Summary
Этот протокол направлен на изоляцию специфических для клеточного типа транслирующих рибосомных мРНК с использованием мышиной модели NuTRAP.
Abstract
Клеточная гетерогенность создает проблемы для понимания функции сложных тканей на уровне транскриптома. Использование специфических для клеточного типа РНК позволяет избежать потенциальных ловушек, вызванных неоднородностью тканей, и высвобождает мощный анализ транскриптома. Протокол, описанный здесь, демонстрирует, как использовать метод трансляционной рибосомной аффинной очистки (TRAP) для выделения рибосомно-связанных РНК из небольшого количества EGFP-экспрессирующих клеток в сложной ткани без сортировки клеток. Этот протокол подходит для выделения специфических для клеток РНК с использованием недавно доступной мышиной модели NuTRAP , а также может быть использован для выделения РНК из любых EGFP-экспрессирующих клеток.
Introduction
Высокопроизводительные подходы, включая секвенирование РНК (RNA-seq) и микрочипы, позволили исследовать профили экспрессии генов на уровне всего генома. Для сложных тканей, таких как сердце, мозг и яичко, специфические для клеточного типа данные предоставят более подробную информацию, сравнивающую использование РНК из всей ткани 1,2,3. Чтобы преодолеть влияние клеточной гетерогенности, с начала 2010-х годов был разработан метод трансляционной рибосомной аффинной очистки (TRAP)4. TRAP способен изолировать рибосомно-связанные РНК из определенных типов клеток без диссоциации тканей. Этот метод был использован для анализа транслейлома (мРНК, которые набираются в рибосому для трансляции) в различных организмах, включая нацеливание на чрезвычайно редкую популяцию мышечных клеток в эмбрионах дрозофилы5, изучение различных корневых клеток в модельном растении Arabidopsis thaliana6 и выполнение транскриптомного анализа эндотелиальных клеток у млекопитающих7.
TRAP требует генетической модификации для маркировки рибосомы модельного организма. Эван Розен и его коллеги недавно разработали модель мыши под названием Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse8, которая доступна через Лабораторию Джексона с 2017 года. Пересекаясь с линией мыши Cre, исследователи могут использовать эту модель мыши NuTRAP для выделения рибосомных РНК и клеточных ядер из Cre-экспрессирующих клеток без сортировки клеток. В cre-экспрессирующих клетках, которые также несут аллель NuTRAP , рибосома с меткой EGFP / L10a позволяет изолировать транслирующие мРНК с использованием аффинных вытягивающих анализов. В той же клетке ядерная мембрана, помеченная пептидом распознавания биотин-лигазы (BLRP), которая также является mCherry положительной, позволяет ядерную изоляцию с использованием аффинной или флуоресцентной очистки. Та же исследовательская группа также создала аналогичную линию мышей, в которой ядерная мембрана помечена только mCherry без биотина8. Эти две генетически модифицированные линии мыши дают доступ к характеристике парных эпигеномных и транскриптомных профилей конкретных типов клеток, представляющих интерес.
Сигнальный путь ежа (Hh) играет решающую роль в развитии тканей9. GLI1, член семейства GLI, действует как транскрипционный активатор и опосредует передачу сигналов Hh. Клетки Gli1+ можно найти во многих гормон-секретирующих органах, включая надпочечники и яичко. Чтобы изолировать специфические для клеток ДНК и РНК из клеток Gli1+ с использованием мышиной модели NuTRAP , мышей Gli1-CreERT2 скрещивали с мышами NuTRAP . Мышей Shh-CreERT2 также скрещивали с мышами NuTRAP с целью выделения клеток, экспрессирующих звукового ежа (Shh). Следующий протокол показывает, как использовать Gli1-CreERT2; Мыши NuTRAP для выделения рибосомно-связанных РНК из клеток Gli1+ во взрослых мышах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все проведенные эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Обернском университете.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол использует одно яичко (около 100 мг) при P28 от Gli1-CreERT2; Мыши NuTRAP (Mus musculus). Объемы реагентов, возможно, потребуется скорректировать в зависимости от типов образцов и количества тканей.
1. Сбор тканей
- Усыпляют мышей с помощью камеры CO2 , дезинфицируют поверхность брюшка 70% этанолом.
- Откройте нижнюю часть живота ножницами и удалите яички. Используйте жидкий азот (LN2), чтобы немедленно заморозить яички.
- Храните образцы в паровой фазе LN2 до использования.
2. Подготовка реагентов и бисера
- Приготовьте раствор для гомогенизации: добавьте 50 мМ Tris (рН 7,4), 12 мМ MgCl2, 100 мМ KCl, 1% NP-40 и 1 мг/мл гепарина. Хранить раствор при 4 °C до использования (до 1 месяца).
- Подготавливают рабочий буфер гомогенизации из исходного раствора (стадия 2.1) сразу перед применением: добавляют ДТТ (конечная концентрация: 1 мМ), циклогексимид (конечная концентрация: 100 мкг/мл), рекомбинантную рибонуклеазу (конечная концентрация: 200 единиц/мл) и коктейль ингибитора протеазы (конечная концентрация: 1x) в раствор для гомогенизации, чтобы сделать необходимое количество рабочего буфера гомогенизации. Храните свежеприготовленный рабочий буфер на льду до использования.
- Приготовьте буферы для промывки с низким содержанием соли и высоким содержанием соли:
- Для приготовления низкосолевой промывки смеют буферную смесь 50 мМ Tris (рН 7,4), 12 мМMgCl2, 100 мМ KCl и 1% NP-40. Перед использованием добавляют DTT (конечная концентрация: 1 мМ) и циклогексимид (конечная концентрация: 100 мкг/мл).
- Для приготовления высокосолевой промывочной буферной смеси 50 мМ Tris (рН 7,4), 12 мМMgCl2, 300 мМ KCl, 1% NP-40. Перед использованием добавляют DTT (конечная концентрация: 2 мМ) и циклогексимид (конечная концентрация: 100 мкг/мл).
- Приготовьте белковые шарики G (Таблица материалов):
- Для каждого образца потребуется 50 мкл белковых шариков G. Поместите необходимое количество бусин в центрифужную трубку объемом 1,5 мл и отделите бусины от раствора с помощью магнитной стойки, оставив трубку на стойке на 30-60 с.
- Удалите супернатант путем пипетирования. Вымойте бусины три раза с 1 мл ледяного буфера для промывки с низким содержанием соли каждый раз.
3. Лизис и гомогенизация тканей
- Добавьте 2 мл рабочего буфера гомогенизации ледяного холода (свежеприготовленного на этапе 2.2) в комплект измельчителя стеклянной ткани. Быстро поместите замороженный образец в мясорубку и гомогенизируйте ткань 30 ударами по льду с помощью рыхлого пестика.
- Переложите гомогенат в трубку круглого дна объемом 2 мл и центрифугу при 12 000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
- Перенесите супернатант в новую трубку объемом 2 мл. Сохраните 100 мкл в трубке 1,5 мл в качестве «входа».
- Инкубировать супернатант в трубке 2 мл с антителом против GFP (5 мкг/мл; 1:400) при 4 °C на торцевом ротаторе (24 об/мин) в течение ночи.
4. Иммунопреципитация
- Перенесите смесь гомогената/антитела в новую трубку круглого дна объемом 2 мл, содержащую промытые белковые шарики G со стадии 2.4. Инкубировать при 4 °C на торцевом ротаторе (24 об/мин) в течение 2 ч.
- Отделите магнитные шарики от супернатанта с помощью магнитной стойки. Сохраните супернатант как «отрицательную фракцию». Отрицательная фракция содержит (1) РНК в EGFP-отрицательных клетках и (2) РНК в EGFP-положительных клетках, которые не связаны с рибосомами.
- Добавьте 1 мл буфера для промывки с высоким содержанием соли в бусины и ненадолго вихрете трубку, чтобы промыть бусины. Поместите трубку в магнитную стойку.
- Снимите буфер стирки. Повторите этап стирки еще два раза. Бусины теперь содержат комплекс бусин-рибосома-РНК из EGFP-положительных клеток.
5. Экстракция РНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги адаптированы из комплекта изоляции РНК (Таблица материалов). Рассматривайте каждую фракцию (т.е. входную, положительную и отрицательную) как независимую выборку и независимо изолируйте РНК.
- Инкубируйте шарики со стадии 4.4 с 50 мкл экстракционного буфера (из комплекта изоляции РНК) в термомиксоре (42 °C, 500 об/мин) в течение 30 мин для высвобождения РНК из шариков.
- Отделите бусины с помощью магнитной стойки, перенесите супернатант, который содержит комплекс шарики-рибосома-РНК, в трубку объемом 1,5 мл.
- Центрифугируйте трубку при 3000 х г в течение 2 мин, затем пипетку супернатанта в новую трубку объемом 1,5 мл. Эта трубка содержит «положительную фракцию» стадии TRAP.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для входных и отрицательных фракций извлекайте РНК из 25 мкл образцов, используя 1 мл экстракционного буфера. Инкубировать в термомикшере (42 °C, 500 об/мин) в течение 30 мин. - Предварительно обусловите колонну очистки РНК: Пипетку 250 мкл кондиционирующего буфера на колонну очистки. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Центрифугировать колонну при 16 000 х г в течение 1 мин.
- Пипетировать равный объем 70% EtOH в супернатант со стадии 5.3 (около 50 мкл 70% EtOH для положительной фракции и 1 мл 70% EtOH для входных и отрицательных фракций). Хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз.
- Пипетка смеси в колонну с этапа 5.4.
- Центрифугируют колонну при 100 х г в течение 2 мин, чтобы обеспечить связывание РНК с мембраной в колонке, затем продолжают центрифугу при 16 000 х г в течение 30 с немедленно. Отбросьте сквозной поток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для входных и отрицательных фракций каждый раз добавляйте в колонку 250 мкл смеси. Повторяйте шаги 5.6 и 5.7 до тех пор, пока не будут использованы все смеси. - Пипетка 100 мкл Wash Buffer 1 (W1) в колонну и центрифугу при 8 000 х г в течение 1 мин. Отбросьте сквозной поток.
- Пипетку 75 мкл раствора ДНКазы смешивают непосредственно с мембраной очистительной колонны. Инкубировать в RT в течение 15 мин.
- Пипетка 40 мкл W1 в колонну и центрифугу при 8 000 х г в течение 30 с. Отбросьте сквозной поток.
- Пипетка 100 мкл Wash Buffer 2 (W2) в колонну и центрифугу при 8 000 х г в течение 1 мин. Отбросьте сквозной поток.
- Пипетка 100 мкл W2 в колонну и центрифугу при 16 000 х г в течение 2 мин. Отбросьте сквозной поток. Повторно центрифугируйте ту же колонну при 16 000 х г в течение 1 мин, чтобы удалить все следы промывочного буфера до стадии элюирования.
- Перенесите колонку в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
- Пипетка 12 мкл рваазной воды непосредственно на мембрану очистительной колонны. Наконечник пипетки не должен касаться мембраны. Инкубировать на RT в течение 1 мин и центрифугу при 1000 х г в течение 1 мин. Затем продолжают центрифугирование при 16 000 х г в течение 1 мин для элюирования РНК.
6. Концентрация и качество РНК
- Используйте биоанализатор для оценки качества и количества экстрагированной РНК10.
7. Хранение и дальнейший анализ
- Храните РНК при -80 °C (до 1 года) до дальнейшего анализа (например, микрочип, количественная ПЦР (qPCR) и РНК-seq и т. Д.).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации об анализе qPCR, включая синтез кДНК, обратитесь к Lyu et al.11. Грунтовки для qPCR перечислены в Таблице материалов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мыши Gli1-CreERT2 (Jackson Lab Stock Number: 007913) были впервые скрещены с мышью-репортером NuTRAP (Jackson Lab Stock Number: 029899) для генерации двухмутантных мышей. Мышам, несущим оба генно-инженерных аллеля генов (то есть Gli1-CreERT2 и NuTRAP), вводили тамоксифен один раз в день, через день, в течение трех инъекций. Образцы тканей собирали на7-й день после1-го дня инъекции. Иммунофлуоресцентный анализ показал, что EGFP экспрессировался в интерстициальных клетках в яичках (рисунок 1). Известно, что капсула надпочечников является еще одной клеточной популяцией, положительной на Gli1 12,13. EGFP также был обнаружен в капсульных клетках надпочечников в Gli1-CreERT2; Мыши NuTRAP (рисунок 1). Наша лаборатория также имеет Shh-CreERT2; Мыши NuTRAP. Обратите внимание, что в Shh-CreERT2; Мыши NuTRAP, клеточная популяция EGFP+, находится во внешней коре надпочечников под капсулой (рисунок 1), том же месте экспрессии клеток EGFP+ в области Shh+ в надпочечнике13, подтверждающем экспрессию EGFP в Cre-экспрессирующих клетках.
После экстракции специфических для клеточного типа РНК количество и качество выделенных РНК в каждой фракции из двух независимых экстракций (одно яичко, используемое в каждой экстракции) оценивали с помощью биоанализатора (рисунок 2). Результат биоанализатора показал, что этот протокол способен получать высококачественные РНК из всех трех фракций. Все фракции имели одинаковое число целостности РНК (RIN).
Для дальнейшей проверки того, является ли извлеченная РНК специфичной для клеточного типа, экстрагированную РНК отправили на анализ микрочипов с использованием коммерческого сервиса микрочипов (см. Таблицу материалов). Результат микрочипа показал, что около 4000 генов были обогащены положительной фракцией по сравнению с отрицательной фракцией, тогда как около 3000 генов были обогащены отрицательной фракцией (рисунок 3). Среди этих дифференциально экспрессированных генов лейдиг-клеточно-ассоциированные гены Hsd11b1 и Hsd3b614,15 были обогащены положительной фракцией. В отрицательной фракции были обогащены сероли-клеточно-ассоциированные гены Dhh и Gstm6 16,17. Только несколько дифференциально экспрессированных генов были идентифицированы при сравнении отрицательной фракции с входом.
Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени (qPCR) также использовалась для подтверждения экспрессии ключевых генов в положительной и отрицательной фракциях. Подобно тому, что было обнаружено в анализе микрочипов, стероидогенные ферменты 3β-гидроксистероиддегидрогеназа (кодируемые Hsd3b) и фермент расщепления боковой цепи холестерина (кодируемый Cyp11a1) были обогащены положительной фракцией. В то время как клеточный маркер Сертоли Sox9 (SRY-box Transcription Factor 9) и маркер зародышевых клеток Sycp3 (Synaptonemal Complex Protein 3) были обогащены отрицательной фракцией (Рисунок 4). Вместе эти данные продемонстрировали, что транскриптомы в клетках Gli1+ были успешно удалены и обогащены вышеуказанным протоколом.
Рисунок 1: Иммунофлуоресцентные изображения экспрессии EGFP в моделях мыши-репортеров NuTRAP . Gli1-CreERT2; NuTRAP и Shh-CreERT2; Мышей NuTRAP лечили тамоксифеном для активации экспрессии EGFP. В яичке клетки Gli1+ находились в интерстиции, тогда как в надпочечниках клетки Gli1+ находились в капсуле надпочечников. В надпочечниках клетки под капсулой были положительными на SHH (клетки EGFP+ в Shh-CreERT2; Мыши NuTRAP ). SHH является лигандом сигнального пути SHH, который вызывает свою функцию в капсульных клетках Gli1+ 13. Шкала: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Качество и количество РНК от экстракции TRAP. РНК положительной фракции, отрицательной фракции и входных данных оценивали с помощью биоанализатора. Положительная фракция содержит РНК, извлеченные из белковых шариков G после инкубации с антителом GFP (этап 4.1). Отрицательная фракция содержит РНК, которые остаются в супернатанте на шаге 4.2. Входные данные содержат РНК из гомогената (шаг 3.3). В электроферограмме, поскольку известны концентрации нижнего маркера (отображаемого как первый пик на 20-25 с времени миграции образцов, показанных на оси X) и лестницы (не показанной в этих электроферограммах), концентрация каждого образца может быть рассчитана. Два основных пика в 40-50 с представляют рРНК 18S и 28S. Рибосомное соотношение (основанное на интенсивности флуоресценции, показанной на оси Y) используется для определения целостности образца РНК. Номер целостности РНК (RIN) каждого образца показан в правом верхнем углу каждого участка. Каждая точка на точечном графике представляет количество РНК, которое было извлечено из одного единственного яичка. Количество РНК каждого образца в отрицательной фракции и входе извлекали из 25 мкл образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Анализ микрочипов для образцов TRAP. Показаны результаты двух извлечений (по одному тесту в каждом). Анализ микрочипов выявил аналогичное количество дифференциально экспрессированных генов из двух независимых экстракций (Testis A и Testis B). Около 4000 генов были обогащены (красные точки) в положительной фракции, тогда как ~ 3000 генов были обогащены (зеленые точки) в отрицательной фракции. Hsd11b1 и Hsd3b6 были обогащены положительными фракциями. Dhh и Gstm6 были обогащены отрицательными фракциями. Только несколько генов были идентифицированы как дифференциально экспрессированные гены между отрицательной фракцией и входом, предполагая, что яичко содержит только очень небольшое количество клеток Gli1 + . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: анализ qPCR для образцов TRAP. Анализ qPCR показал относительную экспрессию специфических для клеточного типа генов в положительной и отрицательной фракциях. Экспрессия каждого гена была впервые нормализована с помощью Actb. Относительные экспрессии генов в пределах положительной фракции были затем рассчитаны на основе экспрессии Sox9 (установлено как 10). Для отрицательной дроби для нормализации относительного выражения использовался Cyp11a1 (заданный как 10). Обратите внимание, что относительную экспрессию генов-мишеней можно сравнить только внутри каждой фракции. Гены, кодирующие стероидогенные ферменты (Hsd3b и Cyp11a1), были обогащены положительной фракцией. Тогда как ген маркера для половых клеток (Scyp3) и клеток Сертоли (Sox9) были обогащены отрицательной фракцией. Были показаны три биологические реплики (три независимых экстракции, по одному яичку в каждом). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Полезность анализа транскриптома всей ткани может быть ослаблена, особенно при изучении сложных гетерогенных тканей. Как получить специфические для клеток РНК становится насущной необходимостью для высвобождения мощной техники РНК-seq. Выделение специфических для клеток РНК обычно основывается на сборе определенного типа клеток с использованием микроманипуляции, флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) или микродиссекции лазерного захвата (LCM)18. Другие современные высокопроизводительные одноклеточные методы сбора и инструменты также были разработаны19. Эти методы обычно используют методы микрофлюидики для штрих-кодирования отдельных клеток, за которыми следует одноклеточные РНК-seq. Диссоциация клеток является необходимым этапом для получения взвешенного клеточного раствора, который затем пройдет либо через сортировщик клеток, либо через микрофлюидное устройство для штрих-кодирования каждой ячейки. Этап диссоциации клеток создает проблемы для этих методов для специфических для клеточного типа исследований, поскольку ферментативное лечение не только разрушает ткани, но и влияет на жизнеспособность клеток и транскрипционные профили20. Кроме того, затраты на одноклеточные РНК-seq обычно высоки и требуют специализированного оборудования на месте.
Недавно два исследования успешно выделили РНК / ДНК определенных типов клеток из целых тканей с использованием мышей NuTRAP 8,21. Без использования специального оборудования и инструментов мышиная модель NuTRAP позволяет получать РНК и ДНК из конкретных типов клеток. Аллель NuTRAP может нацеливаться на Cre-экспрессирующие клетки без стадии диссоциации клеток, избегая изменения жизнеспособности клетки и транскрипционных профилей. Rol et al. использовали мышиную модель NuTRAP для выделения ядер и одновременной трансляции мРНК из жировой ткани. Другое исследование также продемонстрировало, что мышиная модель NuTRAP может работать для глиальных клеток в центральной нервной системе8.
В нашей лаборатории мы заинтересованы в изучении популяций стволовых клеток в стероидогенных тканях, таких как интерстициальные клетки Gli1+ в яичке22 и капсулярные клетки Gli1+ в надпочечниках13. Проблема изучения клеток Gli1 + в этих двух органах заключается в том, что количество клеток Gli1 + в яичке и надпочечниках невелико. Например, доля клеток Лейдига, которые являются основной популяцией клеток Gli1+ в яичке, занимает всего около 3,8% от общего объема яичка у взрослых мышей23. Поскольку метод TRAP направлен на то, чтобы специально снижать трансляцию рибосомно-связанных РНК в сложной ткани, мышиная модель NuTRAP может быть мощным инструментом, подходящим для изучения редкой клеточной популяции в сложной ткани. Ранее опубликованные протоколы с использованием мышей NuTRAP нацелены на адипоциты и глиальные клетки, которые более распространены в мозге и жировой ткани по сравнению с клетками Gli1 + в яичке и в надпочечниках. Чтобы обеспечить получение необходимых РНК из небольшого количества клеток в сложной ткани, мы пересмотрели существующие протоколы путем (1) увеличения времени инкубации с антителом GFP с 1 ч до ночи; (2) использование другого типа набора для экстракции РНК, целью которого является выделение небольшого количества РНК на уровне пикограммы.
Мы продемонстрировали, что этот протокол может получать высококачественные РНК, специфичные для клеточного типа, из небольшого количества клеток в сложной ткани. Качество и количество извлеченных РНК способны к qPCR и коммерческому сервису микрочипов. Результаты микрочипов и qPCR подтвердили, что гены, связанные с клетками Лейдига, обогащены положительной фракцией, поступающей из одного яичка. Протокол здесь предоставляет подробный подход к выделению специфических для клеток транслирующих рибосомных мРНК с использованием мышиной модели NuTRAP . Этот протокол также может быть использован для изоляции РНК от любых EGFP-экспрессирующих клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана NIH R00HD082686. Мы благодарим Летнюю исследовательскую стипендию Эндокринного общества H.S.Z. Мы также благодарим доктора Юань Кана за разведение и поддержание колонии мышей.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
References
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).
- Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).
- Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Varjosalo, M., Taipale, J. Hedgehog: functions and mechanisms. Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , Application Note 1 1-8 (2004).
- Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
- King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
- Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
- Benton, L., Shan, L. -X., Hardy, M. P. Differentiation of adult Leydig cells. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).
- Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
- Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
- Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481 (2009).
- Gross, A., et al. Technologies for single-cell isolation. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
- Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).
