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Biology

सेल सॉर्टिंग के बिना स्नैप-जमे हुए विषम ऊतक नमूनों से सेल-टाइप-विशिष्ट आरएनए को अलग करें

Published: December 8, 2021 doi: 10.3791/63143
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine, Auburn University

Summary

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य न्यूट्रैप माउस मॉडल का उपयोग करके राइबोसोमल एमआरएनए का अनुवाद करने वाले सेल-प्रकार-विशिष्ट को अलग करना है।

Abstract

सेलुलर विषमता एक प्रतिलेख स्तर पर जटिल ऊतकों के कार्य को समझने के लिए चुनौतियां पैदा करती है। सेल-प्रकार-विशिष्ट आरएनए का उपयोग ऊतकों की विविधता के कारण होने वाले संभावित नुकसान से बचाता है और शक्तिशाली ट्रांसस्क्रिप्टम विश्लेषण को उजागर करता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल दर्शाता है कि सेल सॉर्टिंग के बिना एक जटिल ऊतक में ईजीएफपी-व्यक्त कोशिकाओं की एक छोटी मात्रा से राइबोसोम-बाध्य आरएनए को अलग करने के लिए राइबोसोम-बाध्य आरएनए को अलग करने के लिए ट्रांसलेटिंग राइबोसोम एफिनिटी प्यूरीफिकेशन (ट्रैप) विधि का उपयोग कैसे किया जाए। यह प्रोटोकॉल हाल ही में उपलब्ध न्यूट्रैप माउस मॉडल का उपयोग करके सेल-प्रकार-विशिष्ट आरएनए को अलग करने के लिए उपयुक्त है और इसका उपयोग किसी भी ईजीएफपी-व्यक्त कोशिकाओं से आरएनए को अलग करने के लिए भी किया जा सकता है।

Introduction

आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सेक) और माइक्रोएरे सहित उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोण ने जीनोम-वाइड स्तर पर जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल से पूछताछ करना संभव बना दिया है। हृदय, मस्तिष्क और वृषण जैसे जटिल ऊतकों के लिए, सेल-प्रकार-विशिष्ट डेटा पूरे ऊतक 1,2,3 से आरएनए के उपयोग की तुलना में अधिक विवरण प्रदान करेगा। सेलुलर विषमता के प्रभाव को दूर करने के लिए, ट्रांसलेटिंग राइबोसोम एफिनिटी प्यूरीफिकेशन (ट्रैप) विधि 2010के दशक की शुरुआत से विकसित की गई है। ट्रैप ऊतक पृथक्करण के बिना विशिष्ट सेल प्रकारों से राइबोसोम-बाध्य आरएनए को अलग करने में सक्षम है। इस विधि का उपयोग विभिन्न जीवों में ट्रांसलेटोम (एमआरएनए जिन्हें अनुवाद के लिए राइबोसोम में भर्ती किया जा रहा है) विश्लेषण के लिए किया गया है, जिसमें ड्रोसोफिला भ्रूण5 में मांसपेशियों की कोशिकाओं की एक अत्यंत दुर्लभ आबादी को लक्षित करना, मॉडल प्लांट एराबिडोप्सिस थैलियाना6 में विभिन्न जड़ कोशिकाओं का अध्ययन करना और स्तनधारियों में एंडोथेलियल कोशिकाओं का ट्रांसस्क्रिप्टम विश्लेषण करनाशामिल है।

ट्रैप को एक मॉडल जीव के राइबोसोम को टैग करने के लिए आनुवंशिक संशोधन की आवश्यकता होती है। इवान रोसेन और उनके सहयोगियों ने हाल ही में न्यूक्लियर टैगिंग एंड ट्रांसलेटिंग राइबोसोम एफिनिटी प्यूरीफिकेशन (न्यूटीआरएपी) माउस8 नामक एक माउस मॉडल विकसित किया है, जो 2017 से जैक्सन प्रयोगशाला के माध्यम से उपलब्ध है। क्रे माउस लाइन के साथ पार करके, शोधकर्ता सेल सॉर्टिंग के बिना क्रे-व्यक्त कोशिकाओं से राइबोसोम-बाध्य आरएनए और सेल नाभिक को अलग करने के लिए इस न्यूट्रैप माउस मॉडल का उपयोग कर सकते हैं। क्रे-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में जो न्यूट्रैप एलील भी ले जाते हैं, ईजीएफपी / एल 10 ए टैग किए गए राइबोसोम आत्मीयता पुलडाउन परख का उपयोग करके एमआरएनए का अनुवाद करने के अलगाव की अनुमति देता है। उसी सेल में, बायोटिन लिगेज रिकग्निशन पेप्टाइड (बीएलआरपी) -टैग परमाणु झिल्ली, जो एमचेरी पॉजिटिव भी है, आत्मीयता- या प्रतिदीप्ति-आधारित शुद्धिकरण का उपयोग करके परमाणु अलगाव की अनुमति देता है। उसी शोध टीम ने एक समान माउस लाइन भी उत्पन्न की जिसमें परमाणु झिल्ली को बायोटिन 8 के बिना केवल एमचेरी के साथ लेबल कियागया है। ये दो आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइनें रुचि में विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के युग्मित एपिजेनोमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइल को चिह्नित करने के लिए पहुंच प्रदान करती हैं।

हेजहोग (एचएच) सिग्नलिंग मार्ग ऊतक विकास में महत्वपूर्ण भूमिकानिभाता है। GLI1, GLI परिवार का एक सदस्य, एक ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर के रूप में कार्य करता है और एचएच सिग्नलिंग की मध्यस्थता करता है। ग्लि1+ कोशिकाएं कई हार्मोन-स्रावित अंगों में पाई जा सकती हैं, जिनमें अधिवृक्क ग्रंथि और वृषण शामिल हैं। न्यूट्रैप माउस मॉडल का उपयोग करके ग्लि1+ कोशिकाओं से सेल-प्रकार-विशिष्ट डीएनए और आरएनए को अलग करने के लिए, ग्लि1-सीआरईआरटी 2 चूहों को न्यूट्रैप चूहों के साथ पार किया गया था। एसएचएच-सीआरईआरटी 2 चूहों को भी न्यूट्रैप चूहों के साथ पार किया गया था, जिसका उद्देश्य सोनिक हेजहोग (एसएचएच) व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को अलग करना था। निम्न प्रोटोकॉल दिखाता है कि Gli1-CreERT2 का उपयोग कैसे करें; वयस्क माउस वृषण में ग्लि1+ कोशिकाओं से राइबोसोम-बाध्य आरएनए को अलग करने के लिए न्यूट्रैप चूहे।

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Protocol

सभी प्रदर्शन किए गए पशु प्रयोगों ने ऑबर्न विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का पालन किया।

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल Gli1-CreERT2 से P28 पर एक वृषण (लगभग 100 मिलीग्राम) का उपयोग करता है; न्यूट्रैप चूहे (मस मस्कुलस)। अभिकर्मकों की मात्रा को नमूनों के प्रकार और ऊतकों की संख्या के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।

1. ऊतक संग्रह

  1. सीओ2 कक्ष का उपयोग करके चूहों को इच्छामृत्यु करें, 70% इथेनॉल के साथ पेट की सतह को साफ करें।
  2. कैंची से पेट के निचले हिस्से को खोलें और वृषण को हटा दें। वृषण को तुरंत स्नैप-फ्रीज करने के लिए तरल नाइट्रोजन (एलएन2) का उपयोग करें।
  3. उपयोग तक एलएन2 के वाष्प चरण में नमूने स्टोर करें।

2. अभिकर्मक और मोती तैयारी

  1. होमोजेनाइजेशन स्टॉक समाधान तैयार करें: 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40, और 1 mg/ mL हेपरिन जोड़ें। उपयोग (1 महीने तक) तक समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. उपयोग से पहले स्टॉक समाधान (चरण 2.1) से होमोजेनाइजेशन वर्किंग बफर तैयार करें: होमोजेनाइजेशन वर्किंग बफर की आवश्यक मात्रा बनाने के लिए होमोजेनाइजेशन स्टॉक समाधान में डीटीटी (अंतिम एकाग्रता: 1 एमएम), साइक्लोहेक्सिमाइड (अंतिम एकाग्रता: 100 μg / mL), पुनः संयोजक राइबोन्यूक्लिज़ (अंतिम एकाग्रता: 200 इकाइयाँ / एमएल), और प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल (अंतिम एकाग्रता: 1x) जोड़ें। उपयोग होने तक बर्फ पर ताजा तैयार काम करने वाले बफर को स्टोर करें।
  3. कम नमक और उच्च नमक धोने वाले बफर तैयार करें:
    1. कम नमक धोने वाले बफर मिश्रण को तैयार करने के लिए 50 एमएम ट्राइस (पीएच 7.4), 12 एमएम एमजीसीएल2, 100 एमएम केसीएल और 1% एनपी -40। उपयोग से पहले डीटीटी (अंतिम एकाग्रता: 1 एमएम) और साइक्लोहेक्सिमाइड (अंतिम एकाग्रता: 100 μg / mL) जोड़ें।
    2. उच्च नमक धोने वाले बफर मिश्रण को तैयार करने के लिए 50 एमएम ट्राइस (पीएच 7.4), 12 एमएम एमजीसीएल2, 300 एमएम केसीएल, 1% एनपी -40। उपयोग से पहले डीटीटी (अंतिम एकाग्रता: 2 एमएम) और साइक्लोहेक्सिमाइड (अंतिम एकाग्रता: 100 μg / mL) जोड़ें।
  4. प्रोटीन जी मोती तैयार करें (सामग्री की तालिका):
    1. प्रत्येक नमूने को प्रोटीन जी मोतियों के 50 μL की आवश्यकता होगी। 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में मोतियों की आवश्यक मात्रा रखें और ट्यूब को 30-60 सेकंड के लिए रैक पर छोड़कर चुंबकीय रैक का उपयोग करके घोल से मोतियों को अलग करें।
    2. पाइपिंग द्वारा सतह पर तैरने वाले को हटा दें। हर बार 1 एमएल बर्फ-ठंडा कम नमक धोने वाले बफर के साथ मोतियों को तीन बार धोएं।

3. ऊतक लाइसिस और समरूपीकरण

  1. ग्लास टिशू ग्राइंडर सेट में 2 एमएल बर्फ-ठंडा होमोजेनाइजेशन वर्किंग बफर (चरण 2.2 से ताजा तैयार) जोड़ें। जमे हुए नमूने को जल्दी से ग्राइंडर में रखें और ढीले मूसल का उपयोग करके बर्फ पर 30 स्ट्रोक के साथ ऊतक को समरूप करें।
  2. होमोजेनेट को 2 एमएल राउंड-बॉटम ट्यूब में स्थानांतरित करें और सेंट्रीफ्यूज को 12,000 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें।
  3. सुपरनैटेंट को एक नई 2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। "इनपुट" के रूप में 1.5 एमएल ट्यूब में 100 μL सहेजें।
  4. रात भर एंड-ओवर-एंड रोटेटर (24 आरपीएम) पर 4 डिग्री सेल्सियस पर एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी (5 μg / mL; 1: 400) के साथ 2 एमएल ट्यूब में सुपरनैटेंट को इनक्यूबेट करें।

4. इम्यूनोप्रेसिपेशन

  1. एंटीबॉडी मिश्रण को चरण 2.4 से धोए गए प्रोटीन जी मोतियों वाले एक नए 2 एमएल गोल-तल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 2 घंटे के लिए एंड-ओवर-एंड रोटेटर (24 आरपीएम) पर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. चुंबक रैक का उपयोग करके चुंबकीय मोतियों को सतह पर तैरने वाले से अलग करें। सुपरनैटेंट को "नकारात्मक अंश" के रूप में सहेजें। नकारात्मक अंश में (1) ईजीएफपी-नकारात्मक कोशिकाओं में आरएनए और (2) ईजीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं में आरएनए होते हैं जो राइबोसोम से बंधे नहीं होते हैं।
  3. मोतियों में 1 एमएल उच्च नमक धोने का बफर जोड़ें और मोतियों को धोने के लिए ट्यूब को संक्षेप में भंवर करें। ट्यूब को एक चुंबक रैक में रखें।
  4. वॉश बफर को हटा दें। धोने के चरण को दो बार दोहराएं। मोतियों में अब ईजीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं से मोती-राइबोसोम-आरएनए कॉम्प्लेक्स होता है।

5. आरएनए निष्कर्षण

नोट: निम्नलिखित चरणों को आरएनए अलगाव किट (सामग्री की तालिका) से अनुकूलित किया गया है। प्रत्येक अंश (यानी, इनपुट, सकारात्मक और नकारात्मक) को एक स्वतंत्र नमूने के रूप में मानें और आरएनए को स्वतंत्र रूप से अलग करें।

  1. चरण 4.4 से मोतियों को 50 μL एक्सट्रैक्शन बफर (आरएनए आइसोलेशन किट से) के साथ थर्मोमिक्सर (42 डिग्री सेल्सियस, 500 आरपीएम) में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें ताकि मोतियों से आरएनए जारी किया जा सके।
  2. एक चुंबक रैक के साथ मोतियों को अलग करें, सुपरनैटेंट को स्थानांतरित करें जिसमें मोती-राइबोसोम-आरएनए कॉम्प्लेक्स होता है, जिसे 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. ट्यूब को 2 मिनट के लिए 3000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, फिर सुपरनैटेंट को एक नए 1.5 एमएल ट्यूब में डालें। इस ट्यूब में ट्रैप चरण का "सकारात्मक अंश" होता है।
    नोट: इनपुट और नकारात्मक अंशों के लिए, निष्कर्षण बफर के 1 एमएल का उपयोग करके नमूने के 25 μL से आरएनए निकालें। 30 मिनट के लिए थर्मोमिक्सर (42 डिग्री सेल्सियस, 500 आरपीएम) में इनक्यूबेट करें।
  4. आरएनए शुद्धि करण कॉलम की पूर्व-शर्त: शुद्धिकरण कॉलम पर कंडीशनिंग बफर का पिपेट 250 μL। कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 1 मिनट के लिए 16,000 x g पर कॉलम को सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. चरण 5.3 से सतह पर तैरने वाले में 70% ईटीओएच की समान मात्रा (सकारात्मक अंश के लिए 70% ईटीओएच का लगभग 50 μL और इनपुट और नकारात्मक अंशों के लिए 70% ETOH का 1 एमएल)। ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह मिलाएं।
  6. चरण 5.4 से मिश्रण को स्तंभ में लिखें।
  7. कॉलम में झिल्ली से आरएनए बाइंडिंग की अनुमति देने के लिए 2 मिनट के लिए 100 x g पर कॉलम को सेंट्रीफ्यूज करें, फिर तुरंत 30 सेकंड के लिए 16,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज जारी रखें। प्रवाह के माध्यम से त्याग दें।
    नोट: इनपुट और नकारात्मक अंशों के लिए, हर बार कॉलम में मिश्रण के 250 μL जोड़ें। चरण 5.6 और 5.7 को दोहराएं जब तक कि सभी मिश्रण ों का उपयोग न किया जाए।
  8. वॉश बफर 1 (डब्ल्यू 1) के पिपेट 100 μL कॉलम में और सेंट्रीफ्यूज 1 मिनट के लिए 8,000 x g पर। प्रवाह के माध्यम से त्याग दें।
  9. डीनेस घोल के पिपेट 75 μL सीधे शुद्धि स्तंभ झिल्ली में मिश्रित होते हैं। 15 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
  10. पिपेट 40 μL W1 कॉलम में और सेंट्रीफ्यूज 30 s के लिए 8,000 x g पर। प्रवाह के माध्यम से त्याग दें।
  11. वॉश बफर 2 (डब्ल्यू 2) के पिपेट 100 μL कॉलम में और सेंट्रीफ्यूज 1 मिनट के लिए 8,000 x g पर। प्रवाह के माध्यम से त्याग दें।
  12. कॉलम में 100 μL W2 और 2 मिनट के लिए 16,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज। प्रवाह के माध्यम से त्याग दें। क्षालन चरण से पहले वॉश बफर के सभी निशान ों को हटाने के लिए 1 मिनट के लिए 16,000 x g पर उसी कॉलम को फिर से सेंट्रीफ्यूज करें।
  13. कॉलम को एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  14. पिपेट 12 μL RNase-मुक्त पानी सीधे शुद्धिकरण स्तंभ की झिल्ली पर। पिपेट टिप को झिल्ली को नहीं छूना चाहिए। आरटी पर 1 मिनट के लिए और सेंट्रीफ्यूज को 1 मिनट के लिए 1000 x g पर इनक्यूबेट करें। फिर आरएनए को हटाने के लिए 1 मिनट के लिए 16,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन जारी रखें।

6. आरएनए एकाग्रता और गुणवत्ता

  1. निकाले गए आरएनए10 की गुणवत्ता और मात्रा का आकलन करने के लिए बायोएनालाइज़र का उपयोग करें।

7. भंडारण और आगे का विश्लेषण

  1. आगे के विश्लेषण (जैसे, माइक्रोएरे, मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर), और आरएनए-सेक, आदि) तक आरएनए को -80 डिग्री सेल्सियस (1 वर्ष तक) पर स्टोर करें।
    नोट: सीडीएनए संश्लेषण सहित क्यूपीसीआर विश्लेषण के विवरण के लिए, ल्यू एट अल.11 देखें। QPCR के लिए प्राइमर सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं।

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Representative Results

ग्लि1-सीआरईआरटी 2 माउस (जैक्सन लैब स्टॉक नंबर: 007913) को पहले डबल-म्यूटेंट चूहों को उत्पन्न करने के लिए न्यूट्रैप रिपोर्टर माउस (जैक्सन लैब स्टॉक नंबर: 029899) के साथ पार किया गया था। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर जीन एलील (यानी, ग्लि1-सीआरईआरटी 2 और न्यूट्रैप) दोनों को ले जाने वाले चूहों को तीन इंजेक्शन के लिए दिन में एक बार, हर दूसरे दिन टैमोक्सीफेन के साथ इंजेक्शन दिया गया था। इंजेक्शन केपहले दिन के बाद 7वें दिन ऊतक के नमूने एकत्र किए गए थे। इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण से पता चला है कि ईजीएफपी वृषण में अंतरालीय कोशिकाओं में व्यक्त किया गया था (चित्रा 1)। अधिवृक्क ग्रंथि कैप्सूल को ग्लि112,13 के एक और सेल आबादी सकारात्मक के रूप में जाना जाता है। ईजीएफपी ग्लि1-सीआरईआरटी 2 में अधिवृक्क कैप्सुलर कोशिकाओं में भी पाया गया था; न्यूट्रैप चूहे (चित्रा 1)। हमारी प्रयोगशाला में Shh-CreERT2 भी है; न्यूट्रैप चूहे। ध्यान दें कि Shh-CreERT2 में; न्यूट्रैप चूहों, ईजीएफपी + सेल आबादी कैप्सूल (चित्रा 1) के नीचे अधिवृक्क ग्रंथि के बाहरी कॉर्टेक्स में रहती है, अधिवृक्क ग्रंथि13 में एसएचएच + क्षेत्र में ईजीएफपी + कोशिकाओं की एक ही अभिव्यक्ति साइट क्रे-व्यक्त कोशिकाओं में ईजीएफपी की अभिव्यक्ति की पुष्टि करती है।

सेल-प्रकार-विशिष्ट आरएनए के निष्कर्षण के बाद, दो स्वतंत्र निष्कर्षण (प्रत्येक निष्कर्षण में उपयोग किया जाने वाला एक वृषण) से प्रत्येक अंश में पृथक आरएनए की मात्रा और गुणवत्ता का मूल्यांकन बायोएनालाइज़र (चित्रा 2) का उपयोग करके किया गया था। बायोएनालाइज़र परिणाम ने संकेत दिया कि यह प्रोटोकॉल सभी तीन अंशों से उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए प्राप्त करने में सक्षम है। सभी अंशों में एक समान आरएनए अखंडता संख्या (आरआईएन) थी।

आगे यह जांचने के लिए कि क्या निकाला गया आरएनए सेल-प्रकार-विशिष्ट है, निकाले गए आरएनए को वाणिज्यिक माइक्रोएरे सेवा का उपयोग करके माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए भेजा गया था (सामग्री की तालिका देखें)। माइक्रोएरे परिणाम से पता चला कि नकारात्मक अंश की तुलना में सकारात्मक अंश में लगभग 4,000 जीन समृद्ध थे, जबकि नकारात्मक अंश में लगभग 3,000 जीन समृद्ध थे (चित्रा 3)। इन अलग-अलग व्यक्त जीनों में, लेडिग-सेल से जुड़े जीन एचएसडी 11 बी 1 और एचएसडी 3 बी 614,15 सकारात्मक अंश में समृद्ध थे। नकारात्मक अंश में, सर्टोली-सेल से जुड़े जीन Dhh और GSTM616,17 समृद्ध थे। इनपुट के साथ नकारात्मक अंश की तुलना करते समय केवल कुछ अलग-अलग व्यक्त जीनों की पहचान की गई थी।

वास्तविक समय मात्रात्मक आरटी-पीसीआर (क्यूपीसीआर) का उपयोग सकारात्मक अंश और नकारात्मक अंश में प्रमुख जीनों की अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए भी किया गया था। माइक्रोएरे परख में जो पाया गया था, उसके समान, स्टेरॉयडोजेनिक एंजाइम 3-हाइड्रॉक्सीस्टेरॉयड डिहाइड्रोजनेज ( एचएसडी 3 बी द्वारा एन्कोडेड) और कोलेस्ट्रॉल साइड-चेन क्लीवेज एंजाइम ( Cyp11a1 द्वारा एन्कोडेड) सकारात्मक अंश में समृद्ध थे। जबकि सर्टोली सेल मार्कर सॉक्स 9 (एसआरवाई-बॉक्स ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर 9), और जर्म सेल मार्कर एससीपी 3 (सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स प्रोटीन 3), नकारात्मक अंश (चित्रा 4) में समृद्ध थे। साथ में इन आंकड़ों से पता चला कि ग्लि1+ कोशिकाओं में ट्रांसस्क्रिप्टम को उपरोक्त प्रोटोकॉल द्वारा सफलतापूर्वक नीचे खींचा और समृद्ध किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: न्यूट्रैप रिपोर्टर माउस मॉडल में ईजीएफपी अभिव्यक्ति की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। ग्लि1-सीआरईआरटी 2; NuTRAP और Shh-CreERT2; ईजीएफपी अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए न्यूट्रैप चूहों को टैमोक्सीफेन के साथ इलाज किया गया था। वृषण में, ग्लि1+ कोशिकाएं इंटरस्टिटियम में थीं, जबकि अधिवृक्क ग्रंथि में, ग्लि1+ कोशिकाएं अधिवृक्क कैप्सूल में थीं। अधिवृक्क ग्रंथि में, कैप्सूल के नीचे की कोशिकाएं एसएचएच (ईजीएफपी + कोशिकाओं में एसएचएच-सीआरईआरटी 2 में) की सकारात्मक थीं; NuTRAP चूहे)। एसएचएच एसएचएच सिग्नलिंग मार्ग का लिगैंड है जो ग्लि1 + कैप्सुलर कोशिकाओं13 में अपना कार्य प्राप्त करता है। स्केल पट्टियाँ: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ट्रैप निष्कर्षण से आरएनए गुणवत्ता और मात्रा। सकारात्मक अंश, नकारात्मक अंश और इनपुट के आरएनए का मूल्यांकन बायोएनालाइज़र का उपयोग करके किया गया था। सकारात्मक अंश में जीएफपी एंटीबॉडी (चरण 4.1) के साथ इनक्यूबेशन के बाद प्रोटीन जी मोतियों से निकाले गए आरएनए होते हैं। नकारात्मक अंश में आरएनए होते हैं जो चरण 4.2 पर सतह पर तैरने वाले में रहते हैं। इनपुट में होमोजेनेट (चरण 3.3) से आरएनए शामिल हैं। इलेक्ट्रोफेरोग्राम में, क्योंकि निचले मार्कर की सांद्रता (एक्स-अक्ष पर दिखाए गए नमूनों के माइग्रेशन समय के 20-25 एस पर पहले शिखर के रूप में प्रदर्शित) और सीढ़ी (इन इलेक्ट्रोफेरोग्राम में नहीं दिखाया गया है) ज्ञात है, प्रत्येक नमूने की एकाग्रता की गणना की जा सकती है। 40-50 एस पर दो प्रमुख चोटियां 18 एस और 28 एस आरआरएनए का प्रतिनिधित्व करती हैं। राइबोसोमल अनुपात (वाई-अक्ष पर दिखाए गए प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर) का उपयोग आरएनए नमूने की अखंडता को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। प्रत्येक नमूने की आरएनए अखंडता संख्या (आरआईएन) प्रत्येक भूखंड के ऊपरी दाएं कोने पर दिखाई गई है। डॉट प्लॉट में प्रत्येक बिंदु आरएनए की मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है जिसे एक एकल वृषण से निकाला गया था। नकारात्मक अंश और इनपुट में प्रत्येक नमूने के आरएनए की मात्रा 25 μL नमूनों से निकाली गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ट्रैप नमूने के लिए माइक्रोएरे विश्लेषण। दो निष्कर्षण (प्रत्येक में एक वृषण) के परिणाम दिखाए गए हैं। माइक्रोएरे विश्लेषण ने दो स्वतंत्र निष्कर्षण (टेस्टिस ए और टेस्टिस बी) से अलग-अलग व्यक्त जीनों की एक समान संख्या की पहचान की। सकारात्मक अंश में लगभग 4,000 जीन समृद्ध (लाल बिंदु) थे, जबकि ~ 3,000 जीन नकारात्मक अंश में समृद्ध (हरे बिंदु) थे। Hsd11b1 और Hsd3b6 को सकारात्मक अंशों में समृद्ध किया गया था। Dhh और GSTM6 को नकारात्मक अंशों में समृद्ध किया गया था। केवल कुछ जीनों को नकारात्मक अंश और इनपुट के बीच अलग-अलग व्यक्त जीन के रूप में पहचाना गया था, यह सुझाव देते हुए कि वृषण में केवल बहुत कम संख्या में ग्लि1 + कोशिकाएं होती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: ट्रैप नमूने के लिए क्यूपीसीआर विश्लेषण। क्यूपीसीआर विश्लेषण ने सकारात्मक अंश और नकारात्मक अंश में सेल-प्रकार-विशिष्ट जीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति को दिखाया। प्रत्येक जीन की अभिव्यक्ति को पहले एक्टबी के साथ सामान्यीकृत किया गया था। सकारात्मक अंश के भीतर जीन की सापेक्ष अभिव्यक्तियों की गणना तब सॉक्स 9 (10 के रूप में सेट) की अभिव्यक्ति के आधार पर की गई थी। नकारात्मक अंश के लिए, सापेक्ष अभिव्यक्ति को सामान्य करने के लिए Cyp11a1 (10 के रूप में सेट) का उपयोग किया गया था। ध्यान दें कि लक्ष्य जीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति की तुलना केवल प्रत्येक अंश के भीतर की जा सकती है। जीन जो स्टेरॉयडोजेनिक एंजाइमों (एचएसडी 3 बी और साइप 11 ए 1) को एन्कोड करते हैं, सकारात्मक अंश में समृद्ध थे। जबकि जर्म कोशिकाओं (Scyp3) और सर्टोली कोशिकाओं (Sox9) के लिए मार्कर जीन, नकारात्मक अंश में समृद्ध थे। तीन जैविक प्रतिकृतियां (तीन स्वतंत्र निष्कर्षण, एक वृषण प्रत्येक) दिखाए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

पूरे ऊतक ट्रांसक्रिपटम विश्लेषण की उपयोगिता को कम किया जा सकता है, खासकर जब जटिल विषम ऊतकों का अध्ययन किया जाता है। सेल-प्रकार-विशिष्ट आरएनए कैसे प्राप्त करें, शक्तिशाली आरएनए-सेक तकनीक को उजागर करने के लिए एक तत्काल आवश्यकता बन जाती है। सेल-प्रकार-विशिष्ट आरएनए का अलगाव आमतौर पर माइक्रोमैनिपुलेशन, फ्लोरोसेंट-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस), या लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) 18 का उपयोग करके एक विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के संग्रह पर निर्भर करता है। अन्य आधुनिक उच्च-थ्रूपुट सिंगल-सेल संग्रह विधियों और उपकरणों कोभी विकसित किया गया है। ये विधियां आमतौर पर एकल कोशिकाओं को बारकोड करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स तकनीकों को नियोजित करती हैं, जिसके बाद एकल-कोशिका आरएनए-सेक होता है। निलंबित सेल समाधान प्राप्त करने के लिए सेल पृथक्करण आवश्यक कदम है, जो तब प्रत्येक सेल को बारकोड करने के लिए या तो सेल सॉर्टर या माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के माध्यम से जाएगा। सेल पृथक्करण चरण सेल-प्रकार-विशिष्ट अध्ययनों के लिए इन तरीकों के लिए चुनौतियों का परिचय देता है क्योंकि एंजाइमेटिक उपचार न केवल ऊतकों को तोड़ता है बल्कि सेल व्यवहार्यता और ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल20 को भी प्रभावित करता है। इसके अलावा, एकल-सेल आरएनए-सेक के लिए खर्च आमतौर पर अधिक होता है और साइट पर विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है।

हाल ही में, दो अध्ययनों ने NuTRAP चूहों 8,21 का उपयोग करके पूरे ऊतकों से विशिष्ट सेलप्रकारों के आरएनए / डीएनए को सफलतापूर्वक अलग किया। विशिष्ट उपकरणों और उपकरणों का उपयोग किए बिना, NuTRAP माउस मॉडल विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं से RNA और DNA प्राप्त करने की अनुमति देता है। न्यूट्रैप एलील सेल पृथक्करण चरण के बिना सीआरई-व्यक्त कोशिकाओं को लक्षित कर सकता है, सेल की व्यवहार्यता और ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल को बदलने से बच सकता है। रोल एट अल ने नाभिक को अलग करने और वसा ऊतक से एक साथ एमआरएनए का अनुवाद करने के लिए न्यूट्रैप माउस मॉडल का उपयोग किया। अन्य अध्ययन ने यह भी प्रदर्शित किया कि न्यूट्रैप माउस मॉडल केंद्रीय तंत्रिका तंत्र 8 में ग्लियल कोशिकाओं के लिए काम कर सकताहै।

हमारी प्रयोगशाला में, हम एड्रेनलग्रंथि 1 3 में टेस्टिस22 में ग्लि1+ इंटरस्टीशियल कोशिकाओं और ग्लि1+ कैप्सुलर कोशिकाओं जैसे स्टेरॉयडोजेनिक ऊतकों में स्टेम सेल आबादी का अध्ययन करने में रुचि रखते हैं। इन दो अंगों में ग्लि1+ कोशिकाओं का अध्ययन करने की चुनौती यह है कि वृषण और अधिवृक्क ग्रंथि में ग्लि1+ कोशिकाओं की संख्या कम है। उदाहरण के लिए, लेडिग कोशिकाओं का अनुपात, जो वृषण में ग्लि1+ कोशिकाओं की प्रमुख आबादी है, वयस्क चूहों में कुल वृषण की मात्रा का लगभग 3.8% कब्जा करलेता है। चूंकि ट्रैप तकनीक का उद्देश्य विशेष रूप से जटिल ऊतक में राइबोसोम-बाध्य आरएनए का अनुवाद करना है, इसलिए न्यूट्रैप माउस मॉडल एक जटिल ऊतक में दुर्लभ कोशिका आबादी का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है। न्यूट्रैप चूहों का उपयोग करके पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल एडिपोसाइट्स और ग्लियल कोशिकाओं को लक्षित करते हैं जो वृषण और अधिवृक्क ग्रंथि में ग्लि1 + कोशिकाओं की तुलना में मस्तिष्क और वसा ऊतक में अधिक प्रचुर मात्रा में होते हैं। एक जटिल ऊतक में कोशिकाओं की एक छोटी संख्या से आवश्यक आरएनए प्राप्त करना सुनिश्चित करने के लिए, हमने मौजूदा प्रोटोकॉल को संशोधित किया (1) जीएफपी एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन समय को 1 घंटे से रात भर तक बढ़ाकर; (2) एक अन्य प्रकार के आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करना जिसका उद्देश्य पिकोग्राम स्तर पर आरएनए की एक छोटी मात्रा को अलग करना है।

हमने प्रदर्शित किया कि यह प्रोटोकॉल एक जटिल ऊतक में कोशिकाओं की एक छोटी संख्या से उच्च गुणवत्ता वाले सेल-प्रकार-विशिष्ट आरएनए प्राप्त कर सकता है। निकाले गए आरएनए की गुणवत्ता और मात्रा क्यूपीसीआर और एक वाणिज्यिक माइक्रोएरे सेवा के लिए सक्षम हैं। माइक्रोएरे और क्यूपीसीआर के परिणामों ने पुष्टि की कि लेडिग-कोशिकाओं से जुड़े जीन एक वृषण से आने वाले सकारात्मक अंश में समृद्ध होते हैं। यहां प्रोटोकॉल न्यूट्रैप माउस मॉडल का उपयोग करके राइबोसोम एमआरएनए का अनुवाद करने वाले सेल-प्रकार-विशिष्ट को अलग करने के लिए एक विस्तृत दृष्टिकोण प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग किसी भी ईजीएफपी-व्यक्त कोशिकाओं से आरएनए को अलग करने के लिए भी किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

यह काम आंशिक रूप से एनआईएच आर 00एचडी082686 द्वारा समर्थित था। हम एचएसजेड के लिए एंडोक्राइन सोसाइटी समर रिसर्च फैलोशिप का धन्यवाद करते हैं। हम माउस कॉलोनी के प्रजनन और रखरखाव के लिए डॉ युआन कांग को भी धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actb eurofins qPCR primers ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer)
Bioanalyzer Agilent 2100 Bioanalyzer Instrument
cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Millipore 11836170001
cycloheximide Millipore 239764-100MG
Cyp11a1 eurofins qPCR primers CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer)
dNTP Thermo Fisher Scientific R0191
DTT, Dithiothreitol Thermo Fisher Scientific P2325
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher Scientific 12321D
Falcon tubes 15 mL VWR 89039-666
GFP antibody Abcam ab290
Glass grinder set DWK Life Sciences 357542
heparin BEANTOWN CHEMICAL 139975-250MG
Hsd3b eurofins qPCR primers GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer)
KCl Biosciences R005
MgCl2 Biosciences R004
Microcentrifuge tubes 2 mL Thermo Fisher Scientific 02-707-354
Mouse Clariom S Assay microarrays Thermo Fisher Scientific Microarray service
NP-40 Millipore 492018-50 Ml
oligo (dT)20 Invitrogen 18418020
PicoPure RNA Isolation Kit Thermo Fisher Scientific KIT0204
Protein G Dynabead Thermo Fisher Scientific 10003D
RNase-free water growcells NUPW-0500
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher Scientific 10777019
Sox9 eurofins qPCR primers TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer
Superscript IV reverse transcriptase Invitrogen 18090050
SYBR Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4309155
Sycp3 eurofins qPCR primers GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer)
Tris Alfa Aesar J62848

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References

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जीव विज्ञान अंक 178 सेल-प्रकार-विशिष्ट आरएनए राइबोसोम आत्मीयता शुद्धिकरण वृषण माइक्रोएरे ईजीएफपी ग्लि1 का अनुवाद
सेल सॉर्टिंग के बिना स्नैप-जमे हुए विषम ऊतक नमूनों से सेल-टाइप-विशिष्ट आरएनए को अलग करें
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