Summary
Ce protocole vise à isoler les ARNm ribosomales de traduction spécifiques au type cellulaire à l’aide du modèle murin NuTRAP.
Abstract
L’hétérogénéité cellulaire pose des défis pour comprendre la fonction des tissus complexes au niveau du transcriptome. L’utilisation d’ARN spécifiques au type cellulaire évite les pièges potentiels causés par l’hétérogénéité des tissus et libère la puissante analyse du transcriptome. Le protocole décrit ici montre comment utiliser la méthode TRAP (Translating Ribosome Affinity Purity) pour isoler les ARN liés aux ribosomes à partir d’une petite quantité de cellules exprimant l’EGFP dans un tissu complexe sans tri cellulaire. Ce protocole convient à l’isolement d’ARN spécifiques au type cellulaire à l’aide du modèle murin NuTRAP récemment disponible et pourrait également être utilisé pour isoler les ARN de toutes les cellules exprimant l’EGFP.
Introduction
Les approches à haut débit, y compris le séquençage de l’ARN (RNA-seq) et les microarrays, ont permis d’interroger les profils d’expression génique à l’échelle du génome. Pour les tissus complexes tels que le cœur, le cerveau et les testicules, les données spécifiques au type cellulaire fourniront plus de détails comparant l’utilisation des ARN du tissu entier 1,2,3. Pour surmonter l’impact de l’hétérogénéité cellulaire, la méthode TRAP (Translating Ribosome Affinity Purifie) est développée depuis le début des années 20104. TRAP est capable d’isoler les ARN liés aux ribosomes de types cellulaires spécifiques sans dissociation tissulaire. Cette méthode a été utilisée pour l’analyse des translatomes (ARNm qui sont recrutés sur le ribosome pour la traduction) dans différents organismes, y compris le ciblage d’une population extrêmement rare de cellules musculaires chez les embryons de drosophile5, l’étude de différentes cellules racinaires dans la plante modèle Arabidopsis thaliana6 et l’analyse du transcriptome des cellules endothéliales chez les mammifères7.
TRAP nécessite une modification génétique pour marquer le ribosome d’un organisme modèle. Evan Rosen et ses collègues ont récemment développé un modèle murin appelé Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse 8, disponible auprès du Jackson Laboratory depuis 2017. En croisant avec une lignée de souris Cre, les chercheurs peuvent utiliser ce modèle murin NuTRAP pour isoler les ARN liés aux ribosomes et les noyaux cellulaires des cellules exprimant Cre sans tri cellulaire. Dans les cellules exprimant Cre qui portent également l’allèle NuTRAP , le ribosome marqué EGFP/L10a permet l’isolement des ARNm transposés à l’aide de tests d’affinité. Dans la même cellule, la membrane nucléaire marquée au peptide de reconnaissance de la biotine ligase (BLRP), qui est également positive à la cerise, permet l’isolement nucléaire en utilisant une purification basée sur l’affinité ou la fluorescence. La même équipe de recherche a également généré une lignée de souris similaire dans laquelle la membrane nucléaire est marquée uniquement avec mCherry sans biotine8. Ces deux lignées de souris génétiquement modifiées donnent accès à la caractérisation des profils épigénomiques et transcriptomiques appariés de types spécifiques de cellules d’intérêt.
La voie de signalisation du hérisson (Hh) joue un rôle essentiel dans le développement des tissus9. GLI1, un membre de la famille GLI, agit comme un activateur transcriptionnel et médie la signalisation Hh. Les cellules Gli1+ peuvent être trouvées dans de nombreux organes sécrétant des hormones, y compris la glande surrénale et le testicule. Pour isoler les ADN et les ARN spécifiques du type cellulaire des cellules Gli1+ à l’aide du modèle murin NuTRAP, des souris Gli1-CreERT2 ont été croisées avec les souris NuTRAP . Des souris Shh-CreERT2 ont également été croisées avec les souris NuTRAP visant à isoler les cellules exprimant sonic hedgehog (Shh). Le protocole suivant montre comment utiliser Gli1-CreERT2; Des souris NuTRAP pour isoler les ARN liés aux ribosomes à partir de cellules Gli1+ dans des testicules de souris adultes.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux effectuées ont suivi les protocoles approuvés par les comités institutionnels de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université d’Auburn.
REMARQUE: Le protocole suivant utilise un testicule (environ 100 mg) à P28 de Gli1-CreERT2; Souris NuTRAP (Mus musculus). Les volumes de réactifs peuvent devoir être ajustés en fonction des types d’échantillons et du nombre de tissus.
1. Prélèvement de tissus
- Euthanasier les souris à l’aide d’une chambre CO2 , désinfecter la surface de l’abdomen avec de l’éthanol à 70%.
- Ouvrez le bas-ventre avec des ciseaux et retirez les testicules. Utilisez de l’azote liquide (LN2) pour congeler immédiatement les testicules.
- Conserver les échantillons dans la phase vapeur de LN2 jusqu’à utilisation.
2. Préparation des réactifs et des billes
- Préparer la solution mère d’homogénéisation : Ajouter 50 mM de Tris (pH 7,4), 12 mM de MgCl2, 100 mM de KCl, 1 % de NP-40 et 1 mg/mL d’héparine. Conserver la solution à 4 °C jusqu’à utilisation (jusqu’à 1 mois).
- Préparer le tampon de travail d’homogénéisation à partir de la solution mère (étape 2.1) fraîchement avant utilisation : Ajouter le DTT (concentration finale : 1 mM), le cycloheximide (concentration finale : 100 μg/mL), la ribonucléase recombinante (concentration finale : 200 unités/mL) et le cocktail inhibiteur de protéase (concentration finale : 1x) à la solution mère d’homogénéisation pour obtenir la quantité requise du tampon de travail d’homogénéisation. Conserver le tampon de travail fraîchement préparé sur de la glace jusqu’à utilisation.
- Préparez les tampons de lavage à faible teneur en sel et à haute teneur en sel :
- Pour préparer un mélange tampon de lavage à faible teneur en sel, 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl et 1% NP-40. Ajouter le DTT (concentration finale : 1 mM) et le cycloheximide (concentration finale : 100 μg/mL) avant utilisation.
- Pour préparer un mélange tampon de lavage à haute teneur en sel 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. Ajouter le DTT (concentration finale : 2 mM) et le cycloheximide (concentration finale : 100 μg/mL) avant utilisation.
- Préparer des billes de protéines G (tableau des matières) :
- Chaque échantillon nécessitera 50 μL de billes de protéine G. Placez la quantité requise de billes dans un tube à centrifuger de 1,5 ml et séparez les billes de la solution à l’aide d’une grille magnétique en laissant le tube sur le rack pendant 30 à 60 s.
- Retirer le surnageant par pipetage. Lavez les billes trois fois avec 1 ml de tampon de lavage glacé à faible teneur en sel à chaque fois.
3. Lyse tissulaire et homogénéisation
- Ajouter 2 mL de tampon de travail d’homogénéisation à froid glacé (fraîchement préparé à partir de l’étape 2.2) dans un ensemble de broyeur de tissu en verre. Placez rapidement l’échantillon congelé dans le broyeur et homogénéisez le tissu en 30 coups sur glace à l’aide d’un pilon lâche.
- Transférer l’homogénat dans un tube à fond rond de 2 ml et centrifuger à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 2 mL. Économisez 100 μL dans un tube de 1,5 mL comme « entrée ».
- Incuber le surnageant dans le tube de 2 mL avec l’anticorps anti-GFP (5 μg/mL; 1:400) à 4 °C sur un rotateur bout à bout (24 rpm) pendant une nuit.
4. Immunoprécipitation
- Transférer le mélange homogénat/anticorps dans un nouveau tube à fond rond de 2 mL contenant les billes de protéines G lavées de l’étape 2.4. Incuber à 4 °C sur un rotateur bout à bout (24 tr/min) pendant 2 h.
- Séparez les billes magnétiques du surnageant à l’aide d’un support magnétique. Enregistrer le surnageant comme « fraction négative ». La fraction négative contient (1) des ARN dans les cellules EGFP-négatives et (2) des ARN dans les cellules EGFP-positives qui ne sont pas liés aux ribosomes.
- Ajouter 1 ml de tampon de lavage à haute teneur en sel aux billes et vortex brièvement le tube pour laver les perles. Placez le tube dans un support magnétique.
- Retirez le tampon de lavage. Répétez l’étape de lavage deux fois de plus. Les billes contiennent maintenant le complexe billes-ribosome-ARN des cellules EGFP-positives.
5. Extraction de l’ARN
NOTE: Les étapes suivantes sont adaptées du kit d’isolement ARN (Table of Materials). Traiter chaque fraction (c.-à-d. entrée, positive et négative) comme un échantillon indépendant et isoler les ARN indépendamment.
- Incuber les billes de l’étape 4.4 avec 50 μL de tampon d’extraction (du kit d’isolement d’ARN) dans un thermomélangeur (42 °C, 500 rpm) pendant 30 min pour libérer les ARN des billes.
- Séparez les billes avec un support magnétique, transférez le surnageant qui contient le complexe perles-ribosome-ARN dans un tube de 1,5 mL.
- Centrifuger le tube à 3000 x g pendant 2 min, puis pipeter le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL. Ce tube contient la « fraction positive » de l’étape TRAP.
NOTE: Pour les fractions d’entrée et négatives, extraire l’ARN de 25 μL d’échantillons en utilisant 1 mL de tampon d’extraction. Incuber dans un thermomélangeur (42 °C, 500 tr/min) pendant 30 min. - Préconditionner la colonne de purification de l’ARN : Pipeter 250 μL de tampon de conditionnement sur la colonne de purification. Incuber pendant 5 min à température ambiante (RT). Centrifuger la colonne à 16 000 x g pendant 1 min.
- Piper un volume égal de 70% d’EtOH dans le surnageant à partir de l’étape 5.3 (environ 50 μL d’EtOH à 70% pour la fraction positive et 1 mL d’EtOH à 70% pour les fractions entrantes et négatives). Bien mélanger en pipetant de haut en bas.
- Introduire à la pipette le mélange dans la colonne à partir de l’étape 5.4.
- Centrifuger la colonne à 100 x g pendant 2 min pour permettre à l’ARN de se lier à la membrane dans la colonne, puis continuer la centrifugeuse à 16 000 x g pendant 30 s immédiatement. Jetez le flux continu.
NOTE: Pour les fractions d’entrée et négatives, ajouter 250 μL du mélange à la colonne à chaque fois. Répétez les étapes 5.6 et 5.7 jusqu’à ce que tous les mélanges soient utilisés. - Introduire à la pipette 100 μL de tampon de lavage 1 (W1) dans la colonne et centrifuger à 8 000 x g pendant 1 min. Jetez le flux continu.
- Pipeter 75 μL de solution de DNase mélanger directement dans la membrane de la colonne de purification. Incuber à TA pendant 15 min.
- Pipeter 40 μL de W1 dans la colonne et centrifuger à 8 000 x g pendant 30 s. Jetez le flux continu.
- Introduire à la pipette 100 μL de tampon de lavage 2 (W2) dans la colonne et centrifuger à 8 000 x g pendant 1 min. Jetez le flux continu.
- Pipeter 100 μL de W2 dans la colonne et centrifuger à 16 000 x g pendant 2 min. Jetez le flux continu. Recentrifuger la même colonne à 16 000 x g pendant 1 min pour éliminer toute trace de tampon de lavage avant l’étape d’élution.
- Transférer la colonne dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL.
- Pipeter 12 μL d’eau exempte de RNase directement sur la membrane de la colonne de purification. L’embout de la pipette ne doit pas toucher la membrane. Incuber à TA pendant 1 min et centrifuger à 1000 x g pendant 1 min. Poursuivre ensuite la centrifugation à 16 000 x g pendant 1 min pour éluer l’ARN.
6. Concentration et qualité de l’ARN
- Utiliser un bioanalyseur pour évaluer la qualité et la quantité de l’ARN10 extrait.
7. Stockage et analyse plus approfondie
- Conservez l’ARN à -80 °C (jusqu’à 1 an) jusqu’à une analyse plus approfondie (p. ex. microréseau, PCR quantitative (qPCR), RNA-seq, etc.).
REMARQUE : Pour plus de détails sur l’analyse qPCR, y compris la synthèse de l’ADNc, se reporter à Lyu et coll.11. Les amorces pour la qPCR sont énumérées dans le tableau des matériaux.
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Representative Results
Les souris Gli1-CreERT2 (Jackson Lab Stock Number: 007913) ont d’abord été croisées avec la souris rapporteure NuTRAP (Jackson Lab Stock Number: 029899) pour générer des souris double-mutantes. Des souris portant les deux allèles génétiques génétiquement modifiés (c.-à-d. Gli1-CreERT2 et NuTRAP) ont reçu une injection de tamoxifène une fois par jour, tous les deux jours, pour trois injections. Des échantillons de tissus ont été prélevés le 7ème jour après le 1erjour de l’injection. L’analyse par immunofluorescence a montré que l’EGFP était exprimé dans les cellules interstitielles des testicules (Figure 1). La capsule de la glande surrénale est connue pour être une autre population cellulaire positive de Gli112,13. L’EGFP a également été trouvé dans les cellules capsulaires surrénales de Gli1-CreERT2; Souris NuTRAP (Figure 1). Notre laboratoire transporte également Shh-CreERT2; Souris NuTRAP. Notez que dans Shh-CreERT2; Les souris NuTRAP, la population cellulaire EGFP+ résident dans le cortex externe de la glande surrénale sous la capsule (Figure 1), le même site d’expression des cellules EGFP+ dans la zone Shh+ de la glande surrénale13 confirmant l’expression de l’EGFP dans les cellules exprimant Cre.
Après l’extraction des ARN spécifiques au type cellulaire, la quantité et la qualité des ARN isolés dans chaque fraction provenant de deux extractions indépendantes (un testicule utilisé dans chaque extraction) ont été évaluées à l’aide d’un bioanalyseur (Figure 2). Le résultat du bioanalyseur a indiqué que ce protocole est capable d’obtenir des ARN de haute qualité à partir des trois fractions. Toutes les fractions avaient un nombre d’intégrité de l’ARN (RIN) similaire.
Pour vérifier davantage si l’ARN extrait est spécifique au type cellulaire, l’ARN extrait a été envoyé pour analyse de microréseau à l’aide d’un service commercial de microréseaux (voir le tableau des matériaux). Le résultat du microréseau a montré qu’environ 4 000 gènes étaient enrichis dans la fraction positive par rapport à la fraction négative, tandis qu’environ 3 000 gènes étaient enrichis dans la fraction négative (Figure 3). Parmi ces gènes exprimés différentiellement, les gènes associés aux cellules de Leydig Hsd11b1 et Hsd3b6 14,15 ont été enrichis dans la fraction positive. Dans la fraction négative, les gènes associés aux cellules de Sertoli Dhh et Gstm616,17 ont été enrichis. Seuls quelques gènes exprimés différentiellement ont été identifiés lors de la comparaison de la fraction négative avec l’entrée.
La RT-PCR quantitative en temps réel (qPCR) a également été utilisée pour confirmer l’expression de gènes clés dans la fraction positive et la fraction négative. Semblable à ce qui a été trouvé dans le test de microréseau, les enzymes stéroïdogènes 3β-hydroxystéroïde déshydrogénase (codées par Hsd3b) et l’enzyme de clivage de la chaîne latérale du cholestérol (codée par Cyp11a1) ont été enrichies dans la fraction positive. Alors que le marqueur cellulaire Sertoli Sox9 (SRY-box Transcription Factor 9), et le marqueur de cellules germinales Sycp3 (Synaptonemal Complex Protein 3), ont été enrichis dans la fraction négative (Figure 4). Ensemble, ces données ont démontré que les transcriptomes dans les cellules Gli1+ ont été tirés avec succès vers le bas et enrichis par le protocole ci-dessus.
Figure 1 : Images d’immunofluorescence de l’expression de l’EGFP dans des modèles murins rapporteurs NuTRAP. Le Gli1-CreERT2; NuTRAP et le Shh-CreERT2; Les souris NuTRAP ont été traitées avec du tamoxifène pour activer l’expression EGFP. Dans le testicule, les cellules Gli1+ étaient dans l’interstitium, tandis que dans la glande surrénale, les cellules Gli1+ étaient dans la capsule surrénale. Dans la glande surrénale, les cellules sous la capsule étaient positives pour la SHH (cellules EGFP+ dans Shh-CreERT2; Souris NuTRAP). SHH est le ligand de la voie de signalisation SHH qui suscite sa fonction dans les cellules capsulaires Gli1+ 13. Barres d’échelle: 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Qualité et quantité d’ARN provenant de l’extraction TRAP. Les ARN de la fraction positive, de la fraction négative et de l’entrée ont été évalués à l’aide d’un bioanalyseur. La fraction positive contient des ARN extraits des billes de protéine G après l’incubation avec l’anticorps GFP (étape 4.1). La fraction négative contient des ARN qui restent dans le surnageant à l’étape 4.2. L’entrée contient des ARN de l’homogénat (étape 3.3). Dans l’électrophérogramme, comme les concentrations du marqueur inférieur (affiché comme le premier pic à 20-25 s du temps de migration des échantillons montrés sur l’axe des abscisses) et de l’échelle (non représentée dans ces électrophérogrammes) sont connues, la concentration de chaque échantillon peut être calculée. Les deux pics majeurs à 40-50 s représentent l’ARNr 18S et 28S. Le rapport ribosomique (basé sur l’intensité de fluorescence indiquée sur l’axe Y) est utilisé pour déterminer l’intégrité de l’échantillon d’ARN. Le numéro d’intégrité de l’ARN (RIN) de chaque échantillon est indiqué dans le coin supérieur droit de chaque placette. Chaque point du diagramme à points représente la quantité d’ARN qui a été extraite d’un seul testicule. La quantité d’ARN de chaque échantillon dans la fraction négative et l’entrée ont été extraites de 25 μL d’échantillons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Analyse des microréseaux pour les échantillons TRAP. Les résultats de deux extractions (un testicule chacun) sont présentés. L’analyse des microréseaux a identifié un nombre similaire de gènes exprimés différentiellement à partir de deux extractions indépendantes (Testicule A et Testicule B). Environ 4 000 gènes ont été enrichis (points rouges) dans la fraction positive, tandis que ~3 000 gènes ont été enrichis (points verts) dans la fraction négative. Hsd11b1 et Hsd3b6 ont été enrichis en fractions positives. Dhh et Gstm6 ont été enrichis en fractions négatives. Seuls quelques gènes ont été identifiés comme des gènes exprimés différemment entre la fraction négative et l’entrée, ce qui suggère que le testicule ne contient qu’un très petit nombre de cellules Gli1+. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : analyse qPCR pour les échantillons TRAP. L’analyse qPCR a montré l’expression relative de gènes spécifiques au type cellulaire dans la fraction positive et la fraction négative. L’expression de chaque gène a d’abord été normalisée avec Actb. Les expressions relatives des gènes au sein de la fraction positive ont ensuite été calculées sur la base de l’expression de Sox9 (définie sur 10). Pour la fraction négative, Cyp11a1 (défini sur 10) a été utilisé pour normaliser l’expression relative. Notez que l’expression relative des gènes cibles ne peut être comparée qu’au sein de chaque fraction. Les gènes codant pour les enzymes stéroïdogènes (Hsd3b et Cyp11a1) ont été enrichis dans la fraction positive. Alors que le gène marqueur des cellules germinales (Scyp3) et les cellules Sertoli (Sox9), ont été enrichis dans la fraction négative. Trois répétitions biologiques (trois extractions indépendantes, un testicule chacune) ont été montrées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’utilité de l’analyse du transcriptome des tissus entiers pourrait être atténuée, en particulier lors de l’étude de tissus hétérogènes complexes. Comment obtenir des ARN spécifiques au type cellulaire devient un besoin urgent de libérer la puissante technique de séquençage de l’ARN. L’isolement d’ARN spécifiques à un type cellulaire repose généralement sur la collecte d’un type spécifique de cellules à l’aide de la micromanipulation, du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) ou de la microdissection par capture laser (LCM)18. D’autres méthodes et instruments modernes de collecte de cellules uniques à haut débit ont également été mis au point19. Ces méthodes utilisent généralement les techniques microfluidiques pour coder à barres des cellules individuelles suivies d’un séquençage d’ARN unicellulaire. La dissociation cellulaire est l’étape nécessaire pour obtenir la solution de cellules en suspension, qui passera ensuite par un trieur de cellules ou un dispositif microfluidique pour coder à barres chaque cellule. L’étape de dissociation cellulaire introduit des défis à ces méthodes pour les études spécifiques au type cellulaire, car le traitement enzymatique non seulement décompose les tissus, mais affecte également la viabilité cellulaire et les profils transcriptionnels20. De plus, les dépenses pour le séquençage d’ARN unicellulaire sont généralement élevées et nécessitent un équipement spécialisé sur place.
Récemment, deux études ont réussi à isoler l’ARN / ADN de types cellulaires spécifiques de tissus entiers en utilisant les souris NuTRAP 8,21. Sans utiliser d’équipements et d’outils spécifiques, le modèle murin NuTRAP permet d’obtenir des ARN et des ADN à partir de types spécifiques de cellules. L’allèle NuTRAP pourrait cibler les cellules exprimant Cre sans l’étape de dissociation cellulaire, évitant ainsi de modifier la viabilité cellulaire et les profils transcriptionnels. Rol et al. ont utilisé le modèle murin NuTRAP pour isoler les noyaux et traduire simultanément l’ARNm du tissu adipeux. L’autre étude a également démontré que le modèle murin NuTRAP pouvait fonctionner pour les cellules gliales du système nerveux central8.
Dans notre laboratoire, nous nous intéressons à l’étude des populations de cellules souches dans les tissus stéroïdogènes tels que les cellules interstitielles Gli1+ dans le testicule22 et les cellules capsulaires Gli1+ dans la glande surrénale13. Le défi de l’étude des cellules Gli1+ dans ces deux organes est que le nombre de cellules Gli1+ dans le testicule et la glande surrénale est faible. Par exemple, la proportion de cellules de Leydig, qui constituent la principale population de cellules Gli1+ dans le testicule, n’occupe qu’environ 3,8% du volume total des testicules chez les souris adultes23. Parce que la technique TRAP vise spécifiquement à réduire la traduction des ARN liés aux ribosomes dans des tissus complexes, le modèle murin NuTRAP pourrait être un outil puissant adapté à l’étude d’une population de cellules rares dans un tissu complexe. Les protocoles précédemment publiés utilisant des souris NuTRAP ciblent les adipocytes et les cellules gliales qui sont plus abondants dans le cerveau et le tissu adipeux par rapport aux cellules Gli1+ dans les testicules et dans la glande surrénale. Pour assurer l’obtention des ARN requis à partir d’un petit nombre de cellules dans un tissu complexe, nous avons révisé les protocoles existants en (1) augmentant le temps d’incubation avec l’anticorps GFP de 1 h à la nuit; (2) en utilisant un autre type de kit d’extraction d’ARN qui vise à isoler une petite quantité d’ARN au niveau du picogramme.
Nous avons démontré que ce protocole pouvait obtenir des ARN spécifiques de type cellulaire de haute qualité à partir d’un petit nombre de cellules dans un tissu complexe. La qualité et la quantité d’ARN extraits sont capables de la qPCR et d’un service de microréseau commercial. Les résultats de la micropuce et de la qPCR ont confirmé que les gènes associés aux cellules de Leydig sont enrichis en fraction positive provenant d’un testicule. Le protocole fournit ici une approche détaillée pour isoler les ARNm de ribosomes de traduction spécifiques au type cellulaire à l’aide du modèle murin NuTRAP . Ce protocole peut également être utilisé pour isoler les ARN de toute cellule exprimant l’EGFP.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été partiellement soutenu par NIH R00HD082686. Nous remercions la bourse de recherche d’été de l’Endocrine Society à H.S.Z. Nous remercions également le Dr Yuan Kang pour la reproduction et le maintien de la colonie de souris.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
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