Summary
Die intensive Vorbereitung intakter zerebraler endothelialer "Röhrchen" der Maus aus den zerebralen parenchymalen Arteriolen wird für die Untersuchung der zerebralen Blutflussregulation veranschaulicht. Darüber hinaus demonstrieren wir die experimentellen Stärken dieses endothelialen Studienmodells für die Fluoreszenzbildgebung und die elektrophysiologische Messung wichtiger zellulärer Signalwege, einschließlich Änderungen des intrazellulären [Ca2+] und des Membranpotentials.
Abstract
Der zerebrale Blutfluss wird durch vaskuläre Widerstandsarterien und nachgeschaltete parenchymale Arteriolen gefördert. Der stationäre Gefäßwiderstand gegen den Blutfluss nimmt mit abnehmendem Durchmesser von den Arterien zu den Arteriolen zu, die letztendlich in die Kapillaren münden. Aufgrund ihrer geringeren Größe und Lage im Parenchym wurden Arteriolen relativ wenig untersucht und mit geringerer Reproduzierbarkeit der Befunde als oberflächliche Piialarterien. Unabhängig davon erfordert die Struktur und Funktion der arteriolaren Endothelzellen - integraler Bestandteil der Physiologie und Ätiologie chronischer degenerativer Erkrankungen - umfangreiche Untersuchungen. Insbesondere zeigen neue Erkenntnisse, dass eine beeinträchtigte Endothelfunktion kognitiven Beeinträchtigungen und Demenz vorausgeht und diese verschlimmert.
In der parenchymalen Mikrozirkulation ist die endotheliale K + - Kanalfunktion der robusteste Reiz, um die Ausbreitung der Vasodilatation fein zu kontrollieren, um die Erhöhung des Blutflusses in Bereiche der neuronalen Aktivität zu fördern. Diese Arbeit veranschaulicht eine verfeinerte Methode zur frischen Isolierung intakter und elektrisch gekoppelter endothelialer "Röhren" (Durchmesser, ~ 25 μm) aus parenchymalen Arteriolen des Mausgehirns. Arterioläre Endothelröhren werden unter physiologischen Bedingungen (37 °C, pH 7,4) gesichert, um experimentelle Variablen aufzulösen, die die K+- Kanalfunktion und deren Regulation umfassen, einschließlich intrazellulärer Ca2+- Dynamik, Veränderungen des Membranpotentials und Membranlipidregulation. Ein deutlicher technischer Vorteil gegenüber dem arteriellen Endothel ist die verbesserte morphologische Auflösung der Zell- und Organellendimensionen (z. B. Mitochondrien), was die Nützlichkeit dieser Technik erweitert. Eine gesunde zerebrale Perfusion während des gesamten Lebens beinhaltet eine robuste Endothelfunktion in parenchymalen Arteriolen, die den Blutfluss direkt mit der Förderung der neuronalen und glialen Aktivität in präzisen anatomischen Regionen des Gehirns verbindet. Es wird daher erwartet, dass diese Methode das allgemeine Wissen über Gefäßphysiologie und Neurowissenschaften in Bezug auf das gesunde und kranke Gehirn erheblich voranbringen wird.
Introduction
Parenchymale Arteriolen liefern direkt essentiellen Sauerstoff und Nährstoffe im gesamten Gehirn1. Während der Verbindung mit Kapillaren reagieren hochvasoaktive Arteriolen auf retrograde Signale, die von Kapillarionenkanälen initiiert werden, die Stoffwechselsignale aus bestimmten neuronalen Regionen wahrnehmen2. Da das Gehirnparenchym in der Vergangenheit den Großteil der Untersuchungen erhalten hat, hat sich nun eine Rolle für die endotheliale Dysfunktion für die Klärung pathologischer Mechanismen im Zusammenhang mit verschiedenen zerebrovaskulären Erkrankungen ergeben, die Demenz zugrunde liegen (z. B. ischämischer Schlaganfall, Alzheimer-Krankheit)3,4,5,6 . Das Endothel ist ein integraler Bestandteil der Perfusion des Gehirns in Übereinstimmung mit der Heterogenität von Genetik, Struktur und Funktion in den Gefäßsegmenten7. Pialarterien wurden aufgrund ihrer relativ großen Größe, ihres hohen segmentalen Gefäßwiderstands und ihrer Rolle bei der Blutflussverteilung zum darunter liegenden Großhirnumfassend untersucht 8,9. Daher wird ein besseres Verständnis der arteriolaren Endothelmechanismen wahrscheinlich das Verständnis der Blutflussregulation des Gehirns in Gesundheit und Krankheit im Hinblick auf die Entwicklung neuartiger therapeutischer Regime verbessern.
Neue Erkenntnisse unterstreichen, wie wichtig es ist, parenchymale Arteriolen in Bezug auf verschiedene Signalwege und Krankheiten zu untersuchen 8,10. Dieser Ansatz beschränkte sich jedoch auf die Verwendung intakter druckbeaufschlagter Arteriolen-11- und/oder Kapillar-Parenchymal-Arteriolen-Präparate (CaPA)12. Frisch isolierte, native zerebrale arterioläre Endothelzellen, die frei von anderen Zelltypen und Störfaktoren sind, wurden nicht untersucht, wahrscheinlich aufgrund technischer Schwierigkeiten bei ihrer Isolierung. Diese Arbeit bringt eine frühere Technik voran, die die Isolierung des arteriellen Endothels13 hervorhebt, um nun das Endothel der parenchymalen Arteriolen des Gehirns zuverlässig und reproduzierbar zu isolieren (Breite: ~ 25 μm, Länge: ~ 250 μm). Diese Technik hilft, eine optimale Auflösung von elektrisch und chemisch gekoppelten Zellen in ihrer individuellen Orientierung und ihren zellulären Netzwerken zu erreichen.
Zu den wichtigsten interessanten Signalwegen gehörten die Wechselwirkung der intrazellulären Ca 2 + ([Ca2 +]i) -Signalgebung und die Hyperpolarisation des Membranpotentials (Vm) 14,15 - integraler Bestandteil der Vasodilatation 16 -, damit Blut in die Kapillaren eindringen und Sauerstoff und Nährstoffe an aktives Parenchym 17 abgebenkann. Diese Präparate ermöglichen elektrophysiologische Echtzeitaufzeichnungen von Ionenkanälen, einschließlich Ca2 +-permeant, transientem Rezeptorpotential (TRP) und K + -Kanälen und/oder fluoreszierender Bildgebung von intrazellulären Organellen in Endothelzellröhren unter nahezu physiologischen Bedingungen. Dies ist eine geeignete Technik für Forscher, die sich für physiologische zelluläre Mechanismen interessieren, die die Endothelzellkontrolle der zerebralen Blutflusslieferung an das Gehirnparenchym steuern. Insgesamt wird diese Technik den Forschern helfen, grundlegende endotheliale Signalwege und die Netzwerkkommunikation von Arteriolen, die in das Parenchym des Gehirns eingebettet sind, besser zu verstehen und gleichzeitig Fragen im Zusammenhang mit der zerebrovaskulären Physiologie und Pathologie zu beantworten.
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Protocol
Experimentatoren sollten sicherstellen, dass die vorgesehene Verwendung von Tieren und die damit verbundenen Protokolle von ihrem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und in Übereinstimmung mit dem "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" des National Research Council (8. Auflage, 2011) und den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt werden. Die IACUC der Loma Linda University und der University of Arizona hat alle Protokolle, die für dieses Manuskript verwendet werden, für C57BL/6N - und 3xTg-AD-Mäuse (Männer und Frauen; Altersspanne: 2-30 Monate) genehmigt. Siehe Abbildung 1 als Überblick über die Isolierung und Untersuchung von arteriolären Endothelröhren, die frisch aus den parenchymalen Arteriolen der Maus des Gehirns isoliert wurden.
1. Materialien und Ausrüstung
HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie alle Reagenzien und Materialien, die für dieses Protokoll erforderlich sind. Darüber hinaus können bei Bedarf auch Handbücher und Websites zu den jeweiligen Anbietern konsultiert werden. Abbildungen von Sezierstationen und Versuchsapparaturen wurden bisher zur Verfügung gestellt13.
- Durchflusskammer
- Befestigen Sie eine Superfusionskammer mit einem Glasdeckel auf einer Plattform aus eloxiertem Aluminium. Befestigen Sie die Plattform mit der Kammer auf einem Aluminiummikroskoptisch.
- Stellen Sie einen Mikromanipulator ein, der an jedem Ende der Plattform eine Pinning-Pipette auf dem Aluminiummikroskoptisch hält.
HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf eine übertragbare Tischapparatur mit einer Durchflusskammereinheit, um einen gesicherten, isolierten Endothelschlauch von einer Mikroskopvorrichtung zur anderen zu bewegen.
- Mikroskope
- Verwenden Sie Stereomikroskope (5x bis 50x Vergrößerungsbereich) und faseroptische Lichtquellen für Dissektionsverfahren.
- Zur Isolierung von Endothelröhren verwenden Sie ein inverses Mikroskop-Rig, das mit Phasenkontrast- oder DIC-kompatiblen Objektiven (DIC) (10x, 20x und 40x) und einem Aluminiumtisch ausgestattet ist.
- Halten Sie neben dem Gerät einen Mikrospritzenpumpenregler bereit, der zur Isolierung von Endothelröhren aus teilweise verdauten Blutgefäßen bestimmt ist.
- Richten Sie die experimentelle Vorrichtung ein, indem Sie ein inverses Mikroskop (Objektive: 4x, 10x, 20x, 40x und 60x) und einen manuellen Aluminiumtisch auf einem Schwingungsisolationstisch anordnen.
- Intrazelluläres Vm Aufzeichnungsgerät
- Schließen Sie das Elektrometer an eine kompatible Kopfstufe an. Verwenden Sie Zubehör wie einen Funktionsgenerator und einen Stimulator für Protokolle, die eine Strominjektion erfordern.
- Schließen Sie die Verstärkerausgänge an ein Datendigitalisierungssystem, ein Oszilloskop und akustische Basislinienmonitore an. Befestigen Sie die Referenzbadelektrode (Ag/AgCl-Pellet) in der Nähe des Durchflusskammerausgangs.
- Stellen Sie ein photometrisches System mit integrierten Komponenten einer Fluoreszenzsystemschnittstelle, einer hochintensiven Bogenlampe und Stromversorgung, einem Hyperschalter, einer Photomultiplierröhre (oder PMT) und einer Kamera zusammen, um [Ca2 +]i in Endothelzellen zu messen.
- Montieren Sie einen Temperaturregler, der mit einer Inline-Heizung ausgestattet ist, um eine physiologische Temperatur (37 ° C) während des gesamten Experiments zu erhöhen und aufrechtzuerhalten.
- Montieren Sie eine Mehrkanalplattform, die mit einer Ventilsteuerung mit einem Inline-Durchflussregelventil verbunden ist, um die Lieferung von Lösungen an Endothelrohre zu steuern, die in der Kammer gesichert sind.
- Mikropipetten und scharfe Elektroden
HINWEIS: Der Experimentator benötigt einen elektronischen Glasabzieher und eine Mikroschmiede zur Vorbereitung von Verreibungs- und Pinning Pipetten.- Um das Endothelrohr vom teilweise verdauten Arteriolsegment zu trennen, bereiten Sie aus Borosilikatglaskapillaren wärmepolierte Verreibungspipetten (Innenspitzendurchmesser: 30-50 μm) vor.
- Um das Endothelrohr in der Superfusionskammer zu sichern, bereiten Sie wärmepolierte Pinning-Pipetten mit einem abgestumpften, kugelförmigen Ende (Außendurchmesser: 50-70 μm) vor, die aus dünnwandigen Borosilikatglaskapillaren hergestellt werden.
- Um Vm einer Endothelzelle aufzuzeichnen, bereiten Sie scharfe Elektroden mit einem Spitzenwiderstand von ~ 150 ± 30 MΩ aus Glaskapillaren nur mit dem Glasabzieher vor.
2. Lösungen und Medikamente
- Physiologische Salzlösung (PSS)
- Bereiten Sie mindestens 1 l PSS mit 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES) und 10 mM Glukose vor.
- Bereiten Sie notwendige Lösungen ohne CaCl 2 (null Ca2 + PSS) für die Dissektion der Hirnarteriolen und die Isolierung des Endothelrohrs vor.
HINWEIS: Bereiten Sie alle Lösungen in hochreinem deionisiertem H2 O vor, gefolgt von einer Filtration (0,22 μm). Stellen Sie sicher, dass das Endprodukt einen pH-Wert von 7,4 mit einer Osmolalität zwischen 290 und 300 mOsm enthält.
- Rinderserumalbumin (BSA, 10%)
- 1 g des lyophilisierten BSA-Pulvers in einem Becherglas von 10 ml Ca2+ PSS auflösen. Bedecken Sie das Becherglas und lassen Sie mindestens 2 h mit langsamem Rühren das BSA auflösen.
- Filtern Sie die Lösung mit einer 10-ml-Spritze und einem 0,22-μm-Filter und bereiten Sie 1 ml-Aliquots vor, die bei -20 °C gelagert werden sollen.
- Dissektionslösung
- Fügen Sie 500 μL BSA (10%) zu 49,5 ml Null Ca2+ PSS für ein Gesamtvolumen von 50 mL hinzu.
- Transferlösung auf eine Petrischale für arterioläre Dissektionen.
- Dissoziationslösung
- 5 μLCaCl2-Lösung (1 M) und 500 μL BSA (10 %) zu 49,5 ml Null Ca2+ PSS für ein Gesamtvolumen von 50 mL hinzufügen. Inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur für mindestens 1 h.
- Enzyme
- Bereiten Sie 1 ml Aufschlusslösung mit 100 μg/ml Papain, 170 μg/ml Dithioerythritol, 250 μg/ml Kollagenase (Typ-H-Mischung) und 40 μg/ml Elastase vor.
HINWEIS: Enzymaktivitäten können variieren, obwohl erfolgreiche Protokolle wahrscheinlich die folgenden enzymatischen Aktivitäten erfordern: ≥ 10 Einheiten / mg für Papain, ≥ 1 Einheit / mg für Kollagenase und ≥ 5 Einheiten / mg für Elastase.
- Bereiten Sie 1 ml Aufschlusslösung mit 100 μg/ml Papain, 170 μg/ml Dithioerythritol, 250 μg/ml Kollagenase (Typ-H-Mischung) und 40 μg/ml Elastase vor.
- Fura-2 und pharmakologische Wirkstoffe
- Fura-2 AM-Vorrat in Dimethylsulfoxid (DMSO; 1 mM) herstellen. Bereiten Sie 500 μL Arbeitskonzentration (10 μM) vor, indem Sie 5 μL des Materials zu 495 μL PSS für die Beladung hinzufügen.
- Bereiten Sie mindestens 50 ml Arbeitskonzentrationen pharmakologischer Wirkstoffe in PSS oder DMSO vor.
- Durchführende Lösung
- Es werden 2 Mio. KCl durch Auflösen von KCl in deionisiertemH2O(7,455 g KCl in 50 mlH2O) hergestellt. Führen Sie die Lösung durch eine Spritze mit einem 0,22-μm-Filter, bevor Sie die scharfen Elektroden verfüllen.
- Fluoreszierende Organellen-Tracker und Antikörper
- Bereiten Sie Plasmamembran- oder Organellar-Tracker (z. B. Kern, endoplasmatisches Retikulum) in der entsprechenden physiologischen Kochsalzlösung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
- Bereiten Sie primäre und sekundäre Antikörper gemäß den Anweisungen des Herstellers in der entsprechenden physiologischen Salzlösung vor.
3. Dissektion und Isolierung von Maus-Hirnarteriolen
HINWEIS: Bei all diesen Sezierverfahren müssen Stereomikroskope und geschärfte Mikrodissektionswerkzeuge (z. B. fein bestückte Pinzetten, Sezierscheren im Vannas-Stil) zur Vergrößerung der Proben (bis zu 50-fach) verwendet werden.
- Isolierung des Mausgehirns
- Anästhesien einer Standard-Labormaus (z. B. C57BL/6, 3xTg-AD; 2-30 Monate alt, männlich oder weiblich) mit Isofluran-Inhalation (3% für 2-3 min), gefolgt von sofortiger Enthauptung mit scharfer Schere oder Guillotine gemäß IACUC-Zulassung. Legen Sie den Mauskopf in eine Petrischale (Durchmesser 10 cm, Tiefe 1,5 cm), die kalte (4 °C) Sezierlösung enthält.
- Entfernen Sie während der Betrachtung unter einem Stereomikroskop Haut und Haare über dem Schädel und waschen Sie überschüssiges Blut mit kalter Dissektionslösung ab. Machen Sie mit den Spitzen von Standard-Dissektionsscheren (z. B. 24-mm-Klingen) einen Einschnitt, der mit dem Hinterhauptbein beginnt und sich durch das Nasenbein des Schädels erstreckt. Verwenden Sie eine grob bestückte Pinzette, um den Schädel entlang des Einschnitts vorsichtig zu öffnen, und trennen Sie das Bindegewebe (Meningealmembran), um das Gehirn zu isolieren, das einen intakten Kreis von Willis enthält.
- Waschen Sie das isolierte Gehirn mit kalter Dissektionslösung in einem Becherglas oder einer Petrischale, um das restliche Blut von der Oberfläche des Gehirns zu entfernen. Platzieren Sie die ventrale Gehirnseite nach oben in einer Kammer, die kalte Dissektionslösung zur Isolierung der parenchymalen Arteriolen enthält (Abbildung 2A).
- Isolierung der parenchymalen Arteriolen
HINWEIS: Für dieses Protokoll werden Arteriolen ausgewählt, die aus den mittleren Hirnarterien (MCAs) stammen und in das Hirnparenchym eingebettet sind. Die Arteriolen werden wie zuvor beschriebenisoliert 11, mit Modifikation.- Verwenden Sie Stahlstifte (Durchmesser: 0,2 mm, Länge: 11 bis 12 mm), um das isolierte Gehirn in kalter Dissektionslösung in einer Petrischale mit einer mit Holzkohle angereicherten Siliziumpolymerbeschichtung (Tiefe ≥ 50 cm) zu sichern.
- Schneiden Sie mit einer scharfen und ausgerichteten Sezierschere ein Rechteck aus Hirngewebe (Länge: 5 mm, Breite: 3 mm) (Abbildung 2B) um die MCA und stellen Sie sicher, dass der obere Teil des Gewebesegments hinter dem Verzweigungspunkt des Willis-Kreises liegt. Schneiden Sie ein weiteres Rechteck aus Hirngewebe aus der anderen Hemisphäre des Gehirns, um bei Bedarf auf weitere Arteriolen zuzugreifen.
- Befestigen Sie das abgetrennte Hirngewebesegment in der Schale mit dem MCA nach oben (distal vom Kreis von Willis) mit Stahlstiften (Durchmesser: 0,1 mm, Länge: 13 bis 14 mm). Machen Sie vorsichtig einen flachen Schnitt in der Nähe der Stifte, um die Pia mit einer kleinen Pinzette zu entfernen, die sich vorsichtig von einem Ende zum anderen ablöst (Abbildung 2C). Entfernen Sie die Pia aus dem anderen Gewebesegment, um bei Bedarf auf weitere Arteriolen zuzugreifen. Sichern Sie vorsichtig die isolierte Pia mit parenchymalen Arteriolen, die von MCA verzweigt sind, in der Schale mit den Stiften und sezieren Sie die parenchymalen Arteriolen (Abbildung 2D), um sicherzustellen, dass die Arteriolen nicht beschädigt werden.
HINWEIS: Wenn die Arteriolen nicht leicht mit der Pia aus dem Parenchym herausgezogen werden können, verwenden Sie eine feine Pinzette und graben Sie sich in das Gehirn, beginnend am MCA-Zweigpunkt vom Kreis von Willis. Lokalisieren Sie die Arteriole, lockern Sie vorsichtig das Gewebe um die Arteriolen (Abbildung 2E) und ziehen Sie die Arteriole vorsichtig aus dem Parenchym, wobei Sie das obere Ende der Arteriole halten (Abbildung 2F). Mehrere Arteriolen (Länge: ~1,5-2 mm) können aus einem Rechteck des Hirngewebes isoliert werden. - Stellen Sie sicher, dass die Arteriole sauber ist und kein Gewebe daran befestigt ist, und schneiden Sie alle verbleibenden distalen Äste ab (Abbildung 3A). Verwenden Sie diese saubere, intakte Arteriole für die enzymatische Verdauung. Alternativ wird jede Arteriole in zwei Stücke geschnitten (Länge: 0,75-1 mm) für den enzymatischen Aufschluss zur Herstellung von Endothelröhren, falls gewünscht.
4. Verdauung der parenchymalen Arteriolen und Vorbereitung der Endothelröhren
- Anordnung von Geräten und Pipetten
HINWEIS: Die Isolierung von arteriellen Endothelröhren aus dem Gehirn wurde zuvorbeschrieben 13,18. Das aktuelle Protokoll enthält Modifikationen zur Isolierung von Endothel aus parenchymalen (intrazerebralen) Arteriolen. Mehrere Arteriolen und/oder Teile von Arteriolen können zusammen für die enzymatische Verdauung verwendet werden.- Montieren Sie die Verreibungsvorrichtung13 zur Vorbereitung von Endothelrohren mit einem Aluminiumtisch, der eine Kammer und Mikromanipulatoren trägt. Stellen Sie ein Mikroskop zusammen, das mit Objektiven (5x-60x) und einer an einen Computermonitor angeschlossenen Kamera ausgestattet ist. Befestigen Sie eine Mikrospritze mit einer Pumpensteuerung neben dem Tisch und der Probe.
- Befestigen Sie eine mit Mineralöl hinterlegte Verreibungspipette über dem Mikrospritzenkolben. Verwenden Sie die Mikrospritze mit der Pumpensteuerung, um die Dissoziationslösung in die Verreibungspipette (~ 130 nL) auf dem Mineralöl zu entnehmen, wobei darauf zu achten ist, dass Luftblasen in der Pipette vermieden werden.
- Teilverdauung von Arteriolsegmenten
- Legen Sie intakte Arteriolsegmente in 1 ml Dissoziationslösung in einem 10 ml Glasröhrchen, das 100 μg/ml Papain, 170 μg/ml Dithioerythrit, 250 μg/ml Kollagenase und 40 μg/ml Elastase enthält. Arteriolare Segmente bei 34 °C für 10-12 min inkubieren.
- Ersetzen Sie nach dem Aufschluss die Enzymlösung durch 3-4 ml frische Dissoziationslösung bei Raumtemperatur.
- Isolierung des arteriolaren Endothelrohrs
HINWEIS: Nach dem Aufschluss und dem Ersatz der Enzymlösung ein oder mehrere teilweise verdaute Segmente in die Dissoziationslösung in einer an eine mobile Plattform angeschlossenen Superfusionskammer übertragen. Wählen Sie beim Betrachten mit 100- bis 200-facher Vergrößerung ein teilweise verdautes, aber ununterbrochenes Gefäßsegment aus und konzentrieren Sie sich unter dem Mikroskop darauf.- Legen Sie die mit dem Mikrospritzeninjektor befestigte Verreibungspipette in die Dissoziationslösung in der Kammer und positionieren Sie sie nahe an einem Ende des verdauten Gefäßsegments. Stellen Sie eine Rate im Bereich von 1-3 nL/s an der Pumpensteuerung für eine sanfte Verreibung ein.
- Unter Beibehaltung der 100- bis 200-fachen Vergrößerung ziehen Sie das Arteriolärsegment in die Pipette zurück und werfen Sie es dann aus, um die Adventitia- und glatten Muskelzellen zu dissoziieren (Abbildung 3B). Trituieren Sie das Gefäßsegment, bis alle glatten Muskelzellen dissoziiert sind und nur noch Endothelzellen als intaktes "Rohr" erhalten bleiben.
HINWEIS: Falls während der Verreibung erforderlich, verwenden Sie vorsichtig eine fein bestückte Pinzette, um die dissoziierten Adventitien und die innere elastische Lamina aus dem Endothelrohr zu entfernen. Typischerweise ergeben nur wenige Verreibungszyklen eine intakte Endothelröhre. - Verwenden Sie Mikromanipulatoren, um jedes Ende des Endothelrohrs auf dem Glasdeckglas in der Kammer mit Borosilikatglas-Pinning-Pipetten zu befestigen (Abbildung 3C, D).
- Sicherung der arteriolaren Endothelröhre
- Ersetzen Sie die Dissoziationslösung durch eine Superfusionslösung (PSS mit 2 mM CaCl2) und stellen Sie sicher, dass nichtendotheliales Material aus der Kammer ausgewaschen wird.
- Übertragen Sie gesicherte Endothelröhren in der mobilen Plattform auf das Mikroskopgerät, das für kontinuierliche Superfusion und intrazelluläre oder fluoreszierende Aufnahmen / Bildgebung ausgelegt ist.
- Wenden Sie während des Experiments die kontinuierliche Bereitstellung von PSS an. Stellen Sie die Durchflussrate (5-7 ml/min) während des gesamten Experiments manuell mit dem Inline-Durchflussregelventil ein, das mit dem laminaren Durchfluss übereinstimmt, während der Zulauf des Lösungsflusses an das Ausmaß der Vakuumabsaugung angepasst wird. Lassen Sie ≥5 Minuten PSS zur Kammer fließen, um das Endothelrohr zu überfusionieren, bevor Sie Hintergrunddaten erfassen und / oder Farbstoff einfüllen.
5. Nutzung der arteriolaren Endothelröhren zur Untersuchung der zellulären Physiologie
HINWEIS: Isolierte und gesicherte arteriolare Endothelröhren können für intrazelluläre Aufnahmen von [Ca2+]i Dynamik und Vm unter Verwendung von Photometrie bzw. scharfer Elektrodenelektrophysiologie verwendet werden, wie zuvordargestellt 13 (Abbildung 4). [Ca2+] i und Vm können je nach Bedarf als separate oder kombinierte experimentelle Größen gemessen werden13 (Abbildung 4). Arterioläre Endothelröhren sind jedoch empfindlicher als das arterielle Endothel, und die Experimentierzeit sollte 1 h nicht überschreiten.
- Messung von [Ca2+]i
- Schalten Sie das Gerät und die Software für [Ca2+]i-Aufnahmen ein, während Sie die kontinuierliche Superfusion bei einer Durchflussrate von 5-7 ml/min beibehalten.
- Beladen Sie das Endothelrohr mit dem Ca2+ Farbstoff Fura-2 AM für 30 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen mit Superfusionslösung für weitere 20-30 Minuten, während Sie die Badtemperatur schrittweise auf 37 ° C erhöhen. Halten Sie die Temperatur während des gesamten Experiments bei 37 ° C.
- Passen Sie das Bildgebungsfenster manuell mit Photometriesoftware an, um sich auf ~ 20 Endothelzellen zu konzentrieren (Abbildung 4A). In Abwesenheit von Licht schalten Sie die PMT auf die Fluoreszenzschnittstelle und beginnen Sie mit der Aufnahme von [Ca2+]i , indem Sie Fura-2 abwechselnd (≥10 Hz) bei 340 nm und 380 nm anregen, während Sie die Fluoreszenzemission bei 510 nm sammeln. Sobald eine stabile Baseline-Aufzeichnung von [Ca2+]i etabliert ist, wenden pharmakologische Wirkstoffe (z. B. purinerge Rezeptoragonisten) pro experimentellem Ziel an (Abbildung 4B).
- Messung von Vm
- Schalten Sie das Gerät und die Software für V m-Aufnahmen ein und stellen Sie die Datenerfassungsrate (≥10 Hz) ein, während die kontinuierliche Superfusion bei einer Durchflussrate von 5-7 ml / min beibehalten wird. Erhöhen Sie die Badtemperatur schrittweise auf 37 °C und halten Sie sie bis zum Ende des Experiments aufrecht.
- Ziehen Sie eine scharfe Elektrode mit einer Borosilikatglaskapillare, füllen Sie sie mit 2 M KCl und befestigen Sie sie über einem mit Chlorid beschichteten Silberdraht in dem Pipettenhalter, der an einem Elektrometer befestigt ist, der wiederum von einem Mikromanipulator gehalten wird.
- Während Sie durch das 4x-Objektiv schauen, verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die scharfe Elektrodenspitze vorsichtig über einer Zelle des arteriolaren Endothelrohrs in das fließende PSS in der Kammer zu positionieren.
- Erhöhen Sie die Vergrößerung schrittweise auf das 400-fache und positionieren Sie die Elektrodenspitze nach Bedarf neu.
- Führen Sie mit dem Mikromanipulator vorsichtig die Spitze einer scharfen Elektrode in eine der Zellen des Endothelrohrs ein und beginnen Sie mit der Aufzeichnung von Vm mit einem Elektrometer (Abbildung 4A).
- Sobald das endotheliale Ruhe-Vm stabil ist (−30 bis −40 mV), wenden Sie die gewünschten pharmakologischen Wirkstoffe pro Versuchsziel an (Abbildung 4C).
6. Zellbildgebung
HINWEIS: Endothelröhren, die in der Kammer der mobilen Plattform gesichert sind, können auch für die mikroskopische Bildgebung unter lebenden und festen Bedingungenverwendet werden 19 unter Verwendung der Standardfluoreszenz- oder konfokalen Mikroskopie. Auch die Immunhistochemie mit verschiedenen Antikörpern für Rezeptoren und Ionenkanäle kann wie zuvor beschriebenangewendet werden 20.
- Laden Sie das Endothelrohr mit dem Fluoreszenz-Tracker für die Plasmamembran oder die gewünschte Organelle (z. B. Kern, endoplasmatisches Retikulum) bei 37 °C für 15-30 min.
- Waschen Sie die Zellen mit frischem Superfusions-PSS und stellen Sie lebende Zellen unter dem Mikroskop bei der Anregungswellenlänge der jeweiligen Farbstoffe dar (Abbildung 4D, E).
HINWEIS: Die Immunhistochemie kann an diesem Röhrenmodell mit interessanten Antikörpern durchgeführt werden.
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Representative Results
Eine Demonstration des Protokolls ist in Abbildung 1 mit arteriolaren Dissektions- und Endothelröhrenisolationsschritten als Abbildung 2 bzw. Abbildung 3 dargestellt. Hier wurde die Endothelfunktion durch Messung von [Ca2+]i und Vm mittels Fura-2-Photometrie und Elektrophysiologie der scharfen Elektrode (Abbildung 4A) als Reaktion auf einen pharmakologischen Wirkstoff [2-Methylthioadenososindiphosphat (MTA), einen potenten purinergen Rezeptor (P2YR)-Agonisten] bei 37 °C beurteilt. Bei Anwendung von MTA (1 μM) steigt [Ca2+]i schnell an (Abbildung 4B) mit einer gleichzeitigen Hyperpolarisation (Abbildung 4C). Diese Messungen spiegeln die Aktivierung von G-q-Protein-gekoppelten Rezeptoren (P2YRs) wider, gefolgt von der Aktivierung von Ca 2+-aktivierten K+-Kanälen mit kleiner und mittlerer Leitfähigkeit (SK Ca/IKCa), die einen endothelabhängigen Hyperpolarisationsweg (EDH) auslösen. Somit ist das aus einer parenchymalenArteriole isolierte Endothel isoliert funktionsfähig und kann verwendet werden, um Schlüsselkomponenten von Signalwegen zu untersuchen, die eine Mobilisierung von [Ca2 +]i und/oder die Regulation von V m über K+-Kanäle beinhalten.
Darüber hinaus wurde das intakte Endothel bei 37 °C mit fluoreszierenden Trackern zur Visualisierung zur Untersuchung der Zellmorphologie inkubiert. Live-Endothelzellbildgebung zeigt Co-Färbung für Plasmamembran (grün) und Kerne (rot) (Abbildung 4D). In Abbildung 4E wurde die Plasmamembran (grün) zusammen mit einem endoplasmatischen Retikulum (ER; rot) fluoreszierenden Fleck gefärbt, wobei Bereiche mit scheinbarer Überlappung von ER in der Nähe der Plasmamembran orange erscheinen (Abbildung 4E). Diese fluoreszierenden Bilder zeigen außerdem die zelluläre Integrität des arteriolaren Endothels und ihre mögliche Verwendung zur Untersuchung von Signalmikrodomänen an Membrankomplexen.
Abbildung 1: Untersuchung der arteriolaren Endothelröhre, die frisch aus der parenchymalen Arteriole der Maus isoliert wurde. Wie dargestellt, wird das Gehirn von einer Maus isoliert, und ein Stück rechteckiges Hirngewebe, das die MCA enthält, wurde entfernt. Parenchymale Arteriolen, die sich vom MCA verzweigen und in das Parenchym des Gehirns eintreten, sind isoliert. Arteriole werden enzymatisch verdaut und verkümmert, wodurch ein intakter Endotheltubus für die Untersuchung entsteht. Das präparierte Endothelrohr ermöglicht die Messung der intrazellulären Ca2 + - Dynamik und Vm und ermöglicht gleichzeitig die zelluläre Bildgebung für die Fluoreszenzbildgebung und Immunhistochemie. Abkürzungen: MCA = mittlere Hirnarterie; Vm = Membranpotential. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Dissektion und Isolierung von parenchymalen Arteriolen. (A) Isoliertes Mausgehirn mit intaktem Willis-Kreis. (B) Ein seziertes rechteckiges Stück Hirngewebe, das den MCA (weißer Pfeil) enthält. (C) Isolierung der Pia aus dem oberen Teil des Gewebes (Arteriol, blauer Pfeil). (D) Arteriolen (mit blauen Pfeilspitzen umrandet), die mit den mittleren Hirnarterien verbunden sind (gelbe Pfeile). (E) Identifizierte Arteriole (blauer Pfeil) im Hirngewebe. (F) Herausziehen der Arteriole (blauer Pfeil) aus dem gelösten Gewebe. Beachten Sie, dass die Felder E und F eine alternative Methode zur Isolierung der Arteriole angeben (siehe Protokollschritt 3.2.3). Maßstäbe = 2 mm (A,B,C), 0,2 mm (T) und 1 mm (E,F). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Vorbereitung von Endothelröhren aus parenchymalen Arteriolen . (A) Isolierte und saubere Arteriole (blauer Pfeil). (B) Verreibung von teilweise enzymverdauten Arteriolen. (C) Intaktes Endothelrohr (Vergrößerung: 100x), das mit Pinning-Pipetten auf dem Glasdeckzettel vorbereitet und befestigt wird. (D) Endothelrohr bei 200-facher Vergrößerung. Maßstabsstäbe = 0,2 mm (A), 0,1 mm (B, C) und 0,05 mm (T). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Anwendung des Endothelrohrs zur physiologischen Untersuchung von Signalwegen im Zusammenhang mit der Blutflussregulation. (A) Eine scharfe Elektrode (violetter Pfeil) wird in einer Zelle eines Endothelrohrs positioniert, das im Datenerfassungsfenster für die Photometrie fokussiert ist. (B) Repräsentative Aufzeichnung von intrazellulärem Ca2+ mittels Fura-2-Photometrie als Reaktion auf MTA (1 μM). (C) Repräsentative Aufzeichnung von Vm gleichzeitig mit intrazellulärer Ca2+-Spur in Panel B. (D) Repräsentatives Bild der Plasmamembran (grün) und der Kerne (rot) lebender Endothelzellen, die mit fluoreszierenden Farbstoffen angefärbt sind. (E) Repräsentatives Bild der Plasmamembran (grün) und des endoplasmatischen Retikulums (ER, rot) von lebenden Endothelzellen, die mit fluoreszierenden Farbstoffen angefärbt sind. Bereiche in der Nähe für Notaufnahme und Plasmamembran sind orange dargestellt. Die Bilder wurden mit einer monochromen Kamera aufgenommen und waren pseudofarbig. Maßstabsstäbe = 20 μm (D), 10 μm (E). Abkürzungen: MTA = 2-Methylthioadenosindiphosphat; F340/F380 = Fura-2 Farbverhältnissignal; Vm = Membranpotential; PM = Plasmamembran; ER = endoplasmatisches Retikulum. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass zerebrovaskuläre Erkrankungen (CVD), Altern und Alzheimer-Krankheit stark korreliert sind und ein aktuelles Thema der Demenzforschungsind 4,8,14,21. Daher ist es offensichtlich, dass Studien des zerebrovaskulären Netzwerks einen breiten Einfluss auf die Gesundheit haben würden, während sie eine fortgesetzte umfassende Untersuchung während der Krankheitszustände erfordern. Als bedeutender Punkt der vaskulären Resistenz für die zerebrale Perfusion wird die allgemeine Bedeutung der parenchymalen Arteriolen für die Ätiologie und Entwicklung von CVD seit über 50 Jahren hervorgehoben22.
Wissenschaftliche Untersuchungsinstrumente wurden jedoch nicht ausreichend entwickelt, um intakte parenchymale Arteriolen und ihre zusammengesetzten Zelltypen zu untersuchen, bis kürzlich Ex-vivo-Ansätze wie die isolierten, unter Druck stehenden parenchymalen Arteriolen11 und CaPA12-Präparate eingesetzt wurden. Der Bereich der zerebrovaskulären Physiologie würde auch von komplementären Techniken in homozellulären Studienmodellen (glatte Muskulatur, Perizyten und Endothel) profitieren, um sich auf bestimmte Zelltypen und ihre genetischen und pharmakologischen Eigenschaften zu konzentrieren, die der zerebralen Blutflussregulation und der Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Hemmung (BHS) zugrunde liegen.
Das Endothel ist ein zentrales Regulationsorgan, das alle anderen Organe im ganzen Körper, einschließlich des Gehirns, "ernährt"23. Obwohl alle Gefäßsegmente (Arterien, Arteriolen, Kapillaren, Venen, Venen) für die zerebrale Perfusion essentiell sind, erfordert das Endothel der Arteriolen eine spezielle Untersuchung als zentrale Komponente der zerebrovaskulären Autoregulation und neurovaskulären Kopplung24. Darüber hinaus scheinen Ca2 + -Signalisierungs-25 und K + -Kanalaktivität17,26 während der Regulation des myogenen Tonus in Parenchymalarteriolen relativ zu den Piialarterien verstärkt zu sein. Damit haben wir nun die bisher etablierte Methode für die pialen Hirnarterien (posterior)13 auf parenchymale Arteriolen ausgeweitet.
Relativ zu diesen zuvor dargestellten Ansätzen11,13 wurde dieses Protokoll durch empirische Anpassung verschiedener Schritte (z.B. enzymatische Behandlung, Verreibung) verfeinert, um reproduzierbar intakte Endothelröhren aus parenchymalen Arteriolen zu erhalten. Darüber hinaus demonstriert dieses Protokoll die Verwendung dieses Studienmodells zur Optimierung der Anwendung von zellulärer Photometrie, Elektrophysiologie und fluoreszierender Bildgebung (Abbildung 4). Mit den allgemeinen Stärken und Einschränkungen der Fura-2-Photometrie und der Elektrophysiologie scharfer Elektroden, die zuvor ausführlich beschriebenwurden 13, wird der Experimentator ermutigt, eine Reihe anderer Ca2 + -Signalisierungs- und Ionenkanalassays auszuprobieren, um spezifische Hypothesen von Interesse zu testen. Darüber hinaus kann die Weiterentwicklung und Generierung neuartiger genetischer Modelle mit endothelzellenspezifischen genetisch kodierten Indikatoren (z.B. [Ca 2+]i27 und Spannung28 Indikatoren) die Nützlichkeit dieser Zubereitung erweitern.
Für den Untersuchungskontext ist dieses isolierte Endothelmodell nützlich für Forschungsfragen, die eine Untersuchung der Rolle des arteriolären Endothels bei der Regulation der Gefäßdynamik erfordern, wobei en-Face-Messungen aufgrund ihrer geringen Größe experimentell nicht durchführbar sind. Die endotheliale Regulation des zerebralen Blutflusses beginnt mit der Aktivierung verschiedener G-Protein-gekoppelter Rezeptoren (z.B. purinerge, muskarinisch)18 und Ionenkanäle (TRPV329, TRPA15, NMDA-Rezeptoren8). Die Aktivierung von G-q-Typ-Rezeptoren beinhaltet eine Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2)-Lipolyse zur Erzeugung von Inositoltrisphosphat (IP3) und Diacylglycerin für die [Ca2+]i-Mobilisierung, die dann die K+-Kanalaktivierung für Veränderungen in Vm15 vermitteln kann. Die K+-Kanalaktivität und damit Vm allein kann auch direkt unterphysiologischen Bedingungen 2 oder über ausgewähltes pharmakologisches Targeting30 untersucht werden. Darüber hinaus ermöglicht das arteriolare Endothelrohr eine verbesserte fluoreszierende Visualisierung ausgewählter Plasmamembran-Remodellierung (z. B. Filipin-III), intrazellulärer Organellen (z. B. ER-Tracker) und Zell-zu-Zell-Kopplung (z. B. Propidiumiodid)18,19. Ein weiteres Merkmal des Studienmodells ist daher die effektive Paarung von zellulärer Morphologie und Histologie mit Funktionsparametern wie Ca2 + und elektrischer Signalgebung beim Altern und der Entwicklung chronischer Krankheiten.
Die Komponenten des Protokolls, die besondere Aufmerksamkeit verdienen, sind die Arteriolärdissektion, die enzymatische Verdauung, die Verreibung und die Sicherung des arteriolaren Endothelrohrs für Messungen. Während der Dissektion aus dem Gehirn sollte eine Schädigung der Parenchymarteriolis um jeden Preis vermieden werden, um eine erfolgreiche Verdauung und Verreibung zur Isolierung einer intakten und funktionellen Endothelschicht zu gewährleisten. Darüber hinaus zerstört eine übermäßige Dehnung während der Sicherung des Endothelrohrs in der Perfusionskammer auch die Zubereitung und negiert effektiv alle vorherigen Protokollschritte.
Lebensfähigkeitstests sollten durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass arteriolare Endothelröhren in Bezug auf wichtige physiologische Komponenten wie Ca2 + -Signalgebung (Zustrom und / oder intrazelluläre Freisetzung) nach Stimulation von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, das Ausmaß derVm Hyperpolarisation und robuste interzelluläre Kopplung durch Gap Junctionsfunktionsfähig sind 18,23. Beispiele für solche Kontrollen sind die reversible purinerge Stimulation mit MTA (1 μM; Δ[Ca2+]i ~ 300 nM; ≥10 mV Hyperpolarisation; Abbildung 4B,C), reversible SK Ca/IKCa-Aktivierung mit NS309 (1 μM; ≥20 mV Hyperpolarisation) und/oder Korrespondenz zwischen Strominjektion (z. B. ~-1 nA) in eine Zelle und V-m-Antworten (~-10 mV) einer anderen Zelle in einem Abstand von ≥250 μm18,31. Mit Übung, Sorgfalt und experimenteller Strenge ist das gesamte Protokoll reproduzierbar, wenn der Lernende Geduld und Ausdauer hat.
Diese Methode hat wichtige Einschränkungen, wie die unzureichende Häufigkeit von Proben (z. B. Nukleinsäuren, Proteine und Lipide) und die relative Fragilität für biochemische Experimente bzw. Lebendzellaufzeichnungen. Dieser molekularbiologische Vorbehalt kann jedoch vermieden werden, indem mehrere Tiere gepoolt und / oder Quantifizierungsmethoden mit höherer Empfindlichkeit und Durchsatz entwickelt werden. Wenn die physiologische Temperatur bei 37 °C gehalten werden soll, sind kurze experimentelle Zeitrahmen (≤1 h) nur mit fokussierten pharmakologischen Interventionen erforderlich. Darüber hinaus wäre es äußerst schwierig, arteriolare Endothelröhren von kurzfristigen oder neugeborenen (<1 Monat alten) Tieren zu isolieren, was möglicherweise Studien zur zerebralen Gefäßentwicklung ausschließt.
Andere Überlegungen umfassen die genaue Zusammensetzung der zerebralen vaskulären Endothelröhren, die möglicherweise ausgewählte Ansätze der Immunfluoreszenz und Elektrophysiologie erfordern. Zum Beispiel verläuft die Basalmembran (hauptsächlich aus Kollagen IV, Laminin und Fibronektin bestehend) entlang des zerebralen Gefäßbaums. Es ist bekannt für seinen Beitrag zur Integrität der BHS, die von gehirnkapillaren Endothelzellengebildet wird 32. Es sollte beachtet werden, dass dieses Studienmodell möglicherweise nicht für BBB-Permeabilitätsexperimente geeignet ist, da Basalmembrankomponenten Substrate des Enzymcocktails sind, der für den teilweisen Aufschluss von arteriolaren Endothelröhren, insbesondere der Kollagenase H-Mischung, verwendet wird. Darüber hinaus eliminiert die Anwendung eines selektiven Enzymcocktails, die Entfernung der inneren elastischen Lamina und die eindeutige Identifizierung von Endothelzellen pro Struktur (parallele Anordnung vs. Umfang für glatte Muskelzellen), Morphologie ("Tränen"-Form von Endothelzellen vs. spindelförmige glatte Muskelzellen) und Elektrophysiologie (z. B. Hyperpolarisation zur GPCR-Stimulation) physiologische Beiträge von glatten Muskelzellen und Perizyten. Schließlich muss der Experimentator die Heterogenität der Endothelzellen (Genexpressionsprofil, Struktur, Funktion) pro Organtyp (z. B. Gehirn, Herz, Lunge 33) zusätzlich zur Hirnregion (z. B. Kortex 9,34, Hippocampus 10) und der jeweiligen vaskulären Segmentierung (z. B. Arterien, Arteriolen und Kapillaren 9,34,35) beachten. ). Daher erfordert eine umfassende Untersuchung der zerebralen Blutflussregulation auch komplementäre Ex-vivo- (z. B. intravaskuläre Druckmyographie, kapillar-parenchymale Arteriolenpräparation) und In-vivo- (z. B. intrazerebrale Laser-Doppler) Ansätze intakter vaskulärer Segmente und Netzwerke.
Zusammenfassend stellt dieses Papier eine fortgeschrittene Technik vor, die zeigt, wie man einen intakten Endotheltubus vorbereitet, der frisch aus den Parenchymarteriolen des Mausgehirns isoliert wurde. Wir gehen davon aus, dass dieser Ansatz In-vivo - und intakte Gefäßstudienmodelle ergänzen und/oder darauf aufbauen wird. Das übergeordnete Ziel ist es, neue Informationen für das Verständnis von Mechanismen zu generieren, die den zerebralen Blutfluss auf der grundlegenden Ebene für die Physiologie untermauern, und ausgewählte Übergänge in Richtung Pathologie für die Therapie.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (R00AG047198 & R56AG062169 an EJB; R00HL140106 bis PWP) und der Alzheimer's Association (AZRGD-21-805835 bis PWP). Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health oder der Alzheimer's Association dar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
| Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
| Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
| Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
| Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
| NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
| Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |
References
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Kelleher, R. J., Soiza, R. L. Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder. American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium. Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).
- Pires, P. W., Earley, S. Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke. elife. 7, 35316 (2018).
- Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease. Function. 2 (2), (2021).
- Zhao, L., et al. Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain. Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).
- Peters, E. C., et al. Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease. Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).
- Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).
- Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex. Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).
- Behringer, E. J., Hakim, M. A. Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).
- Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice. Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).
- Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).
- Attems, J., Jellinger, K. A. The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology. BMC Medicine. 12, 206 (2014).
- Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).
- Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Chen, Y. L., et al. Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice. Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).
- Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators. Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).
- Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).
- Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain. Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. elife. 9, 51413 (2020).
- Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).
- Chen, M. B., et al. Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues. Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).
