Summary
이 프로토콜은 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 유형 특이적 번역 리보솜 mRNA를 분리하는 것을 목표로 합니다.
Abstract
세포 이질성은 전사체 수준에서 복잡한 조직의 기능을 이해하는 데 어려움을 겪습니다. 세포 유형 특이적 RNA를 사용하면 조직의 이질성으로 인한 잠재적인 위험을 방지하고 강력한 전사체 분석을 가능하게 합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 번역 리보솜 친화성 정제(TRAP) 방법을 사용하여 세포 분류 없이 복잡한 조직에서 소량의 EGFP 발현 세포에서 리보솜 결합 RNA를 분리하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 최근 이용 가능한 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 유형 특이적 RNA를 분리하는 데 적합하며 EGFP 발현 세포에서 RNA를 분리하는 데에도 사용할 수 있습니다.
Introduction
RNA 시퀀싱(RNA-seq) 및 마이크로어레이를 포함한 고처리량 접근 방식을 통해 게놈 전체 수준에서 유전자 발현 프로필을 조사할 수 있게 되었습니다. 심장, 뇌 및 고환과 같은 복잡한 조직의 경우 세포 유형 특이적 데이터는 전체 조직 1,2,3의 RNA 사용을 비교하는 더 자세한 정보를 제공합니다. 세포 이질성의 영향을 극복하기 위해, 번역 리보솜 친화성 정제(TRAP) 방법은 2010년대 초부터 개발되어 왔다4. TRAP는 조직 해리없이 특정 세포 유형에서 리보솜 결합 RNA를 분리 할 수 있습니다. 이 방법은 초파리 배아5에서 극히 드문 근육 세포 집단을 표적으로 삼고, 모델 식물 Arabidopsis thaliana6에서 다른 뿌리 세포를 연구하고, 포유류7에서 내피 세포의 전사체 분석을 수행하는 것을 포함하여 다양한 유기체에서 트랜스플라톰(번역을 위해 리보솜에 모집되는 mRNA) 분석에 사용되었습니다.
TRAP은 모델 유기체의 리보솜에 태그를 지정하기 위해 유전자 변형이 필요합니다. Evan Rosen과 동료들은 최근 Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) 마우스8이라는 마우스 모델을 개발했으며, 이는 2017 년부터 Jackson Laboratory를 통해 제공되었습니다. 연구자들은 Cre 마우스 라인과 교차함으로써 이 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 분류 없이 Cre 발현 세포에서 리보솜 결합 RNA와 세포핵을 분리할 수 있습니다. NuTRAP 대립 유전자도 운반하는 Cre 발현 세포에서 EGFP/L10a 태그가 지정된 리보솜을 사용하면 친화성 풀다운 분석을 사용하여 번역 mRNA를 분리할 수 있습니다. 동일한 세포에서 비오틴 리가아제 인식 펩타이드(BLRP) 태그가 부착된 핵막(mCherry 양성이기도 함)은 친화성 또는 형광 기반 정제를 사용하여 핵 분리를 허용합니다. 같은 연구팀은 또한 핵막이 비오틴8없이 mCherry로만 표지 된 유사한 마우스 라인을 생성했습니다. 이 두 개의 유전자 변형 마우스 라인은 관심 있는 특정 유형의 세포의 쌍을 이루는 후성유전체 및 전사체 프로필을 특성화할 수 있는 액세스를 제공합니다.
고슴도치(Hh) 신호 전달 경로는 조직 발달에 중요한 역할을 합니다9. GLI 계열의 구성원인 GLI1은 전사 활성제 역할을 하며 Hh 신호 전달을 매개합니다. Gli1+ 세포는 부신과 고환을 포함한 많은 호르몬 분비 기관에서 찾을 수 있습니다. NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 Gli1+ 세포로부터 세포 유형 특이적 DNA 및 RNA를 분리하기 위해, Gli1-CreERT2 마우스를 NuTRAP 마우스와 교차시켰다. Shh-CreERT2 마우스는 또한 소닉 헤지혹(Shh) 발현 세포를 단리하는 것을 목표로 하는 NuTRAP 마우스와 교차하였다. 다음 프로토콜은 Gli1-CreERT2를 사용하는 방법을 보여줍니다. NuTRAP 마우스를 사용하여 성인 마우스 고환의 Gli1+ 세포에서 리보솜 결합 RNA를 분리합니다.
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Protocol
수행 된 모든 동물 실험은 Auburn University의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에서 승인 한 프로토콜을 따랐습니다.
참고: 다음 프로토콜은 Gli1-CreERT2의 P28에서 하나의 고환(약 100mg)을 사용합니다. NuTRAP 마우스 (무스 근육). 시약의 부피는 샘플 유형과 조직 수에 따라 조정해야 할 수도 있습니다.
1. 조직 수집
- CO2 챔버를 사용하여 마우스를 안락사시키고, 복부 표면을 70% 에탄올로 살균한다.
- 가위로 하복부를 열고 고환을 제거하십시오. 액체 질소 (LN2)를 사용하여 고환을 즉시 스냅 동결하십시오.
- 사용할 때까지 LN2 의 증기상에 샘플을 보관하십시오.
2. 시약 및 비드 준비
- 균질화 원액 준비: 50 mM 트리스(pH 7.4), 12 mMMgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40 및 1 mg/mL 헤파린을 추가합니다. 사용할 때까지 (최대 1 개월) 4 ° C에서 용액을 보관하십시오.
- 사용하기 전에 원액(단계 2.1)에서 균질화 작업 완충액을 새로 준비합니다: DTT(최종 농도: 1mM), 시클로헥시미드(최종 농도: 100μg/mL), 재조합 리보뉴클레아제(최종 농도: 200단위/mL) 및 프로테아제 억제제 칵테일(최종 농도: 1x)을 균질화 원액에 추가하여 필요한 양의 균질화 작업 완충액을 만듭니다. 사용할 때까지 새로 준비한 작업 버퍼를 얼음에 보관하십시오.
- 저염 및 고염 세척액을 준비하십시오.
- 저염 세척 완충액을 제조하여 50 mM 트리스(pH 7.4), 12 mMMgCl2, 100 mM KCl, 및 1% NP-40을 혼합하였다. 사용하기 전에 DTT(최종 농도: 1mM)와 사이클로헥시미드(최종 농도: 100μg/mL)를 추가합니다.
- 고염 세척 완충액을 제조하여 50 mM 트리스(pH 7.4), 12 mMMgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40을 혼합하였다. 사용하기 전에 DTT(최종 농도: 2mM)와 사이클로헥시미드(최종 농도: 100μg/mL)를 추가합니다.
- 단백질 G 비드 준비 (재료 표) :
- 각 샘플에는 50μL의 단백질 G 비드가 필요합니다. 필요한 양의 비드를 1.5mL 원심분리 튜브에 넣고 튜브를 랙에 30-60초 동안 그대로 두어 마그네틱 랙을 사용하여 비드를 용액에서 분리합니다.
- 피펫팅으로 상청액을 제거합니다. 매번 얼음처럼 차가운 저염 세척 완충액 1mL로 구슬을 세 번 씻습니다.
3. 조직 용해 및 균질화
- 2mL의 얼음처럼 차가운 균질화 작업 완충액(2.2단계에서 새로 준비)을 유리 티슈 그라인더 세트에 추가합니다. 냉동 샘플을 분쇄기에 빠르게 넣고 느슨한 유봉을 사용하여 얼음 위에서 30 스트로크로 조직을 균질화하십시오.
- 균질액을 2mL 둥근 바닥 튜브에 옮기고 12,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
- 상청액을 새 2mL 튜브로 옮깁니다. 1.5mL 튜브에 100μL를 "입력"으로 저장합니다.
- 상청액을 항-GFP 항체(5μg/mL; 1:400)와 함께 2mL 튜브에서 엔드 오버엔드 회전기(24rpm)에서 4°C에서 밤새 배양합니다.
4. 면역침전
- 균질액/항체 혼합물을 단계 2.4에서 세척된 단백질 G 비드를 포함하는 새로운 2mL 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 엔드 오버 엔드 로테이터(24rpm)에서 4°C에서 2시간 동안 배양합니다.
- 자석 랙을 사용하여 상청액으로부터 자성 비드를 분리한다. 상청액을 "음수 분획"으로 저장하십시오. 음성 분획에는 (1) EGFP 음성 세포의 RNA와 (2) 리보솜에 결합하지 않은 EGFP 양성 세포의 RNA가 포함됩니다.
- 비드에 고염 세척 버퍼 1mL를 추가하고 튜브를 잠시 와류하여 비드를 세척합니다. 튜브를 자석 랙에 놓습니다.
- 세척 버퍼를 제거합니다. 세척 단계를 두 번 더 반복하십시오. 비드는 이제 EGFP 양성 세포의 비드-리보솜-RNA 복합체를 포함합니다.
5. RNA 추출
참고: 다음 단계는 RNA 분리 키트(재료 표)에서 채택된 것입니다. 각 분획(즉, 입력, 양성 및 음성)을 독립적인 샘플로 처리하고 RNA를 독립적으로 분리합니다.
- 단계 4.4의 비드를 50μL의 추출 버퍼(RNA 분리 키트에서)와 함께 써모믹서(42°C, 500rpm)에서 30분 동안 인큐베이션하여 비드에서 RNA를 방출합니다.
- 자석 랙으로 비드를 분리하고 비드-리보솜-RNA 복합체가 포함된 상청액을 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
- 튜브를 3000 x g 에서 2분 동안 원심분리한 다음 상층액을 새 1.5mL 튜브에 피펫팅합니다. 이 튜브에는 TRAP 단계의 "양의 분획"이 포함되어 있습니다.
참고: 입력 및 음성 분획의 경우 1mL의 추출 버퍼를 사용하여 25μL의 샘플에서 RNA를 추출합니다. 써모믹서(42°C, 500 rpm)에서 30분 동안 배양한다. - RNA 정제 컬럼의 사전 컨디셔닝: 250μL의 컨디셔닝 버퍼를 정제 컬럼에 피펫팅합니다. 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다. 컬럼을 16,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
- 피펫 동량의 70% EtOH를 단계 5.3으로부터의 상청액 내로 넣는다(약 50 μL의 70% EtOH 양성 분획 및 1 mL의 70% EtOH 및 1 mL의 70% EtOH 및 음성 분획). 위아래로 피펫팅하여 잘 섞는다.
- 혼합물을 5.4단계의 컬럼에 피펫팅합니다.
- 컬럼의 멤브레인에 RNA가 결합할 수 있도록 컬럼을 100 x g에서 2분 동안 원심분리한 다음 즉시 16,000 x g 에서 30초 동안 원심분리를 계속합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
참고: 입력 및 음수 분획의 경우 매번 250μL의 혼합물을 컬럼에 추가합니다. 모든 혼합물이 사용될 때까지 5.6단계와 5.7단계를 반복합니다. - 컬럼에 100μL의 세척 버퍼 1(W1)을 피펫팅하고 8,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
- 피펫 75 μL의 DNase 용액을 정제 컬럼 멤브레인에 직접 혼합합니다. RT에서 15 분 동안 배양하십시오.
- 컬럼에 W1 40μL를 피펫팅하고 8,000 x g 에서 30초 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
- 100 μL의 세척 완충액 2(W2)를 컬럼에 피펫팅하고 8,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
- 100 μL의 W2를 컬럼에 피펫팅하고 16,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다. 동일한 컬럼을 16,000 x g 에서 1분 동안 다시 원심분리하여 용리 단계 전에 세척 버퍼의 모든 흔적을 제거합니다.
- 컬럼을 새 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- RNase가 없는 물 12μL를 정제 컬럼의 멤브레인에 직접 피펫팅합니다. 피펫 팁이 멤브레인에 닿지 않아야합니다. RT에서 1 분 동안 배양하고 1000 x g 에서 1 분 동안 원심 분리합니다. 그런 다음 16,000 x g 에서 1분 동안 원심분리를 계속하여 RNA를 용리합니다.
6. RNA 농도 및 품질
- 추출된 RNA10의 품질과 양을 평가하기 위해 바이오분석기를 사용한다.
7. 저장 및 추가 분석
- 추가 분석(예: 마이크로어레이, 정량적 PCR(qPCR) 및 RNA-seq 등)이 있을 때까지 RNA를 -80°C(최대 1년)에서 저장합니다.
참고: cDNA 합성을 포함한 qPCR 분석에 대한 자세한 내용은 Lyu et al.11을 참조하십시오. qPCR용 프라이머는 재료표에 나열되어 있습니다.
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Representative Results
Gli1-CreERT2 마우스 (잭슨 랩 스톡 번호: 007913)를 먼저 NuTRAP 리포터 마우스 (잭슨 랩 스톡 번호: 029899)와 교차시켜 이중 돌연변이 마우스를 생성하였다. 유전자 조작 유전자 대립 유전자 (즉, Gli1-CreERT2 및 NuTRAP)를 모두 보유한 마우스에 하루에 한 번, 격일로 3 회 주사 할 때 타목시펜을 주사 하였다. 조직 샘플은 주사 후 1일째 되는 날인 7일째에 수집하였다. 면역 형광 분석 결과 EGFP는 고환의 간질 세포에서 발현되었습니다 (그림 1). 부신 캡슐은 Gli112,13의 또 다른 세포 집단 양성인 것으로 알려져 있습니다. EGFP는 또한 Gli1-CreERT2의 부신 캡슐 세포에서 발견되었습니다. NuTRAP 마우스 (그림 1). 우리 연구실은 또한 Shh-CreERT2를 가지고 있습니다. 누트랩 마우스. Shh-CreERT2에서; NuTRAP 마우스, EGFP+ 세포 집단은 캡슐 아래 부신의 외부 피질에 상주하며(그림 1), 부신의 Shh+ 영역에 있는 EGFP+ 세포의 동일한 발현 부위(그림 13)는 Cre 발현 세포에서 EGFP의 발현을 확인했습니다.
세포 유형 특이적 RNA를 추출한 후, 바이오분석기를 사용하여 두 개의 독립적인 추출(각 추출에 사용된 하나의 고환)에서 각 분획에서 분리된 RNA의 양과 품질을 평가했습니다(그림 2). 생물 분석기 결과는이 프로토콜이 세 가지 분획 모두에서 고품질 RNA를 얻을 수 있음을 나타냅니다. 모든 분획은 유사한 RNA 무결성 번호 (RIN)를 가졌다.
추출된 RNA가 세포 유형 특이적인지 여부를 추가로 테스트하기 위해, 추출된 RNA를 상용 마이크로어레이 서비스를 사용하여 마이크로어레이 분석을 위해 보냈습니다(재료 표 참조). 마이크로어레이 결과는 음성 분획에 비해 양성 분획에서 약 4,000개의 유전자가 농축된 반면, 음성 분획에는 약 3,000개의 유전자가 풍부하다는 것을 보여주었습니다(그림 3). 이들 차등적으로 발현된 유전자 중에서, 라이디그-세포-연관 유전자 Hsd11b1 및 Hsd3b6 14,15가 양성 분획에서 풍부하였다. 음성 분획에서, 세르톨리-세포-연관 유전자 Dhh 및 Gstm616,17이 풍부하였다. 음성 분획을 입력과 비교할 때 몇 가지 차등적으로 발현된 유전자만이 확인되었습니다.
실시간 정량적 RT-PCR (qPCR)은 또한 양성 분획 및 음성 분획에서 핵심 유전자의 발현을 확인하기 위해 사용되었다. 마이크로어레이 분석에서 발견된 것과 유사하게, 스테로이드 생성 효소 3β-하이드록시스테로이드 탈수소효소( Hsd3b에 의해 암호화됨) 및 콜레스테롤 측쇄 절단 효소( Cyp11a1에 의해 암호화됨)가 양성 분획에서 풍부하게 되었다. 반면 Sertoli 세포 마커 Sox9 (SRY-box 전사 인자 9) 및 생식 세포 마커 Sycp3 (시냅톤 복합체 단백질 3)는 음성 분획에서 풍부했습니다 (그림 4). 이러한 데이터는 함께 Gli1+ 세포의 전사체가 위의 프로토콜에 의해 성공적으로 제거되고 농축되었음을 입증했습니다.
그림 1: NuTRAP 리포터 마우스 모델에서 EGFP 발현의 면역형광 이미지. 글리1-크리어T2; NuTRAP 및 Shh-CreERT2; NuTRAP 마우스를 타목시펜으로 처리하여 EGFP 발현을 활성화시켰다. 고환에서 Gli1+ 세포는 간질에 있는 반면 부신에서는 Gli1+ 세포가 부신 캡슐에 있었습니다. 부신에서 캡슐 아래의 세포는 SHH (Shh-CreERT2의 EGFP + 세포; NuTRAP 마우스). SHH는 Gli1+ 캡슐 세포13에서 기능을 유도하는 SHH 신호 전달 경로의 리간드입니다. 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: TRAP 추출의 RNA 품질 및 양. 양성 분획, 음성 분획 및 투입된 RNA는 바이오분석기를 사용하여 평가하였다. 양성 분획은 GFP 항체와 함께 인큐베이션한 후 단백질 G 비드로부터 추출한 RNA를 함유한다(단계 4.1). 음성 분획은 단계 4.2에서 상청액에 남아있는 RNA를 포함합니다. 입력은 균질 액으로부터의 RNA를 포함한다 (단계 3.3). 전기 페로 그램에서는 하부 마커 (X 축에 표시된 샘플의 이동 시간의 20-25 초에서 첫 번째 피크로 표시됨)와 래더 (이 전기 페로 그램에 표시되지 않음)의 농도가 알려져 있기 때문에 각 샘플의 농도를 계산할 수 있습니다. 40-50초의 두 가지 주요 피크는 18S 및 28S rRNA를 나타냅니다. 리보솜 비율(Y축에 표시된 형광 강도 기준)은 RNA 샘플의 무결성을 결정하는 데 사용됩니다. 각 샘플의 RNA 무결성 번호(RIN)는 각 플롯의 오른쪽 상단 모서리에 표시됩니다. 점도표의 각 점은 단일 고환에서 추출된 RNA의 양을 나타냅니다. 각 샘플의 양을 음성 분획 및 투입하여 25 μL의 샘플로부터 추출하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: TRAP 샘플에 대한 마이크로어레이 분석. 2 개의 추출 결과 (각각 하나의 고환)가 표시됩니다. 마이크로 어레이 분석은 두 개의 독립적 인 추출 (고환 A 및 고환 B)에서 유사한 수의 차등 발현 유전자를 확인했다. 양성 분획에서는 약 4,000개의 유전자(빨간색 점)가 농축된 반면, 음성 분획에서는 ~3,000개의 유전자(녹색 점)가 풍부했습니다. Hsd11b1 및 Hsd3b6 은 양성 분획으로 농축되었다. Dhh 및 Gstm6 은 음의 분획으로 농축되었다. 음성 분획과 입력 사이에 차등적으로 발현된 유전자로 확인된 유전자는 소수에 불과했으며, 이는 고환에 매우 적은 수의 Gli1+ 세포만 포함되어 있음을 시사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: TRAP 샘플에 대한 qPCR 분석. qPCR 분석 결과 양성 분획과 음성 분획에서 세포 유형 특이적 유전자의 상대적 발현을 보여주었다. 각 유전자의 발현은 먼저 Actb 로 정규화하였다. 그런 다음 양성 분획 내 유전자의 상대적 발현을 Sox9 (10으로 설정)의 발현에 기초하여 계산하였다. 음성 분획의 경우, Cyp11a1 (10으로 설정)을 사용하여 상대 발현을 정규화했습니다. 표적 유전자의 상대적 발현은 각 분획 내에서만 비교할 수 있습니다. 스테로이드 생성 효소 (Hsd3b 및 Cyp11a1)를 암호화하는 유전자는 양성 분획으로 풍부 해졌다. 반면 생식 세포(Scyp3) 및 세르톨리 세포(Sox9)에 대한 마커 유전자는 음성 분획에서 풍부하였다. 3 개의 생물학적 복제 (3 개의 독립적 인 추출, 각각 1 개의 고환)가 나타났다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
전체 조직 전사체 분석의 유용성은 특히 복잡한 이종 조직을 연구할 때 저해될 수 있습니다. 세포 유형 특이적 RNA를 얻는 방법은 강력한 RNA-seq 기술을 발휘하는 것이 시급한 필요성이 되고 있다. 세포 유형 특이적 RNA의 분리는 일반적으로 미세 조작, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 레이저 포획 미세 해부(LCM)18를 사용한 특정 유형의 세포 수집에 의존합니다. 다른 현대의 고처리량 단일 세포 수집 방법 및 기기도 개발되었습니다(19). 이러한 방법은 일반적으로 미세 유체 기술을 사용하여 단일 세포에 바코드를 적용한 다음 단일 세포 RNA-seq를 바꿉니다. 세포 해리는 부유 세포 용액을 얻는 데 필요한 단계이며, 그런 다음 세포 분류기 또는 미세 유체 장치를 통해 각 세포를 바코드화합니다. 세포 해리 단계는 효소 처리가 조직을 분해할 뿐만 아니라 세포 생존율 및 전사 프로파일에도 영향을 미치기 때문에 세포 유형 특이적 연구를 위한 이러한 방법에 대한 도전을 도입합니다20. 또한 단일 세포 RNA-seq에 대한 비용은 일반적으로 높으며 현장에 특수 장비가 필요합니다.
최근 두 연구에서 NuTRAP 마우스 8,21을 사용하여 전체 조직에서 특정 세포 유형의 RNA/DNA를 성공적으로 분리했습니다. 특정 장비와 도구를 사용하지 않고 NuTRAP 마우스 모델을 사용하면 특정 유형의 세포에서 RNA와 DNA를 얻을 수 있습니다. NuTRAP 대립 유전자는 세포 해리 단계 없이 Cre 발현 세포를 표적으로 삼아 세포의 생존력 및 전사 프로파일 변경을 피할 수 있습니다. Rol 등은 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 핵을 분리하고 지방 조직에서 mRNA를 동시에 번역했습니다. 다른 연구는 또한 NuTRAP 마우스 모델이 중추 신경계의 신경교 세포에 작용할 수 있음을 입증했습니다8.
우리 연구실에서는 고환22의 Gli1+ 간질 세포 및 부신13의 Gli1+ 캡슐 세포와 같은 스테로이드 생성 조직의 줄기 세포 집단을 연구하는 데 관심이 있습니다. 이 두 기관에서 Gli1+ 세포를 연구하는 문제는 고환과 부신의 Gli1+ 세포 수가 적다는 것입니다. 예를 들어, 고환에서 Gli1+ 세포의 주요 집단인 Leydig 세포의 비율은 성인 마우스(23)에서 전체 고환 부피의 약 3.8%만을 차지합니다. TRAP 기술은 복잡한 조직에서 리보솜 결합 RNA를 특이적으로 끌어내리는 것을 목표로 하기 때문에 NuTRAP 마우스 모델은 복잡한 조직에서 희귀 세포 집단을 연구하는 데 적합한 강력한 도구가 될 수 있습니다. NuTRAP 마우스를 사용하여 이전에 발표된 프로토콜은 고환과 부신의 Gli1+ 세포에 비해 뇌와 지방 조직에 더 풍부한 지방세포와 신경교세포를 표적으로 합니다. 복잡한 조직의 소수의 세포에서 필요한 RNA를 얻을 수 있도록 (1) GFP 항체를 사용한 배양 시간을 1시간에서 밤새 연장하여 기존 프로토콜을 수정했습니다. (2) 피코그램 수준에서 소량의 RNA를 분리하는 것을 목표로 하는 다른 유형의 RNA 추출 키트를 사용합니다.
우리는 이 프로토콜이 복잡한 조직의 소수의 세포에서 고품질 세포 유형 특이적 RNA를 얻을 수 있음을 입증했습니다. 추출된 RNA의 품질과 양은 qPCR 및 상용 마이크로어레이 서비스가 가능합니다. 마이크로어레이 및 qPCR의 결과는 Leydig 세포 관련 유전자가 하나의 고환에서 나오는 양성 분획에서 풍부함을 확인했습니다. 이 프로토콜은 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 유형 특이적 번역 리보솜 mRNA를 분리하는 상세한 접근 방식을 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 임의의 EGFP-발현 세포로부터 RNA를 단리하는데 사용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 NIH R00HD082686에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 우리는 HSZ에 내분비 학회 여름 연구 펠로우십에 감사드립니다. 우리는 또한 마우스 식민지를 번식시키고 유지 한 Yuan Kang 박사에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
References
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).
- Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).
- Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Varjosalo, M., Taipale, J. Hedgehog: functions and mechanisms. Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , Application Note 1 1-8 (2004).
- Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
- King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
- Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
- Benton, L., Shan, L. -X., Hardy, M. P. Differentiation of adult Leydig cells. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).
- Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
- Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
- Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481 (2009).
- Gross, A., et al. Technologies for single-cell isolation. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
- Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).
