Summary
Questo protocollo mira a isolare mRNA ribosomiali traslatori specifici per tipo cellulare utilizzando il modello murino NuTRAP.
Abstract
L'eterogeneità cellulare pone sfide alla comprensione della funzione dei tessuti complessi a livello di trascrittoma. L'uso di RNA specifici del tipo di cellula evita potenziali insidie causate dall'eterogeneità dei tessuti e scatena la potente analisi del trascrittoma. Il protocollo qui descritto dimostra come utilizzare il metodo TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification) per isolare gli RNA legati al ribosoma da una piccola quantità di cellule che esprimono EGFP in un tessuto complesso senza selezione cellulare. Questo protocollo è adatto per isolare RNA specifici del tipo di cellula utilizzando il modello murino NuTRAP recentemente disponibile e potrebbe anche essere utilizzato per isolare gli RNA da qualsiasi cellula che esprime EGFP.
Introduction
Gli approcci ad alto rendimento, tra cui il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) e il microarray, hanno reso possibile interrogare i profili di espressione genica a livello dell'intero genoma. Per tessuti complessi come cuore, cervello e testicolo, i dati specifici del tipo di cellula forniranno maggiori dettagli confrontando l'uso di RNA dall'intero tessuto 1,2,3. Per superare l'impatto dell'eterogeneità cellulare, il metodo Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) è stato sviluppato fin dai primi anni 20104. TRAP è in grado di isolare RNA legati al ribosoma da specifici tipi di cellule senza dissociazione tissutale. Questo metodo è stato utilizzato per l'analisi del translatoma (mRNA che vengono reclutati nel ribosoma per la traduzione) in diversi organismi, incluso il targeting di una popolazione estremamente rara di cellule muscolari negli embrioni di Drosophila5, lo studio di diverse cellule radicali nella pianta modello Arabidopsis thaliana6 e l'esecuzione dell'analisi del trascrittoma delle cellule endoteliali nei mammiferi7.
La TRAP richiede una modificazione genetica per marcare il ribosoma di un organismo modello. Evan Rosen e colleghi hanno recentemente sviluppato un modello murino chiamato Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse8, che è disponibile attraverso il Jackson Laboratory dal 2017. Incrociando con una linea murina Cre, i ricercatori possono utilizzare questo modello murino NuTRAP per isolare gli RNA legati al ribosoma e i nuclei cellulari dalle cellule che esprimono Cre senza ordinamento cellulare. Nelle cellule che esprimono Cre, che trasportano anche l'allele NuTRAP , il ribosoma marcato EGFP/L10a consente l'isolamento degli mRNA traduttori mediante saggi di pulldown di affinità. Nella stessa cellula, la membrana nucleare marcata con peptide di riconoscimento della biotina ligasi (BLRP), che è anche mCherry positiva, consente l'isolamento nucleare utilizzando la purificazione basata sull'affinità o sulla fluorescenza. Lo stesso team di ricerca ha anche generato una linea di topi simile in cui la membrana nucleare è etichettata solo con mCherry senza biotina8. Queste due linee di topi geneticamente modificati danno accesso alla caratterizzazione di profili epigenomici e trascrittomici accoppiati di specifici tipi di cellule in interesse.
La via di segnalazione del riccio (Hh) svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo dei tessuti9. GLI1, un membro della famiglia GLI, agisce come attivatore trascrizionale e media la segnalazione Hh. Le cellule Gli1+ possono essere trovate in molti organi secernenti ormoni, tra cui la ghiandola surrenale e il testicolo. Per isolare DNA e RNA specifici del tipo di cellula dalle cellule Gli1+ utilizzando il modello murino NuTRAP, i topi Gli1-CreERT2 sono stati incrociati con i topi NuTRAP. I topi Shh-CreERT2 sono stati anche incrociati con i topi NuTRAP per isolare le cellule che esprimono il riccio sonico (Shh). Il seguente protocollo mostra come utilizzare Gli1-CreERT2; Topi NuTRAP per isolare gli RNA legati al ribosoma dalle cellule Gli1+ nei testicoli di topo adulto.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali eseguiti hanno seguito i protocolli approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) dell'Università di Auburn.
NOTA: Il seguente protocollo utilizza un testicolo (circa 100 mg) a P28 da Gli1-CreERT2; Topi NuTRAP (Mus musculus). Potrebbe essere necessario regolare i volumi dei reagenti in base ai tipi di campioni e al numero di tessuti.
1. Raccolta dei tessuti
- Eutanasia i topi usando una camera CO2 , disinfettare la superficie dell'addome con etanolo al 70%.
- Aprire l'addome inferiore con le forbici e rimuovere i testicoli. Utilizzare azoto liquido (LN2) per congelare immediatamente i testicoli.
- Conservare i campioni nella fase vapore di LN2 fino all'uso.
2. Preparazione di reagenti e perline
- Preparare la soluzione madre di omogeneizzazione: aggiungere 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40 e 1 mg/mL di eparina. Conservare la soluzione a 4 °C fino all'uso (fino a 1 mese).
- Preparare il tampone di lavoro di omogeneizzazione dalla soluzione madre (fase 2.1) fresco prima dell'uso: aggiungere DTT (concentrazione finale: 1 mM), cicloeximide (concentrazione finale: 100 μg/ml), ribonucleasi ricombinante (concentrazione finale: 200 unità/ml) e cocktail inibitore della proteasi (concentrazione finale: 1x) alla soluzione madre di omogeneizzazione per ottenere la quantità necessaria del tampone di lavoro di omogeneizzazione. Conservare il tampone di lavoro appena preparato su ghiaccio fino all'uso.
- Preparare i tamponi di lavaggio a basso contenuto di sale e ad alto contenuto di sale:
- Per preparare tamponi di lavaggio a basso contenuto di sale miscelare 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl e 1% NP-40. Aggiungere DTT (concentrazione finale: 1 mM) e cicloeximide (concentrazione finale: 100 μg/ml) prima dell'uso.
- Per preparare la miscela tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. Aggiungere DTT (concentrazione finale: 2 mM) e Cycloheximide (concentrazione finale: 100 μg/mL) prima dell'uso.
- Preparare le perle di proteina G (tabella dei materiali):
- Ogni campione avrà bisogno di 50 μL di perle di proteina G. Posizionare la quantità necessaria di sfere in una provetta da centrifuga da 1,5 ml e separare le sfere dalla soluzione utilizzando un rack magnetico lasciando il tubo sul rack per 30-60 s.
- Rimuovere il surnatante mediante pipettaggio. Lavare le perline tre volte con 1 mL di tampone di lavaggio a basso contenuto di sale ghiacciato ogni volta.
3. Lisi tissutale e omogeneizzazione
- Aggiungere 2 ml di tampone di lavoro per omogeneizzazione ghiacciato (preparato al momento dal punto 2.2) a un set di smerigliatrice di tessuto di vetro. Posizionare rapidamente il campione congelato nel macinino e omogeneizzare il tessuto con 30 colpi sul ghiaccio usando un pestello sciolto.
- Trasferire l'omogenato in una provetta a fondo tondo da 2 mL e centrifugare a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
- Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 2 ml. Risparmiare 100 μL in un tubo da 1,5 mL come "input".
- Incubare il surnatante nella provetta da 2 mL con l'anticorpo anti-GFP (5 μg/mL; 1:400) a 4 °C su un rotatore end-over-end (24 rpm) durante la notte.
4. Immunoprecipitazione
- Trasferire la miscela omogenato/anticorpo in un nuovo tubo a fondo tondo da 2 mL contenente le sfere di proteina G lavate dal punto 2.4. Incubare a 4 °C su un rotatore end-over-end (24 rpm) per 2 ore.
- Separare le sfere magnetiche dal surnatante usando un rack magnetico. Salva il surnatante come "frazione negativa". La frazione negativa contiene (1) RNA nelle cellule EGFP-negative e (2) RNA nelle cellule EGFP-positive che non sono legate ai ribosomi.
- Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale alle perline e ruotare brevemente il tubo per lavare le perline. Posizionare il tubo in un rack magnetico.
- Rimuovere il tampone di lavaggio. Ripetere la fase di lavaggio altre due volte. Le perle ora contengono il complesso beads-ribosoma-RNA da cellule EGFP-positive.
5. Estrazione dell'RNA
NOTA: I seguenti passaggi sono adattati dal kit di isolamento dell'RNA (Tabella dei materiali). Trattare ogni frazione (cioè input, positivo e negativo) come un campione indipendente e isolare gli RNA in modo indipendente.
- Incubare le sfere dal punto 4.4 con 50 μL di tampone di estrazione (dal kit di isolamento dell'RNA) in un termomiscelatore (42 °C, 500 rpm) per 30 minuti per rilasciare RNA dalle perle.
- Separare le perle con un rack magnetico, trasferire il surnatante che contiene il complesso perline-ribosoma-RNA in un tubo da 1,5 ml.
- Centrifugare il tubo a 3000 x g per 2 minuti, quindi pipettare il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml. Questo tubo contiene la "frazione positiva" del passo TRAP.
NOTA: Per le frazioni in ingresso e negative, estrarre l'RNA da 25 μL di campioni utilizzando 1 mL di tampone di estrazione. Incubare in un termomiscelatore (42 °C, 500 giri/min) per 30 min. - Pre-condizionare la colonna di purificazione dell'RNA: pipettare 250 μL di tampone di condizionamento sulla colonna di purificazione. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Centrifugare la colonna a 16.000 x g per 1 min.
- Pipet uguale volume del 70% di EtOH nel surnatante dal passo 5.3 (circa 50 μL di 70% EtOH per la frazione positiva e 1 mL di 70% EtOH per la frazione in ingresso e la frazione negativa). Mescolare bene pipettando su e giù.
- Pipettare la miscela nella colonna dal punto 5.4.
- Centrifugare la colonna a 100 x g per 2 minuti per consentire il legame dell'RNA alla membrana nella colonna, quindi continuare la centrifuga a 16.000 x g per 30 s immediatamente. Eliminare il flusso in corso.
NOTA: Per le frazioni in ingresso e negative, aggiungere ogni volta 250 μL della miscela alla colonna. Ripetere i punti 5.6 e 5.7 fino a utilizzare tutte le miscele. - Pipettare 100 μL di tampone di lavaggio 1 (W1) nella colonna e centrifugare a 8.000 x g per 1 minuto. Eliminare il flusso in corso.
- Pipetta 75 μL di soluzione di DNasi miscelare direttamente nella membrana della colonna di purificazione. Incubare a RT per 15 min.
- Pipettare 40 μL di W1 nella colonna e centrifugare a 8.000 x g per 30 s. Eliminare il flusso in corso.
- Pipettare 100 μL di Wash Buffer 2 (W2) nella colonna e centrifugare a 8.000 x g per 1 min. Eliminare il flusso in corso.
- Pipettare 100 μL di W2 nella colonna e centrifugare a 16.000 x g per 2 minuti. Eliminare il flusso in corso. Centrifugare nuovamente la stessa colonna a 16.000 x g per 1 minuto per rimuovere tutte le tracce di tampone di lavaggio prima della fase di eluizione.
- Trasferire la colonna in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
- Pipettare 12 μL di acqua priva di RNasi direttamente sulla membrana della colonna di purificazione. La punta del pipet non deve toccare la membrana. Incubare a RT per 1 min e centrifugare a 1000 x g per 1 min. Quindi continuare la centrifugazione a 16.000 x g per 1 minuto per eluire l'RNA.
6. Concentrazione e qualità dell'RNA
- Utilizzare un bioanalizzatore per valutare la qualità e la quantità dell'RNA estratto10.
7. Conservazione e ulteriori analisi
- Conservare l'RNA a -80 °C (fino a 1 anno) fino a ulteriori analisi (ad esempio, microarray, PCR quantitativa (qPCR) e RNA-seq, ecc.).
NOTA: Per i dettagli dell'analisi qPCR, inclusa la sintesi del cDNA, fare riferimento a Lyu et al.11. I primer per qPCR sono elencati nella tabella dei materiali.
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Representative Results
Il topo Gli1-CreERT2 (Jackson Lab Stock Number: 007913) è stato prima incrociato con il topo reporter NuTRAP (Jackson Lab Stock Number: 029899) per generare topi a doppio mutante. I topi portatori di entrambi gli alleli genici geneticamente modificati (cioè Gli1-CreERT2 e NuTRAP) sono stati iniettati con tamoxifene una volta al giorno, a giorni alterni, per tre iniezioni. I campioni di tessuto sono stati raccolti il 7 ° giorno dopo il 1° giorno dell'iniezione. L'analisi di immunofluorescenza ha mostrato che l'EGFP era espresso nelle cellule interstiziali nei testicoli (Figura 1). La capsula della ghiandola surrenale è nota per essere un'altra popolazione cellulare positiva di Gli112,13. EGFP è stato trovato anche nelle cellule capsulari surrenali in Gli1-CreERT2; Topi NuTRAP (Figura 1). Il nostro laboratorio trasporta anche Shh-CreERT2; Topi NuTRAP. Si noti che in Shh-CreERT2; Topi NuTRAP, la popolazione cellulare EGFP+ risiede nella corteccia esterna della ghiandola surrenale sotto la capsula (Figura 1), lo stesso sito di espressione delle cellule EGFP+ nell'area Shh+ nella ghiandola surrenale13 che conferma l'espressione di EGFP nelle cellule che esprimono Cre.
Dopo l'estrazione degli RNA specifici del tipo di cellula, la quantità e la qualità degli RNA isolati in ciascuna frazione da due estrazioni indipendenti (un testicolo utilizzato in ciascuna estrazione) sono state valutate utilizzando un bioanalizzatore (Figura 2). Il risultato del bioanalizzatore ha indicato che questo protocollo è in grado di ottenere RNA di alta qualità da tutte e tre le frazioni. Tutte le frazioni avevano un RNA Integrity Number (RIN) simile.
Per verificare ulteriormente se l'RNA estratto è specifico per tipo di cellula, l'RNA estratto è stato inviato per l'analisi dei microarray utilizzando un servizio di microarray commerciale (vedi Tabella dei materiali). Il risultato del microarray ha mostrato che circa 4.000 geni sono stati arricchiti nella frazione positiva rispetto alla frazione negativa, mentre circa 3.000 geni sono stati arricchiti nella frazione negativa (Figura 3). Tra questi geni differenzialmente espressi, i geni associati alle cellule di Leydig Hsd11b1 e Hsd3b614,15 sono stati arricchiti nella frazione positiva. Nella frazione negativa, i geni associati alle cellule Sertoli Dhh e Gstm616,17 sono stati arricchiti. Solo pochi geni differenzialmente espressi sono stati identificati confrontando la frazione negativa con l'input.
La RT-PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) è stata utilizzata anche per confermare l'espressione di geni chiave nella frazione positiva e nella frazione negativa. Analogamente a quanto riscontrato nel test microarray, gli enzimi steroidogenici 3β-idrossisteroide deidrogenasi (codificati da Hsd3b) e l'enzima di scissione della catena laterale del colesterolo (codificato da Cyp11a1) sono stati arricchiti nella frazione positiva. Mentre il marcatore cellulare Sertoli Sox9 (SRY-box Transcription Factor 9) e il marcatore delle cellule germinali Sycp3 (Synaptonemal Complex Protein 3), sono stati arricchiti nella frazione negativa (Figura 4). Insieme, questi dati hanno dimostrato che i trascrittomi nelle cellule Gli1+ sono stati abbattuti e arricchiti con successo dal protocollo di cui sopra.
Figura 1: Immagini di immunofluorescenza dell'espressione di EGFP in modelli murini reporter NuTRAP. il Gli1-CreERT2; NuTRAP e Shh-CreERT2; I topi NuTRAP sono stati trattati con tamoxifene per attivare l'espressione di EGFP. Nel testicolo, le cellule Gli1+ erano nell'interstizio, mentre nella ghiandola surrenale, le cellule Gli1+ erano nella capsula surrenale. Nella ghiandola surrenale, le cellule sotto la capsula erano positive di SHH (cellule EGFP + in Shh-CreERT2; Topi NuTRAP). SHH è il ligando della via di segnalazione SHH che suscita la sua funzione nelle cellule capsulari Gli1+ 13. Barre della scala: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Qualità e quantità dell'RNA dall'estrazione TRAP. Gli RNA della frazione positiva, della frazione negativa e dell'input sono stati valutati utilizzando un bioanalizzatore. La frazione positiva contiene RNA estratti da perle di proteina G dopo l'incubazione con l'anticorpo GFP (fase 4.1). La frazione negativa contiene RNA che rimangono nel surnatante al punto 4.2. L'input contiene RNA dall'omogenato (fase 3.3). Nell'elettroferogramma, poiché sono note le concentrazioni del marcatore inferiore (visualizzato come il primo picco a 20-25 s del tempo di migrazione dei campioni mostrati sull'asse X) e della scala (non mostrata in questi elettroferogrammi), è possibile calcolare la concentrazione di ciascun campione. I due picchi principali a 40-50 s rappresentano l'rRNA 18S e 28S. Il rapporto ribosomiale (basato sull'intensità di fluorescenza mostrata sull'asse Y) viene utilizzato per determinare l'integrità del campione di RNA. Il numero di integrità dell'RNA (RIN) di ciascun campione è mostrato nell'angolo in alto a destra di ogni grafico. Ogni punto nel dot plot rappresenta la quantità di RNA che è stata estratta da un singolo testicolo. La quantità di RNA di ciascun campione nella frazione negativa e l'input sono stati estratti da 25 μL di campioni. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Analisi di microarray per campioni TRAP. Vengono mostrati i risultati di due estrazioni (un testicolo ciascuna). L'analisi microarray ha identificato un numero simile di geni differenzialmente espressi da due estrazioni indipendenti (Testis A e Testis B). Circa 4.000 geni sono stati arricchiti (punti rossi) nella frazione positiva, mentre ~ 3.000 geni sono stati arricchiti (punti verdi) nella frazione negativa. Hsd11b1 e Hsd3b6 sono stati arricchiti in frazioni positive. Dhh e Gstm6 sono stati arricchiti in frazioni negative. Solo pochi geni sono stati identificati come geni differenzialmente espressi tra la frazione negativa e l'input, suggerendo che il testicolo contiene solo un numero molto piccolo di cellule Gli1+ . Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Analisi qPCR per campioni TRAP. L'analisi qPCR ha mostrato l'espressione relativa di geni specifici del tipo di cellula nella frazione positiva e nella frazione negativa. L'espressione di ciascun gene è stata normalizzata per la prima volta con Actb. Le espressioni relative dei geni all'interno della frazione positiva sono state quindi calcolate in base all'espressione di Sox9 (impostata come 10). Per la frazione negativa, Cyp11a1 (impostato come 10) è stato utilizzato per normalizzare l'espressione relativa. Si noti che l'espressione relativa dei geni bersaglio può essere confrontata solo all'interno di ciascuna frazione. I geni che codificano gli enzimi steroidogenici (Hsd3b e Cyp11a1) sono stati arricchiti nella frazione positiva. Mentre il gene marcatore per le cellule germinali (Scyp3) e le cellule Sertoli (Sox9), sono stati arricchiti nella frazione negativa. Sono state mostrate tre repliche biologiche (tre estrazioni indipendenti, un testicolo ciascuna). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
L'utilità dell'analisi del trascrittoma dell'intero tessuto potrebbe essere smorzata, specialmente quando si studiano tessuti eterogenei complessi. Come ottenere RNA specifici del tipo di cellula diventa una necessità urgente per scatenare la potente tecnica RNA-seq. L'isolamento degli RNA specifici del tipo di cellula di solito si basa sulla raccolta di un tipo specifico di cellule mediante micromanipolazione, selezione cellulare attivata da fluorescente (FACS) o microdissezione a cattura laser (LCM)18. Sono stati sviluppati anche altri moderni metodi e strumenti di raccolta a cella singola ad alta produttività19. Questi metodi di solito impiegano le tecniche microfluidiche per codificare singole cellule seguite da RNA-seq a singola cellula. La dissociazione cellulare è il passaggio necessario per ottenere la soluzione cellulare sospesa, che poi passerà attraverso un selezionatore cellulare o un dispositivo microfluidico per codificare a barre ogni cellula. La fase di dissociazione cellulare introduce sfide a questi metodi per gli studi specifici del tipo di cellula perché il trattamento enzimatico non solo scompone i tessuti, ma influenza anche la vitalità cellulare e i profili trascrizionali20. Inoltre, la spesa per l'RNA-seq a singola cellula è solitamente elevata e richiede attrezzature specializzate in loco.
Recentemente, due studi hanno isolato con successo RNA/DNA di specifici tipi cellulari da interi tessuti utilizzando i topi NuTRAP 8,21. Senza utilizzare attrezzature e strumenti specifici, il modello murino NuTRAP consente di ottenere RNA e DNA da specifici tipi di cellule. L'allele NuTRAP potrebbe colpire le cellule che esprimono Cre senza la fase di dissociazione cellulare, evitando di cambiare la vitalità della cellula e i profili trascrizionali. Rol et al. hanno utilizzato il modello murino NuTRAP per isolare i nuclei e tradurre simultaneamente l'mRNA dal tessuto adiposo. L'altro studio ha anche dimostrato che il modello murino NuTRAP potrebbe funzionare per le cellule gliali nel sistema nervoso centrale8.
Nel nostro laboratorio, siamo interessati a studiare le popolazioni di cellule staminali nei tessuti steroidogenici come le cellule interstiziali Gli1+ nel testicolo22 e le cellule capsulari Gli1+ nella ghiandola surrenale13. La sfida di studiare le cellule Gli1+ in questi due organi è che il numero di cellule Gli1+ nel testicolo e nella ghiandola surrenale è piccolo. Ad esempio, la proporzione di cellule di Leydig, che sono la principale popolazione di cellule Gli1+ nel testicolo, occupa solo circa il 3,8% del volume totale dei testicoli nei topi adulti23. Poiché la tecnica TRAP mira a ridurre specificamente la traduzione di RNA legati al ribosoma in tessuti complessi, il modello murino NuTRAP potrebbe essere un potente strumento adatto per studiare una popolazione cellulare rara in un tessuto complesso. I protocolli precedentemente pubblicati che utilizzano topi NuTRAP prendono di mira gli adipociti e le cellule gliali che sono più abbondanti nel cervello e nel tessuto adiposo rispetto alle cellule Gli1+ nel testicolo e nella ghiandola surrenale. Per garantire l'ottenimento degli RNA richiesti da un piccolo numero di cellule in un tessuto complesso, abbiamo rivisto i protocolli esistenti (1) aumentando il tempo di incubazione con l'anticorpo GFP da 1 ora a durante la notte; (2) utilizzando un altro tipo di kit di estrazione dell'RNA che mira a isolare una piccola quantità di RNA a livello di picogramma.
Abbiamo dimostrato che questo protocollo potrebbe ottenere RNA specifici del tipo di cellula di alta qualità da un piccolo numero di cellule in un tessuto complesso. La qualità e la quantità di RNA estratti sono in grado di utilizzare la qPCR e un servizio commerciale di microarray. I risultati di microarray e qPCR hanno confermato che i geni associati alle cellule di Leydig sono arricchiti nella frazione positiva proveniente da un testicolo. Il protocollo fornisce un approccio dettagliato per isolare gli mRNA ribosomi traslatori specifici del tipo di cellula utilizzando il modello murino NuTRAP . Questo protocollo può anche essere utilizzato per isolare gli RNA da qualsiasi cellula che esprime EGFP.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato parzialmente supportato da NIH R00HD082686. Ringraziamo la Endocrine Society Summer Research Fellowship a H.S.Z. Ringraziamo anche il Dr. Yuan Kang per aver allevato e mantenuto la colonia di topi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
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