Summary
このプロトコルは、NuTRAPマウスモデルを使用して細胞型特異的翻訳リボソームmRNAを単離することを目的としています。
Abstract
細胞の不均一性は、トランスクリプトームレベルで複雑な組織の機能を理解する上で課題をもたらします。細胞種特異的RNAを使用することで、組織の不均一性によって引き起こされる潜在的な落とし穴を回避し、強力なトランスクリプトーム解析を解き放ちます。ここで説明するプロトコルは、翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)法を使用して、細胞を選別することなく、複雑な組織内の少量のEGFP発現細胞からリボソーム結合RNAを単離する方法を示しています。このプロトコルは、最近入手可能な NuTRAP マウスモデルを使用して細胞タイプ特異的RNAを単離するのに適しており、EGFP発現細胞からRNAを単離するためにも使用できます。
Introduction
RNAシーケンシング(RNA-seq)やマイクロアレイなどのハイスループットアプローチにより、ゲノムワイドレベルで遺伝子発現プロファイルを調べることが可能になりました。心臓、脳、精巣などの複雑な組織の場合、細胞タイプ固有のデータは、組織全体からのRNAの使用を比較する詳細を提供します1、2、3。細胞の不均一性の影響を克服するために、翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)法が2010年代初頭から開発されてきました4。TRAPは、組織を解離することなく、特定の細胞タイプからリボソーム結合RNAを単離することができます。この方法は、ショウジョウバエ胚5の非常にまれな筋細胞集団の標的化、モデル植物シロイヌナズナ6のさまざまな根細胞の研究、哺乳類7の内皮細胞のトランスクリプトーム解析など、さまざまな生物のトランスラトーム(翻訳のためにリボソームにリクルートされるmRNA)分析に使用されています。
TRAPは、モデル生物のリボソームにタグを付けるための遺伝子改変を必要とする。今回、Evan Rosenたちの研究グループは最近、核タグ付けと翻訳リボソーム親和性精製(NuTRAP)マウス8と呼ばれるマウスモデルを開発したが、これは2017年からジャクソン研究所で入手できる。Creマウス株と交配することにより、研究者はこの NuTRAP マウスモデルを使用して、細胞を選別することなく、Cre発現細胞からリボソーム結合RNAおよび細胞核を単離することができます。 NuTRAP 対立遺伝子も持つCre発現細胞では、EGFP/L10aタグ付きリボソームにより、アフィニティープルダウンアッセイを使用して翻訳mRNAを単離できます。同じ細胞では、ビオチンリガーゼ認識ペプチド(BLRP)タグ付き核膜(これもmCherry陽性)であり、アフィニティーまたは蛍光ベースの精製を使用して核分離を可能にします。同じ研究チームはまた、核膜がビオチン8なしでmCherryのみで標識される同様のマウス系統を生成しました。これらの2つの遺伝子改変マウス株は、関心のある特定のタイプの細胞のペアのエピゲノムおよびトランスクリプトミクスプロファイルを特徴付けるためのアクセスを提供します。
ハリネズミ(Hh)シグナル伝達経路は、組織発生において重要な役割を果たします9。GLIファミリーのメンバーであるGLI1は、転写活性化因子として作用し、Hhシグナル伝達を媒介します。Gli1+細胞は、副腎や精巣を含む多くのホルモン分泌器官に見られます。NuTRAPマウスモデルを用いてGli1+細胞から細胞型特異的DNAおよびRNAを単離するために、Gli1-CreERT2マウスをNuTRAPマウスと交配した。Shh−CreERT2マウスはまた、音波ハリネズミ(Shh)発現細胞を単離することを目的としたNuTRAPマウスと交配した。次のプロトコルは、Gli1-CreERT2を使用する方法を示しています。NuTRAPマウスは、成体マウス精巣中のGli1+細胞からリボソーム結合RNAを単離します。
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Protocol
実施されたすべての動物実験は、オーバーン大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルに従いました。
注:次のプロトコルは、 Gli1-CreERT2のP28で1つの精巣(約100 mg)を使用します。NuTRAP マウス(ムスムスクルス)。試薬の量は、サンプルの種類と組織の数に基づいて調整する必要がある場合があります。
1.組織収集
- CO2チャンバーを用いてマウスを安楽死させ、腹部表面を70%エタノールで消毒する。
- ハサミで下腹部を開き、精巣を取り除きます。液体窒素(LN2)を使用して、精巣をすぐに急速凍結します。
- サンプルは、使用するまでLN2 の気相に保管してください。
2.試薬とビーズの準備
- ホモジナイズストック溶液を調製する:50 mM トリス(pH 7.4)、12 mM MgCl2、100 mM KCl、1% NP-40、および1 mg/mLヘパリンを加えます。使用まで溶液を4°Cで保存してください(最大1ヶ月)。
- 使用前に新たにストック溶液からホモジナイズ作業バッファーを調製します(ステップ2.1):DTT(最終濃度:1 mM)、シクロヘキシミド(最終濃度:100 μg/mL)、組換えリボヌクレアーゼ(最終濃度:200ユニット/mL)、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(最終濃度:1x)をホモジナイズストック溶液に加えて、必要量のホモジナイズ作業バッファーを作ります。作りたての作業バッファーは、使用するまで氷上に保管してください。
- 低塩および高塩洗浄バッファーを準備します。
- 50 mM トリス(pH 7.4)、12 mM MgCl2、100 mM KCl、および1% NP-40の低塩洗浄バッファーミックスを調製した。使用前にDTT(最終濃度:1 mM)とシクロヘキシミド(最終濃度:100 μg/mL)を加えてください。
- 高塩洗浄バッファーミックス50mMトリス(pH 7.4)、12mMMgCl2、300mM KCl、1%NP-40を調製した。使用前にDTT(最終濃度:2 mM)とシクロヘキシミド(最終濃度:100 μg/mL)を加えてください。
- プロテインGビーズを準備する(材料の表):
- 各サンプルには50 μLのプロテインGビーズが必要です。必要量のビーズを1.5 mLの遠沈管に入れ、磁気ラックを使用してチューブをラックに30〜60秒間置いて、ビーズを溶液から分離します。
- ピペッティングにより上清を除去する。毎回1 mLの氷冷減塩洗浄バッファーでビーズを3回洗浄します。
3.組織の溶解と均質化
- 2 mLの氷冷ホモジナイズ作業バッファー(ステップ2.2で新たに調製)をガラスティッシュグラインダーセットに加えます。凍結したサンプルをグラインダーにすばやく入れ、緩い乳棒を使用して氷上で30ストロークで組織を均質化します。
- ホモジネートを2 mLの丸底チューブに移し、12,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
- 上清を新しい2 mLチューブに移します。100 μLを「入力」として1.5 mLチューブに保存します。
- 2 mLチューブ内の上清を抗GFP抗体(5 μg/mL; 1:400)とともに、エンドオーバーエンドローテーター(24 rpm)上で4°Cで一晩インキュベートします。
4. 免疫沈降
- ホモジネート/抗体混合物を、ステップ2.4で洗浄したプロテインGビーズを含む新しい2 mLの丸底チューブに移します。エンドオーバーエンドローテーター(24 rpm)で4°Cで2時間インキュベートします。
- マグネットラックを使用して磁気ビーズを上澄みから分離します。上清を「陰性画分」として保存します。陰性画分は、(1)EGFP陰性細胞におけるRNAおよび(2)リボソームに結合していないEGFP陽性細胞におけるRNAを含有する。
- 1 mLの高塩分洗浄バッファーをビーズに加え、チューブを短時間ボルテックスしてビーズを洗浄します。チューブをマグネットラックに入れます。
- 洗浄バッファーを取り外します。洗浄手順をさらに2回繰り返します。ビーズには、EGFP陽性細胞由来のビーズ-リボソーム-RNA複合体が含まれるようになりました。
5. RNA抽出
注:次の手順は、RNA分離キット(材料表)から採用されています。各フラクション(インプット、ポジティブ、ネガティブ)を独立したサンプルとして扱い、RNAを個別に分離します。
- ステップ 4.4 のビーズを 50 μL の抽出バッファー (RNA 分離キットから) とともにサーモミキサー (42 °C、500 rpm) で 30 分間インキュベートし、ビーズから RNA を放出します。
- マグネットラックでビーズを分離し、ビーズ-リボソーム-RNA複合体を含む上清を1.5 mLチューブに移します。
- チューブを3000 x g で2分間遠心分離し、上清を新しい1.5 mLチューブにピペットで移します。このチューブには、TRAPステップの「正の割合」が含まれています。
注:インプットフラクションとネガティブフラクションについては、1 mLの抽出バッファーを使用して25 μLのサンプルからRNAを抽出します。サーモミキサー(42°C、500 rpm)で30分間インキュベートします。 - RNA精製カラムの事前コンディショニング:250 μLのコンディショニングバッファーを精製カラムにピペットで移します。室温(RT)で5分間インキュベートします。カラムを16,000 x g で1分間遠心分離します。
- ステップ5.3から上清に等量の70%EtOHをピペットする(陽性画分については約50μLの70%EtOH、投入画分および陰性画分については70%EtOHの1mL)。上下にピペッティングしてよく混ぜます。
- ステップ5.4の混合物をカラムにピペットで入れます。
- カラムを100 x gで2分間遠心分離して、カラム内のメンブレンにRNAが結合できるようにしてから、すぐに16,000 x gで30秒間遠心分離を続けます。フロースルーを破棄します。
注:インプットフラクションとネガティブフラクションについては、毎回250μLの混合物をカラムに追加します。すべての混合物が使用されるまで、手順5.6と5.7を繰り返します。 - 洗浄バッファー1(W1)100 μLをカラムにピペットで入れ、8,000 x g で1分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
- ピペット75 μLのDNase溶液を精製カラムメンブレンに直接混合します。RTで15分間インキュベートします。
- 40 μLのW1をカラムにピペットで入れ、8,000 x g で30秒間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
- 洗浄バッファー2(W2)100 μLをカラムにピペットで入れ、8,000 x g で1分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
- 100 μLのW2をカラムにピペットで入れ、16,000 x g で2分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。同じカラムを16,000 x g で1分間再遠心分離し、溶出ステップの前に洗浄バッファーの痕跡をすべて除去します。
- カラムを新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。
- 12 μLのRNaseフリー水を精製カラムのメンブレンに直接ピペットで貼り付けます。ピペットの先端が膜に触れないようにしてください。RTで1分間インキュベートし、1000 x g で1分間遠心分離します。その後、16,000 x g で1分間遠心分離を続け、RNAを溶出します。
6. RNAの濃度と品質
- バイオアナライザーを使用して、抽出されたRNA10の質と量を評価します。
7.保管とさらなる分析
- さらなる分析(マイクロアレイ、定量的PCR(qPCR)、RNA-seqなど)まで、RNAを-80°C(最大1年間)で保存します。
注:cDNA合成を含むqPCR分析の詳細については、Lyuら11を参照してください。qPCR用のプライマーは材料 表に記載されています。
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Representative Results
Gli1-CreERT2マウス(ジャクソンラボストック番号:007913)を最初にNuTRAPレポーターマウス(ジャクソンラボストック番号:029899)と交配して、二重変異マウスを生成しました。遺伝子操作された両方の遺伝子対立遺伝子(すなわち、Gli1-CreERT2およびNuTRAP)を有するマウスに、タモキシフェンを1日1回、1日おきに3回注射した。組織サンプルは、注射の1日目の後の7日目に収集された。免疫蛍光分析により、EGFPが精巣の間質細胞で発現していることが示されました(図1)。この副腎被膜は、Gli112,13の別の細胞集団陽性であることが知られている。EGFPは、Gli1-CreERT2の副腎莢膜細胞にも見られました。NuTRAPマウス(図1)。私たちのラボでは、Shh-CreERT2も取り扱っています。ニュートラップマウス。Shh-CreERT2 では;NuTRAPマウスは、副腎の外側皮質下被膜にEGFP+細胞集団が存在し(図1)、副腎13のShh+領域におけるEGFP+細胞の同一発現部位のCre発現細胞におけるEGFPの発現を確認した。
細胞型特異的RNAの抽出後、2つの独立した抽出(各抽出に1つの精巣を使用)から各画分中の単離されたRNAの量と質をバイオアナライザーを使用して評価しました(図2)。バイオアナライザーの結果は、このプロトコルが3つの画分すべてから高品質のRNAを取得できることを示しました。すべての画分は、同様のRNA完全性番号(RIN)を有していた。
抽出されたRNAが細胞型特異的であるかどうかをさらに試験するために、抽出されたRNAを市販のマイクロアレイサービスを用いたマイクロアレイ解析のために送った(材料表参照)。マイクロアレイの結果、陰性画分と比較して陽性画分で約4,000個の遺伝子が濃縮されたのに対し、陰性画分では約3,000個の遺伝子が濃縮されたことが示されました(図3)。これらの発現差のある遺伝子のうち、ライディッヒ細胞関連遺伝子Hsd11b1およびHsd3b614,15は陽性画分に富んでいた。陰性画分では、セルトリ細胞関連遺伝子DhhおよびGstm616,17が富化されていた。陰性分画と入力を比較すると、発現差のある遺伝子はごくわずかしか同定されなかった。
リアルタイム定量RT-PCR(qPCR)を使用して、陽性画分と陰性画分における主要遺伝子の発現を確認しました。マイクロアレイアッセイで発見されたものと同様に、ステロイド生成酵素3β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ( Hsd3bによってコードされる)およびコレステロール側鎖切断酵素( Cyp11a1によってコードされる)が陽性画分において濃縮された。一方、セルトリ細胞 マーカーSox9 (SRY-box転写因子9)、および生殖細胞 マーカーSycp3 (シナプトン複合体タンパク質3)は陰性画分に富んでいた(図4)。これらのデータを総合すると、 Gli1+ 細胞のトランスクリプトームが上記のプロトコルによって正常にプルダウンされ、濃縮されることが実証されました。
図1:NuTRAPレポーターマウスモデルにおけるEGFP発現の免疫蛍光画像。 Gli1-CreERT2;NuTRAP と Shh-CreERT2;NuTRAPマウスをタモキシフェンで処理してEGFP発現を活性化した。精巣ではGli1+細胞が間質にあり、副腎ではGli1+細胞が副腎被膜に存在していた。副腎では、カプセルの下の細胞はSHH陽性でした(Shh-CreERT2のEGFP+細胞;ニュートラップマウス)。SHHは、Gli1+莢膜細胞13においてその機能を惹起するSHHシグナル伝達経路のリガンドである。スケールバー:50μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:TRAP抽出からのRNAの質と量。 陽性画分、陰性画分、および入力物のRNAは、バイオアナライザーを用いて評価した。陽性画分は、GFP抗体とのインキュベーション後にプロテインGビーズから抽出されたRNAを含有する(ステップ4.1)。陰性画分には、ステップ4.2で上清に残るRNAが含まれています。入力にはホモジネートからのRNAが含まれています(ステップ3.3)。エレクトロフェログラムでは、下方マーカー(X軸に示されたサンプルの移動時間の20〜25秒で最初のピークとして表示される)とラダー(これらのエレクトロフェログラムには示されていません)の濃度が既知であるため、各サンプルの濃度を算出することができる。40-50秒の2つの主要なピークは、18Sおよび28S rRNAを表す。リボソーム比(Y軸に示されている蛍光強度に基づく)は、RNAサンプルの完全性を決定するために使用されます。各サンプルのRNAインテグリティナンバー(RIN)は、各プロットの右上隅に表示されます。ドットプロットの各ドットは、1つの精巣から抽出されたRNAの量を表します。陰性画分および投入物中の各サンプルのRNAの量は、25μLのサンプルから抽出した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:TRAPサンプルのマイクロアレイ解析。2回の抽出結果(各1つの精巣)を示します。マイクロアレイ解析により、2つの独立した抽出(精巣Aおよび精巣B)から同数の発現差のある遺伝子が同定された。陽性画分では約4,000個の遺伝子が濃縮され(赤い点)、陰性画分では~3,000個の遺伝子が濃縮された(緑の点)。Hsd11b1およびHsd3b6は陽性画分に富んだ。DhhおよびGstm6は負の割合で濃縮された。陰性画分と入力の間で発現差のある遺伝子として同定された遺伝子はごくわずかであり、精巣には非常に少数のGli1+細胞しか含まれていないことが示唆されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:TRAPサンプルのqPCR分析。 qPCR分析は、陽性画分および陰性画分における細胞型特異的遺伝子の相対的発現を示した。各遺伝子の発現を 最初にActb で標準化した。次に、陽性画分内の遺伝子の相対発現を、 Sox9 (10として設定)の発現に基づいて計算した。負の分数については、 Cyp11a1 (10として設定)を使用して相対式を正規化しました。標的遺伝子の相対発現は、各画分内でのみ比較できることに注意してください。ステロイド産生酵素(Hsd3b および Cyp11a1)をコードする遺伝子は、陽性画分において富化されていた。一方、生殖細胞(Scyp3)およびセルトリ細胞(Sox9)のマーカー遺伝子は、陰性画分に富んでいた。3つの生物学的複製(3つの独立した抽出、それぞれ1つの精巣)が示されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
全組織トランスクリプトーム解析の有用性は、特に複雑な不均一組織を研究する場合、損なわれる可能性があります。細胞種特異的RNAをいかに入手するかは、強力なRNA-seq技術を解き放つための緊急の必要性となっています。細胞種特異的RNAの単離は、通常、マイクロマニピュレーション、蛍光活性化セルソーティング(FACS)、またはレーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)を用いた特定の種類の細胞の収集に依存しています18。他の最新のハイスループット単一細胞収集方法および機器も開発されている19。これらの方法は通常、マイクロフルイディクス技術を使用して、単一細胞に続いて単一細胞RNA-seqをバーコード化します。細胞解離は、懸濁した細胞溶液を得るために必要なステップであり、その後、細胞選別機またはマイクロ流体デバイスのいずれかを通過して各細胞にバーコードを付けます。細胞解離ステップは、酵素処理が組織を破壊するだけでなく、細胞の生存率と転写プロファイルにも影響を与えるため、細胞タイプ特異的研究のためのこれらの方法に課題をもたらします20。さらに、シングルセルRNA-seqの費用は通常高額であり、現場で特殊な機器が必要です。
最近、2つの研究により、NuTRAPマウスを使用して組織全体から特定の細胞タイプのRNA/DNAを単離することに成功しました8,21。NuTRAPマウスモデルは、特定の機器やツールを使用せずに、特定の種類の細胞からRNAやDNAを取得することができます。NuTRAP対立遺伝子は、細胞解離ステップなしでCre発現細胞を標的とすることができ、細胞の生存率と転写プロファイルの変化を回避します。Rolらは、NuTRAPマウスモデルを使用して、核を単離し、脂肪組織からmRNAを同時に翻訳しました。他の研究では、NuTRAPマウスモデルが中枢神経系のグリア細胞に作用することも実証されました8。
私たちの研究室では、精巣22のGli1+間質細胞や副腎のGli1+莢膜細胞などのステロイド産生組織の幹細胞集団の研究に興味を持っています1 3。これら2つの臓器のGli1+細胞を研究することの課題は、精巣と副腎のGli1+細胞の数が少ないことです。たとえば、精巣中のGli1+細胞の主要な集団であるライディッヒ細胞の割合は、成体マウスの総精巣体積の約3.8%しか占めていません23。TRAP法は、複雑な組織におけるリボソーム結合RNAの翻訳を特異的にプルダウンすることを目的としているため、NuTRAPマウスモデルは、複雑な組織における希少細胞集団の研究に適した強力なツールとなる可能性があります。NuTRAPマウスを使用して以前に発表されたプロトコルは、精巣および副腎のGli1+細胞と比較して、脳および脂肪組織に豊富に存在する脂肪細胞およびグリア細胞を標的としています。複雑な組織内の少数の細胞から必要なRNAを確実に取得するために、(1)GFP抗体とのインキュベーション時間を1時間から一晩に増やすことにより、既存のプロトコルを改訂しました。(2)少量のRNAをピコグラムレベルで単離することを目的とした別の種類のRNA抽出キットを使用する。
このプロトコルにより、複雑な組織内の少数の細胞から高品質の細胞種特異的RNAを取得できることを実証しました。抽出されたRNAの質と量は、qPCRおよび商用マイクロアレイサービスに対応しています。マイクロアレイとqPCRの結果、ライディッヒ細胞関連遺伝子は、1つの精巣に由来する陽性画分に富んでいることが確認されました。ここでのプロトコルは、 NuTRAP マウスモデルを使用して細胞タイプ特異的翻訳リボソームmRNAを単離するための詳細なアプローチを提供します。このプロトコルは、任意のEGFP発現細胞からRNAを単離するためにも使用できます。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この作業は、NIH R00HD082686によって部分的にサポートされていました。内分泌学会サマーリサーチフェローシップのH.S.Zに感謝します。また、マウスのコロニーの繁殖と維持について、Yuan Kang博士にも感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
References
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).
- Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).
- Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Varjosalo, M., Taipale, J. Hedgehog: functions and mechanisms. Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , Application Note 1 1-8 (2004).
- Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
- King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
- Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
- Benton, L., Shan, L. -X., Hardy, M. P. Differentiation of adult Leydig cells. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).
- Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
- Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
- Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481 (2009).
- Gross, A., et al. Technologies for single-cell isolation. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
- Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).
