Summary
该协议旨在使用NuTRAP小鼠模型分离细胞类型特异性翻译核糖体mRNA。
Abstract
细胞异质性对在转录组水平上理解复杂组织的功能提出了挑战。使用细胞类型特异性RNA可避免由组织异质性引起的潜在陷阱,并释放强大的转录组分析。此处描述的方案演示了如何使用翻译核糖体亲和纯化(TRAP)方法从复杂组织中的少量表达EGFP的细胞中分离核糖体结合的RNA,而无需细胞分选。该协议适用于使用最近可用的 NuTRAP 小鼠模型分离细胞类型特异性RNA,也可用于从任何表达EGFP的细胞中分离RNA。
Introduction
包括RNA测序(RNA-seq)和微阵列在内的高通量方法使得在全基因组水平上询问基因表达谱成为可能。对于心脏、大脑和睾丸等复杂组织,细胞类型特异性数据将提供更多细节,比较整个组织RNA 的使用 1,2,3。为了克服细胞异质性的影响,自 2010 年代初以来,已经开发了翻译核糖体亲和纯化 (TRAP) 方法4。TRAP能够从特定细胞类型中分离核糖体结合的RNA,而无需组织解离。该方法已用于不同生物体的翻译组(被募集到核糖体中进行翻译的mRNA)分析,包括靶向果蝇胚胎中极其罕见的肌肉细胞群5,研究模式植物拟南芥6中的不同根细胞,以及对哺乳动物的内皮细胞进行转录组分析7。
TRAP需要基因改造来标记模式生物的核糖体。Evan Rosen及其同事最近开发了一种名为核标记和翻译核糖体亲和纯化(NuTRAP)小鼠8的小鼠模型,该模型自2017年以来已通过杰克逊实验室提供。通过与Cre小鼠系杂交,研究人员可以使用这种 NuTRAP 小鼠模型从表达Cre的细胞中分离核糖体结合的RNA和细胞核,而无需细胞分选。在也携带 NuTRAP 等位基因的表达Cre的细胞中,EGFP/L10a标记的核糖体允许使用亲和下拉测定分离翻译mRNA。在同一细胞中,生物素连接酶识别肽(BLRP)标记的核膜也是mCherry阳性,通过使用亲和或荧光纯化允许核分离。同一研究小组还产生了类似的小鼠系,其中核膜仅用mCherry标记,而没有生物素8。这两种转基因小鼠系可以表征特定类型感兴趣细胞的配对表观基因组和转录组谱。
刺猬(Hh)信号通路在组织发育中起着关键作用9。GLI1是GLI家族的成员,充当转录激活剂并介导Hh信号。Gli1+细胞可以在许多激素分泌器官中找到,包括肾上腺和睾丸。为了使用NuTRAP小鼠模型从Gli1 +细胞中分离细胞类型特异性DNA和RNA,将Gli1-CreERT2小鼠与NuTRAP小鼠杂交。Shh-CreERT2小鼠也与NuTRAP小鼠杂交,旨在分离表达声波刺猬(Shh)的细胞。以下协议显示了如何使用 Gli1-CreERT2;NuTRAP小鼠从成年小鼠睾丸中的Gli1 +细胞中分离核糖体结合的RNA。
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Protocol
所有进行的动物实验都遵循奥本大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的协议。
注意:以下方案使用来自 Gli1-CreERT2 的 P28 的一个睾丸(约 100 mg);NuTRAP 小鼠(Mus musculus)。试剂体积可能需要根据样品类型和组织数量进行调整。
1. 组织采集
- 使用CO2 室对小鼠实施安乐死,用70%乙醇消毒腹部表面。
- 用剪刀打开下腹部并取出睾丸。使用液氮(LN2)立即快速冷冻睾丸。
- 将样品储存在LN2 的气相中直至使用。
2. 试剂和磁珠制备
- 制备匀浆储备溶液:加入 50 mM Tris (pH 7.4)、12 mM MgCl2、100 mM KCl、1% NP-40 和 1 mg/mL 肝素。将溶液储存在4°C直至使用(长达1个月)。
- 使用前从储备溶液(步骤2.1)新鲜制备均质工作缓冲液:向均质储备溶液中加入DTT(终浓度:1 mM)、环己酰亚胺(终浓度:100 μg/mL)、重组核糖核酸酶(终浓度:200 单位/mL)和蛋白酶抑制剂混合物(终浓度:1x),制成所需量的匀浆工作缓冲液。将新鲜制备的工作缓冲液储存在冰上直至使用。
- 准备低盐和高盐洗涤缓冲液:
- 制备低盐洗涤缓冲液,混合50 mM Tris(pH 7.4),12 mM MgCl2,100 mM KCl和1% NP-40。使用前加入DTT(终浓度:1 mM)和环己酰亚胺(终浓度:100 μg/mL)。
- 制备高盐洗涤缓冲液混合物50 mM Tris(pH 7.4),12 mM MgCl2,300 mM KCl,1%NP-40。使用前加入DTT(终浓度:2 mM)和环己酰亚胺(终浓度:100 μg/mL)。
- 制备蛋白G珠(材料表):
- 每个样品需要 50 μL 蛋白 G 珠。将所需量的磁珠放入 1.5 mL 离心管中,并使用磁性架将磁珠与溶液分离,方法是将管留在管架上 30-60 秒。
- 通过移液除去上清液。每次用 1 mL 冰冷的低盐洗涤缓冲液洗涤珠子 3 次。
3. 组织裂解和均质
- 将 2 mL 冰冷的均质工作缓冲液(从步骤 2.2 新鲜制备)添加到玻璃组织研磨机组中。快速将冷冻样品放入研磨机中,并使用松散的杵在冰上按 30 次冲程均质组织。
- 将匀浆转移到2mL圆底管中,并在4°C下以12,000× g 离心10分钟。
- 将上清液转移到新的 2 mL 管中。将 100 μL 保存到 1.5 mL 管中作为“输入”。
- 将上清液与抗 GFP 抗体 (5 μg/mL; 1:400) 在 4 °C 下在端对端旋转器 (24 rpm) 下孵育过夜。
4. 免疫沉淀
- 将匀浆/抗体混合物转移到新的 2 mL 圆底管中,该管含有步骤 2.4 中洗涤的蛋白质 G 珠。在4°C下在端对端旋转器(24rpm)上孵育2小时。
- 使用磁铁架将磁珠与上清液分离。将上清液保存为“负级分”。阴性部分在EGFP阴性细胞中含有(1)RNA,在EGFP阳性细胞中含有(2)不与核糖体结合的RNA。
- 向磁珠中加入 1 mL 高盐洗涤缓冲液,并短暂涡旋试管以洗涤珠子。将管子放在磁铁架中。
- 取出洗涤缓冲液。再重复两次洗涤步骤。这些珠子现在含有来自EGFP阳性细胞的珠子 - 核糖体 - RNA复合物。
5. 核糖核酸提取
注意:以下步骤改编自RNA分离试剂盒(材料表)。将每个部分(即输入、阳性和阴性)视为独立样品并独立分离RNA。
- 将步骤 4.4 中的磁珠与 50 μL 提取缓冲液(来自 RNA 分离试剂盒)在热混合器(42 °C,500 rpm)中孵育 30 分钟以释放磁珠中的 RNA。
- 用磁架分离磁珠,将含有磁珠-核糖体-RNA复合物的上清液转移到1.5mL管中。
- 将管以 3000 x g 离心 2 分钟,然后将上清液移液到新的 1.5 mL 管中。该管包含TRAP步骤的“正分数”。
注意:对于起始和负性馏分,使用 1 mL 提取缓冲液从 25 μL 样品中提取 RNA。在热混合器(42°C,500rpm)中孵育30分钟。 - 预处理RNA纯化柱:将250 μL预处理缓冲液移液到纯化柱上。在室温(RT)下孵育5分钟。将色谱柱以16,000× g 离心1分钟。
- 将等体积的70%EtOH移液到步骤5.3的上清液中(正级分约50μL的70%EtOH和1mL的70%EtOH的进样和负级分)。通过上下移液充分混合。
- 将混合物从步骤5.4移液到色谱柱中。
- 将色谱柱以100 x g 离心2分钟,以使RNA与柱中的膜结合,然后立即继续以16,000 x g 离心30秒。丢弃流出物。
注意:对于进样和负馏分,每次向色谱柱中加入250 μL混合物。重复步骤5.6和5.7,直到用完所有混合物。 - 将 100 μL 洗涤缓冲液 1 (W1) 移液到色谱柱中,并以 8,000 x g 离心 1 分钟。丢弃流出物。
- 将 75 μL 脱氧核糖核酸酶溶液直接混合到纯化柱膜中。在室温下孵育15分钟。
- 将 40 μL W1 移液到色谱柱中,并以 8,000 x g 离心 30 秒。丢弃流出物。
- 将 100 μL 洗涤缓冲液 2 (W2) 移液到色谱柱中,并以 8,000 x g 离心 1 分钟。丢弃流出物。
- 将 100 μL W2 移液到色谱柱中,并以 16,000 x g 离心 2 分钟。丢弃流出物。在洗脱步骤之前,以16,000 x g 离心同一色谱柱1分钟,以除去所有痕量的洗涤缓冲液。
- 将色谱柱转移到新的 1.5 mL 微量离心管中。
- 将 12 μL 无 RNase 的水直接移液到纯化柱的膜上。移液器吸头不应接触膜。在室温下孵育1分钟,并以1000× g 离心1分钟。然后继续以16,000× g 离心1分钟以洗脱RNA。
6. RNA浓度和质量
- 使用生物分析仪评估提取的RNA的质量和数量10.
7. 存储和进一步分析
- 将RNA储存在-80°C(长达1年)直至进一步分析(例如,微阵列,定量PCR(qPCR)和RNA-seq等)。
注意:有关qPCR分析的详细信息,包括cDNA合成,请参阅Lyu等人11。qPCR的引物列在 材料表中。
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Representative Results
首先将Gli1-CreERT2小鼠(杰克逊实验室库存号:007913)与NuTRAP报告小鼠(杰克逊实验室库存号:029899)杂交以产生双突变小鼠。携带两种基因工程基因等位基因(即Gli1-CreERT2和NuTRAP)的小鼠每天注射一次他莫昔芬,每隔一天注射三次。在注射第1天后第7天收集组织样本。免疫荧光分析显示,EGFP在睾丸的间质细胞中表达(图1)。已知肾上腺囊是Gli112,13的另一个阳性细胞群。EGFP也存在于Gli1-CreERT2的肾上腺包膜细胞中;NuTRAP小鼠(图1)。我们的实验室还携带Shh-CreERT2;NuTRAP小鼠。请注意,在 Shh-CreERT2 中;NuTRAP小鼠,EGFP+细胞群位于胶囊下方的肾上腺外皮层(图1),EGFP+细胞在肾上腺13的Shh+区域中的表达位点相同,证实了EGFP在表达Cre的细胞中的表达。
提取细胞类型特异性RNA后,使用生物分析仪评估来自两次独立提取(每次提取使用一个睾丸)的每个部分中分离RNA的数量和质量(图2)。生物分析仪结果表明,该方案能够从所有三种组分中获得高质量的RNA。所有馏分都具有相似的RNA完整性数(RIN)。
为了进一步测试提取的RNA是否具有细胞类型特异性,使用商业微阵列服务将提取的RNA送去进行微阵列分析(参见材料表)。微阵列结果显示,与阴性部分相比,约有4,000个基因在阳性部分富集,而阴性部分约有3,000个基因富集(图3)。在这些差异表达基因中,Leydig-cell相关基因Hsd11b1和Hsd3b6 14,15富集在阳性部分中。在阴性部分,Sertoli细胞相关基因Dhh和Gstm616,17富集。在将负部分与输入进行比较时,仅鉴定出几个差异表达的基因。
实时定量RT-PCR(qPCR)也用于确认阳性部分和阴性部分中关键基因的表达。与微阵列测定中发现的类似,类固醇生成酶3β-羟基类固醇脱氢酶(由 Hsd3b编码)和胆固醇侧链裂解酶(由 Cyp11a1编码)富集在阳性部分中。而Sertoli细胞标志物 Sox9 (SRY盒转录因子9)和生殖细胞标志物 Sycp3 (突触复合蛋白3)在阴性部分富集(图4)。这些数据共同表明, Gli1+ 细胞中的转录组被上述方案成功拉下并富集。
图1:NuTRAP报告小鼠模型中EGFP表达的免疫荧光图像。 Gli1-CreERT2;NuTRAP和Shh-CreERT2;用他莫昔芬处理NuTRAP小鼠以激活EGFP表达。在睾丸中,Gli1+细胞位于间质中,而在肾上腺中,Gli1+细胞位于肾上腺囊中。在肾上腺中,胶囊下方的细胞对SHH呈阳性(Shh-CreERT2中的EGFP+细胞;NuTRAP小鼠)。SHH是SHH信号通路的配体,可在Gli1+包膜细胞中引发其功能13。比例尺:50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:来自 TRAP 提取的 RNA 质量和数量。 使用生物分析仪评估正级分、负级分和输入的RNA。阳性部分含有与GFP抗体孵育后从蛋白G珠中提取的RNA(步骤4.1)。阴性部分含有在步骤4.2中保留在上清液中的RNA。输入包含来自匀浆的RNA(步骤3.3)。在电泳图中,由于已知下部标记物(显示为X轴上显示的样品迁移时间20-25秒处的第一个峰)和梯形图(未在这些电泳图中显示)的浓度,因此可以计算每个样品的浓度。40-50 s的两个主要峰代表18S和28S rRNA。核糖体比率(基于Y轴上显示的荧光强度)用于确定RNA样品的完整性。每个样品的RNA完整性数(RIN)显示在每个图的右上角。点图中的每个点代表从一个睾丸中提取的RNA量。从25 μL样品中提取阴性部分和输入物中每个样品的RNA量。 请点击此处查看此图的大图。
图 3:TRAP 样品的微阵列分析。 显示两次拔牙(每次一个睾丸)的结果。微阵列分析从两个独立的提取(睾丸A和睾丸B)中鉴定出相似数量的差异表达基因。在阳性部分中约有4,000个基因富集(红点),而在阴性部分中富集了~3,000个基因(绿点)。 Hsd11b1 和 Hsd3b6 富含正馏分。 Dhh 和 Gstm6 富集在负馏分中。只有少数基因被鉴定为阴性部分和输入之间的差异表达基因,这表明睾丸仅包含非常少量的 Gli1 + 细胞。 请点击此处查看此图的大图。
图 4:捕集阱样品的 qPCR 分析。 qPCR分析显示细胞类型特异性基因在阳性部分和阴性部分中的相对表达。每个基因的表达首先用 Actb标准化。 然后根据 Sox9 的表达(设置为10)计算阳性部分中基因的相对表达。对于负分数, 使用Cyp11a1 (设置为10)来规范化相对表达式。请注意,靶基因的相对表达只能在每个部分内进行比较。编码类固醇生成酶(Hsd3b 和 Cyp11a1)的基因在阳性部分富集。而生殖细胞(Scyp3)和Sertoli细胞(Sox9)的标记基因在阴性部分富集。显示了三个生物学重复(三个独立提取,每个一个睾丸)。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
全组织转录组分析的有用性可能会受到抑制,尤其是在研究复杂的异质组织时。如何获得细胞类型特异性RNA成为释放强大的RNA-seq技术的迫切需要。细胞类型特异性RNA的分离通常依赖于使用显微操作,荧光激活细胞分选(FACS)或激光捕获显微切割(LCM)收集特定类型的细胞18。还开发了其他现代高通量单细胞收集方法和仪器19。这些方法通常采用微流体技术对单细胞进行条形码编码,然后对单细胞RNA-seq进行条形码编码。细胞解离是获得悬浮细胞溶液的必要步骤,然后通过细胞分选仪或微流体装置对每个细胞进行条形码编码。细胞解离步骤为这些细胞类型特异性研究的方法带来了挑战,因为酶处理不仅会分解组织,还会影响细胞活力和转录谱20。此外,单细胞RNA-seq的费用通常很高,并且需要现场的专用设备。
最近,两项研究使用NuTRAP小鼠8,21成功地从整个组织中分离出特定细胞类型的RNA / DNA。在不使用特定设备和工具的情况下,NuTRAP小鼠模型允许从特定类型的细胞中获取RNA和DNA。NuTRAP等位基因可以在没有细胞解离步骤的情况下靶向表达Cre的细胞,避免改变细胞的活力和转录谱。Rol等人使用NuTRAP小鼠模型从脂肪组织中分离细胞核并同时翻译mRNA。另一项研究还表明,NuTRAP小鼠模型可以用于中枢神经系统中的神经胶质细胞8。
在我们的实验室中,我们有兴趣研究类固醇组织中的干细胞群,例如睾丸22中的Gli1+间质细胞和肾上腺13中的Gli1 +荚膜细胞。在这两个器官中研究Gli1+细胞的挑战在于睾丸和肾上腺中的Gli1+细胞数量很少。例如,睾丸中Gli1+细胞的主要群体Leydig细胞的比例仅占成年小鼠23总睾丸体积的3.8%左右。由于TRAP技术旨在特异性地拉低复杂组织中核糖体结合RNA的翻译,因此NuTRAP小鼠模型可能是适用于研究复杂组织中稀有细胞群的强大工具。先前发表的使用NuTRAP小鼠的方案针对脂肪细胞和神经胶质细胞,与睾丸和肾上腺中的Gli1 +细胞相比,脂肪细胞和神经胶质细胞在大脑和脂肪组织中更丰富。为了确保从复杂组织中的少量细胞中获得所需的RNA,我们通过以下方式修改了现有方案:(1)将GFP抗体的孵育时间从1小时增加到过夜;(2)使用另一种类型的RNA提取试剂盒,旨在分离皮克水平的少量RNA。
我们证明了该方案可以从复杂组织中的少量细胞中获得高质量的细胞类型特异性RNA。提取的RNA的质量和数量能够用于qPCR和商业微阵列服务。微阵列和qPCR的结果证实,间质细胞相关基因富含来自一个睾丸的阳性部分。此处的方案提供了一种使用 NuTRAP 小鼠模型分离细胞类型特异性翻译核糖体mRNA的详细方法。该协议也可用于从任何表达EGFP的细胞中分离RNA。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH R00HD082686的部分支持。我们感谢H.S.Z的内分泌学会暑期研究奖学金。我们还要感谢袁康博士培育和维护鼠群。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
GFP antibody | Abcam | ab290 | |
Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
KCl | Biosciences | R005 | |
MgCl2 | Biosciences | R004 | |
Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
Tris | Alfa Aesar | J62848 |
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