Summary
Dit protocol is bedoeld om celtypespecifiek te isoleren, ribosomale mRNA's te vertalen met behulp van het NuTRAP-muismodel.
Abstract
Cellulaire heterogeniteit vormt een uitdaging voor het begrijpen van de functie van complexe weefsels op transcriptoomniveau. Het gebruik van celtypespecifieke RNA's vermijdt potentiële valkuilen veroorzaakt door de heterogeniteit van weefsels en ontketent de krachtige transcriptoomanalyse. Het hier beschreven protocol demonstreert hoe de Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) methode kan worden gebruikt om ribosoomgebonden RNA's te isoleren van een kleine hoeveelheid EGFP-expresserende cellen in een complex weefsel zonder celsortering. Dit protocol is geschikt voor het isoleren van celtypespecifieke RNA's met behulp van het onlangs beschikbare NuTRAP-muismodel en kan ook worden gebruikt om RNA's te isoleren van EGFP-expressiecellen.
Introduction
High-throughput benaderingen, waaronder RNA-sequencing (RNA-seq) en microarray, hebben het mogelijk gemaakt om genexpressieprofielen op genoombreed niveau te ondervragen. Voor complexe weefsels zoals het hart, de hersenen en testis zullen de celtypespecifieke gegevens meer details geven waarin het gebruik van RNA's uit het hele weefsel wordt vergeleken 1,2,3. Om de impact van cellulaire heterogeniteit te overwinnen, is de Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) methode ontwikkeld sinds het begin van de jaren 20104. TRAP is in staat om ribosoomgebonden RNA's te isoleren van specifieke celtypen zonder weefseldissociatie. Deze methode is gebruikt voor translatoom (mRNA's die worden gerekruteerd voor het ribosoom voor vertaling) analyse in verschillende organismen, waaronder het richten op een uiterst zeldzame populatie spiercellen in Drosophila embryo's5, het bestuderen van verschillende wortelcellen in de modelplant Arabidopsis thaliana6, en het uitvoeren van transcriptoomanalyse van endotheelcellen bij zoogdieren7.
TRAP vereist een genetische modificatie om het ribosoom van een modelorganisme te labelen. Evan Rosen en collega's hebben onlangs een muismodel ontwikkeld met de naam Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) muis8, dat sinds 2017 beschikbaar is via het Jackson Laboratory. Door te kruisen met een Cre-muislijn kunnen onderzoekers dit NuTRAP-muismodel gebruiken om ribosoomgebonden RNA's en celkernen te isoleren van Cre-tot expressie brengende cellen zonder celsortering. In Cre-expresserende cellen die ook het NuTRAP-allel dragen, maakt het EGFP / L10a-gelabelde ribosoom de isolatie mogelijk van het vertalen van mRNA's met behulp van affiniteit pulldown-assays. In dezelfde cel maakt het biotine ligase herkenningspeptide (BLRP)-gelabelde kernmembraan, dat ook mCherry-positief is, de nucleaire isolatie mogelijk door gebruik te maken van affiniteits- of fluorescentiegebaseerde zuivering. Hetzelfde onderzoeksteam genereerde ook een vergelijkbare muislijn waarin het kernmembraan alleen wordt gelabeld met mCherry zonder biotine8. Deze twee genetisch gemodificeerde muislijnen geven toegang tot het karakteriseren van gepaarde epigenomische en transcriptomische profielen van specifieke soorten cellen in belang.
De egel (Hh) signaleringsroute speelt een cruciale rol in de weefselontwikkeling9. GLI1, een lid van de GLI-familie, fungeert als een transcriptionele activator en bemiddelt de Hh-signalering. Gli1+ cellen zijn te vinden in veel hormoonafscheidende organen, waaronder de bijnier en de testis. Om celtypespecifieke DNA's en RNA's uit Gli1+ cellen te isoleren met behulp van het NuTRAP-muismodel , werden Gli1-CreERT2-muizen gekruist met de NuTRAP-muizen . Shh-CreERT2-muizen werden ook gekruist met de NuTRAP-muizen die sonische egel (Shh) tot expressie brengen van cellen te isoleren. Het volgende protocol laat zien hoe u Gli1-CreERT2 gebruikt; NuTRAP-muizen om ribosoomgebonden RNA's te isoleren uit Gli1+ cellen in volwassen muistestes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle uitgevoerde dierproeven volgden de protocollen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) aan de Auburn University.
OPMERKING: Het volgende protocol gebruikt één testis (ongeveer 100 mg) bij P28 van Gli1-CreERT2; NuTRAP muizen (Mus musculus). Volumes reagentia moeten mogelijk worden aangepast op basis van de soorten monsters en het aantal weefsels.
1. Weefselverzameling
- Euthanaseer de muizen met behulp van een CO2-kamer , ontsmet het buikoppervlak met 70% ethanol.
- Open de onderbuik met een schaar en verwijder de teelballen. Gebruik vloeibare stikstof (LN2) om de teelballen onmiddellijk te bevriezen.
- Bewaar monsters in de dampfase van LN2 tot gebruik.
2. Bereiding van reagentia en kralen
- Bereid de homogenisatie stockoplossing: Voeg 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40 en 1 mg/ml heparine toe. Bewaar de oplossing bij 4 °C tot gebruik (maximaal 1 maand).
- Bereid de homogenisatiewerkbuffer uit de stamoplossing (stap 2.1) vers voor gebruik: Voeg DTT (eindconcentratie: 1 mM), cycloheximide (eindconcentratie: 100 μg/ml), recombinant ribonuclease (eindconcentratie: 200 eenheden/ml) en proteaseremmercocktail (eindconcentratie: 1x) toe aan de homogenisatievoorraadoplossing om de vereiste hoeveelheid van de homogenisatiewerkbuffer te maken. Bewaar de vers bereide werkbuffer op ijs tot gebruik.
- Bereid de zoutarme en de zoutrijke wasbuffers:
- Voor de bereiding van zoutarme wasbuffer mengt u 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl en 1% NP-40. Voeg voor gebruik DTT (eindconcentratie: 1 mM) en cycloheximide (eindconcentratie: 100 μg/ml) toe.
- Voor de bereiding van zoutrijke wasbuffer mengt u 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. Voeg voor gebruik DTT (eindconcentratie: 2 mM) en Cycloheximide (eindconcentratie: 100 μg/ml) toe.
- Bereid eiwit G-kralen (materiaaltabel):
- Elk monster heeft 50 μL eiwit G-kralen nodig. Plaats de benodigde hoeveelheid kralen in een centrifugebuis van 1,5 ml en scheid de kralen van de oplossing met behulp van een magnetisch rek door de buis 30-60 s op het rek te laten liggen.
- Verwijder het supernatant door te pipetteren. Was de kralen drie keer met telkens 1 ml ijskoude zoutarme wasbuffer.
3. Weefsellyse en homogenisatie
- Voeg 2 ml ijskoude homogenisatiewerkbuffer (vers bereid uit stap 2.2) toe aan een glazen weefselslijpset. Plaats het bevroren monster snel in de molen en homogeniseer het weefsel met 30 slagen op ijs met behulp van een losse stamper.
- Breng het homogenaat over in een buis met ronde bodem van 2 ml en centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Breng het supernatant over in een nieuwe buis van 2 ml. Bespaar 100 μL aan een buis van 1,5 ml als "ingang".
- Incubeer het supernatant in de buis van 2 ml met het anti-GFP-antilichaam (5 μg/ml; 1:400) bij 4 °C op een end-over-end rotator (24 rpm) 's nachts.
4. Immunoprecipitatie
- Breng het homogenaat/antilichaammengsel over in een nieuwe buis met ronde bodem van 2 ml met daarin de gewassen eiwit G-kralen uit stap 2.4. Incubeer bij 4 °C op een end-over-end rotator (24 rpm) gedurende 2 uur.
- Scheid de magnetische kralen van het supernatant met behulp van een magneetrek. Bewaar het supernatant als de "negatieve fractie". De negatieve fractie bevat (1) RNA's in EGFP-negatieve cellen en (2) RNA's in EGFP-positieve cellen die niet gebonden zijn aan ribosomen.
- Voeg 1 ml zoutrijke wasbuffer toe aan de kralen en draai de buis kort om de kralen te wassen. Plaats de buis in een magneetrek.
- Verwijder de wasbuffer. Herhaal de wasstap nog twee keer. De kralen bevatten nu het kralen-ribosoom-RNA-complex van EGFP-positieve cellen.
5. RNA-extractie
OPMERKING: De volgende stappen zijn aangepast van de RNA-isolatiekit (Materiaaltabel). Behandel elke fractie (d.w.z. input, positief en negatief) als een onafhankelijk monster en isoleer RNA's onafhankelijk.
- Incubeer de kralen uit stap 4.4 met 50 μL extractiebuffer (uit de RNA-isolatiekit) in een thermomixer (42 °C, 500 tpm) gedurende 30 minuten om RNA's uit kralen vrij te maken.
- Scheid de kralen met een magneetrek, breng het supernatant dat het kralen-ribosoom-RNA-complex bevat over naar een buis van 1,5 ml.
- Centrifugeer de buis op 3000 x g gedurende 2 minuten en pipetteer het supernatant vervolgens naar een nieuwe buis van 1,5 ml. Deze buis bevat de "positieve fractie" van de TRAP-stap.
OPMERKING: Voor de input en de negatieve fracties, extraheer RNA uit 25 μL monsters met behulp van 1 ml extractiebuffer. Incubeer in een thermomixer (42 °C, 500 tpm) gedurende 30 min. - Conditioneer de RNA-zuiveringskolom vooraf: Pipet 250 μL conditioneringsbuffer op de zuiveringskolom. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Centrifugeer de kolom bij 16.000 x g gedurende 1 min.
- Pipetteer gelijk volume van 70% EtOH in het supernatant vanaf stap 5.3 (ongeveer 50 μL van 70% EtOH voor de positieve fractie en 1 ml van 70% EtOH voor de input en de negatieve fracties). Meng goed door op en neer te pipetteren.
- Pipetteer het mengsel in de kolom vanaf stap 5.4.
- Centrifugeer de kolom bij 100 x g gedurende 2 minuten om RNA-binding aan het membraan in de kolom mogelijk te maken en ga vervolgens onmiddellijk verder met centrifugeren bij 16.000 x g gedurende 30 s. Gooi de doorstroom weg.
OPMERKING: Voeg voor de input en de negatieve fracties telkens 250 μL van het mengsel toe aan de kolom. Herhaal stap 5.6 en 5.7 totdat alle mengsels zijn gebruikt. - Pipetteer 100 μL washbuffer 1 (W1) in de kolom en centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 1 min. Gooi de doorstroom weg.
- Pipet 75 μL DNase-oplossing meng direct in het zuiveringskolommembraan. Incubeer bij RT gedurende 15 min.
- Pipetteer 40 μL W1 in de kolom en centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 30 s. Gooi de doorstroom weg.
- Pipetteer 100 μL wasbuffer 2 (W2) in de kolom en centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 1 minuut. Gooi de doorstroom weg.
- Pipetteer 100 μL W2 in de kolom en centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 2 min. Gooi de doorstroom weg. Centrifugeer dezelfde kolom opnieuw bij 16.000 x g gedurende 1 minuut om alle sporen van wasbuffer voorafgaand aan de elutiestap te verwijderen.
- Breng de kolom over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Pipetteer 12 μL RNase-vrij water rechtstreeks op het membraan van de zuiveringskolom. De pipetpunt mag het membraan niet raken. Incubeer bij RT gedurende 1 min en centrifugeer bij 1000 x g gedurende 1 min. Ga vervolgens door met centrifugatie bij 16.000 x g gedurende 1 minuut om het RNA te elueren.
6. RNA-concentratie en kwaliteit
- Gebruik een bioanalyzer om de kwaliteit en kwantiteit van het geëxtraheerde RNA10 te beoordelen.
7. Opslag en verdere analyse
- Bewaar het RNA bij -80 °C (tot 1 jaar) tot verdere analyse (bijv. microarray, kwantitatieve PCR (qPCR) en RNA-seq, enz.).
OPMERKING: Voor details van de qPCR-analyse, inclusief cDNA-synthese, raadpleegt u Lyu et al.11. Primers voor qPCR staan vermeld in de tabel met materialen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gli1-CreERT2-muizen (Jackson Lab Stock Number: 007913) werden voor het eerst gekruist met de NuTRAP-reportermuis (Jackson Lab Stock Number: 029899) om dubbelmutante muizen te genereren. Muizen met beide genetisch gemanipuleerde gen-allelen (d.w.z. Gli1-CreERT2 en NuTRAP) werden eenmaal daags, om de andere dag, geïnjecteerd met tamoxifen gedurende drie injecties. Weefselmonsters werden verzameld op de7e dag na de1e dag van de injectie. Immunofluorescentieanalyse toonde aan dat het EGFP tot expressie kwam in interstitiële cellen in teelballen (figuur 1). Van de bijniercapsule is bekend dat het een andere celpopulatie is die positief is van Gli112,13. EGFP werd ook gevonden in bijniercapsulaire cellen in Gli1-CreERT2; NuTRAP-muizen (figuur 1). Ons lab draagt ook Shh-CreERT2; NuTRAP muizen. Merk op dat in Shh-CreERT2; NuTRAP-muizen, de EGFP+ celpopulatie bevindt zich in de buitenste cortex van de bijnier onder de capsule (figuur 1), dezelfde expressieplaats van EGFP+ cellen in Shh+ gebied in de bijnier13 die de expressie van EGFP in Cre-expresserende cellen bevestigt.
Na de extractie van de celtypespecifieke RNA's werden de kwantiteit en kwaliteit van geïsoleerde RNA's in elke fractie uit twee onafhankelijke extracties (één testis gebruikt in elke extractie) beoordeeld met behulp van een bioanalyzer (figuur 2). Het bioanalyzerresultaat gaf aan dat dit protocol in staat is om hoogwaardige RNA's te verkrijgen uit alle drie de fracties. Alle fracties hadden een vergelijkbaar RNA Integrity Number (RIN).
Om verder te testen of het geëxtraheerde RNA celtypespecifiek is, werd geëxtraheerd RNA verzonden voor microarray-analyse met behulp van een commerciële microarray-service (zie Tabel met materialen). Het microarrayresultaat toonde aan dat ongeveer 4.000 genen verrijkt waren in de positieve fractie in vergelijking met de negatieve fractie, terwijl ongeveer 3.000 genen verrijkt waren in de negatieve fractie (figuur 3). Van deze differentieel tot expressie gebrachte genen werden de Leydig-cel-geassocieerde genen Hsd11b1 en Hsd3b6 14,15 verrijkt in de positieve fractie. In de negatieve fractie werden de Sertoli-cel-geassocieerde genen Dhh en Gstm616,17 verrijkt. Slechts enkele differentieel tot expressie gebrachte genen werden geïdentificeerd bij het vergelijken van de negatieve fractie met de input.
Real-time kwantitatieve RT-PCR (qPCR) werd ook gebruikt om de expressie van sleutelgenen in de positieve fractie en de negatieve fractie te bevestigen. Vergelijkbaar met wat werd gevonden in de microarray-assay, werden steroidogene enzymen 3β-Hydroxysteroïde dehydrogenase (gecodeerd door Hsd3b) en cholesterol side-chain cleavage enzyme (gecodeerd door Cyp11a1) verrijkt in de positieve fractie. Terwijl de Sertoli-celmarker Sox9 (SRY-box Transcription Factor 9) en de kiemcelmarker Sycp3 (Synaptonemal Complex Protein 3) werden verrijkt in de negatieve fractie (figuur 4). Samen toonden deze gegevens aan dat de transcriptomen in Gli1+ cellen met succes naar beneden werden getrokken en verrijkt door het bovenstaande protocol.
Figuur 1: Immunofluorescentiebeelden van de EGFP-expressie in NuTRAP-reportermuismodellen. De Gli1-CreERT2; NuTRAP en de Shh-CreERT2; NuTRAP-muizen werden behandeld met tamoxifen om de EGFP-expressie te activeren. In de testis bevonden Gli1+ cellen zich in het interstitium, terwijl in de bijnier Gli1+ cellen in de bijniercapsule zaten. In de bijnier waren de cellen onder de capsule positief voor SHH (EGFP+ cellen in Shh-CreERT2; NuTRAP muizen). SHH is het ligand van de SHH-signaleringsroute die zijn functie in Gli1+ kapselcellen13 uitlokt. Schaalbalken: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: RNA-kwaliteit en -kwantiteit van de TRAP-extractie. RNA's van de positieve fractie, de negatieve fractie en de input werden geëvalueerd met behulp van een bioanalyzer. De positieve fractie bevat RNA's geëxtraheerd uit eiwit G-kralen na de incubatie met het GFP-antilichaam (stap 4.1). De negatieve fractie bevat RNA's die in stap 4.2 in het supernatant achterblijven. De input bevat RNA's van het homogenaat (stap 3.3). Omdat in het elektroferogram de concentraties van de onderste marker (weergegeven als de eerste piek op 20-25 s van de migratietijd van monsters op de X-as) en de ladder (niet weergegeven in deze elektroferogrammen) bekend zijn, kan de concentratie van elk monster worden berekend. De twee belangrijkste pieken bij 40-50 s vertegenwoordigen het 18S- en 28S-rRNA. De ribosomale verhouding (gebaseerd op de fluorescentie-intensiteit op de Y-as) wordt gebruikt om de integriteit van het RNA-monster te bepalen. Het RNA-integriteitsnummer (RIN) van elk monster wordt weergegeven in de rechterbovenhoek van elke plot. Elke stip in de dot plot vertegenwoordigt de hoeveelheid RNA die werd geëxtraheerd uit één enkele testis. De hoeveelheid RNA van elk monster in de negatieve fractie en de input werd geëxtraheerd uit 25 μL monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Microarray analyse voor TRAP monsters. De resultaten van twee extracties (elk één testis) worden weergegeven. De microarray-analyse identificeerde een vergelijkbaar aantal differentieel tot expressie gebrachte genen uit twee onafhankelijke extracties (Testis A en Testis B). Ongeveer 4.000 genen werden verrijkt (rode stippen) in de positieve fractie, terwijl ~ 3.000 genen werden verrijkt (groene stippen) in de negatieve fractie. Hsd11b1 en Hsd3b6 werden verrijkt in positieve fracties. Dhh en Gstm6 werden verrijkt met negatieve fracties. Slechts enkele genen werden geïdentificeerd als differentieel tot expressie gebrachte genen tussen de negatieve fractie en de input, wat suggereert dat de testis slechts een zeer klein aantal Gli1 + - cellen bevat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: qPCR-analyse voor TRAP-monsters. qPCR-analyse toonde de relatieve expressie van celtype-specifieke genen in de positieve fractie en de negatieve fractie. De expressie van elk gen werd eerst genormaliseerd met Actb. De relatieve expressies van genen binnen de positieve fractie werden vervolgens berekend op basis van de expressie van Sox9 (ingesteld als 10). Voor de negatieve breuk werd Cyp11a1 (ingesteld als 10) gebruikt om de relatieve expressie te normaliseren. Merk op dat de relatieve expressie van doelgenen alleen binnen elke fractie kan worden vergeleken. Genen die coderen voor de steroidogene enzymen (Hsd3b en Cyp11a1) werden verrijkt in de positieve fractie. Terwijl het markergen voor geslachtscellen (Scyp3) en Sertoli-cellen (Sox9) verrijkt waren in de negatieve fractie. Drie biologische replicaties (drie onafhankelijke extracties, elk één testis) werden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het nut van de analyse van het hele weefsel transcriptoom kan worden gedempt, vooral bij het bestuderen van complexe heterogene weefsels. Het verkrijgen van celtype-specifieke RNA's wordt een dringende noodzaak om de krachtige RNA-seq-techniek te ontketenen. De isolatie van celtypespecifieke RNA's is meestal afhankelijk van het verzamelen van een specifiek type cellen met behulp van micromanipulatie, fluorescent-activated cell sorting (FACS) of laser capture microdissection (LCM)18. Andere moderne high-throughput single-cell verzamelmethoden en instrumenten zijn ook ontwikkeld19. Deze methoden maken meestal gebruik van de microfluïdica-technieken om enkele cellen te barcoderen, gevolgd door eencellige RNA-seq. Celdissociatie is de vereiste stap om de gesuspendeerde celoplossing te verkrijgen, die vervolgens door een celsorteerder of een microfluïdisch apparaat gaat om elke cel te barcoderen. De celdissociatiestap introduceert uitdagingen voor deze methoden voor celtypespecifieke studies omdat de enzymatische behandeling niet alleen weefsels afbreekt, maar ook de levensvatbaarheid van cellen en transcriptionele profielen beïnvloedt20. Bovendien zijn de kosten voor eencellige RNA-seq meestal hoog en vereist gespecialiseerde apparatuur ter plaatse.
Onlangs isoleerden twee studies met succes RNA / DNA van specifieke celtypen uit hele weefsels met behulp van de NuTRAP-muizen 8,21. Zonder specifieke apparatuur en hulpmiddelen te gebruiken, maakt het NuTRAP-muismodel het mogelijk om RNA's en ANI's te verkrijgen van specifieke soorten cellen. Het NuTRAP-allel zou zich kunnen richten op Cre-expresserende cellen zonder de celdissociatiestap, waardoor de levensvatbaarheid van de cel en transcriptionele profielen worden vermeden. Rol et al. gebruikten het NuTRAP-muismodel om kernen te isoleren en mRNA tegelijkertijd uit vetweefsel te vertalen. De andere studie toonde ook aan dat het NuTRAP-muismodel zou kunnen werken voor gliacellen in het centrale zenuwstelsel8.
In ons lab zijn we geïnteresseerd in het bestuderen van de stamcelpopulaties in steroidogene weefsels zoals Gli1+ interstitiële cellen in de testis22 en Gli1+ kapselcellen in de bijnier13. De uitdaging van het bestuderen van Gli1+ cellen in deze twee organen is dat het aantal Gli1+ cellen in de testis en de bijnier klein is. Bijvoorbeeld, het aandeel van Leydig-cellen, die de belangrijkste populatie van Gli1 + -cellen in de testis zijn, beslaat slechts ongeveer 3,8% van het totale testisvolume bij volwassen muizen23. Omdat de TRAP-techniek specifiek gericht is op het naar beneden halen van ribosoomgebonden RNA's in complex weefsel, zou het NuTRAP-muismodel een krachtig hulpmiddel kunnen zijn dat geschikt is voor het bestuderen van een zeldzame celpopulatie in een complex weefsel. De eerder gepubliceerde protocollen met NuTRAP-muizen richten zich op adipocyten en gliacellen die overvloediger aanwezig zijn in de hersenen en vetweefsel in vergelijking met Gli1 + -cellen in de testis en in de bijnier. Om ervoor te zorgen dat de vereiste RNA's uit een klein aantal cellen in een complex weefsel worden verkregen, hebben we de bestaande protocollen herzien door (1) de incubatietijd met het GFP-antilichaam te verhogen van 1 uur naar een nacht; (2) het gebruik van een ander type RNA-extractiekit die tot doel heeft een kleine hoeveelheid RNA op picogramniveau te isoleren.
We hebben aangetoond dat dit protocol hoogwaardige celtypespecifieke RNA's kan verkrijgen uit een klein aantal cellen in een complex weefsel. De kwaliteit en kwantiteit van geëxtraheerde RNA's zijn geschikt voor qPCR en een commerciële microarray-service. Resultaten van microarray en qPCR bevestigden dat Leydig-cellen-geassocieerde genen verrijkt zijn in de positieve fractie afkomstig van één testis. Het protocol hier biedt een gedetailleerde benadering voor het isoleren van celtypespecifiek vertalen van ribosoom mRNA's met behulp van het NuTRAP-muismodel . Dit protocol kan ook worden gebruikt om RNA's te isoleren van EGFP-expressiecellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH R00HD082686. We bedanken de Endocrine Society Summer Research Fellowship aan H.S.Z. We bedanken ook Dr. Yuan Kang voor het fokken en onderhouden van de muizenkolonie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
References
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).
- Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).
- Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Varjosalo, M., Taipale, J. Hedgehog: functions and mechanisms. Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , Application Note 1 1-8 (2004).
- Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
- King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
- Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
- Benton, L., Shan, L. -X., Hardy, M. P. Differentiation of adult Leydig cells. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).
- Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
- Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
- Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481 (2009).
- Gross, A., et al. Technologies for single-cell isolation. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
- Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).
