Summary
Este protocolo tem como objetivo isolar mRNAs ribossomais de tradução específicos do tipo celular usando o modelo de camundongo NuTRAP.
Abstract
A heterogeneidade celular coloca desafios para a compreensão da função de tecidos complexos em um nível de transcriptoma. O uso de RNAs específicos do tipo celular evita possíveis armadilhas causadas pela heterogeneidade dos tecidos e desencadeia a poderosa análise do transcriptoma. O protocolo descrito aqui demonstra como usar o método Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) para isolar RNAs ligados a ribossomos de uma pequena quantidade de células que expressam EGFP em um tecido complexo sem classificação celular. Este protocolo é adequado para isolar RNAs específicos do tipo celular usando o modelo de camundongo NuTRAP recentemente disponível e também pode ser usado para isolar RNAs de quaisquer células que expressem EGFP.
Introduction
Abordagens de alto rendimento, incluindo sequenciamento de RNA (RNA-seq) e microarray, tornaram possível interrogar perfis de expressão gênica no nível de todo o genoma. Para tecidos complexos, como coração, cérebro e testículos, os dados específicos do tipo celular fornecerão mais detalhes comparando o uso de RNAs de todo o tecido 1,2,3. Para superar o impacto da heterogeneidade celular, o método Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) vem sendo desenvolvido desde o início da década de 20104. O TRAP é capaz de isolar RNAs ligados a ribossomos de tipos celulares específicos sem dissociação tecidual. Este método tem sido utilizado para análise de translatomos (mRNAs que estão sendo recrutados para o ribossomo para tradução) em diferentes organismos, incluindo a segmentação de uma população extremamente rara de células musculares em embriões de Drosophila5, o estudo de diferentes células radiculares na planta modelo Arabidopsis thaliana6 e a realização de análise de transcriptoma de células endoteliais em mamíferos7.
O TRAP requer uma modificação genética para marcar o ribossomo de um organismo modelo. Evan Rosen e seus colegas desenvolveram recentemente um modelo de rato chamado Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP)mouse 8, que está disponível no Jackson Laboratory desde 2017. Ao cruzar com uma linha de camundongo Cre, os pesquisadores podem usar este modelo de camundongo NuTRAP para isolar RNAs ligados a ribossomos e núcleos celulares de células que expressam Cre sem classificação celular. Em células que expressam Cre que também carregam o alelo NuTRAP , o ribossomo marcado com EGFP/L10a permite o isolamento de mRNAs de tradução usando ensaios pulldown de afinidade. Na mesma célula, a membrana nuclear marcada com peptídeo de reconhecimento de ligase de biotina (BLRP), que também é mCherry positivo, permite o isolamento nuclear usando purificação baseada em afinidade ou fluorescência. A mesma equipe de pesquisa também gerou uma linha de camundongo semelhante na qual a membrana nuclear é marcada apenas com mCherry sem biotina8. Essas duas linhagens de camundongos geneticamente modificados dão acesso para caracterizar perfis epigenômicos e transcriptômicos emparelhados de tipos específicos de células em interesse.
A via de sinalização do ouriço (Hh) desempenha um papel crítico no desenvolvimento tecidual9. GLI1, um membro da família GLI, atua como um ativador transcricional e medeia a sinalização Hh. As células Gli1+ podem ser encontradas em muitos órgãos secretores de hormônios, incluindo a glândula adrenal e o testículo. Para isolar DNAs e RNAs específicos do tipo celular de células Gli1+ usando o modelo de camundongo NuTRAP, camundongos Gli1-CreERT2 foram cruzados com os camundongos NuTRAP. Camundongos Shh-CreERT2 também foram cruzados com os camundongos NuTRAP com o objetivo de isolar células expressivas de ouriço sônico (Shh). O protocolo a seguir mostra como usar o Gli1-CreERT2; Camundongos NuTRAP para isolar RNAs ligados a ribossomos de células Gli1+ em testículos de camundongos adultos.
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Protocol
Todos os experimentos em animais realizados seguiram os protocolos aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Auburn.
NOTA: O protocolo a seguir usa um testículo (cerca de 100 mg) em P28 de Gli1-CreERT2; Camundongos NuTRAP (Mus musculus). Os volumes de reagentes podem precisar ser ajustados com base nos tipos de amostras e no número de tecidos.
1. Coleta de tecidos
- Eutanasiar os ratos usando uma câmara de CO2 , higienizar a superfície do abdômen com etanol a 70%.
- Abra o abdômen inferior com uma tesoura e remova os testículos. Use nitrogênio líquido (LN2) para congelar os testículos imediatamente.
- Armazenar amostras na fase de vapor do LN2 até o uso.
2. Preparação de reagentes e contas
- Preparar a solução-mãe de homogeneização: Adicionar 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40 e 1 mg/mL de heparina. Conservar a solução a 4 °C até à utilização (até 1 mês).
- Preparar o tampão de trabalho de homogeneização da solução-mãe (passo 2.1) imediatamente antes da utilização: Adicionar TDT (concentração final: 1 mM), cicloheximida (concentração final: 100 μg/ml), ribonuclease recombinante (concentração final: 200 unidades/ml) e cocktail inibidor de protease (concentração final: 1x) à solução-mãe de homogeneização para obter a quantidade necessária do tampão de trabalho de homogeneização. Armazenar o tampão de trabalho recém-preparado no gelo até à utilização.
- Prepare os tampões de lavagem com baixo teor de sal e alto teor de sal:
- Para preparar tampão de lavagem com baixo teor de sal, misture 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl e 1% NP-40. Adicionar TDT (concentração final: 1 mM) e cicloheximida (concentração final: 100 μg/ml) antes de utilizar.
- Para preparar tampão de lavagem com alto teor de sal misture 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. Adicionar TDT (concentração final: 2 mM) e cicloheximida (concentração final: 100 μg/ml) antes de utilizar.
- Prepare as contas de proteína G (Tabela de Materiais):
- Cada amostra precisará de 50 μL de esferas de proteína G. Coloque a quantidade necessária de contas em um tubo de centrífuga de 1,5 mL e separe as contas da solução usando um rack magnético, deixando o tubo no rack por 30-60 s.
- Remova o sobrenadante por pipetagem. Lave as contas três vezes com 1 mL de tampão de lavagem gelado com baixo teor de sal de cada vez.
3. Lise tecidual e homogeneização
- Adicionar 2 ml de tampão de trabalho de homogeneização gelado (preparado na hora a partir do passo 2.2) a um conjunto de moedores de tecido de vidro. Coloque rapidamente a amostra congelada no moedor e homogeneize o tecido com 30 golpes no gelo usando um pilão solto.
- Transferir o homogeneizado para um tubo de fundo redondo de 2 ml e centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C.
- Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 2 mL. Salve 100 μL em um tubo de 1,5 mL como a "entrada".
- Incubar o sobrenadante no tubo de 2 ml com o anticorpo anti-GFP (5 μg/ml; 1:400) a 4 °C num rotador end-over-end (24 rpm) durante a noite.
4. Imunoprecipitação
- Transfira a mistura homogeneizada/anticorpo para um novo tubo de fundo redondo de 2 ml contendo as esferas de proteína G lavadas a partir do passo 2.4. Incubar a 4 °C num rotador de ponta a ponta (24 rpm) durante 2 h.
- Separe as contas magnéticas do sobrenadante usando um rack magnético. Salve o sobrenadante como a "fração negativa". A fração negativa contém (1) RNAs em células EGFP-negativas e (2) RNAs em células EGFP-positivas que não estão ligadas aos ribossomos.
- Adicione 1 mL de tampão de lavagem com alto teor de sal às contas e faça um breve vórtice do tubo para lavar as contas. Coloque o tubo em um rack magnético.
- Remova o tampão de lavagem. Repita a etapa de lavagem mais duas vezes. As contas agora contêm o complexo de RNA de contas ribossomo-RNA de células positivas para EGFP.
5. Extração de RNA
NOTA: As etapas a seguir são adaptadas do kit de isolamento de RNA (Tabela de Materiais). Trate cada fração (ou seja, entrada, positiva e negativa) como uma amostra independente e isole os RNAs de forma independente.
- Incubar as esferas da etapa 4.4 com 50 μL de tampão de extração (do kit de isolamento de RNA) em um bifrutificador (42 °C, 500 rpm) por 30 min para liberar RNAs de contas.
- Separe as contas com um rack magnético, transfira o sobrenadante que contém o complexo contas-ribossomo-RNA para um tubo de 1,5 mL.
- Centrifugar o tubo a 3000 x g durante 2 min e, em seguida, pipetar o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 ml. Este tubo contém a "fração positiva" da etapa TRAP.
NOTA: Para a entrada e as frações negativas, extrair RNA de 25 μL de amostras usando 1 mL de tampão de extração. Incubar numa betoneira (42 °C, 500 rpm) durante 30 min. - Pré-condicione a coluna de purificação de ARN: Pipeta 250 μL de tampão de condicionamento para a coluna de purificação. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente (RT). Centrifugar a coluna a 16.000 x g durante 1 min.
- Pipetar volume igual de 70% de EtOH para o sobrenadante a partir do passo 5.3 (em torno de 50 μL de 70% de EtOH para a fração positiva e 1 mL de EtOH de 70% para a entrada e as frações negativas). Misture bem pipetando para cima e para baixo.
- Pipetar a mistura para a coluna a partir do passo 5.4.
- Centrifugar a coluna a 100 x g durante 2 min para permitir a ligação do ARN à membrana na coluna e, em seguida, continuar a centrifugar a 16.000 x g durante 30 s imediatamente. Descarte o fluxo.
NOTA: Para a entrada e as fracções negativas, adicionar 250 μL da mistura à coluna de cada vez. Repetir os passos 5.6 e 5.7 até que todas as misturas sejam utilizadas. - Pipetar 100 μL de tampão de lavagem 1 (W1) para a coluna e centrifugar a 8.000 x g durante 1 min. Descarte o fluxo.
- Pipeta 75 μL de solução de DNase misturada diretamente na membrana da coluna de purificação. Incubar no RT por 15 min.
- Pipetar 40 μL de W1 para a coluna e centrifugar a 8.000 x g durante 30 s. Descarte o fluxo.
- Pipetar 100 μL de tampão de lavagem 2 (W2) para a coluna e centrifugar a 8.000 x g durante 1 min. Descarte o fluxo.
- Pipetar 100 μL de W2 para a coluna e centrifugar a 16.000 x g durante 2 min. Descarte o fluxo. Recentrífuga da mesma coluna a 16.000 x g durante 1 min para remover todos os vestígios de tampão de lavagem antes da etapa de eluição.
- Transfira a coluna para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Pipetar 12 μL de água isenta de RNase directamente sobre a membrana da coluna de purificação. A ponta da pipeta não deve tocar a membrana. Incubar a RT durante 1 min e centrifugar a 1000 x g durante 1 min. Em seguida, continue a centrifugação a 16.000 x g por 1 min para eluir o RNA.
6. Concentração e qualidade do RNA
- Use um bioanalisador para avaliar a qualidade e a quantidade do RNA10 extraído.
7. Armazenamento e análise posterior
- Armazene o RNA a -80 °C (até 1 ano) até uma análise mais aprofundada (por exemplo, microarray, PCR quantitativa (qPCR) e RNA-seq, etc.).
NOTA: Para obter detalhes da análise de qPCR, incluindo a síntese de cDNA, consulte Lyu et al.11. Os primers para qPCR estão listados na Tabela de Materiais.
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Representative Results
O rato Gli1-CreERT2 (Jackson Lab Stock Number: 007913) foi cruzado pela primeira vez com o rato repórter NuTRAP (Jackson Lab Stock Number: 029899) para gerar ratos com dupla mutação. Camundongos portadores de ambos os alelos genéticos geneticamente modificados (ou seja, Gli1-CreERT2 e NuTRAP) foram injetados com tamoxifeno uma vez por dia, a cada dois dias, para três injeções. As amostras de tecido foram coletadas no 7º dia após o1º dia da injeção. A análise de imunofluorescência mostrou que o EGFP foi expresso em células intersticiais nos testículos (Figura 1). Sabe-se que a cápsula da glândula adrenal é outra população celular positiva de Gli112,13. EGFP também foi encontrado em células capsulares adrenais em Gli1-CreERT2; Camundongos NuTRAP (Figura 1). Nosso laboratório também carrega Shh-CreERT2; Ratos NuTRAP. Note que em Shh-CreERT2; Camundongos NuTRAP, a população de células EGFP+ reside no córtex externo da glândula adrenal sob a cápsula (Figura 1), o mesmo local de expressão das células EGFP+ na área Shh+ na glândula adrenal13 confirmando a expressão de EGFP em células que expressam Cre.
Após a extração dos RNAs específicos do tipo celular, a quantidade e a qualidade dos RNAs isolados em cada fração a partir de duas extrações independentes (um testículo utilizado em cada extração) foram avaliadas por meio de um bioanalisador (Figura 2). O resultado do bioanalisador indicou que este protocolo é capaz de obter RNAs de alta qualidade de todas as três frações. Todas as frações tinham um Número de Integridade de RNA (RIN) semelhante.
Para testar ainda mais se o RNA extraído é específico do tipo de célula, o RNA extraído foi enviado para análise de microarray usando um serviço comercial de microarray (consulte Tabela de Materiais). O resultado do microarray mostrou que cerca de 4.000 genes foram enriquecidos na fração positiva em comparação com a fração negativa, enquanto cerca de 3.000 genes foram enriquecidos na fração negativa (Figura 3). Dentre esses genes diferencialmente expressos, os genes associados às células de Leydig Hsd11b1 e Hsd3b6 14,15 foram enriquecidos na fração positiva. Na fração negativa, os genes associados às células de Sertoli Dhh e Gstm616,17 foram enriquecidos. Apenas alguns genes diferencialmente expressos foram identificados quando se comparou a fração negativa com a entrada.
A RT-PCR quantitativa em tempo real (qPCR) também foi utilizada para confirmar a expressão de genes-chave na fração positiva e na fração negativa. Semelhante ao que foi encontrado no ensaio de microarray, as enzimas esteroidogênicas 3β-hidroxiesteroide desidrogenase (codificada por Hsd3b) e a enzima de clivagem de cadeia lateral do colesterol (codificada pela Cyp11a1) foram enriquecidas na fração positiva. Já o marcador de células de Sertoli Sox9 (SRY-box Transcription Factor 9) e o marcador de células germinativas Sycp3 (Synaptonemal Complex Protein 3) foram enriquecidos na fração negativa (Figura 4). Juntos, esses dados demonstraram que os transcriptomas nas células Gli1+ foram puxados com sucesso para baixo e enriquecidos pelo protocolo acima.
Figura 1: Imagens de imunofluorescência da expressão do EGFP em modelos de camundongos repórteres NuTRAP. O Gli1-CreERT2; NuTRAP e o Shh-CreERT2; Camundongos NuTRAP foram tratados com tamoxifeno para ativar a expressão do EGFP. No testículo, as células Gli1+ estavam no interstício, enquanto na glândula adrenal, as células Gli1+ estavam na cápsula adrenal. Na glândula adrenal, as células abaixo da cápsula foram positivas para SHH (células EGFP+ em Shh-CreERT2; Ratos NuTRAP). SHH é o ligante da via de sinalização SHH que provoca sua função nas células capsulares Gli1+ 13. Barras de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Qualidade e quantidade de RNA da extração do TRAP. Os RNAs da fração positiva, da fração negativa e da entrada foram avaliados por meio de um bioanalisador. A fração positiva contém RNAs extraídos de esferas de proteína G após a incubação com o anticorpo GFP (etapa 4.1). A fração negativa contém RNAs que permanecem no sobrenadante na etapa 4.2. A entrada contém RNAs do homogeneizado (etapa 3.3). No eletroferograma, como as concentrações do marcador inferior (exibido como o primeiro pico em 20-25 s do tempo de migração das amostras mostradas no eixo X) e da escada (não mostrada nesses eletroferogramas) são conhecidas, a concentração de cada amostra pode ser calculada. Os dois principais picos em 40-50 s representam o rRNA 18S e 28S. A razão ribossomal (com base na intensidade de fluorescência mostrada no eixo Y) é usada para determinar a integridade da amostra de RNA. O Número de Integridade de RNA (RIN) de cada amostra é mostrado no canto superior direito de cada gráfico. Cada ponto no gráfico de pontos representa a quantidade de RNA que foi extraída de um único testículo. A quantidade de RNA de cada amostra na fração negativa e a entrada foram extraídas de 25 μL de amostras. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise de microarray para amostras TRAP. Os resultados de duas extrações (um testículo cada) são mostrados. A análise de microarray identificou um número semelhante de genes diferencialmente expressos de duas extrações independentes (Testis A e Testis B). Cerca de 4.000 genes foram enriquecidos (pontos vermelhos) na fração positiva, enquanto ~ 3.000 genes foram enriquecidos (pontos verdes) na fração negativa. Hsd11b1 e Hsd3b6 foram enriquecidos em frações positivas. Dhh e Gstm6 foram enriquecidos em frações negativas. Apenas alguns genes foram identificados como genes diferencialmente expressos entre a fração negativa e a entrada, sugerindo que o testículo contém apenas um número muito pequeno de células Gli1+ . Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise qPCR para amostras TRAP. A análise de qPCR mostrou a expressão relativa de genes específicos do tipo celular na fração positiva e na fração negativa. A expressão de cada gene foi primeiramente normalizada com Actb. As expressões relativas dos genes dentro da fração positiva foram então calculadas com base na expressão de Sox9 (definida como 10). Para a fração negativa, Cyp11a1 (definido como 10) foi usado para normalizar a expressão relativa. Note que a expressão relativa de genes-alvo só pode ser comparada dentro de cada fração. Os genes que codificam as enzimas esteroidogênicas (Hsd3b e Cyp11a1) foram enriquecidos na fração positiva. Considerando que o gene marcador para células germinativas (Scyp3) e células de Sertoli (Sox9), foram enriquecidos na fração negativa. Três repetições biológicas (três extrações independentes, um testículo cada) foram mostradas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A utilidade da análise do transcriptoma de todo o tecido pode ser atenuada, especialmente quando se estuda tecidos heterogêneos complexos. Como obter RNAs específicos do tipo celular torna-se uma necessidade urgente para liberar a poderosa técnica de RNA-seq. O isolamento de RNAs específicos do tipo celular geralmente depende da coleta de um tipo específico de células usando micromanipulação, classificação celular ativada por fluorescência (FACS) ou microdissecção por captura a laser (LCM)18. Outros métodos e instrumentos modernos de coleta de célula única de alto rendimento também foram desenvolvidos19. Esses métodos geralmente empregam as técnicas de microfluídica para codificar células únicas, seguidas de RNA-seq de célula única. A dissociação celular é a etapa necessária para obter a solução de célula suspensa, que então passará por um classificador de células ou um dispositivo microfluídico para codificar cada célula. A etapa de dissociação celular introduz desafios a esses métodos para estudos específicos do tipo celular, pois o tratamento enzimático não apenas decompõe tecidos, mas também afeta a viabilidade celular e os perfis transcricionais20. Além disso, a despesa com RNA-seq de célula única geralmente é alta e requer equipamentos especializados no local.
Recentemente, dois estudos isolaram com sucesso o RNA/DNA de tipos celulares específicos de tecidos inteiros utilizando camundongos NuTRAP 8,21. Sem o uso de equipamentos e ferramentas específicas, o modelo de camundongo NuTRAP permite a obtenção de RNAs e DNAs de tipos específicos de células. O alelo NuTRAP poderia atingir células que expressam Cre sem a etapa de dissociação celular, evitando alterar a viabilidade da célula e os perfis transcricionais. Rol et al. usaram o modelo de camundongo NuTRAP para isolar núcleos e traduzir mRNA simultaneamente do tecido adiposo. O outro estudo também demonstrou que o modelo de camundongo NuTRAP poderia funcionar para células gliais no sistema nervoso central8.
Em nosso laboratório, estamos interessados em estudar as populações de células-tronco em tecidos esteroidogênicos, como células intersticiais Gli1+ no testículo22 e células capsulares Gli1+ na glândula adrenal13. O desafio de estudar as células Gli1+ nesses dois órgãos é que o número de células Gli1+ no testículo e na glândula adrenal é pequeno. Por exemplo, a proporção de células de Leydig, que são a maior população de células Gli1+ no testículo, ocupa apenas cerca de 3,8% do volume total do testículo em camundongos adultos23. Como a técnica TRAP visa puxar especificamente para baixo a tradução de RNAs ligados a ribossomos em tecidos complexos, o modelo de camundongo NuTRAP pode ser uma ferramenta poderosa adequada para estudar uma população celular rara em um tecido complexo. Os protocolos publicados anteriormente usando camundongos NuTRAP têm como alvo adipócitos e células gliais que são mais abundantes no cérebro e no tecido adiposo em comparação com as células Gli1+ no testículo e na glândula adrenal. Para garantir a obtenção de RNAs necessários de um pequeno número de células em um tecido complexo, revisamos os protocolos existentes em (1) aumentando o tempo de incubação com o anticorpo GFP de 1 h para a noite; (2) utilizando outro tipo de kit de extração de RNA que visa isolar uma pequena quantidade de RNA em nível de picograma.
Demonstramos que este protocolo poderia obter RNAs específicos de tipo celular de alta qualidade a partir de um pequeno número de células em um tecido complexo. A qualidade e a quantidade de RNAs extraídos são capazes de qPCR e um serviço comercial de microarray. Os resultados do microarray e da qPCR confirmaram que os genes associados às células de Leydig são enriquecidos na fração positiva proveniente de um testículo. O protocolo aqui fornece uma abordagem detalhada para isolar mRNAs de ribossomo de tradução específicos do tipo de célula usando o modelo de camundongo NuTRAP . Este protocolo também pode ser usado para isolar RNAs de quaisquer células que expressem EGFP.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo NIH R00HD082686. Agradecemos à Endocrine Society Summer Research Fellowship a H.S.Z. Também agradecemos ao Dr. Yuan Kang por criar e manter a colônia de ratos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
References
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).
- Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).
- Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Varjosalo, M., Taipale, J. Hedgehog: functions and mechanisms. Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , Application Note 1 1-8 (2004).
- Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
- King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
- Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
- Benton, L., Shan, L. -X., Hardy, M. P. Differentiation of adult Leydig cells. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).
- Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
- Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
- Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481 (2009).
- Gross, A., et al. Technologies for single-cell isolation. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
- Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).
