Summary
Detta protokoll syftar till att isolera celltypspecifika översättning ribosomala mRNA med hjälp av NuTRAP-musmodellen.
Abstract
Cellulär heterogenitet innebär utmaningar för att förstå funktionen hos komplexa vävnader på transkriptomnivå. Genom att använda celltypspecifika RNA undviks potentiella fallgropar orsakade av vävnadernas heterogenitet och släpper loss den kraftfulla transkriptomanalysen. Protokollet som beskrivs här visar hur man använder metoden Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) för att isolera ribosombundna RNA från en liten mängd EGFP-uttryckande celler i en komplex vävnad utan cellsortering. Detta protokoll är lämpligt för att isolera celltypspecifika RNA med den nyligen tillgängliga NuTRAP-musmodellen och kan också användas för att isolera RNA från alla EGFP-uttryckande celler.
Introduction
Metoder med hög genomströmning, inklusive RNA-sekvensering (RNA-seq) och mikroarray, har gjort det möjligt att förhöra genuttrycksprofiler på genomomfattande nivå. För komplexa vävnader som hjärta, hjärna och testiklar kommer celltypspecifika data att ge mer information som jämför användningen av RNA från hela vävnaden 1,2,3. För att övervinna effekterna av cellulär heterogenitet har metoden Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) utvecklats sedan början av 2010-talet4. TRAP kan isolera ribosombundna RNA från specifika celltyper utan vävnadsdissociation. Denna metod har använts för translatom (mRNA som rekryteras till ribosomen för översättning) analys i olika organismer, inklusive inriktning på en extremt sällsynt population av muskelceller i Drosophila embryon5, studera olika rotceller i modellväxten Arabidopsis thaliana6 och utföra transkriptomanalys av endotelceller hos däggdjur7.
TRAP kräver en genetisk modifiering för att märka ribosomen hos en modellorganism. Evan Rosen och kollegor utvecklade nyligen en musmodell som heter Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mus8, som har varit tillgänglig via Jackson Laboratory sedan 2017. Genom att korsa med en Cre-muslinje kan forskare använda denna NuTRAP-musmodell för att isolera ribosombundna RNA och cellkärnor från Cre-uttryckande celler utan cellsortering. I Cre-uttryckande celler som också bär NuTRAP-allelen tillåter EGFP / L10a-taggad ribosom isolering av översättning av mRNA med hjälp av affinitetspulldown-analyser. I samma cell tillåter det biotinligasigenkänningspeptid (BLRP) -märkta kärnmembranet, som också är mCherry-positivt, kärnisolering genom att använda affinitets- eller fluorescensbaserad rening. Samma forskargrupp genererade också en liknande muslinje där kärnmembranet endast är märkt med mCherry utan biotin8. Dessa två genetiskt modifierade muslinjer ger tillgång till att karakterisera parade epigenomiska och transkriptomiska profiler av specifika typer av celler i intresse.
Signalvägen för igelkott (Hh) spelar en avgörande roll i vävnadsutveckling9. GLI1, en medlem av GLI-familjen, fungerar som en transkriptionell aktivator och förmedlar Hh-signaleringen. Gli1+ celler finns i många hormonutsöndrande organ, inklusive binjurarna och testiklarna. För att isolera celltypsspecifika DNA och RNA från Gli1+-celler med hjälp av NuTRAP-musmodellen korsades Gli1-CreERT2-möss med NuTRAP-mössen. Shh-CreERT2-möss korsades också med NuTRAP-mössen som syftar till att isolera sonisk igelkott (Shh) som uttrycker celler. Följande protokoll visar hur du använder Gli1-CreERT2; NuTRAP-möss för att isolera ribosombundna RNA från Gli1+-celler i vuxna mustestiklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla utförda djurförsök följde de protokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) vid Auburn University.
OBS: Följande protokoll använder en testiklar (ca 100 mg) vid P28 från Gli1-CreERT2; NuTRAP-möss (Mus musculus). Reagensvolymerna kan behöva justeras utifrån provtyperna och antalet vävnader.
1. Uppsamling av vävnader
- Avliva mössen med en CO2-kammare , sanera bukytan med 70% etanol.
- Öppna underlivet med sax och ta bort testiklarna. Använd flytande kväve (LN2) för att snabbt frysa testiklarna.
- Förvara prover i ångfasen av LN2 tills de används.
2. Reagens- och pärlberedning
- Förbered homogeniseringsstamlösningen: Tillsätt 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40 och 1 mg/ml heparin. Förvara lösningen vid 4 °C tills den används (upp till 1 månad).
- Förbered homogeniseringsarbetsbufferten från stamlösningen (steg 2.1) nyligen före användning: Tillsätt DTT (slutlig koncentration: 1 mM), cykloheximid (slutlig koncentration: 100 μg / ml), rekombinant ribonuklease (slutlig koncentration: 200 enheter / ml) och proteashämmare cocktail (slutlig koncentration: 1x) till homogeniseringsstamlösningen för att göra den önskade mängden homogeniseringsbuffert. Förvara den nyberedda arbetsbufferten på is tills den används.
- Förbered tvättbuffertarna med låg salthalt och hög salthalt:
- För att förbereda tvättbuffert med låg salthalt, blanda 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl och 1% NP-40. Tillsätt DTT (slutlig koncentration: 1 mM) och cykloheximid (slutlig koncentration: 100 μg/ml) före användning.
- För att förbereda högsalttvättbuffert blanda 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. Tillsätt DTT (slutlig koncentration: 2 mM) och cykloheximid (slutlig koncentration: 100 μg/ml) före användning.
- Förbered protein G-pärlor (materialtabell):
- Varje prov behöver 50 μL protein G-pärlor. Placera den önskade mängden pärlor i ett 1,5 ml centrifugrör och separera pärlorna från lösningen med hjälp av ett magnetiskt ställ genom att lämna röret på stället i 30-60 s.
- Ta bort supernatanten genom pipettering. Tvätta pärlorna tre gånger med 1 ml iskall tvättbuffert med låg salthalt varje gång.
3. Vävnadslys och homogenisering
- Tillsätt 2 ml iskall homogeniseringsarbetsbuffert (nyberedd från steg 2.2) till en glasvävnadskvarnsats. Placera snabbt det frusna provet i kvarnen och homogenisera vävnaden med 30 slag på is med en lös stöt.
- Överför homogenatet till ett 2 ml rundbottenrör och centrifugera vid 12 000 x g i 10 minuter vid 4 °C.
- Överför supernatanten till ett nytt 2 ml rör. Spara 100 μL till ett 1,5 ml rör som "ingång".
- Inkubera supernatanten i 2 ml-röret med anti-GFP-antikroppen (5 μg/ml; 1:400) vid 4 °C på en end-over-end-rotator (24 rpm) över natten.
4. Immunoprecipitation
- Överför homogenat/antikroppsblandningen till ett nytt 2 ml rundbottenrör som innehåller de tvättade proteinet G-pärlor från steg 2.4. Inkubera vid 4 °C på en end-over-end-rotator (24 rpm) i 2 timmar.
- Separera magnetpärlorna från supernatanten med hjälp av ett magnetställ. Spara supernatanten som den "negativa fraktionen". Den negativa fraktionen innehåller (1) RNA i EGFP-negativa celler och (2) RNA i EGFP-positiva celler som inte är bundna till ribosomer.
- Tillsätt 1 ml tvättbuffert med hög salthalt i pärlorna och virvla kort röret för att tvätta pärlorna. Placera röret i ett magnetställ.
- Ta bort tvättbufferten. Upprepa tvättsteget två gånger till. Pärlorna innehåller nu pärlor-ribosom-RNA-komplexet från EGFP-positiva celler.
5. RNA-extraktion
OBS: Följande steg är anpassade från RNA-isoleringssatsen (Materialtabell). Behandla varje fraktion (dvs. inmatad, positiv och negativ) som ett oberoende prov och isolera RNA oberoende.
- Inkubera pärlorna från steg 4.4 med 50 μL extraktionsbuffert (från RNA-isoleringssatsen) i en termomixer (42 °C, 500 rpm) i 30 minuter för att frigöra RNA från pärlor.
- Separera pärlorna med ett magnetställ, överför supernatanten som innehåller pärlor-ribosom-RNA-komplexet till ett 1,5 ml rör.
- Centrifugera röret vid 3000 x g i 2 minuter och pipettera sedan supernatanten till ett nytt 1,5 ml rör. Detta rör innehåller den "positiva fraktionen" av TRAP-steget.
OBS: För de ingående och negativa fraktionerna, extrahera RNA från 25 μL prover med användning av 1 ml extraktionsbuffert. Inkubera i en termomixer (42 °C, 500 rpm) i 30 minuter. - Förkonditionera RNA-reningskolonnen: Pipettera 250 μL konditioneringsbuffert på reningskolonnen. Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur (RT). Centrifugera kolonnen vid 16 000 x g i 1 min.
- Pipet lika stor volym av 70% EtOH i supernatanten från steg 5.3 (cirka 50 μL 70% EtOH för den positiva fraktionen och 1 ml 70% EtOH för indata och de negativa fraktionerna). Blanda väl genom att pipettera upp och ner.
- Pipettera blandningen i kolonnen från steg 5.4.
- Centrifugera kolonnen vid 100 x g i 2 minuter så att RNA binder till membranet i kolonnen och fortsätt sedan centrifugen vid 16 000 x g i 30 s omedelbart. Kasta genomströmningen.
OBS: För de ingående och negativa fraktionerna, tillsätt 250 μl av blandningen till kolonnen varje gång. Upprepa steg 5.6 och 5.7 tills alla blandningar har använts. - Pipettera 100 μl tvättbuffert 1 (W1) i kolonnen och centrifugera vid 8 000 x g i 1 min. Kasta genomströmningen.
- Pipettera över 75 μl DNas-lösningsblandning direkt i reningskolonnmembranet. Inkubera vid RT i 15 min.
- Pipettera in 40 μl W1 i kolonnen och centrifugera vid 8 000 x g i 30 s. Kasta genomströmningen.
- Pipettera in 100 μl tvättbuffert 2 (W2) i kolonnen och centrifugera vid 8 000 x g i 1 min. Kasta genomströmningen.
- Pipettera in 100 μl W2 i kolonnen och centrifugera vid 16 000 x g i 2 minuter. Kasta genomströmningen. Centrifugera om samma kolonn vid 16 000 x g i 1 min för att avlägsna alla spår av tvättbuffert före elueringssteget.
- Överför kolonnen till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Pipettera 12 μL RNasfritt vatten direkt på reningskolonnens membran. Pientspetsen ska inte röra membranet. Inkubera vid RT i 1 min och centrifugera vid 1000 x g i 1 min. Fortsätt sedan centrifugeringen vid 16 000 x g i 1 min för att eluera RNA.
6. RNA-koncentration och kvalitet
- Använd en bioanalysator för att bedöma kvaliteten och kvantiteten av det extraherade RNA10.
7. Lagring och vidare analys
- Förvara RNA vid -80 ° C (upp till 1 år) tills vidare analys (t.ex. mikroarray, kvantitativ PCR (qPCR) och RNA-seq, etc.).
OBS: För detaljer om qPCR-analysen, inklusive cDNA-syntes, se Lyu et al.11. Primers för qPCR listas i materialförteckningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gli1-CreERT2-mus (Jackson Lab Stock Number: 007913) korsades först med NuTRAP-reportermusen (Jackson Lab Stock Number: 029899) för att generera dubbelmutanta möss. Möss som bär båda genetiskt modifierade genalleler (dvs. Gli1-CreERT2 och NuTRAP) injicerades med tamoxifen en gång om dagen, varannan dag, för tre injektioner. Vävnadsprover samlades in den 7:e dagen efter injektionens 1: a dag. Immunofluorescensanalys visade att EGFP uttrycktes i interstitiella celler i testiklar (figur 1). Binjurekapseln har varit känd för att vara en annan cellpopulation positiv till Gli112,13. EGFP hittades också i binjurekapslar i Gli1-CreERT2; NuTRAP-möss (figur 1). Vårt laboratorium bär också Shh-CreERT2; NuTRAP-möss. Observera att i Shh-CreERT2; NuTRAP-möss, EGFP + -cellpopulationen finns i binjurens yttre cortex under kapseln (figur 1), samma uttrycksställe för EGFP + -celler i Shh + -området i binjuren13 som bekräftar uttrycket av EGFP i Cre-uttryckande celler.
Efter extraktionen av de celltypsspecifika RNA bedömdes kvantiteten och kvaliteten på isolerade RNA i varje fraktion från två oberoende extraktioner (en testikel som användes vid varje extraktion) med hjälp av en bioanalysator (figur 2). Bioanalyserresultatet indikerade att detta protokoll kan erhålla högkvalitativa RNA från alla tre fraktionerna. Alla fraktioner hade ett liknande RNA-integritetsnummer (RIN).
För att ytterligare testa om det extraherade RNA är celltypspecifikt skickades extraherat RNA för mikroarrayanalys med hjälp av en kommersiell mikroarraytjänst (se Materialförteckning). Mikroarrayresultatet visade att cirka 4 000 gener berikades i den positiva fraktionen jämfört med den negativa fraktionen, medan cirka 3 000 gener berikades i den negativa fraktionen (figur 3). Bland dessa differentiellt uttryckta gener berikades Leydig-cellassocierade gener Hsd11b1 och Hsd3b614,15 i den positiva fraktionen. I den negativa fraktionen berikades de Sertoli-cellassocierade generna Dhh och Gstm616,17. Endast ett fåtal differentiellt uttryckta gener identifierades när man jämförde den negativa fraktionen med ingången.
Kvantitativ RT-PCR (qPCR) i realtid användes också för att bekräfta uttrycket av nyckelgener i den positiva fraktionen och den negativa fraktionen. I likhet med vad som hittades i mikroarrayanalysen berikades steroidogena enzymer 3β-hydroxisteroiddehydrogenas (kodat av Hsd3b) och kolesterol sidokedjeklyvningsenzym (kodat av Cyp11a1) i den positiva fraktionen. Medan Sertoli-cellmarkören Sox9 (SRY-box Transkriptionsfaktor 9) och bakteriecellmarkören Sycp3 (Synaptonemal Complex Protein 3) berikades i den negativa fraktionen (Figur 4). Tillsammans visade dessa data att transkriptomerna i Gli1+ -celler framgångsrikt drogs ner och berikades av ovanstående protokoll.
Figur 1: Immunofluorescensbilder av EGFP-uttrycket i NuTRAP-reportermusmodeller. Gli1-CreERT2; NuTRAP och Shh-CreERT2; NuTRAP-möss behandlades med tamoxifen för att aktivera EGFP-uttrycket. I testiklarna var Gli1+ celler i interstitium, medan i binjurarna var Gli1+ celler i binjurekapseln. I binjurarna var cellerna under kapseln positiva av SHH (EGFP + -celler i Shh-CreERT2; NuTRAP-möss). SHH är liganden för SHH-signalvägen som framkallar dess funktion i Gli1+ kapselceller13. Skalstreck: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: RNA-kvalitet och -kvantitet från TRAP-extraktionen. RNA för den positiva fraktionen, den negativa fraktionen och ingången utvärderades med hjälp av en bioanalysator. Den positiva fraktionen innehåller RNA extraherade från protein G-pärlor efter inkubationen med GFP-antikroppen (steg 4.1). Den negativa fraktionen innehåller RNA som finns kvar i supernatanten vid steg 4.2. Tillsatsen innehåller RNA från homogenatet (steg 3.3). I elektroferogrammet, eftersom koncentrationerna av den nedre markören (visas som den första toppen vid 20-25 s av migrationstiden för prover som visas på X-axeln) och stegen (som inte visas i dessa elektroferogram) är kända, kan koncentrationen av varje prov beräknas. De två stora topparna på 40-50 s representerar 18S och 28S rRNA. Det ribosomala förhållandet (baserat på fluorescensintensiteten som visas på Y-axeln) används för att bestämma RNA-provets integritet. RNA-integritetsnumret (RIN) för varje prov visas i det övre högra hörnet av varje diagram. Varje punkt i punktdiagrammet representerar mängden RNA som extraherades från en enda testikel. Mängden RNA för varje prov i den negativa fraktionen och tillsatsen extraherades från 25 μl prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Microarray-analys för TRAP-prover. Resultat av två extraktioner (en testikel vardera) visas. Mikroarrayanalysen identifierade ett liknande antal differentiellt uttryckta gener från två oberoende extraktioner (Testis A och Testis B). Cirka 4 000 gener berikades (röda prickar) i den positiva fraktionen, medan ~ 3 000 gener berikades (gröna prickar) i den negativa fraktionen. Hsd11b1 och Hsd3b6 berikades i positiva fraktioner. Dhh och Gstm6 berikades i negativa fraktioner. Endast ett fåtal gener identifierades som differentiellt uttryckta gener mellan den negativa fraktionen och ingången, vilket tyder på att testiklarna bara innehåller ett mycket litet antal Gli1+ -celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: qPCR-analys för TRAP-prover. qPCR-analys visade det relativa uttrycket av celltypspecifika gener i den positiva fraktionen och den negativa fraktionen. Uttrycket av varje gen normaliserades först med Actb. De relativa uttrycken av gener inom den positiva fraktionen beräknades sedan baserat på uttrycket av Sox9 (satt som 10). För den negativa fraktionen användes Cyp11a1 (inställd som 10) för att normalisera det relativa uttrycket. Observera att det relativa uttrycket av målgener endast kan jämföras inom varje fraktion. Gener som kodar för de steroidogena enzymerna (Hsd3b och Cyp11a1) berikades i den positiva fraktionen. Medan markörgenen för könsceller (Scyp3) och Sertoli-celler (Sox9) berikades i den negativa fraktionen. Tre biologiska replikat (tre oberoende extraktioner, en testikel vardera) visades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användbarheten av transkriptomanalysen i hela vävnaden kan dämpas, särskilt när man studerar komplexa heterogena vävnader. Hur man erhåller celltypsspecifika RNA blir ett brådskande behov av att frigöra den kraftfulla RNA-seq-tekniken. Isoleringen av celltypspecifika RNA är vanligtvis beroende av insamling av en specifik typ av celler med hjälp av mikromanipulation, fluorescerande aktiverad cellsortering (FACS) eller laserfångningsmikrodissektion (LCM)18. Andra moderna encellsinsamlingsmetoder och instrument med hög genomströmning har också utvecklats19. Dessa metoder använder vanligtvis mikrofluidikteknikerna för att streckkoda enstaka celler följt av encells RNA-seq. Celldissociation är det nödvändiga steget för att erhålla den suspenderade celllösningen, som sedan kommer att gå igenom antingen en cellsorterare eller en mikrofluidisk anordning för att streckkoda varje cell. Celldissociationssteget introducerar utmaningar för dessa metoder för celltypspecifika studier eftersom den enzymatiska behandlingen inte bara bryter ner vävnader utan också påverkar cellviabilitet och transkriptionsprofiler20. Dessutom är kostnaden för encells RNA-seq vanligtvis hög och kräver specialutrustning på plats.
Nyligen isolerade två studier framgångsrikt RNA / DNA av specifika celltyper från hela vävnader med hjälp av NuTRAP-mössen 8,21. Utan att använda specifik utrustning och verktyg tillåter NuTRAP-musmodellen att erhålla RNA och DNA från specifika typer av celler. NuTRAP-allelen kan rikta in sig på Cre-uttryckande celler utan celldissociationssteget, vilket undviker att ändra cellens livskraft och transkriptionsprofiler. använde NuTRAP-musmodellen för att isolera kärnor och översätta mRNA samtidigt från fettvävnad. Den andra studien visade också att NuTRAP-musmodellen kunde fungera för gliaceller i centrala nervsystemet8.
I vårt laboratorium är vi intresserade av att studera stamcellspopulationerna i steroidogena vävnader såsom Gli1+ interstitiella celler i testiklarna22 och Gli1+ kapselceller i binjuren13. Utmaningen med att studera Gli1+ celler i dessa två organ är att antalet Gli1+ celler i testiklarna och binjurarna är litet. Till exempel upptar andelen Leydig-celler, som är den största populationen av Gli1+-celler i testiklarna, endast cirka 3,8% av den totala testikelvolymen hos vuxna möss23. Eftersom TRAP-tekniken syftar till att specifikt dra ner översättning av ribosombundna RNA i komplex vävnad, kan NuTRAP-musmodellen vara ett kraftfullt verktyg som är lämpligt för att studera en sällsynt cellpopulation i en komplex vävnad. De tidigare publicerade protokollen med NuTRAP-möss riktar sig mot adipocyter och gliaceller som är rikligare i hjärnan och fettvävnaden jämfört med Gli1+-celler i testiklarna och i binjurarna. För att säkerställa att erforderliga RNA erhålls från ett litet antal celler i en komplex vävnad reviderade vi de befintliga protokollen genom att (1) öka inkubationstiden med GFP-antikroppen från 1 h till över natten; (2) med hjälp av en annan typ av RNA-extraktionssats som syftar till att isolera en liten mängd RNA på pikogramnivå.
Vi visade att detta protokoll kunde erhålla högkvalitativa celltypspecifika RNA från ett litet antal celler i en komplex vävnad. Kvaliteten och kvantiteten av extraherade RNA kan för qPCR och en kommersiell mikroarraytjänst. Resultat från microarray och qPCR bekräftade att Leydig-cellassocierade gener berikas i den positiva fraktionen som kommer från en testikel. Protokollet här ger en detaljerad metod för att isolera celltypspecifika översättning av ribosom-mRNA med hjälp av NuTRAP-musmodellen . Detta protokoll kan också användas för att isolera RNA från alla EGFP-uttryckande celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av NIH R00HD082686. Vi tackar Endocrine Society Summer Research Fellowship till H.S.Z. Vi tackar också Dr. Yuan Kang för avel och underhåll av muskolonin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
References
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).
- Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).
- Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Varjosalo, M., Taipale, J. Hedgehog: functions and mechanisms. Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , Application Note 1 1-8 (2004).
- Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
- King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
- Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
- Benton, L., Shan, L. -X., Hardy, M. P. Differentiation of adult Leydig cells. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).
- Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
- Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
- Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481 (2009).
- Gross, A., et al. Technologies for single-cell isolation. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
- Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).
