsd3b ve Cyp11a1) kodlayan genler pozitif fraksiyonda zenginleştirildi. Germ hücreleri (Scyp3) ve Sertoli hücreleri (Sox9) için belirteç geni ise negatif fraksiyonda zenginleştirilmiştir. Üç biyolojik replikasyon (üç bağımsız ekstraksiyon, her biri bir testis) gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tüm doku transkriptom analizinin yararlılığı, özellikle karmaşık heterojen dokuları incelerken azaltılabilir. Hücre tipine özgü RNA'ların nasıl elde edileceği, güçlü RNA-seq tekniğini ortaya çıkarmak için acil bir ihtiyaç haline gelir. Hücre tipine özgü RNA'ların izolasyonu genellikle mikromanipülasyon, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) veya lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LCM) kullanılarak belirli bir hücre tipinin toplanmasına dayanır18. Diğer modern yüksek verimli tek hücreli toplama yöntemleri ve cihazları da geliştirilmiştir19. Bu yöntemler genellikle tek hücreleri barkodlamak için mikroakışkan teknikleri ve ardından tek hücreli RNA-seq kullanır. Hücre ayrışması, askıya alınmış hücre çözeltisini elde etmek için gerekli adımdır, daha sonra her hücreyi barkodlamak için bir hücre sıralayıcısından veya mikroakışkan bir cihazdan geçecektir. Hücre ayrışma adımı, hücre tipine özgü çalışmalar için bu yöntemlere zorluklar getirmektedir, çünkü enzimatik tedavi sadece dokuları parçalamakla kalmaz, aynı zamanda hücre canlılığını ve transkripsiyonel profilleri de etkiler20. Dahası, tek hücreli RNA-seq için masraf genellikle yüksektir ve sahada özel ekipman gerektirir.
Son zamanlarda, iki çalışma, NuTRAP fareleri 8,21'i kullanarak tüm dokulardan spesifik hücre tiplerinin RNA / DNA'sını başarıyla izole etti. NuTRAP fare modeli, belirli ekipman ve araçlar kullanmadan, belirli hücre türlerinden RNA'lar ve DNA'lar elde edilmesini sağlar. NuTRAP aleli, hücre ayrışma adımı olmadan Cre-eksprese eden hücreleri hedefleyebilir ve hücrenin canlılığını ve transkripsiyonel profillerini değiştirmekten kaçınabilir. Rol ve ark. çekirdekleri izole etmek ve mRNA'yı aynı anda yağ dokusundan çevirmek için NuTRAP fare modelini kullandılar. Diğer çalışma ayrıca NuTRAP fare modelinin merkezi sinir sistemindeki glial hücreler için çalışabileceğini göstermiştir8.
Laboratuvarımızda testis22'deki Gli1+ interstisyel hücreler ve adrenal bez 13'teki Gli1+ kapsüler hücreler gibi steroidojenik dokulardaki kök hücre popülasyonlarını incelemekle ilgileniyoruz. Bu iki organdaki Gli1 + hücrelerini incelemenin zorluğu, testisteki ve adrenal bezdeki Gli1 + hücrelerinin sayısının az olmasıdır. Örneğin, testisteki Gli1 + hücrelerinin ana popülasyonu olan Leydig hücrelerinin oranı, yetişkin farelerde toplam testis hacminin sadece% 3.8'ini kaplar23. TRAP tekniği, karmaşık dokudaki ribozoma bağlı RNA'ları çevirmeyi özel olarak aşağı çekmeyi amaçladığından, NuTRAP fare modeli, karmaşık bir dokudaki nadir bir hücre popülasyonunu incelemek için uygun güçlü bir araç olabilir. NuTRAP farelerini kullanan daha önce yayınlanmış protokoller, testis ve adrenal bezdeki Gli1 + hücrelerine kıyasla beyinde ve yağ dokusunda daha bol bulunan adipositleri ve glial hücreleri hedef almaktadır. Karmaşık bir dokudaki az sayıda hücreden gerekli RNA'ların elde edilmesini sağlamak için, mevcut protokolleri (1) GFP antikoru ile inkübasyon süresini 1 saatten bir geceye çıkararak; (2) Az miktarda RNA'yı bir pikogram seviyesinde izole etmeyi amaçlayan başka bir RNA ekstraksiyon kiti türü kullanmak.
Bu protokolün, karmaşık bir dokudaki az sayıda hücreden yüksek kaliteli hücre tipine özgü RNA'lar elde edebileceğini gösterdik. Ekstrakte edilen RNA'ların kalitesi ve miktarı, qPCR ve ticari bir mikroarray hizmeti için uygundur. Mikroarray ve qPCR'den elde edilen sonuçlar, Leydig hücreleri ile ilişkili genlerin, bir testisten gelen pozitif fraksiyonda zenginleştirildiğini doğruladı. Buradaki protokol, NuTRAP fare modelini kullanarak hücre tipine özgü çeviri ribozom mRNA'larını izole etmek için ayrıntılı bir yaklaşım sağlar. Bu protokol, RNA'ları herhangi bir EGFP eksprese eden hücreden izole etmek için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen NIH R00HD082686 tarafından desteklenmiştir. Endokrin Derneği Yaz Araştırma Bursu'na H.S.Z.'ye teşekkür ederiz. Ayrıca fare kolonisini yetiştirdiği ve koruduğu için Dr. Yuan Kang'a teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
References
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).
- Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).
- Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Varjosalo, M., Taipale, J.
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , Application Note 1 1-8 (2004).
- Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
- King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
- Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
- Benton, L., Shan, L. -X., Hardy, M. P.
- Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
- Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
- Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481 (2009).
- Gross, A., et al.
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
- Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).
