Summary
Denne protokol sigter mod at isolere celletypespecifik oversættelse af ribosomale mRNA'er ved hjælp af NuTRAP-musemodellen.
Abstract
Cellulær heterogenitet udgør udfordringer for at forstå funktionen af komplekse væv på et transkriptomniveau. Brug af celletypespecifikke RNA'er undgår potentielle faldgruber forårsaget af vævets heterogenitet og frigør den kraftfulde transkriptomanalyse. Protokollen, der er beskrevet her, viser, hvordan man bruger TRAP-metoden (Translating Ribosome Affinity Purification) til at isolere ribosombundne RNA'er fra en lille mængde EGFP-ekspressive celler i et komplekst væv uden cellesortering. Denne protokol er velegnet til isolering af celletypespecifikke RNA'er ved hjælp af den nyligt tilgængelige NuTRAP-musemodel og kan også bruges til at isolere RNA'er fra alle EGFP-ekspressive celler.
Introduction
High-throughput tilgange, herunder RNA-sekventering (RNA-seq) og microarray, har gjort det muligt at forhøre genekspressionsprofiler på genom-dækkende niveau. For komplekse væv som hjerte, hjerne og testikelser vil de celletypespecifikke data give flere detaljer, der sammenligner brugen af RNA'er fra hele vævet 1,2,3. For at overvinde virkningen af cellulær heterogenitet er metoden Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) blevet udviklet siden begyndelsen af 2010'erne4. TRAP er i stand til at isolere ribosombundne RNA'er fra specifikke celletyper uden vævsdissociation. Denne metode er blevet brugt til translatom (mRNA'er, der rekrutteres til ribosomet til translation) analyse i forskellige organismer, herunder målretning mod en ekstremt sjælden population af muskelceller i Drosophila embryoner5, undersøgelse af forskellige rodceller i modelplanten Arabidopsis thaliana6 og udførelse af transkriptomanalyse af endotelceller hos pattedyr7.
TRAP kræver en genetisk modifikation for at mærke ribosomet af en modelorganisme. Evan Rosen og kolleger udviklede for nylig en musemodel kaldet Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mus8, som har været tilgængelig via Jackson Laboratory siden 2017. Ved at krydse med en Cre-muselinje kan forskere bruge denne NuTRAP-musemodel til at isolere ribosombundne RNA'er og cellekerner fra Cre-ekspressive celler uden cellesortering. I Cre-ekspressive celler, der også bærer NuTRAP-allelen , tillader EGFP / L10a-mærket ribosomet isolering af oversættelse af mRNA'er ved hjælp af affinitetspulldown-assays. Ved samme celle tillader biotin ligasegenkendelsespeptid (BLRP) -mærket nuklear membran, som også er mCherry-positiv, den nukleare isolering ved hjælp af affinitets- eller fluorescensbaseret oprensning. Det samme forskerhold genererede også en lignende muselinje, hvor kernemembranen kun er mærket med mCherry uden biotin8. Disse to genetisk modificerede muselinjer giver adgang til at karakterisere parrede epigenomiske og transkriptomiske profiler af specifikke typer celler i interesse.
Pindsvinets (Hh) signalvej spiller en afgørende rolle i vævsudvikling9. GLI1, et medlem af GLI-familien, fungerer som en transkriptionel aktivator og formidler Hh-signalering. Gli1+ celler findes i mange hormonudskillende organer, herunder binyrerne og testiklerne. For at isolere celletypespecifikke DNA'er og RNA'er fra Gli1+ celler ved hjælp af NuTRAP-musemodellen blev Gli1-CreERT2-mus krydset med NuTRAP-musene. Shh-CreERT2-mus blev også krydset med NuTRAP-musenes mål om at isolere sonisk pindsvin (Shh) ekspressive celler. Følgende protokol viser, hvordan du bruger Gli1-CreERT2; NuTRAP-mus til at isolere ribosombundne RNA'er fra Gli1+ celler i voksne musetestikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle udførte dyreforsøg fulgte protokollerne godkendt af Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) ved Auburn University.
BEMÆRK: Følgende protokol bruger en testikel (ca. 100 mg) ved P28 fra Gli1-CreERT2; NuTRAP mus (Mus musculus). Det kan være nødvendigt at justere mængderne af reagenser på grundlag af typerne af prøver og antallet af væv.
1. Indsamling af væv
- Afliv musene ved hjælp af et CO2 -kammer, desinficer maveoverfladen med 70% ethanol.
- Åbn underlivet med en saks og fjern testiklerne. Brug flydende nitrogen (LN2) til at snap-fryse testiklerne med det samme.
- Opbevar prøver i dampfasen af LN2 indtil brug.
2. Forberedelse af reagenser og perler
- Homogeniseringsstamopløsningen forberedes: Der tilsættes 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40 og 1 mg/ml heparin. Opløsningen opbevares ved 4 °C indtil brug (op til 1 måned).
- Homogeniseringsarbejdsbufferen fra stamopløsningen (trin 2.1) fremstilles frisk før brug: DTT (slutkoncentration: 1 mM), cycloheximid (slutkoncentration: 100 μg/ml), rekombinant ribonuklease (slutkoncentration: 200 enheder/ml) og proteasehæmmercocktail (endelig koncentration: 1x) til homogeniseringsstamopløsningen for at fremstille den krævede mængde af homogeniseringsbufferen. Opbevar den frisklavede arbejdsbuffer på is indtil brug.
- Forbered vaskebuffere med lavt saltindhold og højt saltindhold:
- Til fremstilling af bufferblanding med lavt saltindhold 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl og 1% NP-40. Der tilsættes DTT (slutkoncentration: 1 mM) og cycloheximid (slutkoncentration: 100 μg/ml) før brug.
- Til fremstilling af vaskebufferblanding med højt saltindhold 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. Der tilsættes DTT (slutkoncentration: 2 mM) og cycloheximid (slutkoncentration: 100 μg/ml) før brug.
- Forbered protein G perler (materialetabel):
- Hver prøve skal bruge 50 μL protein G-perler. Anbring den nødvendige mængde perler i et 1,5 ml centrifugerør, og adskil perlerne fra opløsningen ved hjælp af et magnetisk stativ ved at lade røret stå på stativet i 30-60 s.
- Fjern supernatanten ved pipettering. Vask perlerne tre gange med 1 ml iskold vaskebuffer med lavt saltindhold hver gang.
3. Vævslysis og homogenisering
- Der tilsættes 2 ml iskold homogeniseringsarbejdsbuffer (frisklavet fra trin 2.2) til et glasvævsslibersæt. Placer hurtigt den frosne prøve i kværnen og homogeniser vævet med 30 slag på is ved hjælp af en løs pistil.
- Homogenatet overføres til et 2 ml rundbundet rør og centrifugeres ved 12.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Overfør supernatanten til et nyt 2 ml rør. Spar 100 μL til et 1,5 ml rør som "input".
- Supernatanten inkuberes i 2 ml røret med anti-GFP-antistoffet (5 μg/ml; 1:400) ved 4 °C på en end-over-end rotator (24 o/min) natten over.
4. Immunoprecipitation
- Homogenat/antistofblandingen overføres til et nyt 2 ml rundbundet rør indeholdende de vaskede protein G-perler fra trin 2.4. Der inkuberes ved 4 °C på en end-over-end rotator (24 o/min) i 2 timer.
- Adskil magnetperlerne fra supernatanten ved hjælp af et magnetstativ. Gem supernatanten som den "negative fraktion". Den negative fraktion indeholder (1) RNA'er i EGFP-negative celler og (2) RNA'er i EGFP-positive celler, der ikke er bundet til ribosomer.
- Tilsæt 1 ml vaskebuffer med højt saltindhold til perlerne og vælg kortvarigt røret for at vaske perlerne. Placer røret i et magnetstativ.
- Fjern vaskebufferen. Gentag vasketrinnet to gange mere. Perlerne indeholder nu perle-ribosom-RNA-komplekset fra EGFP-positive celler.
5. RNA-ekstraktion
BEMÆRK: Følgende trin er tilpasset fra RNA-isolationssættet (Materialetabel). Behandl hver fraktion (dvs. input, positiv og negativ) som en uafhængig prøve og isoler RNA'er uafhængigt.
- Inkuber perlerne fra trin 4.4 med 50 μL ekstraktionsbuffer (fra RNA-isolationssættet) i en termomixer (42 °C, 500 o / min) i 30 minutter for at frigive RNA'er fra perler.
- Adskil perlerne med et magnetstativ, overfør supernatanten, der indeholder perler-ribosom-RNA-komplekset, til et 1,5 ml rør.
- Centrifuger røret ved 3000 x g i 2 min, og pipetter derefter supernatanten til et nyt 1,5 ml rør. Dette rør indeholder den "positive fraktion" af TRAP-trinnet.
BEMÆRK: For input og de negative fraktioner ekstraheres RNA fra 25 μL prøver ved hjælp af 1 ml ekstraktionsbuffer. Inkuberes i en termomixer (42 °C, 500 o/min.) i 30 min. - Prækonditioner RNA-oprensningskolonnen: Pipette 250 μL konditioneringsbuffer på oprensningskolonnen. Inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur (RT). Centrifuger søjlen ved 16.000 x g i 1 min.
- Pipet lige volumen på 70% EtOH ind i supernatanten fra trin 5.3 (ca. 50 μL 70% EtOH for den positive fraktion og 1 ml 70% EtOH for input og de negative fraktioner). Bland godt ved at pipettere op og ned.
- Blandingen pipetteres ind i søjlen fra trin 5.4.
- Centrifuge søjlen ved 100 x g i 2 minutter for at tillade RNA-binding til membranen i kolonnen, og fortsæt derefter centrifuge ved 16.000 x g i 30 s med det samme. Kassér gennemstrømningen.
BEMÆRK: For input- og de negative fraktioner tilsættes 250 μL af blandingen til kolonnen hver gang. Gentag trin 5.6 og 5.7, indtil alle blandinger er anvendt. - Pipetter 100 μL vaskebuffer 1 (B1) ind i søjlen og centrifuger ved 8.000 x g i 1 min. Kassér gennemstrømningen.
- Pipette 75 μL DNase-opløsning blandes direkte ind i rensesøjlemembranen. Inkuberes ved RT i 15 min.
- Der pipetteres 40 μL W1 i søjlen og centrifugeres ved 8.000 x g i 30 s. Kassér gennemstrømningen.
- Pipetter 100 μL vaskebuffer 2 (W2) ind i søjlen og centrifuger ved 8.000 x g i 1 min. Kassér gennemstrømningen.
- Pipetter 100 μL B2 ind i søjlen og centrifuge ved 16.000 x g i 2 min. Kassér gennemstrømningen. Centrifuger den samme kolonne ved 16.000 x g i 1 minut for at fjerne alle spor af vaskebuffer før elueringstrinnet.
- Overfør søjlen til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Der pipetteres 12 μL RNase-frit vand direkte på rensesøjlens membran. Pipetspidsen må ikke røre membranen. Inkuberes ved RT i 1 min og centrifuge ved 1000 x g i 1 min. Fortsæt derefter centrifugering ved 16.000 x g i 1 minut for at eluere RNA'et.
6. RNA-koncentration og kvalitet
- Brug en bioanalysator til at vurdere kvaliteten og mængden af det ekstraherede RNA10.
7. Opbevaring og yderligere analyse
- Opbevar RNA'et ved -80 °C (op til 1 år) indtil yderligere analyse (f.eks. mikroarray, kvantitativ PCR (qPCR) og RNA-seq osv.).
BEMÆRK: For detaljer om qPCR-analysen, herunder cDNA-syntese, henvises til Lyu et al.11. Primere til qPCR er angivet i materialetabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gli1-CreERT2-mus (Jackson Lab Stock Number: 007913) blev først krydset med NuTRAP-reportermusen (Jackson Lab Stock Number: 029899) for at generere dobbeltmutante mus. Mus, der bærer begge gensplejsede genalleler (dvs. Gli1-CreERT2 og NuTRAP), blev injiceret med tamoxifen en gang dagligt, hver anden dag, til tre injektioner. Vævsprøver blev indsamlet den 7. dag efter injektionens 1. dag. Immunofluorescensanalyse viste, at EGFP blev udtrykt i interstitielle celler i testikler (figur 1). Binyrekapslen har været kendt for at være en anden cellepopulation positiv af Gli112,13. EGFP blev også fundet i binyrebarkceller i Gli1-CreERT2; NuTRAP mus (figur 1). Vores laboratorium bærer også Shh-CreERT2; NuTRAP mus. Bemærk, at i Shh-CreERT2; NuTRAP-mus, EGFP + cellepopulationen befinder sig i den ydre cortex af binyrerne under kapslen (figur 1), det samme ekspressionssted for EGFP + -celler i Shh + -området i binyrerne13, der bekræfter ekspressionen af EGFP i Cre-ekspressive celler.
Efter ekstraktionen af de celletypespecifikke RNA'er blev mængden og kvaliteten af isolerede RNA'er i hver fraktion fra to uafhængige ekstraktioner (en testikel anvendt i hver ekstraktion) vurderet ved hjælp af en bioanalysator (figur 2). Bioanalysatorresultatet viste, at denne protokol er i stand til at opnå RNA'er af høj kvalitet fra alle tre fraktioner. Alle fraktioner havde et lignende RNA-integritetsnummer (RIN).
For yderligere at teste, om det ekstraherede RNA er celletypespecifikt, blev ekstraheret RNA sendt til mikroarrayanalyse ved hjælp af en kommerciel mikroarray-tjeneste (se Materialetabel). Mikroarray-resultatet viste, at ca. 4.000 gener blev beriget i den positive fraktion sammenlignet med den negative fraktion, mens ca. 3.000 gener blev beriget i den negative fraktion (figur 3). Blandt disse differentielt udtrykte gener blev Leydig-celle-associerede gener Hsd11b1 og Hsd3b614,15 beriget i den positive fraktion. I den negative fraktion blev de Sertoli-celle-associerede gener Dhh og Gstm616,17 beriget. Kun få differentielt udtrykte gener blev identificeret, når man sammenlignede den negative fraktion med input.
Real-time kvantitativ RT-PCR (qPCR) blev også brugt til at bekræfte ekspressionen af nøglegener i den positive fraktion og den negative fraktion. I lighed med hvad der blev fundet i mikroarray-assayet, blev steroidogene enzymer 3β-Hydroxysteroid dehydrogenase (kodet af Hsd3b) og kolesterol sidekædespaltningsenzym (kodet af Cyp11a1) beriget i den positive fraktion. Mens Sertoli-cellemarkøren Sox9 (SRY-box Transcription Factor 9) og kimcellemarkøren Sycp3 (Synaptonemal Complex Protein 3) blev beriget i den negative fraktion (figur 4). Sammen viste disse data, at transkriptomerne i Gli1+ celler med succes blev trukket ned og beriget af ovenstående protokol.
Figur 1: Immunofluorescensbilleder af EGFP-ekspressionen i NuTRAP-reportermusemodeller. Gli1-CreERT2; NuTRAP og Shh-CreERT2; NuTRAP-mus blev behandlet med tamoxifen for at aktivere EGFP-ekspressionen. I testiklerne var Gli1+ celler i interstitium, mens der i binyrerne var Gli1+ celler i binyrekapslen. I binyrerne var cellerne under kapslen positive for SHH (EGFP+ celler i Shh-CreERT2; NuTRAP mus). SHH er liganden af SHH-signalvejen, som fremkalder dens funktion i Gli1+ kapsulære celler13. Vægtstænger: 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: RNA-kvalitet og kvantitet fra TRAP-ekstraktionen. RNA'er af den positive fraktion, den negative fraktion og input blev evalueret ved hjælp af en bioanalysator. Den positive fraktion indeholder RNA'er ekstraheret fra protein G-perler efter inkubationen med GFP-antistoffet (trin 4.1). Den negative fraktion indeholder RNA'er, der forbliver i supernatanten ved trin 4.2. Inputtet indeholder RNA'er fra homogenatet (trin 3.3). I elektroferogrammet, fordi koncentrationerne af den nedre markør (vist som den første top ved 20-25 s af migrationstiden for prøver vist på X-aksen) og stigen (ikke vist i disse elektroferogrammer) er kendt, kan koncentrationen af hver prøve beregnes. De to store toppe ved 40-50 s repræsenterer 18S og 28S rRNA. Det ribosomale forhold (baseret på fluorescensintensiteten vist på Y-aksen) anvendes til at bestemme RNA-prøvens integritet. RNA-integritetsnummeret (RIN) for hver prøve vises i øverste højre hjørne af hvert plot. Hver prik i prikplottet repræsenterer mængden af RNA, der blev ekstraheret fra en enkelt testikler. Mængden af RNA af hver prøve i den negative fraktion og input blev ekstraheret fra 25 μL prøver. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Microarray-analyse for TRAP-prøver. Resultater af to ekstraktioner (en testikler hver) vises. Mikroarrayanalysen identificerede et tilsvarende antal differentielt udtrykte gener fra to uafhængige ekstraktioner (Testis A og Testis B). Omkring 4.000 gener blev beriget (røde prikker) i den positive fraktion, mens ~ 3.000 gener blev beriget (grønne prikker) i den negative fraktion. Hsd11b1 og Hsd3b6 blev beriget med positive fraktioner. Dhh og Gstm6 blev beriget med negative fraktioner. Kun få gener blev identificeret som differentielt udtrykte gener mellem den negative fraktion og input, hvilket tyder på, at testiklerne kun indeholder et meget lille antal Gli1+ celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: qPCR-analyse for TRAP-prøver. qPCR-analyse viste den relative ekspression af celletypespecifikke gener i den positive fraktion og den negative fraktion. Ekspressionen af hvert gen blev først normaliseret med Actb. De relative ekspressioner af gener inden for den positive fraktion blev derefter beregnet ud fra ekspressionen af Sox9 (indstillet som 10). For den negative fraktion blev Cyp11a1 (indstillet som 10) brugt til at normalisere det relative udtryk. Bemærk, at den relative ekspression af målgener kun kan sammenlignes inden for hver brøkdel. Gener, der koder for de steroidogene enzymer (Hsd3b og Cyp11a1) blev beriget i den positive fraktion. Mens markørgenet for kimceller (Scyp3) og Sertoli-celler (Sox9) blev beriget i den negative fraktion. Tre biologiske replikater (tre uafhængige ekstraktioner, en testikler hver) blev vist. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nytten af helvævstranskriptomanalysen kan dæmpes, især når man studerer komplekse heterogene væv. Hvordan man får celletypespecifikke RNA'er bliver et presserende behov for at frigøre den kraftfulde RNA-seq-teknik. Isoleringen af celletypespecifikke RNA'er er normalt afhængig af indsamling af en bestemt type celler ved hjælp af mikromanipulation, fluorescerende aktiveret cellesortering (FACS) eller laserfangstmikrodissektion (LCM)18. Andre moderne enkeltcelleopsamlingsmetoder og instrumenter med høj kapacitet er også blevet udviklet19. Disse metoder anvender normalt mikrofluidics-teknikkerne til at stregkode enkeltceller efterfulgt af enkeltcelle-RNA-seq. Celledissociation er det nødvendige trin for at opnå den suspenderede celleopløsning, som derefter vil gå gennem enten en cellesorterer eller en mikrofluidisk enhed for at stregkode hver celle. Celledissociationstrinnet introducerer udfordringer til disse metoder til celletypespecifikke undersøgelser, fordi den enzymatiske behandling ikke kun nedbryder væv, men også påvirker cellelevedygtighed og transkriptionelle profiler20. Desuden er udgiften til enkeltcellet RNA-seq normalt høj og kræver specialudstyr på stedet.
For nylig isolerede to undersøgelser med succes RNA / DNA af specifikke celletyper fra hele væv ved hjælp af NuTRAP-musene 8,21. Uden at bruge specifikt udstyr og værktøjer gør NuTRAP-musemodellen det muligt at opnå RNA'er og DNA'er fra bestemte typer celler. NuTRAP-allelen kunne målrette Cre-ekspressive celler uden celledissociationstrinnet og undgå at ændre cellens levedygtighed og transkriptionelle profiler. Rol et al. brugte NuTRAP-musemodellen til at isolere kerner og oversætte mRNA samtidigt fra fedtvæv. Den anden undersøgelse viste også, at NuTRAP-musemodellen kunne fungere for gliaceller i centralnervesystemet8.
I vores laboratorium er vi interesserede i at studere stamcellepopulationerne i steroidogene væv såsom Gli1+ interstitielle celler i testikelkræft22 og Gli1+ kapsulære celler i binyrerne13. Udfordringen ved at studere Gli1+ celler i disse to organer er, at antallet af Gli1+ celler i testiklerne og binyrerne er lille. For eksempel optager andelen af Leydig-celler, som er den største population af Gli1+ celler i testiklerne, kun ca. 3,8% af det samlede testisvolumen hos voksne mus23. Fordi TRAP-teknikken sigter mod specifikt at nedbryde oversættende ribosombundne RNA'er i komplekst væv, kan NuTRAP-musemodellen være et kraftfuldt værktøj, der er egnet til at studere en sjælden cellepopulation i et komplekst væv. De tidligere offentliggjorte protokoller ved hjælp af NuTRAP-mus er målrettet mod adipocytter og gliaceller, der er mere rigelige i hjernen og fedtvævet sammenlignet med Gli1+ celler i testiklerne og i binyrerne. For at sikre opnåelse af nødvendige RNA'er fra et lille antal celler i et komplekst væv reviderede vi de eksisterende protokoller ved (1) at øge inkubationstiden med GFP-antistoffet fra 1 time til natten over; (2) ved hjælp af en anden type RNA-ekstraktionssæt, der sigter mod at isolere en lille mængde RNA på picogramniveau.
Vi demonstrerede, at denne protokol kunne opnå celletypespecifikke RNA'er af høj kvalitet fra et lille antal celler i et komplekst væv. Kvaliteten og mængden af ekstraherede RNA'er er i stand til qPCR og en kommerciel mikroarray-service. Resultater fra microarray og qPCR bekræftede, at Leydig-celler-associerede gener er beriget i den positive fraktion, der kommer fra en testikler. Protokollen her giver en detaljeret tilgang til at isolere celletypespecifik oversættelse af ribosommRNA'er ved hjælp af NuTRAP-musemodellen . Denne protokol kan også bruges til at isolere RNA'er fra alle EGFP-ekspressive celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af NIH R00HD082686. Vi takker Endocrine Society Summer Research Fellowship til HSZ. Vi takker også Dr. Yuan Kang for opdræt og vedligeholdelse af musekolonien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
References
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).
- Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).
- Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Varjosalo, M., Taipale, J. Hedgehog: functions and mechanisms. Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , Application Note 1 1-8 (2004).
- Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
- King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
- Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
- Benton, L., Shan, L. -X., Hardy, M. P. Differentiation of adult Leydig cells. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).
- Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
- Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
- Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481 (2009).
- Gross, A., et al. Technologies for single-cell isolation. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
- Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).
