Summary
Dieses Protokoll zielt darauf ab, zelltypspezifisch translatierende ribosomale mRNAs mit dem NuTRAP-Mausmodell zu isolieren.
Abstract
Die zelluläre Heterogenität stellt das Verständnis der Funktion komplexer Gewebe auf Transkriptomebene vor Herausforderungen. Die Verwendung zelltypspezifischer RNAs vermeidet potenzielle Fallstricke, die durch die Heterogenität von Geweben verursacht werden, und löst die leistungsstarke Transkriptomanalyse aus. Das hier beschriebene Protokoll zeigt, wie die TRAP-Methode (Translating Ribosome Affinity Purification) verwendet werden kann, um Ribosomen-gebundene RNAs aus einer kleinen Menge EGFP-exprimierender Zellen in einem komplexen Gewebe ohne Zellsortierung zu isolieren. Dieses Protokoll eignet sich für die Isolierung zelltypspezifischer RNAs mit dem kürzlich verfügbaren NuTRAP-Mausmodell und könnte auch verwendet werden, um RNAs aus beliebigen EGFP-exprimierenden Zellen zu isolieren.
Introduction
Hochdurchsatzansätze, einschließlich RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) und Microarray, haben es ermöglicht, Genexpressionsprofile auf genomweiter Ebene abzufragen. Für komplexe Gewebe wie Herz, Gehirn und Hoden liefern die zelltypspezifischen Daten mehr Details zum Vergleich der Verwendung von RNAs aus dem gesamten Gewebe 1,2,3. Um die Auswirkungen der zellulären Heterogenität zu überwinden, wurde seit Anfang der 2010er Jahre die TRAP-Methode (Translating Ribosome Affinity Purification) entwickelt4. TRAP ist in der Lage, Ribosom-gebundene RNAs aus bestimmten Zelltypen ohne Gewebedissoziation zu isolieren. Diese Methode wurde für die Translatomanalyse (mRNAs, die zur Translation in das Ribosom rekrutiert werden) in verschiedenen Organismen verwendet, einschließlich der Ausrichtung auf eine extrem seltene Population von Muskelzellen in Drosophila-Embryonen5, der Untersuchung verschiedener Wurzelzellen in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana6 und der Durchführung einer Transkriptomanalyse von Endothelzellen in Säugetieren7.
TRAP erfordert eine genetische Veränderung, um das Ribosom eines Modellorganismus zu markieren. Evan Rosen und Kollegen entwickelten kürzlich ein Mausmodell namens Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse8, das seit 2017 über das Jackson Laboratory erhältlich ist. Durch Kreuzung mit einer Cre-Mauslinie können Forscher dieses NuTRAP-Mausmodell verwenden, um Ribosomen-gebundene RNAs und Zellkerne aus Cre-exprimierenden Zellen ohne Zellsortierung zu isolieren. In Cre-exprimierenden Zellen, die auch das NuTRAP-Allel tragen, ermöglicht das EGFP/L10a-markierte Ribosom die Isolierung translatierender mRNAs unter Verwendung von Affinitäts-Pulldown-Assays. An derselben Zelle ermöglicht die Biotin-Ligase-Erkennungspeptid (BLRP)-markierte Kernmembran, die ebenfalls mCherry-positiv ist, die nukleare Isolierung durch affinitäts- oder fluoreszenzbasierte Reinigung. Das gleiche Forscherteam erzeugte auch eine ähnliche Mauslinie, in der die Kernmembran nur mit mCherry ohne Biotin8 markiert ist. Diese beiden genetisch veränderten Mauslinien ermöglichen die Charakterisierung gepaarter epigenomischer und transkriptomischer Profile bestimmter Zelltypen.
Der Hedgehog (Hh)-Signalweg spielt eine entscheidende Rolle bei der Gewebeentwicklung9. GLI1, ein Mitglied der GLI-Familie, fungiert als transkriptioneller Aktivator und vermittelt die Hh-Signalisierung. Gli1+ Zellen können in vielen hormonsezernierenden Organen gefunden werden, einschließlich der Nebenniere und des Hodens. Um zelltypspezifische DNAs und RNAs aus Gli1+-Zellen mit dem NuTRAP-Mausmodell zu isolieren, wurden Gli1-CreERT2-Mäuse mit den NuTRAP-Mäusen gekreuzt. Shh-CreERT2-Mäuse wurden auch mit den NuTRAP-Mäusen gekreuzt, um Schalligel (Shh) exprimierende Zellen zu isolieren. Das folgende Protokoll zeigt, wie Gli1-CreERT2 verwendet wird. NuTRAP-Mäuse isolieren Ribosomen-gebundene RNAs aus Gli1+-Zellen in erwachsenen Maushoden.
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Protocol
Alle durchgeführten Tierversuche folgten den Protokollen, die von den Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) der Auburn University genehmigt wurden.
HINWEIS: Das folgende Protokoll verwendet einen Hoden (ca. 100 mg) bei P28 von Gli1-CreERT2; NuTRAP-Mäuse (Mus musculus). Das Volumen der Reagenzien muss möglicherweise basierend auf der Art der Proben und der Anzahl der Gewebe angepasst werden.
1. Gewebeentnahme
- Euthanasieren Sie die Mäuse mit einerCO2-Kammer , desinfizieren Sie die Bauchoberfläche mit 70% Ethanol.
- Öffnen Sie den Unterbauch mit einer Schere und entfernen Sie die Hoden. Verwenden Sie flüssigen Stickstoff (LN2), um die Hoden sofort einzufrieren.
- Lagern Sie Proben in der Dampfphase von LN2 bis zur Verwendung.
2. Zubereitung von Reagenzien und Perlen
- Bereiten Sie die Homogenisierungsstammlösung vor: Fügen Sie 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40 und 1 mg/ml Heparin hinzu. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C bis zur Verwendung (bis zu 1 Monat).
- Bereiten Sie den Homogenisierungsarbeitspuffer aus der Stammlösung (Schritt 2.1) frisch vor Gebrauch vor: Fügen Sie DTT (Endkonzentration: 1 mM), Cycloheximid (Endkonzentration: 100 μg/ml), rekombinante Ribonuklease (Endkonzentration: 200 Einheiten/ml) und Proteaseinhibitorcocktail (Endkonzentration: 1x) zur Homogenisierungsstammlösung hinzu, um die erforderliche Menge des Homogenisierungsarbeitspuffers herzustellen. Lagern Sie den frisch zubereiteten Arbeitspuffer bis zum Gebrauch auf Eis.
- Bereiten Sie die salzarmen und salzreichen Waschpuffer vor:
- Zur Herstellung eines salzarmen Waschpuffers mischen Sie 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl und 1% NP-40. Fügen Sie vor Gebrauch DVB-T (Endkonzentration: 1 mM) und Cycloheximid (Endkonzentration: 100 μg/ml) hinzu.
- Zur Herstellung eines salzreichen Waschpuffers mischen Sie 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mMMgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. Fügen Sie vor Gebrauch DVB-T (Endkonzentration: 2 mM) und Cycloheximid (Endkonzentration: 100 μg/ml) hinzu.
- Protein G-Perlen vorbereiten (Materialtabelle):
- Jede Probe benötigt 50 μL Protein-G-Perlen. Legen Sie die erforderliche Menge an Perlen in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und trennen Sie die Perlen mit einem Magnetgestell von der Lösung, indem Sie das Röhrchen für 30-60 s auf dem Rack belassen.
- Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren. Waschen Sie die Perlen dreimal mit jeweils 1 ml eiskaltem, salzarmem Waschpuffer.
3. Gewebelyse und Homogenisierung
- Fügen Sie 2 mL eiskalten Homogenisierungsarbeitspuffer (frisch zubereitet aus Schritt 2.2) zu einem Glasgewebeschleifer-Set hinzu. Legen Sie die gefrorene Probe schnell in die Mühle und homogenisieren Sie das Gewebe mit 30 Schlägen auf Eis mit einem losen Stößel.
- Das Homogenat in ein 2-ml-Rundbodenröhrchen überführen und 10 min bei 4 °C bei 12.000 x g zentrifugieren.
- Überstand wird in ein neues 2-ml-Röhrchen überführt. Speichern Sie 100 μL in eine 1,5 mL Röhre als "Eingang".
- Inkubieren Sie den Überstand im 2-ml-Röhrchen mit dem Anti-GFP-Antikörper (5 μg/ml; 1:400) bei 4 °C auf einem End-over-End-Rotator (24 U/min) über Nacht.
4. Immunpräzipitation
- Das Homogenat/Antikörper-Gemisch wird in ein neues 2-ml-Rundbodenröhrchen überführt, das die gewaschenen Protein-G-Perlen aus Schritt 2.4 enthält. Bei 4 °C auf einem End-over-End-Rotator (24 U/min) für 2 h inkubieren.
- Trennen Sie die magnetischen Kügelchen mit einem Magnetgestell vom Überstand. Speichern Sie den Überstand als "negativen Bruch". Die negative Fraktion enthält (1) RNAs in EGFP-negativen Zellen und (2) RNAs in EGFP-positiven Zellen, die nicht an Ribosomen gebunden sind.
- Fügen Sie 1 ml salzreichen Waschpuffer zu den Perlen hinzu und wirbeln Sie das Röhrchen kurz an, um die Perlen zu waschen. Legen Sie das Rohr in ein Magnetgestell.
- Entfernen Sie den Waschpuffer. Wiederholen Sie den Waschvorgang noch zwei weitere Male. Die Beads enthalten nun den Beads-Ribosom-RNA-Komplex aus EGFP-positiven Zellen.
5. RNA-Extraktion
HINWEIS: Die folgenden Schritte wurden aus dem RNA-Isolierkit (Table of Materials) adaptiert. Behandeln Sie jede Fraktion (d. H. Input, positiv und negativ) als unabhängige Probe und isolieren Sie RNAs unabhängig.
- Inkubieren Sie die Beads aus Schritt 4.4 mit 50 μL Extraktionspuffer (aus dem RNA-Isolierkit) in einem Thermomixer (42 °C, 500 U/min) für 30 min, um RNAs aus Beads freizusetzen.
- Trennen Sie die Beads mit einem Magnetgestell, übertragen Sie den Überstand, der den Beads-Ribosom-RNA-Komplex enthält, in ein 1,5 ml Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 3000 x g für 2 min, dann pipetten Sie den Überstand zu einem neuen 1,5 ml Röhrchen. Dieses Röhrchen enthält den "positiven Anteil" des TRAP-Schritts.
HINWEIS: Für den Input und die negativen Fraktionen extrahieren Sie RNA aus 25 μL Proben unter Verwendung von 1 mL Extraktionspuffer. In einem Thermomixer (42 °C, 500 U/min) 30 min inkubieren. - Vorkonditionierung der RNA-Reinigungssäule: Pipettieren Sie 250 μL Konditionierungspuffer auf die Reinigungssäule. 5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Zentrifugieren Sie die Säule bei 16.000 x g für 1 min.
- Pipet gleiches Volumen von 70% EtOH in den Überstand aus Schritt 5.3 (ca. 50 μL 70% EtOH für die positive Fraktion und 1 ml 70% EtOH für die Eingangs- und die negativen Fraktionen). Gut mischen, indem Sie auf und ab pipettieren.
- Die Mischung aus Schritt 5.4 in die Säule pipettieren.
- Zentrifugieren Sie die Säule bei 100 x g für 2 Minuten, damit RNA an die Membran in der Säule bindet, und zentrifugieren Sie dann sofort bei 16.000 x g für 30 s. Verwerfen Sie den Durchfluss.
HINWEIS: Für die Eingabe und die negativen Fraktionen fügen Sie jedes Mal 250 μL der Mischung in die Säule ein. Wiederholen Sie die Schritte 5.6 und 5.7, bis alle Gemische verwendet sind. - 100 μL Waschpuffer 1 (W1) in die Säule pipettieren und bei 8.000 x g für 1 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss.
- 75 μL DNase-Lösungsmischung werden direkt in die Membran der Reinigungskolonne pipettiert. Inkubieren bei RT für 15 min.
- 40 μL W1 in die Säule pipettieren und bei 8.000 x g für 30 s zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss.
- 100 μL Waschpuffer 2 (W2) in die Säule pipettieren und bei 8.000 x g für 1 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss.
- 100 μL W2 in die Säule pipettieren und bei 16.000 x g für 2 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss. Zentrifugieren Sie dieselbe Säule bei 16.000 x g für 1 Minute, um alle Spuren des Waschpuffers vor dem Elutionsschritt zu entfernen.
- Die Säule wird in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
- Pipettieren Sie 12 μL RNase-freies Wasser direkt auf die Membran der Reinigungssäule. Die Pipettenspitze sollte die Membran nicht berühren. Inkubieren bei RT für 1 min und Zentrifugieren bei 1000 x g für 1 min. Dann setzen Sie die Zentrifugation bei 16.000 x g für 1 min fort, um die RNA zu eluieren.
6. RNA-Konzentration und -Qualität
- Verwenden Sie einen Bioanalysator, um die Qualität und Quantität der extrahierten RNA10 zu beurteilen.
7. Speicherung und weitere Analyse
- Lagern Sie die RNA bei -80 °C (bis zu 1 Jahr) bis zur weiteren Analyse (z. B. Microarray, quantitative PCR (qPCR) und RNA-seq usw.).
HINWEIS: Einzelheiten zur qPCR-Analyse, einschließlich der cDNA-Synthese, finden Sie in Lyu et al.11. Primer für qPCR sind in der Materialtabelle aufgeführt.
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Representative Results
Die Gli1-CreERT2-Maus (Jackson Lab Stock Number: 007913) wurde zuerst mit der NuTRAP-Reportermaus (Jackson Lab Stock Number: 029899) gekreuzt, um Doppelmutantenmäuse zu erzeugen. Mäusen, die beide gentechnisch veränderten Genallele (d.h. Gli1-CreERT2 und NuTRAP) trugen, wurde Tamoxifen einmal täglich, jeden zweiten Tag, für drei Injektionen injiziert. Die Gewebeproben wurden am 7. Tag nach dem 1. Tag der Injektion entnommen. Die Immunfluoreszenzanalyse zeigte, dass das EGFP in interstitiellen Zellen in Hoden exprimiert wurde (Abbildung 1). Es ist bekannt, dass die Nebennierenkapsel eine weitere Zellpopulation ist, die positiv auf Gli112,13 ist. EGFP wurde auch in Nebennierenkapselzellen in Gli1-CreERT2 gefunden; NuTRAP-Mäuse (Abbildung 1). Unser Labor führt auch Shh-CreERT2; NuTRAP-Mäuse. Beachten Sie, dass in Shh-CreERT2; Bei NuTRAP-Mäusen befindet sich die EGFP+-Zellpopulation im äußeren Kortex der Nebenniere unterhalb der Kapsel (Abbildung 1), der gleichen Expressionsstelle von EGFP+-Zellen im Shh+-Bereich in der Nebenniere13, was die Expression von EGFP in Cre-exprimierenden Zellen bestätigt.
Nach der Extraktion der zelltypspezifischen RNAs wurden die Menge und Qualität der isolierten RNAs in jeder Fraktion aus zwei unabhängigen Extraktionen (ein Hoden wird in jeder Extraktion verwendet) mit einem Bioanalysator bewertet (Abbildung 2). Das Bioanalyzer-Ergebnis zeigte, dass dieses Protokoll in der Lage ist, qualitativ hochwertige RNAs aus allen drei Fraktionen zu erhalten. Alle Fraktionen hatten eine ähnliche RNA-Integritätsnummer (RIN).
Um weiter zu testen, ob die extrahierte RNA zelltypspezifisch ist, wurde extrahierte RNA zur Microarray-Analyse mit einem kommerziellen Microarray-Dienst geschickt (siehe Materialtabelle). Das Microarray-Ergebnis zeigte, dass etwa 4.000 Gene in der positiven Fraktion im Vergleich zur negativen Fraktion angereichert waren, während etwa 3.000 Gene in der negativen Fraktion angereichert waren (Abbildung 3). Unter diesen differentiell exprimierten Genen waren die Leydig-Zell-assoziierten Gene Hsd11b1 und Hsd3b614,15 in der positiven Fraktion angereichert. In der negativen Fraktion wurden die Sertoli-Zell-assoziierten Gene Dhh und Gstm616,17 angereichert. Beim Vergleich des negativen Anteils mit dem Input wurden nur wenige differentiell exprimierte Gene identifiziert.
Die quantitative RT-PCR (qPCR) in Echtzeit wurde ebenfalls verwendet, um die Expression von Schlüsselgenen in der positiven und der negativen Fraktion zu bestätigen. Ähnlich wie im Microarray-Assay wurden die steroidogenen Enzyme 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (kodiert durch Hsd3b) und das Cholesterin-Seitenkettenspaltungsenzym (kodiert durch Cyp11a1) in der positiven Fraktion angereichert. Während der Sertoli-Zellmarker Sox9 (SRY-box Transcription Factor 9) und der Keimzellmarker Sycp3 (Synaptonemal Complex Protein 3) in der negativen Fraktion angereichert waren (Abbildung 4). Zusammen zeigten diese Daten, dass die Transkriptome in Gli1+ -Zellen erfolgreich nach unten gezogen und durch das obige Protokoll angereichert wurden.
Abbildung 1: Immunfluoreszenzbilder der EGFP-Expression in NuTRAP-Reportermausmodellen. Der Gli1-CreERT2; NuTRAP und der Shh-CreERT2; NuTRAP-Mäuse wurden mit Tamoxifen behandelt, um die EGFP-Expression zu aktivieren. Im Hoden befanden sich Gli1+-Zellen im Interstitium, während sich in der Nebenniere Gli1+-Zellen in der Nebennierenkapsel befanden. In der Nebenniere waren Zellen unterhalb der Kapsel positiv auf SHH (EGFP+-Zellen in Shh-CreERT2; NuTRAP-Mäuse). SHH ist der Ligand des SHH-Signalwegs, der seine Funktion in Gli1+-Kapselzellen hervorruft 13. Maßstabsbalken: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: RNA-Qualität und -Quantität aus der TRAP-Extraktion. RNAs der positiven Fraktion, der negativen Fraktion und des Eingangs wurden mit einem Bioanalysator ausgewertet. Die positive Fraktion enthält RNAs, die nach der Inkubation mit dem GFP-Antikörper aus Protein-G-Perlen extrahiert wurden (Schritt 4.1). Die negative Fraktion enthält RNAs, die in Schritt 4.2 im Überstand verbleiben. Der Input enthält RNAs aus dem Homogenat (Schritt 3.3). Da im Elektropherogramm die Konzentrationen des unteren Markers (angezeigt als erster Peak bei 20-25 s der Migrationszeit der auf der X-Achse gezeigten Proben) und der Leiter (in diesen Elektropherogrammen nicht dargestellt) bekannt sind, kann die Konzentration jeder Probe berechnet werden. Die beiden Hauptpeaks bei 40-50 s repräsentieren die 18S und 28S rRNA. Das ribosomale Verhältnis (basierend auf der Fluoreszenzintensität auf der Y-Achse) wird verwendet, um die Integrität der RNA-Probe zu bestimmen. Die RNA-Integritätsnummer (RIN) jeder Probe wird in der oberen rechten Ecke jedes Diagramms angezeigt. Jeder Punkt im Punktdiagramm repräsentiert die Menge an RNA, die aus einem einzelnen Hoden extrahiert wurde. Die Menge an RNA jeder Probe in der negativen Fraktion und der Input wurde aus 25 μL Proben extrahiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Microarray-Analyse für TRAP-Proben. Die Ergebnisse von zwei Extraktionen (je ein Hoden) werden gezeigt. Die Microarray-Analyse identifizierte eine ähnliche Anzahl von differentiell exprimierten Genen aus zwei unabhängigen Extraktionen (Testis A und Hoden B). Rund 4.000 Gene wurden in der positiven Fraktion angereichert (rote Punkte), während ~3.000 Gene in der negativen Fraktion angereichert waren (grüne Punkte). Hsd11b1 und Hsd3b6 waren in positiven Fraktionen angereichert. Dhh und Gstm6 waren mit negativen Fraktionen angereichert. Nur wenige Gene wurden als differentiell exprimierte Gene zwischen der negativen Fraktion und dem Input identifiziert, was darauf hindeutet, dass der Hoden nur eine sehr kleine Anzahl von Gli1+-Zellen enthält. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: qPCR-Analyse für TRAP-Proben. Die qPCR-Analyse zeigte die relative Expression von zelltypspezifischen Genen in der positiven Fraktion und der negativen Fraktion. Die Expression jedes Gens wurde zuerst mit Actb normalisiert. Die relativen Expressionen der Gene innerhalb der positiven Fraktion wurden dann basierend auf der Expression von Sox9 (gesetzt als 10) berechnet. Für den negativen Bruch wurde Cyp11a1 (gesetzt als 10) verwendet, um den relativen Ausdruck zu normalisieren. Beachten Sie, dass die relative Expression der Zielgene nur innerhalb jeder Fraktion verglichen werden kann. Gene, die für die steroidogenen Enzyme (Hsd3b und Cyp11a1) kodieren, wurden in der positiven Fraktion angereichert. Während das Markergen für Keimzellen (Scyp3) und Sertoli-Zellen (Sox9) in der negativen Fraktion angereichert waren. Drei biologische Replikate (drei unabhängige Extraktionen, je ein Hoden) wurden gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Nützlichkeit der Ganzgewebe-Transkriptom-Analyse könnte gedämpft werden, insbesondere bei der Untersuchung komplexer heterogener Gewebe. Wie man zelltypspezifische RNAs erhält, wird zu einer dringenden Notwendigkeit, die leistungsstarke RNA-seq-Technik zu entfesseln. Die Isolierung zelltypspezifischer RNAs beruht in der Regel auf der Sammlung eines bestimmten Zelltyps mittels Mikromanipulation, fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) oder Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM)18. Andere moderne Hochdurchsatz-Einzelzellsammelmethoden und -instrumente wurden ebenfalls entwickelt19. Diese Methoden verwenden normalerweise die Mikrofluidik-Techniken, um einzelne Zellen zu barcoden, gefolgt von Einzelzell-RNA-seq. Die Zelldissoziation ist der erforderliche Schritt, um die suspendierte Zelllösung zu erhalten, die dann entweder einen Zellsortierer oder ein mikrofluidisches Gerät durchläuft, um jede Zelle mit einem Barcode zu versehen. Der Schritt der Zelldissoziation stellt diese Methoden für zelltypspezifische Studien vor Herausforderungen, da die enzymatische Behandlung nicht nur Gewebe abbaut, sondern auch die Zelllebensfähigkeit und die Transkriptionsprofile beeinflusst20. Darüber hinaus ist der Aufwand für Einzelzell-RNA-seq in der Regel hoch und erfordert spezielle Geräte vor Ort.
Kürzlich isolierten zwei Studien erfolgreich RNA/DNA bestimmter Zelltypen aus ganzen Geweben mit den NuTRAP-Mäusen 8,21. Ohne spezielle Geräte und Werkzeuge ermöglicht das NuTRAP-Mausmodell die Gewinnung von RNAs und DNAs aus bestimmten Zelltypen. Das NuTRAP-Allel könnte auf Cre-exprimierende Zellen ohne den Zelldissoziationsschritt abzielen, wodurch eine Veränderung der Lebensfähigkeit und der Transkriptionsprofile der Zelle vermieden wird. Rol et al. verwendeten das NuTRAP-Mausmodell, um Kerne zu isolieren und mRNA gleichzeitig aus Fettgewebe zu übersetzen. Die andere Studie zeigte auch, dass das NuTRAP-Mausmodell für Gliazellen im zentralen Nervensystem funktionieren könnte8.
In unserem Labor sind wir daran interessiert, die Stammzellpopulationen in steroidogenen Geweben wie Gli1+ interstitiellen Zellen im Hoden22 und Gli1+ Kapselzellen in der Nebenniere13 zu untersuchen. Die Herausforderung bei der Untersuchung von Gli1+-Zellen in diesen beiden Organen besteht darin, dass die Anzahl der Gli1+-Zellen im Hoden und in der Nebenniere gering ist. Zum Beispiel nimmt der Anteil der Leydig-Zellen, die die Hauptpopulation von Gli1+-Zellen im Hoden darstellen, nur etwa 3,8% des gesamten Hodenvolumens bei erwachsenen Mäusen ein23. Da die TRAP-Technik darauf abzielt, spezifisch translatierende Ribosomen-gebundene RNAs in komplexem Gewebe herunterzuziehen, könnte das NuTRAP-Mausmodell ein leistungsfähiges Werkzeug sein, das sich für die Untersuchung einer seltenen Zellpopulation in einem komplexen Gewebe eignet. Die zuvor veröffentlichten Protokolle mit NuTRAP-Mäusen zielen auf Adipozyten und Gliazellen ab, die im Gehirn und im Fettgewebe häufiger vorkommen als Gli1+-Zellen im Hoden und in der Nebenniere. Um sicherzustellen, dass wir die erforderlichen RNAs aus einer kleinen Anzahl von Zellen in einem komplexen Gewebe erhalten, haben wir die bestehenden Protokolle überarbeitet, indem wir (1) die Inkubationszeit mit dem GFP-Antikörper von 1 h auf über Nacht erhöht haben; (2) Verwendung eines anderen Typs von RNA-Extraktionskit, das darauf abzielt, eine kleine Menge RNA auf Pikogrammebene zu isolieren.
Wir haben gezeigt, dass dieses Protokoll qualitativ hochwertige zelltypspezifische RNAs aus einer kleinen Anzahl von Zellen in einem komplexen Gewebe erhalten kann. Die Qualität und Quantität der extrahierten RNAs sind für qPCR und einen kommerziellen Microarray-Service geeignet. Die Ergebnisse von Microarray und qPCR bestätigten, dass Leydig-Zellen-assoziierte Gene in der positiven Fraktion aus einem Hoden angereichert sind. Das Protokoll bietet hier einen detaillierten Ansatz zur Isolierung zelltypspezifischer translatierender Ribosom-mRNAs unter Verwendung des NuTRAP-Mausmodells. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um RNAs aus beliebigen EGFP-exprimierenden Zellen zu isolieren.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise von NIH R00HD082686 unterstützt. Wir danken dem Sommerforschungsstipendium der Endocrine Society an H.S.Z. Wir danken auch Dr. Yuan Kang für die Zucht und Pflege der Mauskolonie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
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