Summary
يهدف هذا البروتوكول إلى عزل mRNAs الريبوسومية المترجمة الخاصة بنوع الخلية باستخدام نموذج الماوس NuTRAP.
Abstract
يشكل عدم التجانس الخلوي تحديات لفهم وظيفة الأنسجة المعقدة على مستوى النسخ. يؤدي استخدام الحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية إلى تجنب المزالق المحتملة الناجمة عن عدم تجانس الأنسجة ويطلق العنان لتحليل النسخ القوي. يوضح البروتوكول الموصوف هنا كيفية استخدام طريقة تنقية تقارب الريبوسوم المترجم (TRAP) لعزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم من كمية صغيرة من الخلايا المعبرة عن EGFP في نسيج معقد دون فرز الخلايا. هذا البروتوكول مناسب لعزل الحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية باستخدام نموذج الماوس NuTRAP المتاح مؤخرا ويمكن استخدامه أيضا لعزل الحمض النووي الريبي عن أي خلايا تعبر عن EGFP.
Introduction
مكنت النهج عالية الإنتاجية ، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) والمصفوفات الدقيقة ، من استجواب ملفات تعريف التعبير الجيني على مستوى الجينوم. بالنسبة للأنسجة المعقدة مثل القلب والدماغ والخصية ، ستوفر البيانات الخاصة بنوع الخلية مزيدا من التفاصيل التي تقارن استخدام الحمض النووي الريبي من الأنسجة بأكملها1،2،3. للتغلب على تأثير عدم التجانس الخلوي ، تم تطوير طريقة ترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (TRAP) منذ أوائل عام 20104. TRAP قادر على عزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم من أنواع خلايا معينة دون تفكك الأنسجة. تم استخدام هذه الطريقة لتحليل translatome (mRNAs التي يتم تجنيدها إلى الريبوسوم للترجمة) في كائنات مختلفة ، بما في ذلك استهداف مجموعة نادرة للغاية من الخلايا العضلية في أجنة ذبابة الفاكهة5 ، ودراسة الخلايا الجذرية المختلفة في نموذج النبات Arabidopsis thaliana6 ، وإجراء تحليل النسخ للخلايا البطانية في الثدييات7.
يتطلب TRAP تعديلا وراثيا لتمييز الريبوسوم لكائن نموذجي. طور إيفان روزن وزملاؤه مؤخرا نموذجا للفأر يسمى وضع العلامات النووية وترجمة الماوس8 لتنقية تقارب الريبوسوم (NuTRAP) ، والذي كان متاحا من خلال مختبر جاكسون منذ عام 2017. من خلال العبور مع خط الماوس Cre ، يمكن للباحثين استخدام نموذج الماوس NuTRAP هذا لعزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم ونوى الخلايا من الخلايا المعبرة عن Cre دون فرز الخلايا. في الخلايا المعبرة عن Cre التي تحمل أيضا أليل NuTRAP ، يسمح الريبوسوم الموسوم EGFP / L10a بعزل ترجمة mRNAs باستخدام مقايسات القائمة المنسدلة للتقارب. في نفس الخلية ، يسمح الغشاء النووي الموسوم بببتيد التعرف على البيوتين (BLRP) ، والذي يكون أيضا إيجابيا ل mCherry ، بالعزل النووي باستخدام التنقية القائمة على التقارب أو التألق. قام فريق البحث نفسه أيضا بإنشاء خط فأر مشابه يتم فيه تسمية الغشاء النووي فقط ب mCherry بدون البيوتين8. يتيح هذان الخطان المعدلان وراثيا للفأر الوصول إلى توصيف الملامح الجينومية والنسخ المقترنة لأنواع معينة من الخلايا محل الاهتمام.
يلعب مسار إشارات القنفذ (Hh) دورا مهما في نمو الأنسجة9. يعمل GLI1 ، وهو عضو في عائلة GLI ، كمنشط نسخ ويتوسط إشارات Hh. يمكن العثور على خلايا Gli1 + في العديد من الأعضاء التي تفرز الهرمونات ، بما في ذلك الغدة الكظرية والخصية. لعزل الحمض النووي والحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية من خلايا Gli1 + باستخدام نموذج الماوس NuTRAP ، تم تهجين الفئران Gli1-CreERT2 مع الفئران NuTRAP. كما تم تهجين فئران Shh-CreERT2 مع فئران NuTRAP بهدف عزل خلايا تعبير القنفذ الصوتي (Shh). يوضح البروتوكول التالي كيفية استخدام Gli1-CreERT2 ؛ فئران NuTRAP لعزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم من خلايا Gli1 + في خصيتي الفئران البالغة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
اتبعت جميع التجارب التي أجريت على الحيوانات البروتوكولات المعتمدة من قبل اللجان المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في جامعة أوبورن.
ملاحظة: يستخدم البروتوكول التالي خصية واحدة (حوالي 100 ملغ) في P28 من Gli1-CreERT2 ؛ فئران NuTRAP (Mus musculus). قد تحتاج أحجام الكواشف إلى التعديل بناء على أنواع العينات وعدد الأنسجة.
1. جمع الأنسجة
- القتل الرحيم للفئران باستخدام غرفة CO2 ، وتطهير سطح البطن مع 70 ٪ من الإيثانول.
- افتح أسفل البطن بالمقص وأزل الخصيتين. استخدم النيتروجين السائل (LN2) لتجميد الخصيتين على الفور.
- قم بتخزين العينات في مرحلة بخار LN2 حتى الاستخدام.
2. إعداد الكواشف والخرز
- تحضير محلول مخزون التجانس: أضف 50 mM Tris (pH 7.4) ، 12 mM MgCl2 ، 100 mM KCl ، 1٪ NP-40 ، و 1 mg / mL heparin. قم بتخزين المحلول في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام (حتى 1 شهر).
- قم بإعداد مخزن عمل التجانس من محلول المخزون (الخطوة 2.1) طازجا قبل الاستخدام: أضف DTT (التركيز النهائي: 1 mM) ، سيكلوهيكسيميد (التركيز النهائي: 100 ميكروغرام / مل) ، الريبونوكلياز المؤتلف (التركيز النهائي: 200 وحدة / مل) ، وكوكتيل مثبطات الأنزيم البروتيني (التركيز النهائي: 1x) إلى محلول مخزون التجانس لجعل الكمية المطلوبة من مخزن عمل التجانس. قم بتخزين المخزن المؤقت الطازج على الثلج حتى الاستخدام.
- تحضير مخازن الغسيل قليلة الملح وعالية الملح:
- لتحضير محلول غسيل قليل الملح ، امزج 50 مللي مول تريس (درجة حموضة 7.4) ، 12 مللي مول MgCl2 ، 100 مللي مول KCl ، و 1٪ NP-40. أضف DTT (التركيز النهائي: 1 مليمول) وسيكلوهكسيميد (التركيز النهائي: 100 ميكروغرام / مل) قبل الاستخدام.
- لتحضير محلول غسيل عالي الملح ، امزج 50 مللي مول تريس (درجة الحموضة 7.4) ، 12 مللي مول MgCl2 ، 300 مللي متر KCl ، 1٪ NP-40. أضف DTT (التركيز النهائي: 2 مللي مول) و Cycloheximide (التركيز النهائي: 100 ميكروغرام / مل) قبل الاستخدام.
- تحضير حبات البروتين G (جدول المواد):
- ستحتاج كل عينة إلى 50 ميكرولتر من حبات البروتين G. ضع الكمية المطلوبة من الخرز في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل وافصل الخرز عن المحلول باستخدام رف مغناطيسي عن طريق ترك الأنبوب على الرف لمدة 30-60 ثانية.
- إزالة الطافت عن طريق سحب العينات. اغسل الخرز ثلاث مرات باستخدام 1 مل من محلول الغسيل المثلج منخفض الملح في كل مرة.
3. تحلل الأنسجة والتجانس
- أضف 2 مل من محلول عمل التجانس المثلج البارد (محضر حديثا من الخطوة 2.2) إلى مجموعة مطحنة الأنسجة الزجاجية. ضع العينة المجمدة بسرعة في المطحنة وقم بتجانس الأنسجة ب 30 ضربة على الجليد باستخدام مدقة فضفاضة.
- انقل التجانس إلى أنبوب دائري القاع سعة 2 مل وأجهزة طرد مركزي عند 12000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 2 مل. حفظ 100 ميكرولتر إلى أنبوب 1.5 مل ك "إدخال".
- احتضان المادة الطافية في أنبوب سعة 2 مل مع الجسم المضاد ل GFP (5 ميكروغرام / مل ؛ 1: 400) عند 4 درجات مئوية على دوار من طرف إلى طرف (24 دورة في الدقيقة) طوال الليل.
4. الترسيب المناعي
- انقل خليط التجانس / الأجسام المضادة إلى أنبوب جديد مستدير القاع سعة 2 مل يحتوي على حبات البروتين G المغسولة من الخطوة 2.4. احتضان عند 4 درجات مئوية على دوار من طرف إلى طرف (24 دورة في الدقيقة) لمدة 2 ساعة.
- افصل الخرزات المغناطيسية عن المادة الطافية باستخدام رف مغناطيسي. احفظ الطافت ك "الكسر السالب". يحتوي الكسر السالب على (1) RNAs في الخلايا السالبة EGFP و (2) RNAs في الخلايا الإيجابية EGFP غير المرتبطة بالريبوسومات.
- أضف 1 مل من محلول الغسيل عالي الملح إلى الخرز وقم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة لغسل الخرز. ضع الأنبوب في رف مغناطيسي.
- قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل. كرر خطوة الغسيل مرتين أخريين. تحتوي الخرزات الآن على مركب حبات الريبوسوم والحمض النووي الريبي من الخلايا الإيجابية EGFP.
5. استخراج الحمض النووي الريبي
ملاحظة: الخطوات التالية مقتبسة من مجموعة عزل الحمض النووي الريبي (جدول المواد). تعامل مع كل جزء (أي المدخلات والإيجابية والسلبية) كعينة مستقلة واعزل الحمض النووي الريبي بشكل مستقل.
- احتضان الخرز من الخطوة 4.4 مع 50 ميكرولتر من محلول الاستخراج (من مجموعة عزل الحمض النووي الريبي) في خلاط حراري (42 درجة مئوية ، 500 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة لتحرير الحمض النووي الريبي من الخرز.
- افصل الخرز برف مغناطيسي ، وانقل المادة الطافية التي تحتوي على مركب الخرز والريبوسوم والحمض النووي الريبي إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
- جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 3000 × جم لمدة 2 دقيقة ، ثم ماصة الطافي إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. يحتوي هذا الأنبوب على "الكسر الموجب" لخطوة TRAP.
ملاحظة: بالنسبة للمدخلات والكسور السالبة ، استخرج الحمض النووي الريبي من 25 ميكرولتر من العينات باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت للاستخراج. احتضان في خلاط حراري (42 درجة مئوية ، 500 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة. - قم بتهيئة عمود تنقية الحمض النووي الريبي مسبقا: ماصة 250 ميكرولتر من التكييف المؤقت على عمود التنقية. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). جهاز طرد مركزي للعمود عند 16000 × جم لمدة 1 دقيقة.
- حجم ماصة متساوي من 70٪ EtOH في الطاف من الخطوة 5.3 (حوالي 50 ميكرولتر من 70٪ EtOH للكسر الموجب و 1 مل من 70٪ EtOH للمدخلات والكسور السالبة). تخلط جيدا عن طريق سحب لأعلى ولأسفل.
- ماصة الخليط في العمود من الخطوة 5.4.
- قم بالطرد المركزي للعمود عند 100 × جم لمدة 2 دقيقة للسماح بربط الحمض النووي الريبي بالغشاء الموجود في العمود ، ثم استمر في الطرد المركزي عند 16000 × جم لمدة 30 ثانية على الفور. تخلص من التدفق من خلال.
ملاحظة: بالنسبة للمدخلات والكسور السالبة ، أضف 250 ميكرولتر من الخليط إلى العمود في كل مرة. كرر الخطوتين 5.6 و 5.7 حتى يتم استخدام جميع المخاليط. - ماصة 100 ميكرولتر من Wash Buffer 1 (W1) في العمود وأجهزة الطرد المركزي بسرعة 8000 × جم لمدة دقيقة واحدة. تخلص من التدفق من خلال.
- ماصة 75 ميكرولتر من محلول DNase تمتزج مباشرة في غشاء عمود التنقية. احتضان في RT لمدة 15 دقيقة.
- ماصة 40 ميكرولتر من W1 في العمود وأجهزة الطرد المركزي عند 8000 × جم لمدة 30 ثانية. تخلص من التدفق من خلال.
- ماصة 100 ميكرولتر من Wash Buffer 2 (W2) في العمود وأجهزة الطرد المركزي عند 8000 × جم لمدة دقيقة واحدة. تخلص من التدفق من خلال.
- ماصة 100 ميكرولتر من W2 في العمود وأجهزة الطرد المركزي عند 16000 × جم لمدة دقيقتين. تخلص من التدفق من خلال. أعد جهاز الطرد المركزي لنفس العمود عند 16000 × جم لمدة 1 دقيقة لإزالة جميع آثار المخزن المؤقت للغسيل قبل خطوة الشطف.
- انقل العمود إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل.
- ماصة 12 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase مباشرة على غشاء عمود التنقية. يجب ألا يلمس طرف الماصة الغشاء. احتضان في RT لمدة 1 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي في 1000 × غرام لمدة 1 دقيقة. ثم استمر في الطرد المركزي عند 16000 × جم لمدة 1 دقيقة لتهدئة الحمض النووي الريبي.
6. تركيز الحمض النووي الريبي وجودته
- استخدم محلل حيوي لتقييم جودة وكمية الحمض النووي الريبيالمستخرج 10.
7. التخزين ومزيد من التحليل
- قم بتخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية (حتى 1 سنة) حتى مزيد من التحليل (على سبيل المثال ، microararray ، PCR الكمي (qPCR) ، و RNA-seq ، إلخ).
ملاحظة: للحصول على تفاصيل تحليل qPCR ، بما في ذلك تخليق cDNA ، راجع Lyu et al.11. يتم سرد الاشعال ل qPCR في جدول المواد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم عبور الماوس Gli1-CreERT2 (رقم مخزون مختبر جاكسون: 007913) لأول مرة باستخدام فأر مراسل NuTRAP (رقم مخزون مختبر جاكسون: 029899) لتوليد فئران مزدوجة التحول. تم حقن الفئران التي تحمل أليلات الجينات المعدلة وراثيا (أي Gli1-CreERT2 و NuTRAP) بعقار تاموكسيفين مرة واحدة يوميا ، كل يومين ، لثلاث حقن. تم جمع عينات الأنسجةفي اليوم 7 بعد اليوم 1من الحقن. أظهر تحليل التألق المناعي أن EGFP تم التعبير عنه في الخلايا الخلالية في الخصيتين (الشكل 1). من المعروف أن كبسولة الغدة الكظرية هي مجموعة خلايا أخرى إيجابية من Gli112,13. تم العثور على EGFP أيضا في خلايا المحفظة الكظرية في Gli1-CreERT2. فئران NuTRAP (الشكل 1). يحمل مختبرنا أيضا Shh-CreERT2. فئران NuTRAP. لاحظ أنه في Shh-CreERT2 ؛ فئران NuTRAP ، يتواجد عدد خلايا EGFP + في القشرة الخارجية للغدة الكظرية أسفل الكبسولة (الشكل 1) ، وهو نفس موقع التعبير لخلايا EGFP + في منطقة Shh + في الغدة الكظرية13 مما يؤكد التعبير عن EGFP في خلايا التعبير عن Cre.
بعد استخراج الحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية ، تم تقييم كمية ونوعية الحمض النووي الريبي المعزول في كل جزء من عمليتي استخراج مستقلتين (خصية واحدة تستخدم في كل استخراج) باستخدام محلل حيوي (الشكل 2). أشارت نتيجة المحلل الحيوي إلى أن هذا البروتوكول قادر على الحصول على الحمض النووي الريبي عالي الجودة من جميع الكسور الثلاثة. كان لجميع الكسور رقم تكامل RNA مماثل (RIN).
لمزيد من الاختبار ما إذا كان الحمض النووي الريبي المستخرج خاصا بنوع الخلية ، تم إرسال الحمض النووي الريبي المستخرج لتحليل المصفوفات الدقيقة باستخدام خدمة ميكروأري تجارية (انظر جدول المواد). أظهرت نتيجة المصفوفات الدقيقة أنه تم إثراء حوالي 4000 جين في الكسر الموجب مقارنة بالكسر السالب ، بينما تم إثراء حوالي 3000 جين في الكسر السالب (الشكل 3). من بين هذه الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي ، تم إثراء الجينات المرتبطة بخلية Leydig Hsd11b1 و Hsd3b614,15 في الكسر الموجب. في الجزء السالب ، تم إثراء الجينات المرتبطة بخلايا سيرتولي Dhh و Gstm616,17. تم تحديد عدد قليل فقط من الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي عند مقارنة الكسر السالب بالمدخلات.
كما تم استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل RT-PCR الكمي في الوقت الفعلي (qPCR) لتأكيد التعبير عن الجينات الرئيسية في الكسر الموجب والكسر السالب. على غرار ما تم العثور عليه في مقايسة microarray ، تم إثراء إنزيمات الستيرويد 3β-Hydroxysteroid dehydrogenase (المشفرة بواسطة Hsd3b) وإنزيم انشقاق السلسلة الجانبية للكوليسترول (المشفر بواسطة Cyp11a1) في الكسر الموجب. في حين أن علامة خلية سيرتولي Sox9 (عامل النسخ SRY-box 9) ، وعلامة الخلية الجرثومية Sycp3 (البروتين المركب المتشابك 3) ، تم إثراؤها في الكسر السالب (الشكل 4). أظهرت هذه البيانات معا أن النسخ في خلايا Gli1 + تم سحبها وإثرائها بنجاح بواسطة البروتوكول أعلاه.
الشكل 1: صور التألق المناعي لتعبير EGFP في نماذج فأر مراسل NuTRAP. Gli1-CreERT2 ؛ NuTRAP و Shh-CreERT2 ؛ تم علاج فئران NuTRAP بعقار تاموكسيفين لتنشيط تعبير EGFP. في الخصية ، كانت خلايا Gli1 + في الخلالي ، بينما في الغدة الكظرية ، كانت خلايا Gli1 + في كبسولة الغدة الكظرية. في الغدة الكظرية ، كانت الخلايا الموجودة أسفل الكبسولة إيجابية ل SHH (خلايا EGFP + في Shh-CreERT2; فئران NuTRAP). SHH هو رابط مسار إشارات SHH الذي يستنبط وظيفته في خلايا المحفظة Gli1 + 13. قضبان المقياس: 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: جودة وكمية الحمض النووي الريبي من استخراج TRAP. تم تقييم الحمض النووي الريبي للجزء الموجب والكسر السالب والمدخلات باستخدام محلل حيوي. يحتوي الجزء الموجب على الحمض النووي الريبي المستخرج من حبات البروتين G بعد الحضانة مع الجسم المضاد GFP (الخطوة 4.1). يحتوي الكسر السالب على الحمض النووي الريبي الذي يبقى في المادة الطافية في الخطوة 4.2. يحتوي الإدخال على الحمض النووي الريبي من التجانس (الخطوة 3.3). في مخطط كهربية القلب ، نظرا لأن تركيزات العلامة السفلية (المعروضة كأول قمة عند 20-25 ثانية من وقت ترحيل العينات الموضحة على المحور السيني) والسلم (غير الموضح في هذه المخططات الكهربائية) معروفة ، يمكن حساب تركيز كل عينة. تمثل القمتان الرئيسيتان عند 40-50 ثانية 18S و 28S rRNA. يتم استخدام نسبة الريبوسوم (بناء على شدة التألق الموضحة على المحور Y) لتحديد سلامة عينة الحمض النووي الريبي. يظهر رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) لكل عينة في الزاوية اليمنى العليا من كل قطعة أرض. تمثل كل نقطة في المخطط النقطي كمية الحمض النووي الريبوزي (RNA) التي تم استخراجها من خصية واحدة. تم استخراج كمية الحمض النووي الريبي لكل عينة في الكسر السالب والمدخلات من 25 ميكرولتر من العينات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تحليل المصفوفات الدقيقة لعينات TRAP. يتم عرض نتائج اثنين من عمليات الاستخراج (خصية واحدة لكل منهما). حدد تحليل microarray عددا مشابها من الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي من اثنين من عمليات الاستخراج المستقلة (Testis A و Testis B). تم إثراء حوالي 4000 جين (نقاط حمراء) في الكسر الموجب ، بينما تم إثراء ~ 3000 جين (نقاط خضراء) في الكسر السالب. تم إثراء Hsd11b1 و Hsd3b6 في كسور موجبة. تم إثراء Dhh و Gstm6 في الكسور السالبة. تم تحديد عدد قليل فقط من الجينات على أنها جينات معبر عنها بشكل تفاضلي بين الكسر السالب والمدخلات ، مما يشير إلى أن الخصية تحتوي فقط على عدد صغير جدا من خلايا Gli1 +. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تحليل qPCR لعينات TRAP. أظهر تحليل qPCR التعبير النسبي للجينات الخاصة بنوع الخلية في الكسر الموجب والكسر السالب. تم تطبيع التعبير عن كل جين لأول مرة مع Actb. ثم تم حساب التعبيرات النسبية للجينات داخل الكسر الموجب بناء على تعبير Sox9 (المحدد ك 10). بالنسبة للكسر السالب ، تم استخدام Cyp11a1 (المعين ك 10) لتطبيع التعبير النسبي. لاحظ أنه لا يمكن مقارنة التعبير النسبي للجينات المستهدفة إلا داخل كل جزء. تم إثراء الجينات التي تشفر الإنزيمات الستيرويدية (Hsd3b و Cyp11a1) في الكسر الموجب. في حين أن الجين الواسم للخلايا الجرثومية (Scyp3) وخلايا سيرتولي (Sox9) ، تم إثراؤه في الجزء السالب. تم عرض ثلاث نسخ بيولوجية (ثلاث عمليات استخراج مستقلة ، خصية واحدة لكل منها). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن أن تخفف فائدة تحليل نسخ الأنسجة الكاملة ، خاصة عند دراسة الأنسجة غير المتجانسة المعقدة. تصبح كيفية الحصول على الحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية حاجة ملحة لإطلاق العنان لتقنية RNA-seq القوية. عادة ما يعتمد عزل الحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية على جمع نوع معين من الخلايا باستخدام المعالجة الدقيقة أو فرز الخلايا المنشط بالفلورسنت (FACS) أو التشريح المجهري لالتقاط الليزر (LCM)18. كما تم تطوير طرق وأدوات حديثة أخرى عالية الإنتاجية لجمع خلية واحدة19. تستخدم هذه الطرق عادة تقنيات الموائع الدقيقة لترميز الخلايا المفردة متبوعة بتسلسل RNA-seq أحادي الخلية. تفكك الخلية هو الخطوة المطلوبة للحصول على محلول الخلية المعلقة ، والذي سيمر بعد ذلك إما عبر فارز الخلايا أو جهاز الموائع الدقيقة لترميز كل خلية بالباركود. تقدم خطوة تفكك الخلية تحديات لهذه الطرق للدراسات الخاصة بنوع الخلية لأن العلاج الأنزيمي لا يكسر الأنسجة فحسب ، بل يؤثر أيضا على صلاحية الخلية وملامح النسخ20. علاوة على ذلك ، عادة ما تكون تكلفة RNA-seq أحادية الخلية مرتفعة وتتطلب معدات متخصصة في الموقع.
في الآونة الأخيرة ، نجحت دراستان في عزل الحمض النووي الريبي / الحمض النووي لأنواع معينة من الخلايا من الأنسجة الكاملة باستخدام فئران NuTRAP 8,21. بدون استخدام معدات وأدوات محددة ، يسمح نموذج الماوس NuTRAP بالحصول على الحمض النووي الريبي والحمض النووي من أنواع معينة من الخلايا. يمكن أن يستهدف أليل NuTRAP الخلايا المعبرة عن Cre دون خطوة تفكك الخلية ، وتجنب تغيير صلاحية الخلية وملفات تعريف النسخ. استخدم Rol et al. نموذج الماوس NuTRAP لعزل النوى وترجمة mRNA في وقت واحد من الأنسجة الدهنية. أظهرت الدراسة الأخرى أيضا أن نموذج فأر NuTRAP يمكن أن يعمل مع الخلايا الدبقية في الجهاز العصبي المركزي8.
في مختبرنا ، نحن مهتمون بدراسة مجموعات الخلايا الجذعية في الأنسجة الستيرويدية مثل الخلايا الخلالية Gli1 + في الخصية22 وخلايا المحفظة Gli1 + في الغدة الكظرية13. التحدي المتمثل في دراسة خلايا Gli1+ في هذين الجهازين هو أن عدد خلايا Gli1+ في الخصية والغدة الكظرية صغير. على سبيل المثال ، نسبة خلايا Leydig ، وهي المجموعة الرئيسية لخلايا Gli1 + في الخصية ، تشغل فقط حوالي 3.8٪ من إجمالي حجم الخصية في الفئران البالغة23. نظرا لأن تقنية TRAP تهدف على وجه التحديد إلى سحب ترجمة الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم في الأنسجة المعقدة ، يمكن أن يكون نموذج الماوس NuTRAP أداة قوية مناسبة لدراسة مجموعة الخلايا النادرة في الأنسجة المعقدة. تستهدف البروتوكولات المنشورة سابقا باستخدام فئران NuTRAP الخلايا الشحمية والخلايا الدبقية الأكثر وفرة في الدماغ والأنسجة الدهنية مقارنة بخلايا Gli1 + في الخصية وفي الغدة الكظرية. لضمان الحصول على الحمض النووي الريبي المطلوب من عدد صغير من الخلايا في نسيج معقد ، قمنا بمراجعة البروتوكولات الحالية عن طريق (1) زيادة وقت الحضانة مع الجسم المضاد GFP من 1 ساعة إلى ليلة وضحاها. (2) استخدام نوع آخر من مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي التي تهدف إلى عزل كمية صغيرة من الحمض النووي الريبي على مستوى بيكوغرام.
لقد أثبتنا أن هذا البروتوكول يمكن أن يحصل على الحمض النووي الريبي عالي الجودة الخاص بنوع الخلية من عدد صغير من الخلايا في نسيج معقد. جودة وكمية الحمض النووي الريبي المستخرج قادرة على qPCR وخدمة microarray التجارية. أكدت نتائج microarray و qPCR أن الجينات المرتبطة بخلايا Leydig يتم تخصيبها في الجزء الإيجابي القادم من خصية واحدة. يوفر البروتوكول هنا نهجا مفصلا لعزل الريبوسوم mRNAs المترجمة الخاصة بنوع الخلية باستخدام نموذج الماوس NuTRAP . يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لعزل الحمض النووي الريبي عن أي خلايا معبرة عن EGFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل جزئيا بواسطة NIH R00HD082686. نشكر زمالة الأبحاث الصيفية لجمعية الغدد الصماء إلى H.S.Z. كما نشكر الدكتور يوان كانغ على تربية مستعمرة الفئران والحفاظ عليها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
References
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).
- Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).
- Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Varjosalo, M., Taipale, J. Hedgehog: functions and mechanisms. Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , Application Note 1 1-8 (2004).
- Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
- King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
- Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
- Benton, L., Shan, L. -X., Hardy, M. P. Differentiation of adult Leydig cells. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).
- Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
- Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
- Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481 (2009).
- Gross, A., et al. Technologies for single-cell isolation. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
- Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).
