Summary
Denne protokollen tar sikte på å isolere celletypespesifikke oversette ribosomale mRNA ved hjelp av NuTRAP-musemodellen.
Abstract
Cellulær heterogenitet gir utfordringer for å forstå funksjonen til komplekse vev på transkriptomnivå. Ved å bruke celletypespesifikke RNA unngår potensielle fallgruver forårsaket av heterogeniteten til vev og frigjør den kraftige transkriptomanalysen. Protokollen beskrevet her demonstrerer hvordan du bruker TRAP-metoden (Translating Ribosome Affinity Purification) for å isolere ribosombundne RNA fra en liten mengde EGFP-uttrykkende celler i et komplekst vev uten cellesortering. Denne protokollen er egnet for å isolere celletypespesifikke RNAer ved hjelp av den nylig tilgjengelige NuTRAP-musemodellen , og kan også brukes til å isolere RNA fra alle EGFP-uttrykkende celler.
Introduction
High-throughput-tilnærminger, inkludert RNA-sekvensering (RNA-seq) og mikroarray, har gjort det mulig å forhøre genuttrykksprofiler på genomnivå. For komplekse vev som hjerte, hjerne og testis, vil de celletypespesifikke dataene gi flere detaljer som sammenligner bruken av RNA fra hele vevet 1,2,3. For å overvinne virkningen av cellulær heterogenitet, har TRAP-metoden (Translating Ribosome Affinity Purification) blitt utviklet siden tidlig på 2010-tallet4. TRAP er i stand til å isolere ribosombundne RNA fra spesifikke celletyper uten vevsdissosiasjon. Denne metoden har blitt brukt til translatomanalyse (mRNA som rekrutteres til ribosomet for oversettelse) i forskjellige organismer, inkludert målretting mot en ekstremt sjelden populasjon av muskelceller i Drosophila-embryoer5, studere forskjellige rotceller i modellplanten Arabidopsis thaliana6, og utføre transkriptomanalyse av endotelceller hos pattedyr7.
TRAP krever en genetisk modifisering for å merke ribosomet til en modellorganisme. Evan Rosen og kolleger utviklet nylig en musemodell kalt Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mus8, som har vært tilgjengelig gjennom Jackson Laboratory siden 2017. Ved å krysse med en Cre-muselinje, kan forskere bruke denne NuTRAP-musemodellen til å isolere ribosombundne RNAer og cellekjerner fra Cre-uttrykkende celler uten cellesortering. I Cre-uttrykkende celler som også bærer NuTRAP-allelet , tillater EGFP / L10a-merket ribosom isolering av oversettelse av mRNA ved hjelp av affinitetsnedtrekksanalyser. I samme celle tillater biotinligasegjenkjenningspeptidet (BLRP) -merket nukleær membran, som også er mCherry-positiv, den kjernefysiske isolasjonen ved å bruke affinitets- eller fluorescensbasert rensing. Det samme forskerteamet genererte også en lignende muselinje der kjernemembranen bare er merket med mCherry uten biotin8. Disse to genmodifiserte muselinjene gir tilgang til å karakterisere parrede epigenomiske og transkriptomiske profiler av spesifikke typer celler i interesse.
Pinnsvinet (Hh) signalveien spiller en kritisk rolle i vevsutvikling9. GLI1, et medlem av GLI-familien, fungerer som en transkripsjonsaktivator og formidler Hh-signalering. Gli1+-celler finnes i mange hormonutskillende organer, inkludert binyrene og testisene. For å isolere celletypespesifikke DNAer og RNA fra Gli1+-celler ved hjelp av NuTRAP-musemodellen, ble Gli1-CreERT2-mus krysset med NuTRAP-musene. Shh-CreERT2-mus ble også krysset med NuTRAP-musene som mål å isolere sonisk pinnsvin (Shh) som uttrykker celler. Følgende protokoll viser hvordan du bruker Gli1-CreERT2; NuTRAP-mus for å isolere ribosombundne RNA fra Gli1+-celler i voksne musetester.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle utførte dyreforsøk fulgte protokollene godkjent av Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) ved Auburn University.
MERK: Følgende protokoll bruker en testis (ca. 100 mg) ved P28 fra Gli1-CreERT2; NuTRAP mus (Mus musculus). Volumer av reagenser må kanskje justeres basert på typer prøver og antall vev.
1. Vevssamling
- Avliv musene ved hjelp av et CO2-kammer , desinfiser mageoverflaten med 70% etanol.
- Åpne underlivet med saks og fjern testiklene. Bruk flytende nitrogen (LN2) til å fryse testiklene umiddelbart.
- Oppbevar prøver i dampfasen av LN2 til bruk.
2. Forberedelse av reagenser og perler
- Forbered homogeniseringsløsningen: Tilsett 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40 og 1 mg / ml heparin. Oppbevar oppløsningen ved 4 °C til bruk (opptil 1 måned).
- Forbered homogeniseringsarbeidsbufferen fra stamløsningen (trinn 2.1) nylig før bruk: Tilsett DTT (sluttkonsentrasjon: 1 mM), cykloheksimid (sluttkonsentrasjon: 100 μg / ml), rekombinant ribonuklease (endelig konsentrasjon: 200 enheter / ml) og proteaseinhibitorcocktail (endelig konsentrasjon: 1x) til homogeniseringsmasseløsningen for å gjøre den nødvendige mengden av homogeniseringsarbeidsbufferen. Oppbevar den tilberedte arbeidsbufferen på is til bruk.
- Forbered lavsalt- og høysaltvaskebufferne:
- For å tilberede lavsaltvaskebufferblanding 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl og 1% NP-40. Tilsett DTT (sluttkonsentrasjon: 1 mM) og cyklohekssimid (sluttkonsentrasjon: 100 μg/ml) før bruk.
- For å forberede høysalt vaskebufferblanding 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. Tilsett DTT (sluttkonsentrasjon: 2 mM) og cykloheksimid (sluttkonsentrasjon: 100 μg/ml) før bruk.
- Forbered protein G-perler (Materialtabell):
- Hver prøve trenger 50 μL protein G-perler. Plasser den nødvendige mengden perler i et 1,5 ml sentrifugerør og skill perlene fra løsningen ved hjelp av et magnetisk stativ ved å la røret ligge på stativet i 30-60 s.
- Fjern supernatanten ved pipettering. Vask perlene tre ganger med 1 ml iskald lavsaltvaskebuffer hver gang.
3. Vevlysis og homogenisering
- Tilsett 2 ml iskald homogeniseringsarbeidsbuffer (tilberedt fra trinn 2.2) til et glassvevkvernsett. Legg den frosne prøven raskt i kvernen og homogeniser vevet med 30 slag på is ved hjelp av en løs pestle.
- Overfør homogenatet til et 2 ml rundbunnsrør og sentrifuger ved 12 000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Overfør supernatanten til et nytt 2 ml rør. Spar 100 μL til et 1,5 ml rør som "inngang".
- Inkuber supernatanten i 2 ml røret med anti-GFP antistoffet (5 μg / ml; 1:400) ved 4 ° C på en end-over-end rotator (24 rpm) over natten.
4. Immunprecipitation
- Overfør homogenat-/antistoffblandingen til et nytt 2 ml rundbunnsrør som inneholder det vaskede protein G-perlene fra trinn 2.4. Inkuber ved 4 °C på en ende-over-ende-rotator (24 o / min) i 2 timer.
- Skill de magnetiske perlene fra supernatanten ved hjelp av et magnetstativ. Lagre supernatanten som "negativ brøkdel". Den negative fraksjonen inneholder (1) RNA i EGFP-negative celler og (2) RNA i EGFP-positive celler som ikke er bundet til ribosomer.
- Tilsett 1 ml høysalt vaskebuffer til perlene og virvle kort røret for å vaske perlene. Plasser røret i et magnetstativ.
- Fjern vaskebufferen. Gjenta vasketrinnet to ganger til. Perlene inneholder nå perle-ribosom-RNA-komplekset fra EGFP-positive celler.
5. RNA-ekstraksjon
MERK: Følgende trinn er tilpasset fra RNA-isolasjonssettet (Table of Materials). Behandle hver fraksjon (dvs. input, positiv og negativ) som en uavhengig prøve og isoler RNA uavhengig.
- Inkuber perlene fra trinn 4.4 med 50 μL ekstraksjonsbuffer (fra RNA-isolasjonssettet) i en termomikser (42 ° C, 500 o / min) i 30 minutter for å frigjøre RNA fra perler.
- Skill perlene med et magnetstativ, overfør supernatanten som inneholder perle-ribosom-RNA-komplekset til et 1,5 ml rør.
- Sentrifuge røret ved 3000 x g i 2 min, deretter pipette supernatanten til en ny 1,5 ml rør. Dette røret inneholder den "positive fraksjonen" av TRAP-trinnet.
MERK: For inngangs- og de negative fraksjonene, trekk ut RNA fra 25 μL prøver ved bruk av 1 ml ekstraksjonsbuffer. Inkuber i en termomikser (42 °C, 500 o / min) i 30 min. - Forutsett RNA-rensingskolonnen: Pipette 250 μL kondisjoneringsbuffer på rensekolonnen. Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur (RT). Sentrifuge kolonnen på 16.000 x g i 1 min.
- Pipet lik volum på 70 % EtOH inn i supernatanten fra trinn 5,3 (rundt 50 μL av 70 % EtOH for den positive fraksjonen og 1 ml 70 % EtOH for inngangs- og de negative fraksjonene). Bland godt ved pipettering opp og ned.
- Pipette blandingen inn i kolonnen fra trinn 5.4.
- Sentrifuge kolonnen ved 100 x g i 2 minutter for å tillate RNA-binding til membranen i kolonnen, og fortsett deretter sentrifugen ved 16 000 x g i 30 s umiddelbart. Kast gjennomstrømningen.
MERK: For inngangs- og de negative fraksjonene, tilsett 250 μL av blandingen til kolonnen hver gang. Gjenta trinn 5.6 og 5.7 til alle blandingene er brukt. - Pipetter 100 μL vaskebuffer 1 (W1) inn i kolonnen og sentrifuger ved 8 000 x g i 1 min. Kast gjennomstrømningen.
- Pipette 75 μL DNase-oppløsning blandes direkte inn i rensesøylemembranen. Inkuber ved RT i 15 min.
- Pipetter 40 μL W1 inn i kolonnen og sentrifugen ved 8000 x g i 30 s. Kast gjennomstrømningen.
- Pipette 100 μL vaskebuffer 2 (W2) inn i kolonnen og sentrifugen ved 8 000 x g i 1 min. Kast gjennomstrømningen.
- Pipette 100 μL W2 inn i kolonnen og sentrifugen ved 16 000 x g i 2 minutter. Kast gjennomstrømningen. Sentrifuger den samme kolonnen på 16 000 x g i 1 minutt for å fjerne alle spor av vaskebuffer før elueringstrinnet.
- Overfør kolonnen til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Pipette 12 μL RNase-fritt vann direkte på membranen i rensesøylen. Pipetspissen skal ikke berøre membranen. Inkuber ved RT i 1 min og sentrifuge ved 1000 x g i 1 min. Fortsett deretter sentrifugering ved 16 000 x g i 1 minutt for å eluere RNA.
6. RNA-konsentrasjon og kvalitet
- Bruk en bioanalysator for å vurdere kvaliteten og mengden av det ekstraherte RNA10.
7. Lagring og videre analyse
- Oppbevar RNA ved -80 °C (opptil 1 år) inntil videre analyse (f.eks. mikromatrise, kvantitativ PCR (qPCR) og RNA-seq, etc.).
MERK: For detaljer om qPCR-analysen, inkludert cDNA-syntese, se Lyu et al.11. Primere for qPCR er oppført i materialtabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gli1-CreERT2-mus (Jackson Lab Stock Number: 007913) ble først krysset med NuTRAP-reportermusen (Jackson Lab Stock Number: 029899) for å generere dobbeltmutante mus. Mus som bærer begge genmodifiserte genalleler (dvs. Gli1-CreERT2 og NuTRAP) ble injisert med tamoxifen en gang daglig, annenhver dag, for tre injeksjoner. Vevsprøver ble tatt den 7. dagen etter injeksjonens 1.dag. Immunfluorescensanalyse viste at EGFP ble uttrykt i interstitielle celler i testikler (figur 1). Binyrene kapsel har vært kjent for å være en annen cellepopulasjon positiv av Gli112,13. EGFP ble også funnet i binyrene capsulære celler i Gli1-CreERT2; NuTRAP-mus (figur 1). Vårt laboratorium bærer også Shh-CreERT2; NuTRAP mus. Merk at i Shh-CreERT2; NuTRAP-mus, EGFP+-cellepopulasjonen ligger i den ytre cortex av binyrene under kapselen (figur 1), det samme ekspresjonsstedet for EGFP+-celler i Shh+-området i binyrene13 som bekrefter ekspresjonen av EGFP i Cre-uttrykkende celler.
Etter ekstraksjonen av de celletypespesifikke RNA-ene ble mengden og kvaliteten på isolerte RNA i hver fraksjon fra to uavhengige ekstraksjoner (en testis brukt i hver ekstraksjon) vurdert ved hjelp av en bioanalysator (figur 2). Bioanalysatorresultatet indikerte at denne protokollen er i stand til å oppnå RNA av høy kvalitet fra alle tre fraksjonene. Alle fraksjoner hadde et lignende RNA Integrity Number (RIN).
For ytterligere å teste om det ekstraherte RNA er celletypespesifikt, ble ekstrahert RNA sendt til mikroarrayanalyse ved hjelp av en kommersiell mikroarray-tjeneste (se Materialtabell). Mikromatriseresultatet viste at ca. 4000 gener ble beriket i den positive fraksjonen sammenlignet med den negative fraksjonen, mens ca. 3000 gener ble beriket i den negative fraksjonen (figur 3). Blant disse differensielt uttrykte genene ble Leydig-celleassosierte gener Hsd11b1 og Hsd3b614,15 beriket i den positive fraksjonen. I den negative fraksjonen ble de Sertoli-celleassosierte genene Dhh og Gstm616,17 beriket. Bare noen få differensielt uttrykte gener ble identifisert når man sammenlignet den negative fraksjonen med inngangen.
Sanntids kvantitativ RT-PCR (qPCR) ble også brukt til å bekrefte uttrykket av nøkkelgener i den positive fraksjonen og den negative fraksjonen. I likhet med det som ble funnet i mikromatriseanalysen, ble steroidogene enzymer 3β-hydroksysteroiddehydrogenase (kodet av Hsd3b) og kolesterolsidekjedespaltningsenzym (kodet av Cyp11a1) beriket i den positive fraksjonen. Mens Sertoli-cellemarkøren Sox9 (SRY-box Transcription Factor 9) og kimcellemarkøren Sycp3 (Synaptonemal Complex Protein 3) ble beriket i den negative fraksjonen (figur 4). Sammen viste disse dataene at transkriptomene i Gli1+ -celler ble trukket ned og beriket av ovennevnte protokoll.
Figur 1: Immunfluorescensbilder av EGFP-uttrykket i NuTRAP reportermusemodeller. Den Gli1-CreERT2; NuTRAP og Shh-CreERT2; NuTRAP-mus ble behandlet med tamoksifen for å aktivere EGFP-uttrykket. I testiklene var Gli1+-cellene i interstitium, mens i binyrene var Gli1+-celler i binyrekapselen. I binyrene var cellene under kapselen positive til SHH (EGFP+-celler i Shh-CreERT2; NuTRAP mus). SHH er liganden til SHH-signalveien som fremkaller dens funksjon i Gli1+ kapselceller13. Vektstenger: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: RNA-kvalitet og kvantitet fra TRAP-ekstraksjonen. RNA av den positive fraksjonen, den negative fraksjonen og inngangen ble evaluert ved hjelp av en bioanalysator. Den positive fraksjonen inneholder RNA ekstrahert fra protein G-perler etter inkubasjonen med GFP-antistoffet (trinn 4.1). Den negative fraksjonen inneholder RNA som forblir i supernatanten ved trinn 4.2. Inngangen inneholder RNA fra homogenatet (trinn 3.3). I elektroferogrammet, fordi konsentrasjonene av den nedre markøren (vist som den første toppen ved 20-25 s av migrasjonstiden for prøver vist på X-aksen) og stigen (ikke vist i disse elektroferogrammene) er kjent, kan konsentrasjonen av hver prøve beregnes. De to store toppene på 40-50 s representerer 18S og 28S rRNA. Det ribosomale forholdet (basert på fluorescensintensiteten vist på Y-aksen) brukes til å bestemme integriteten til RNA-prøven. RNA-integritetsnummeret (RIN) for hver prøve vises øverst til høyre i hvert plott. Hver prikk i prikkplottet representerer mengden RNA som ble ekstrahert fra en enkelt testis. Mengden RNA av hver prøve i den negative fraksjonen og inngangen ble ekstrahert fra 25 μL prøver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Mikromatriseanalyse for TRAP-prøver. Resultater av to ekstraksjoner (en testis hver) vises. Mikromatriseanalysen identifiserte et tilsvarende antall differensielt uttrykte gener fra to uavhengige ekstraksjoner (Testis A og Testis B). Rundt 4000 gener ble beriket (røde prikker) i den positive fraksjonen, mens ~ 3000 gener ble beriket (grønne prikker) i den negative fraksjonen. Hsd11b1 og Hsd3b6 ble beriket i positive fraksjoner. Dhh og Gstm6 ble beriket i negative fraksjoner. Bare noen få gener ble identifisert som differensielt uttrykte gener mellom den negative fraksjonen og inngangen, noe som tyder på at testisene bare inneholder et svært lite antall Gli1 + -celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: qPCR-analyse for TRAP-prøver. qPCR-analyse viste det relative uttrykket av celletypespesifikke gener i den positive fraksjonen og den negative fraksjonen. Ekspresjonen av hvert gen ble først normalisert med Actb. De relative uttrykkene av gener i den positive fraksjonen ble deretter beregnet basert på uttrykket av Sox9 (satt som 10). For den negative fraksjonen ble Cyp11a1 (satt som 10) brukt til å normalisere det relative uttrykket. Legg merke til at det relative uttrykket av målgener bare kan sammenlignes innenfor hver fraksjon. Gener som koder for de steroidogene enzymene (Hsd3b og Cyp11a1) ble beriket i den positive fraksjonen. Mens markørgenet for kimceller (Scyp3) og Sertoli-celler (Sox9) ble beriket i den negative fraksjonen. Tre biologiske replikasjoner (tre uavhengige ekstraksjoner, en testis hver) ble vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nytten av helvevstranskriptomanalysen kan dempes, spesielt når man studerer komplekse heterogene vev. Hvordan skaffe celletypespesifikke RNA blir et presserende behov for å frigjøre den kraftige RNA-seq-teknikken. Isoleringen av celletypespesifikke RNA er vanligvis avhengig av innsamling av en bestemt type celler ved hjelp av mikromanipulering, fluorescerende aktivert cellesortering (FACS) eller laserfangstmikrodisseksjon (LCM)18. Andre moderne single-cell innsamlingsmetoder og instrumenter med høy gjennomstrømning er også utviklet19. Disse metodene bruker vanligvis mikrofluidikkteknikkene til strekkode enkeltceller etterfulgt av enkeltcelle-RNA-seq. Celledissosiasjon er det nødvendige trinnet for å oppnå den suspenderte celleløsningen, som deretter vil gå gjennom enten en cellesorterer eller en mikrofluidisk enhet for å strekkode hver celle. Celledissosiasjonstrinnet introduserer utfordringer for disse metodene for celletypespesifikke studier fordi den enzymatiske behandlingen ikke bare bryter ned vev, men også påvirker cellens levedyktighet og transkripsjonsprofiler20. Videre er utgiftene for encellet RNA-seq vanligvis høye og krever spesialisert utstyr på stedet.
Nylig har to studier vellykket isolert RNA / DNA av spesifikke celletyper fra hele vev ved hjelp av NuTRAP-musene 8,21. Uten å bruke spesifikt utstyr og verktøy, tillater NuTRAP-musemodellen å skaffe RNA og DNA fra bestemte typer celler. NuTRAP-allelet kan målrette Cre-uttrykkende celler uten celledissosiasjonstrinnet, og unngå å endre cellens levedyktighet og transkripsjonsprofiler. Rol og medarbeidere brukte musemodellen NuTRAP til å isolere kjerner og oversette mRNA samtidig fra fettvev. Den andre studien viste også at NuTRAP-musemodellen kunne fungere for gliaceller i sentralnervesystemet8.
I vårt laboratorium er vi interessert i å studere stamcellepopulasjonene i steroidogene vev som Gli1+ interstitielle celler i testis22 og Gli1+ kapselceller i binyrene13. Utfordringen med å studere Gli1+-celler i disse to organene er at antallet Gli1+-celler i testiklene og binyrene er lite. For eksempel opptar andelen Leydig-celler, som er den viktigste populasjonen av Gli1+-celler i testis, bare ca. 3,8% av det totale testisvolumet hos voksne mus23. Fordi TRAP-teknikken tar sikte på å spesifikt trekke ned oversettelse av ribosombundne RNAer i komplekst vev, kan NuTRAP-musemodellen være et kraftig verktøy som er egnet for å studere en sjelden cellepopulasjon i et komplekst vev. De tidligere publiserte protokollene som bruker NuTRAP-mus, retter seg mot adipocytter og gliaceller som er mer tallrike i hjernen og fettvev sammenlignet med Gli1+-celler i testis og i binyrene. For å sikre å oppnå nødvendige RNA fra et lite antall celler i et komplekst vev, reviderte vi de eksisterende protokollene ved å (1) øke inkubasjonstiden med GFP-antistoffet fra 1 time til over natten; (2) ved bruk av en annen type RNA-ekstraksjonssett som tar sikte på å isolere en liten mengde RNA på pikogramnivå.
Vi demonstrerte at denne protokollen kunne oppnå høykvalitets celletypespesifikke RNA fra et lite antall celler i et komplekst vev. Kvaliteten og mengden av ekstraherte RNA er i stand til qPCR og en kommersiell microarray-tjeneste. Resultater fra microarray og qPCR bekreftet at Leydig-celler-assosierte gener er beriket i den positive fraksjonen som kommer fra en testis. Protokollen her gir en detaljert tilnærming til å isolere celletypespesifikke oversette ribosom-mRNA-er ved hjelp av NuTRAP-musemodellen . Denne protokollen kan også brukes til å isolere RNA fra alle EGFP-uttrykkende celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av NIH R00HD082686. Vi takker Endocrine Society Summer Research Fellowship til H.S.Z. Vi takker også Dr. Yuan Kang for avl og vedlikehold av musekolonien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
References
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).
- Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).
- Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Varjosalo, M., Taipale, J. Hedgehog: functions and mechanisms. Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , Application Note 1 1-8 (2004).
- Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
- King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
- Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
- Benton, L., Shan, L. -X., Hardy, M. P. Differentiation of adult Leydig cells. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).
- Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
- Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
- Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481 (2009).
- Gross, A., et al. Technologies for single-cell isolation. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
- Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).
