Summary
La préparation intensive de « tubes » endothéliaux cérébraux intacts de souris à partir d’artérioles parenchymateuses cérébrales est illustrée pour étudier la régulation du flux sanguin cérébral. De plus, nous démontrons les forces expérimentales de ce modèle d’étude endothéliale pour l’imagerie par fluorescence et la mesure électrophysiologique des principales voies de signalisation cellulaire, y compris les changements dans le potentiel intracellulaire [Ca2+] et membranaire.
Abstract
Le flux sanguin cérébral est véhiculé par les artères de résistance vasculaire et les artérioles parenchymateuses en aval. La résistance vasculaire à l’état d’équilibre au flux sanguin augmente avec la diminution du diamètre des artères aux artérioles qui alimentent finalement les capillaires. En raison de leur plus petite taille et de leur emplacement dans le parenchyme, les artérioles ont été relativement peu étudiées et avec moins de reproductibilité dans les résultats que les artères piales de surface. Quoi qu’il en soit, la structure et la fonction des cellules endothéliales artériolaires – qui font partie intégrante de la physiologie et de l’étiologie des maladies dégénératives chroniques – nécessitent une enquête approfondie. En particulier, de nouvelles preuves démontrent que la fonction endothéliale compromise précède et exacerbe les troubles cognitifs et la démence.
Dans la microcirculation parenchymateuse, la fonction endothéliale du canal K + est le stimulus le plus robuste pour contrôler finement la propagation de la vasodilatation afin de favoriser l’augmentation du flux sanguin vers les zones d’activité neuronale. Cet article illustre une méthode raffinée pour isoler fraîchement des « tubes » endothéliaux intacts et couplés électriquement (diamètre, ~ 25 μm) à partir d’artérioles parenchymateuses du cerveau de souris. Les tubes endothéliaux artériolaires sont fixés dans des conditions physiologiques (37 °C, pH 7,4) pour résoudre les variables expérimentales qui englobent la fonction du canal K+ et leur régulation, y compris la dynamique intracellulaire du Ca2+ , les changements dans le potentiel membranaire et la régulation des lipides membranaires. Un avantage technique distinct par rapport à l’endothélium artériel est la résolution morphologique améliorée des dimensions des cellules et des organites (par exemple, les mitochondries), ce qui élargit l’utilité de cette technique. Une perfusion cérébrale saine tout au long de la vie implique une fonction endothéliale robuste dans les artérioles parenchymateuses, reliant directement le flux sanguin à l’alimentation de l’activité neuronale et gliale dans des régions anatomiques précises du cerveau. Ainsi, on s’attend à ce que cette méthode fasse progresser de manière significative les connaissances générales en physiologie vasculaire et en neurosciences concernant le cerveau sain et malade.
Introduction
Les artérioles parenchymateuses fournissent directement de l’oxygène et des nutriments essentiels dans tout le cerveau1. Lors de l’interfaçage avec les capillaires, les artérioles hautement vasoactives répondent à la signalisation rétrograde initiée par les canaux ioniques capillaires qui détectent les signaux métaboliques de régions neuronales spécifiques2. Le parenchyme cérébral ayant historiquement fait l’objet de la majeure partie des recherches, un rôle pour le dysfonctionnement endothélial est maintenant apparu pour clarifier les mécanismes pathologiques associés à divers troubles cérébrovasculaires qui sous-tendent la démence (par exemple, accident vasculaire cérébral ischémique, maladie d’Alzheimer)3,4,5,6 . L’endothélium fait partie intégrante de la perfusion du cerveau en accord avec l’hétérogénéité de la génétique, de la structure et de la fonction dans les segments vasculaires7. Les artères piales ont été largement étudiées en raison de leur taille relativement grande, de leur résistance vasculaire segmentaire élevée et de leur rôle dans la distribution du flux sanguin vers le cerveau sous-jacent 8,9. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes endothéliaux artériolaires améliorera probablement la compréhension de la régulation du flux sanguin cérébral dans la santé et la maladie en vue du développement de nouveaux schémas thérapeutiques.
De nouvelles preuves soulignent l’importance d’étudier les artérioles parenchymateuses en relation avec différentes voies de signalisation et maladies 8,10. Cependant, cette approche s’est limitée à l’utilisation de préparations intactes d’artériole11 sous pression et/ou d’artériole capillaire-parenchymateuse (CaPA)12. Les cellules endothéliales artériolaires cérébrales natives fraîchement isolées et dépourvues d’autres types de cellules et de facteurs de confusion n’ont pas été examinées, probablement en raison de difficultés techniques dans leur isolement. Cet article avance une technique antérieure mettant en évidence l’isolement de l’endothélium artériel pial13 pour isoler maintenant de manière fiable et reproductible l’endothélium des artérioles parenchymateuses du cerveau (largeur: ~25 μm, longueur: ~250 μm). Cette technique permet d’obtenir une résolution optimale des cellules couplées électriquement et chimiquement dans leur orientation individuelle et leurs réseaux cellulaires.
Les principales voies d’intérêt ont inclus l’interaction de la signalisation intracellulaire ca2+ ([Ca2+]i) et l’hyperpolarisation du potentiel membranaire (Vm)14,15 – partie intégrante de la vasodilatation16 – pour permettre au sang de pénétrer dans les capillaires et de fournir de l’oxygène et des nutriments au parenchymeactif 17. Ces préparations permettent des enregistrements électrophysiologiques en temps réel des canaux ioniques, y compris les canaux ca2+-perméants, le potentiel récepteur transitoire (TRP) et les canaux K+ et/ou l’imagerie fluorescente des organites intracellulaires dans les tubes cellulaires endothéliaux dans des conditions quasi physiologiques. Il s’agit d’une technique appropriée pour les chercheurs intéressés par les mécanismes cellulaires physiologiques qui régissent le contrôle des cellules endothéliales de l’administration du flux sanguin cérébral au parenchyme cérébral. Dans l’ensemble, cette technique aidera les chercheurs à mieux comprendre les voies fondamentales de signalisation endothéliale et la communication en réseau des artérioles intégrées dans le parenchyme cérébral tout en abordant les questions liées à la physiologie et à la pathologie cérébrovasculaires.
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Protocol
Les expérimentateurs doivent s’assurer que l’utilisation désignée des animaux et les protocoles connexes sont approuvés par leur Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) et effectués conformément au « Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire » du Conseil national de recherches du Canada (8e édition, 2011) et aux lignes directrices ARRIVE. L’IACUC de l’Université de Loma Linda et l’Université de l’Arizona ont approuvé tous les protocoles utilisés pour ce manuscrit pour les souris C57BL/6N et 3xTg-AD (mâles et femelles; tranche d’âge: 2-30 mois). Voir la figure 1 comme un aperçu de l’isolement et de l’examen des tubes endothéliaux artériolaires fraîchement isolés à partir d’artérioles parenchymateuses du cerveau de souris.
1. Matériaux et équipements
REMARQUE : Voir le Tableau des matériaux pour tous les réactifs et matériaux requis pour ce protocole. En outre, les manuels et les sites Web associés aux fournisseurs respectifs peuvent également être consultés au besoin. Des illustrations de stations de dissection et d’appareils expérimentaux ont déjà été fournies13.
- Chambre d’écoulement
- Fixez une chambre de superfusion avec un couvercle en verre sur une plate-forme composée d’aluminium anodisé. Fixez la plate-forme avec la chambre sur un étage de microscope en aluminium.
- Placez un micromanipulateur tenant une pipette d’épinglage à chaque extrémité de la plate-forme sur l’étage du microscope en aluminium.
REMARQUE: Si nécessaire, utilisez un appareil à étage transférable avec une unité de chambre d’écoulement pour déplacer un tube endothélial isolé et sécurisé d’un appareil de microscope à un autre pour l’expérimentation.
- Microscopes
- Utilisez des stéréomicroscopes (plage de grossissement de 5 à 50x) et des sources lumineuses à fibre optique pour les procédures de dissection.
- Pour isoler les tubes endothéliaux, utilisez un microscope inversé équipé d’objectifs compatibles avec le contraste de phase ou le contraste d’interférence différentielle (DIC) (10x, 20x et 40x) et un étage en aluminium.
- Ayez un contrôleur de pompe à microsyringe prêt à côté de l’appareil dédié à l’isolation des tubes endothéliaux des vaisseaux sanguins partiellement digérés.
- Installez l’appareil expérimental en disposant un microscope inversé (objectifs: 4x, 10x, 20x, 40x et 60x) et un étage manuel en aluminium sur une table d’isolation des vibrations.
- Appareil de contrôle intracellulaire Vm
- Connectez l’électromètre à un headstage compatible. Utilisez des accessoires, tels qu’un générateur de fonction et un stimulateur, pour les protocoles nécessitant une injection de courant.
- Connectez les sorties d’amplificateur à un système de numérisation de données, à un oscilloscope et à des moniteurs de base audibles. Fixez l’électrode de bain de référence (pastille Ag/AgCl) près de la sortie de la chambre d’écoulement.
- Assemblez un système photométrique avec des composants intégrés d’une interface de système de fluorescence, d’une lampe à arc à haute intensité et d’une alimentation électrique, d’un hypercommutateur, d’un tube photomultiplicateur (ou PMT) et d’une caméra pour mesurer [Ca2+]i dans les cellules endothéliales.
- Assemblez un régulateur de température équipé d’un réchauffeur en ligne pour élever et maintenir une température physiologique (37 °C) tout au long de l’expérience.
- Assemblez une plate-forme multicanal connectée à un contrôleur de vanne avec une vanne de régulation de débit en ligne pour contrôler la livraison de solutions aux tubes endothéliaux fixés dans la chambre.
- Micropipettes et électrodes tranchantes
REMARQUE: L’expérimentateur aura besoin d’un extracteur de verre électronique et d’une microforge pour préparer la trituration et épingler les pipettes.- Pour séparer le tube endothélial du segment artériolaire partiellement digéré, préparez des pipettes de trituration polies thermiquement (diamètre interne de la pointe: 30-50 μm) à partir de capillaires en verre borosilicate.
- Pour fixer le tube endothélial dans la chambre de superfusion, préparez des pipettes d’épinglage polies à la chaleur avec une extrémité sphérique émoussée (diamètre extérieur: 50-70 μm) préparée à partir de capillaires en verre borosilicate à paroi mince.
- Pour enregistrer Vm d’une cellule endothéliale, préparez des électrodes pointues avec une résistance de pointe d’environ 150 ± 30 MΩ à partir de capillaires en verre en utilisant uniquement le extracteur de verre.
2. Solutions et médicaments
- Solution saline physiologique (PSS)
- Préparer un minimum de 1 L de PSS en utilisant 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM deCaCl2, 1 mM deMgCl2, 10 mM d’acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique (HEPES) et 10 mM de glucose.
- Préparer les solutions nécessaires dépourvues de CaCl2 (zéro Ca2+ PSS) pour la dissection des artérioles cérébrales et l’isolement du tube endothélial.
REMARQUE: Préparer toutes les solutions dans H2O désionisé ultrapur, suivi d’une filtration (0,22 μm). Assurez-vous que le produit final contient un pH de 7,4 avec une osmolalité comprise entre 290 et 300 mOsm.
- Albumine sérique bovine (BSA, 10 %)
- Dissoudre 1 g de poudre de BSA lyophilisée dans un bécher de 10 mL de Ca2+ PSS nul. Couvrir le bécher et laisser reposer au moins 2 h en remuant lentement pour que le BSA se dissolve.
- Filtrer la solution à l’aide d’une seringue de 10 mL plus un filtre de 0,22 μm et préparer 1 mL d’aliquotes à conserver à -20 °C.
- Solution de dissection
- Ajouter 500 μL de BSA (10 %) à 49,5 mL de Ca2+ PSS zéro pour un volume total de 50 mL.
- Transférer la solution dans une boîte de Petri pour des dissections artériolaires.
- Solution de dissociation
- Ajouter 5 μL de solution de CaCl2 (1 M) et 500 μL de BSA (10 %) à 49,5 mL de Ca2+ PSS zéro pour un volume total de 50 mL. Incuber la solution à température ambiante pendant au moins 1 h.
- Enzymes
- Préparer 1 mL de solution de digestion avec 100 μg/mL de papaïne, 170 μg/mL de dithioérythritol, 250 μg/mL de collagénase (mélange de type H) et 40 μg/mL d’élastase.
REMARQUE: Les activités enzymatiques peuvent varier, bien que les protocoles réussis nécessiteront probablement les activités enzymatiques suivantes: ≥ 10 unités / mg pour la papaïne, ≥ 1 unité / mg pour la collagénase et ≥ 5 unités / mg pour l’élastase.
- Préparer 1 mL de solution de digestion avec 100 μg/mL de papaïne, 170 μg/mL de dithioérythritol, 250 μg/mL de collagénase (mélange de type H) et 40 μg/mL d’élastase.
- Fura-2 et agents pharmacologiques
- Préparer le bouillon de Fura-2 AM dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO; 1 mM). Préparer 500 μL de concentration de travail (10 μM) en ajoutant 5 μL de la matière à 495 μL de PSS pour le chargement.
- Préparer au moins 50 mL de concentrations opérationnelles d’agents pharmacologiques dans le PSS ou le DMSO, selon le cas.
- Solution de conduction
- Préparer 2 M KCl en dissolvant KCl dans H2O désionisé (7,455 g de KCl dans 50 mL de H2O). Passer la solution à travers une seringue avec un filtre de 0,22 μm avant de remplir les électrodes tranchantes.
- Trackers d’organites fluorescents et anticorps
- Préparer des traceurs de membrane plasmique ou organellaires (p. ex. noyau, réticulum endoplasmique) dans la solution saline physiologique appropriée conformément aux instructions du fabricant.
- Préparer les anticorps primaires et secondaires selon les instructions du fabricant dans la solution saline physiologique appropriée.
3. Dissection et isolement des artérioles cérébrales de souris
REMARQUE: Les stéréomicroscopes et les outils de microdissection affûtés (par exemple, les pinces à pointe fine, les ciseaux de dissection de style Vannas) doivent être utilisés pour le grossissement de l’échantillon (jusqu’à 50x) dans toutes ces procédures de dissection.
- Isolement du cerveau de la souris
- Anesthésier une souris de laboratoire standard (p. ex., C57BL/6, 3xTg-AD; 2 à 30 mois, mâle ou femelle) par inhalation d’isoflurane (3 % pendant 2 à 3 min), suivie d’une décapitation immédiate à l’aide de ciseaux tranchants ou de guillotine selon l’approbation de l’IACUC. Placer la tête de souris dans une boîte de Petri (diamètre 10 cm, profondeur 1,5 cm) contenant une solution de dissection froide (4 °C).
- Lors de la visualisation sous un stéréomicroscope, retirez la peau et les poils sur le crâne et lavez l’excès de sang avec une solution de dissection froide. À l’aide des pointes des ciseaux à dissection standard (p. ex. lames de 24 mm), faites une incision en commençant par l’os occipital et en s’étendant jusqu’à travers l’os nasal du crâne. Utilisez des pinces à pointe grossière pour ouvrir soigneusement le crâne le long de l’incision et séparez le tissu conjonctif (membrane méningée) pour isoler le cerveau contenant un cercle intact de Willis.
- Lavez le cerveau isolé avec une solution de dissection froide dans un bécher ou une boîte de Pétri pour éliminer le sang restant de la surface du cerveau. Placer la face ventrale du cerveau vers le haut dans une chambre contenant une solution de dissection froide pour isoler les artérioles parenchymateuses (Figure 2A).
- Isolement des artérioles parenchymateuses
REMARQUE: Les artérioles provenant des artères cérébrales moyennes (MCA) et intégrées dans le parenchyme cérébral sont choisies pour ce protocole. Les artérioles sont isolées comme décrit précédemment11, avec modification.- Utilisez des broches en acier (diamètre: 0,2 mm, longueur: 11 à 12 mm) pour fixer le cerveau isolé dans une solution de dissection froide dans une boîte de Petri contenant un revêtement en polymère de silicium infusé de charbon de bois (profondeur ≥ 50 cm).
- À l’aide de ciseaux de dissection tranchants et alignés, coupez un rectangle de tissu cérébral (longueur: 5 mm, largeur: 3 mm) (Figure 2B) autour du MCA tout en vous assurant que la partie supérieure du segment tissulaire est au-delà du point de ramification du cercle de Willis. Coupez un autre rectangle de tissu cérébral de l’autre hémisphère du cerveau pour accéder à plus d’artérioles si nécessaire.
- Fixez le segment de tissu cérébral séparé dans le plat avec le MCA tourné vers le haut (distal du cercle de Willis) à l’aide de broches en acier (diamètre: 0,1 mm, longueur: 13 à 14 mm). Faites soigneusement une incision peu profonde près des broches pour retirer la pia avec une petite pince, en pelant doucement d’une extrémité vers l’autre (Figure 2C). Retirez la pia de l’autre segment tissulaire pour accéder à plus d’artérioles si nécessaire. Fixez soigneusement la pia isolée avec des artérioles parenchymateuses ramifiées à partir de MCA dans le plat avec les épingles et disséquez les artérioles parenchymateuses (Figure 2D), en veillant à ce que les artérioles ne soient pas endommagées.
REMARQUE: Si les artérioles ne sont pas facilement retirées avec la pia du parenchyme, utilisez une pince fine et creusez dans le cerveau, en commençant par le point de branche MCA du cercle de Willis. Localisez l’artériole, desserrez soigneusement le tissu autour des artérioles (figure 2E) et retirez doucement l’artériole du parenchyme, en maintenant l’extrémité supérieure de l’artériole (figure 2F). Plusieurs artérioles (longueur: ~ 1,5-2 mm) peuvent être isolées à partir d’un rectangle de tissu cérébral. - Assurez-vous que l’artériole est propre sans tissu attaché et coupez toutes les branches distales restantes (figure 3A). Utilisez cet artériole propre et intact pour la digestion enzymatique. Alternativement, coupez chaque artériole en deux morceaux (longueur: 0,75-1 mm) pour la digestion enzymatique pour la préparation de tubes endothéliaux si vous le souhaitez.
4. Digestion des artérioles parenchymateuses et préparation des tubes endothéliaux
- Disposition de l’équipement et des pipettes
NOTE: L’isolement des trompes endothéliales artérielles du cerveau a été décrit précédemment13,18. Le protocole actuel incorpore des modifications pour l’isolement de l’endothélium des artérioles parenchymateuses (intracérébrales). Plusieurs artérioles et/ou morceaux d’artérioles peuvent être utilisés ensemble pour la digestion enzymatique.- Assemblez l’appareil de trituration13 pour la préparation de tubes endothéliaux à l’aide d’un étage en aluminium supportant une chambre et des micromanipulateurs. Assemblez un microscope équipé d’objectifs (5x-60x) et d’une caméra connectée à un écran d’ordinateur. Fixez un microsyringe avec un contrôleur de pompe à côté de la scène et de l’échantillon.
- Fixez une pipette de trituration remblayée avec de l’huile minérale sur le piston microsyringe. Utilisez le microsyringe avec le contrôleur de pompe pour retirer la solution de dissociation dans la pipette de trituration (~130 nL) sur le dessus de l’huile minérale tout en prenant soin d’éviter les bulles d’air dans la pipette.
- Digestion partielle des segments artériolaires
- Placer des segments artériolaires intacts dans 1 mL de solution de dissociation dans un tube de verre de 10 mL contenant 100 μg/mL de papaïne, 170 μg/mL de dithioérythritol, 250 μg/mL de collagénase et 40 μg/mL d’élastase. Incuber des segments artériolaires à 34 °C pendant 10-12 min.
- Après la digestion, remplacer la solution enzymatique par 3-4 mL de solution de dissociation fraîche à température ambiante.
- Isolement du tube endothélial artériolaire
REMARQUE: Après la digestion et le remplacement de la solution enzymatique, transférer un ou plusieurs segments partiellement digérés dans la solution de dissociation dans une chambre de superfusion fixée à une plate-forme mobile. Lors de l’affichage à un grossissement de 100x à 200x, sélectionnez un segment de vaisseau partiellement digéré mais ininterrompu et concentrez-vous dessus au microscope.- Placez la pipette de trituration fixée avec l’injecteur de microsyringe dans la solution de dissociation dans la chambre et positionnez-la près d’une extrémité du segment de récipient digéré. Réglez un débit compris entre 1 et 3 nL/s sur le contrôleur de la pompe pour une trituration en douceur.
- Tout en maintenant un grossissement de 100x à 200x, retirez le segment artériolaire dans la pipette, puis éjectez-vous pour dissocier l’adventice et les cellules musculaires lisses (Figure 3B). Triturez le segment des vaisseaux jusqu’à ce que toutes les cellules musculaires lisses soient dissociées et que seules les cellules endothéliales restent sous forme de « tube » intact.
REMARQUE: Si nécessaire pendant la trituration, utilisez soigneusement une pince à pointe fine pour retirer l’adventice dissociée et la lame élastique interne du tube endothélial. En règle générale, seuls quelques cycles de trituration donnent un tube endothélial intact. - Utilisez des micromanipulateurs pour fixer chaque extrémité du tube endothélial sur le couvercle en verre dans la chambre avec des pipettes d’épinglage en verre borosilicate (Figure 3C,D).
- Fixation du tube endothélial artériolaire
- Remplacer la solution de dissociation par une solution de superfusion (PSS contenant 2 mM de CaCl2) tout en veillant à ce que le matériau non endothélial soit lavé de la chambre.
- Transférer le tube endothélial sécurisé de la plate-forme mobile vers la plate-forme de microscope conçue pour la superfusion continue et les enregistrements / imagerie intracellulaires ou fluorescents.
- Appliquer la livraison continue de PSS pendant l’expérience. Réglez manuellement le débit (5-7 mL/min) tout au long de l’expérience à l’aide de la vanne de régulation du débit en ligne, compatible avec le débit laminaire, tout en faisant correspondre l’alimentation du débit de solution à l’étendue de l’aspiration sous vide. Laisser ≥5 min d’écoulement PSS dans la chambre pour la superfusion du tube endothélial avant d’acquérir des données de fond et/ou de chargement de colorant.
5. Utilisation de trompes endothéliales artériolaires pour l’examen de la physiologie cellulaire
REMARQUE: Des tubes endothéliaux artériolaires isolés et sécurisés peuvent être utilisés pour les enregistrements intracellulaires de la dynamique [Ca2+]i et de Vm en utilisant respectivement la photométrie et l’électrophysiologie des électrodes pointues, comme illustré précédemment13 (Figure 4). [Ca2+] i et Vm peuvent être mesurés en tant que variables expérimentales distinctes ou combinées selon les besoins13 (Figure 4). Cependant, les tubes endothéliaux artériolaires sont plus délicats que l’endothélium artériel et le temps d’expérimentation ne doit pas dépasser 1 h.
- Mesure de [Ca2+]i
- Allumez l’équipement et le logiciel pour les enregistrements [Ca2+]i tout en maintenant une superfusion continue à un débit de 5 à 7 mL/min.
- Chargez le tube endothélial avec le colorant Ca2+ Fura-2 AM pendant 30 min à température ambiante. Lavez les cellules avec une solution de superfusion pendant encore 20 à 30 minutes tout en augmentant progressivement la température du bain à 37 ° C. Maintenez la température à 37 °C tout au long de l’expérience.
- Ajustez manuellement la fenêtre d’imagerie à l’aide d’un logiciel de photométrie pour faire la mise au point sur environ 20 cellules endothéliales (Figure 4A). En l’absence de lumière, tournez le PMT sur l’interface de fluorescence et commencez l’acquisition de [Ca2+]i en excitant Fura-2 alternativement (≥10 Hz) à 340 nm et 380 nm tout en collectant l’émission de fluorescence à 510 nm. Une fois qu’un enregistrement de base stable de [Ca2+]i est établi, appliquer des agents pharmacologiques (p. ex., agonistes des récepteurs purinergiques) par objectif expérimental (figure 4B).
- Mesure de Vm
- Allumez l’équipement et le logiciel pour les enregistrements Vm et réglez le débit d’acquisition de données (≥10 Hz) tout en maintenant une superfusion continue à un débit de 5 à 7 mL / min. Augmentez progressivement la température du bain à 37 °C et maintenez-la jusqu’à la fin de l’expérience.
- Tirez une électrode tranchante à l’aide d’un capillaire en verre borosilicate, remblai de 2 M KCl, et fixez-la sur un fil d’argent recouvert de chlorure dans le porte-pipette fixé à un électromètre, qui à son tour, est maintenu par un micromanipulateur.
- Lors de la visualisation à travers l’objectif 4x, utilisez un micromanipulateur pour positionner soigneusement la pointe de l’électrode pointue juste au-dessus d’une cellule du tube endothélial artériolaire dans le PSS qui coule dans la chambre.
- Augmentez progressivement le grossissement à 400x et repositionnez la pointe de l’électrode au besoin.
- À l’aide du micromanipulateur, insérez doucement la pointe d’une électrode tranchante dans l’une des cellules du tube endothélial et commencez à enregistrer Vm à l’aide d’un électromètre (Figure 4A).
- Une fois que le Vm au repos endothélial est stable (−30 à −40 mV), appliquer les agents pharmacologiques souhaités par objectif expérimental (figure 4C).
6. Imagerie cellulaire
REMARQUE: Les tubes endothéliaux fixés dans la chambre de la plate-forme mobile peuvent également être utilisés pour l’imagerie microscopique dans des conditions réelles et fixes19 en utilisant la fluorescence standard ou la microscopie confocale. L’immunohistochimie avec différents anticorps pour les récepteurs et les canaux ioniques peut également être appliquée comme décrit précédemment20.
- Chargez le tube endothélial avec le traceur de fluorescence pour la membrane plasmique ou l’organite souhaité (par exemple, noyau, réticulum endoplasmique) à 37 °C pendant 15-30 min.
- Lavez les cellules avec de la superfusion PSS fraîche et imagez les cellules vivantes au microscope à la longueur d’onde d’excitation des colorants respectifs (Figure 4D, E).
REMARQUE: L’immunohistochimie peut être effectuée sur ce modèle de tube en utilisant des anticorps d’intérêt.
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Representative Results
Une démonstration du protocole est illustrée à la figure 1 avec les étapes de dissection artériolaire et d’isolation du tube endothélial comme la figure 2 et la figure 3, respectivement. Ici, la fonction endothéliale a été évaluée en mesurant [Ca2+]i et Vm à l’aide de la photométrie Fura-2 et de l’électrophysiologie à électrode pointue (Figure 4A) en réponse à un agent pharmacologique [2-méthylthioadénosine diphosphate (MTA), un puissant agoniste du récepteur purinergique (P2YR)] à 37 °C. Lors de l’application de MTA (1 μM), [Ca2+]i augmente rapidement (Figure 4B) avec une hyperpolarisation concomitante (Figure 4C). Ces mesures sont le reflet de l’activation des récepteurs couplés aux protéines Gq (P2YR) suivie de l’activation des canaux K+ activés par Ca2+ à petite et moyenne conductance (SKCa/IKCa), qui initient une voie vasodilatatrice d’hyperpolarisation dépendante de l’endothélium (EDH). Ainsi, l’endothélium isolé d’une artériole parenchymateuse est fonctionnel isolément et peut être utilisé pour étudier les composants clés des voies qui impliquent la mobilisation de [Ca2+]i et/ou la régulation de Vm via les canaux K+.
De plus, l’endothélium intact a été incubé à 37 °C avec des trackers fluorescents pour la visualisation afin d’examiner la morphologie cellulaire. L’imagerie des cellules endothéliales vivantes montre une co-coloration de la membrane plasmique (vert) et des noyaux (rouge) (Figure 4D). Dans la figure 4E, la membrane plasmique (verte) a été colorée avec une coloration fluorescente du réticulum endoplasmique (RE; rouge), de sorte que les zones de chevauchement apparent de RE à proximité de la membrane plasmique apparaissent en orange (figure 4E). Ces images fluorescentes révèlent en outre l’intégrité cellulaire de l’endothélium artériolaire et leur utilisation possible pour étudier les microdomaines de signalisation situés dans des complexes de membranes jonctionnelles.
Figure 1 : Examen du tube endothélial artériolaire fraîchement isolé de l’artériole parenchymateuse de souris. Comme illustré, le cerveau est isolé d’une souris et un morceau de tissu cérébral rectangulaire contenant le MCA a été enlevé. Les artérioles parenchymateuses qui se ramifient à partir du MCA et pénètrent dans le parenchyme cérébral sont isolées. Les artérioles sont digérées et triturées par voie enzymatique, produisant un tube endothélial intact pour étude. Le tube endothélial préparé permet de mesurer la dynamique intracellulaire ca2+ et Vm tout en permettant l’imagerie cellulaire pour l’imagerie par fluorescence et l’immunohistochimie. Abréviations: MCA = artère cérébrale moyenne; Vm = potentiel membranaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Dissection et isolement des artérioles parenchymateuses. (A) Cerveau de souris isolé avec cercle de Willis intact. (B) Un morceau rectangulaire disséqué de tissu cérébral contenant le MCA (flèche blanche). (C) Isolement de pia de la partie supérieure du tissu (artériole, flèche bleue). (D) Artérioles (soulignées par des pointes de flèches bleues) reliées aux artères cérébrales moyennes (flèches jaunes). (E) Identification de l’artériole (flèche bleue) dans le tissu cérébral. (F) Extraire l’artériole (flèche bleue) du tissu desserré. Notez que les panneaux E et F indiquent une autre méthode d’isolement de l’artériole (voir l’étape 3.2.3 du protocole). Barres d’échelle = 2 mm (A, B, C), 0,2 mm (D) et 1 mm (E, F). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Préparation des tubes endothéliaux à partir d’artérioles parenchymateuses. (A) Artériole isolée et propre (flèche bleue). B) Trituration de l’artériole partiellement digérée par les enzymes. (C) Tube endothélial intact (grossissement: 100x) préparé et fixé sur le couvercle en verre à l’aide de pipettes d’épinglage. (D) Tube endothélial à un grossissement de 200x. Barres d’échelle = 0,2 mm (A), 0,1 mm (B, C) et 0,05 mm (D). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Application d’un tube endothélial pour l’examen physiologique des voies liées à la régulation du flux sanguin. (A) Une électrode pointue (flèche violette) est positionnée dans une cellule d’un tube endothélial focalisée dans la fenêtre d’acquisition de données pour la photométrie. (B) Enregistrement représentatif du Ca2+ intracellulaire à l’aide de la photométrie Fura-2 en réponse au MTA (1 μM). (C) Enregistrement représentatif de Vm simultanément avec trace intracellulaire de Ca2+ dans le panneau B. (D) Image représentative de la membrane plasmique (verte) et des noyaux (rouge) de cellules endothéliales vivantes colorées avec des colorants fluorescents. (E) Image représentative de la membrane plasmique (vert) et du réticulum endoplasmique (ER, rouge) de cellules endothéliales vivantes colorées avec des colorants fluorescents. Les zones de proximité pour les urgences et la membrane plasmique sont indiquées en orange. Les images ont été acquises à l’aide d’une caméra monochrome et étaient pseudo-colorées. Barres d’échelle = 20 μm (D), 10 μm (E). Abréviations : MTA = 2-méthylthioadénosine diphosphate; F340/F380 = signal de rapport de colorant Fura-2; Vm = potentiel membranaire; PM = membrane plasmique; ER = réticulum endoplasmique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
De plus en plus de preuves suggèrent que les maladies cérébrovasculaires (MCV), le vieillissement et la maladie d’Alzheimer sont fortement corrélés et constituent un sujet actuel de recherche sur la démence 4,8,14,21. Ainsi, il est évident que les études du réseau cérébrovasculaire auraient un large impact sur la santé tout en nécessitant une enquête approfondie et continue pendant les conditions de la maladie. En tant que point significatif de résistance vasculaire pour la perfusion cérébrale, l’importance générale des artérioles parenchymateuses dans l’étiologie et le développement des MCV est soulignée depuis plus de 50 ans22.
Cependant, les outils d’examen scientifique n’ont pas été suffisamment développés pour étudier les artérioles parenchymateuses intactes et leurs types de cellules composites jusqu’à l’apparition récente d’approches ex vivo telles que les préparations isolées et pressurisées d’artérioleparenchymateuse 11 et de CaPA12 . Le domaine de la physiologie cérébrovasculaire bénéficierait également de techniques complémentaires dans les modèles d’étude homocellulaires (muscle lisse, péricytes et endothélium) pour se concentrer sur des types cellulaires spécifiques et leurs caractéristiques génétiques et pharmacologiques sous-jacentes à la régulation du flux sanguin cérébral et à la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE).
L’endothélium est un organe régulateur central qui « nourrit » tous les autres organes du corps, y compris le cerveau23. Bien que tous les segments vasculaires (artères, artérioles, capillaires, veinules, veines) soient essentiels à la perfusion cérébrale, l’endothélium des artérioles nécessite une investigation dédiée en tant que composant central de l’autorégulation cérébrovasculaire et du couplage neurovasculaire24. De plus, la signalisation Ca2+ 25 et l’activité des canaux K+ 17,26 semblent être améliorées lors de la régulation du tonus myogénique dans les artérioles parenchymateuses par rapport aux artères piales. Ainsi, nous avons maintenant étendu la méthode précédemment établie pour les artères cérébrales piales (postérieures)13 aux artérioles parenchymateuses.
Par rapport à ces approches précédemment illustrées 11,13, ce protocole a été affiné en ajustant empiriquement diverses étapes (p. ex., traitement enzymatique, trituration) pour produire de manière reproductible des tubes endothéliaux intacts à partir d’artérioles parenchymateuses. De plus, ce protocole démontre l’utilisation de ce modèle d’étude pour optimiser l’application de la photométrie cellulaire, de l’électrophysiologie et de l’imagerie fluorescente (figure 4). Avec les forces et les limites générales de la photométrie Fura-2 et de l’électrophysiologie des électrodes pointues précédemment décrites en détail13, l’expérimentateur est encouragé à essayer un ensemble d’autres tests de signalisation Ca2+ et de canaux ioniques pour tester des hypothèses spécifiques d’intérêt. En outre, l’avancement et la génération de nouveaux modèles génétiques avec des indicateurs génétiquement codés spécifiques aux cellules endothéliales (par exemple, [Ca2+]i27 et indicateurs de tension28) peuvent accroître l’utilité de cette préparation.
Pour le contexte d’investigation, ce modèle endothélial isolé est utile pour les questions de recherche qui nécessitent d’étudier le rôle de l’endothélium artériolaire dans la régulation de la dynamique vasculaire, les mesures faciales n’étant pas réalisables expérimentalement en raison de leur petite taille. La régulation endothéliale du flux sanguin cérébral commence par l’activation de divers récepteurs couplés aux protéines G (p. ex., purinergique, muscarinique)18 et des canaux ioniques (TRPV329, TRPA15, récepteurs NMDA8). L’activation des récepteurs de type Gq implique une lipolyse du phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) pour générer de l’inositol trisphosphate (IP3) et du diacylglycérol pour la mobilisation [Ca2+]i qui peut ensuite servir de médiateur dans l’activation du canal K+ pour les changements dans Vm15. L’activité du canal K+, et donc Vm seul, peut également être étudiée directement dans des conditions physiologiques2 ou via un ciblage pharmacologique sélectionné30. De plus, le tube endothélial artériolaire permet une visualisation fluorescente améliorée du remodelage de la membrane plasmique de certains (p. ex., Filipin-III), des organites intracellulaires (p. ex., traceur ER) et du couplage cellule-cellule (p. ex. iodure de propidium)18,19. Ainsi, une autre caractéristique du modèle d’étude implique l’appariement efficace de la morphologie cellulaire et de l’histologie avec des paramètres de fonction, tels que Ca2+ et la signalisation électrique, dans le vieillissement et le développement de maladies chroniques.
Les composants du protocole qui méritent une attention particulière sont la dissection artériolaire, la digestion enzymatique, la trituration et la fixation du tube endothélial artériolaire pour les mesures. Lors de la dissection du cerveau, les dommages à l’artériole parenchymateuse doivent être évités à tout prix pour assurer une digestion et une trituration réussies pour isoler une couche endothéliale intacte et fonctionnelle. En outre, un étirement excessif tout en sécurisant le tube endothélial dans la chambre de perfusion détruira également la préparation, annulant efficacement toutes les étapes du protocole précédent.
Des tests de viabilité doivent être appliqués pour s’assurer que les tubes endothéliaux artériolaires sont fonctionnels en ce qui concerne les composants physiologiques clés tels que la signalisation Ca2+ (afflux et/ou libération intracellulaire) après la stimulation des récepteurs couplés aux protéines G, l’étendue de l’hyperpolarisation Vm et le couplage intercellulaire robuste à travers les jonctions lacunaires 18,23. Des exemples de tels contrôles comprennent la stimulation purinergique réversible à l’aide de MTA (1 μM; Δ[Ca2+]i ~ 300 nM; hyperpolarisation de ≥10 mV; Figure 4B,C), activation réversible de SKCa/IKCa à l’aide de NS309 (hyperpolarisation de 1 μM; ≥20 mV) et/ou correspondance entre l’injection actuelle (p. ex., ~-1 nA) dans une cellule et les réponses Vm (~-10 mV) d’une autre à une distance de 250 μm18,31 ≥. Avec de la pratique, du soin et de la rigueur expérimentale, l’ensemble du protocole est reproductible si l’apprenant a de la patience et de la persévérance.
Cette méthode a des limites clés à traiter, telles que l’abondance insuffisante d’échantillons (par exemple, les acides nucléiques, les protéines et les lipides) et la fragilité relative pour les expériences biochimiques et les enregistrements de cellules vivantes, respectivement. Cependant, cette mise en garde en biologie moléculaire peut être évitée en mettant en commun plusieurs animaux et / ou en concevant des méthodes de quantification de sensibilité et de débit plus élevés. Si la température physiologique doit être maintenue à 37 °C, de courtes périodes expérimentales (≤1 h) seront nécessaires avec des interventions pharmacologiques ciblées uniquement. En outre, il serait extrêmement difficile d’isoler les trompes endothéliales artériolaires d’animaux à court terme ou nouveau-nés (<1 mois), ce qui pourrait empêcher les études sur le développement vasculaire cérébral.
D’autres considérations englobent la composition précise des tubes endothéliaux vasculaires cérébraux, nécessitant potentiellement des approches sélectionnées d’immunofluorescence et d’électrophysiologie. Par exemple, la membrane basale (composée principalement de collagène IV, de laminine et de fibronectine) longe l’arbre vasculaire cérébral. Il est connu pour sa contribution à l’intégrité de la BHE formée par les cellules endothéliales capillaires du cerveau32. Il convient de noter que ce modèle d’étude peut ne pas convenir aux expériences de perméabilité au BBB, car les composants de la membrane basale sont des substrats du cocktail enzymatique utilisé pour la digestion partielle des tubes endothéliaux artériolaires, en particulier le mélange de collagénase H. En outre, l’application d’un cocktail enzymatique sélectif, l’élimination de la lame élastique interne et l’identification claire des cellules endothéliales par structure (arrangement parallèle vs circonférentiel pour les cellules musculaires lisses), la morphologie (« forme en goutte d’eau » des cellules endothéliales par rapport aux cellules musculaires lisses en forme de fuseau) et l’électrophysiologie (par exemple, hyperpolarisation à la stimulation GPCR), éliminent les contributions physiologiques des cellules musculaires lisses et des péricytes. Enfin, l’expérimentateur doit prendre note de l’hétérogénéité des cellules endothéliales (profil d’expression génique, structure, fonction) par type d’organe (p. ex., cerveau, cœur, poumon33) en plus de la région du cerveau (p. ex., cortex 9,34, hippocampe10) et de la segmentation vasculaire respective (p. ex., artères, artérioles et capillaires 9,34,35 ). Ainsi, une étude approfondie de la régulation du flux sanguin cérébral nécessitera également des approches complémentaires ex vivo (p. ex. myographie de la pression intravasculaire, préparation d’artériole capillaire-parenchymateuse) et in vivo (p. ex., Doppler laser intracérébral) de segments et de réseaux vasculaires intacts.
En résumé, cet article présente une technique avancée démontrant comment préparer un tube endothélial intact fraîchement isolé à partir d’artérioles parenchymateuses du cerveau de souris. Nous prévoyons que cette approche complétera et/ou construira à partir de modèles d’études vasculaires in vivo et intacts. L’objectif global est de générer de nouvelles informations pour comprendre les mécanismes qui sous-tendent le flux sanguin cérébral au niveau fondamental de la physiologie et sélectionner les transitions vers la pathologie pour la thérapie.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par des subventions des National Institutes of Health (R00AG047198 & R56AG062169 à EJB; R00HL140106 à PWP) et l’Alzheimer’s Association (AZRGD-21-805835 à PWP). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels des National Institutes of Health ou de l’Alzheimer’s Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
| Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
| Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
| Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
| Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
| NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
| Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |
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