Summary
Serebral parankimal arteriollerden sağlam fare serebral endotelyal "tüplerinin" yoğun bir şekilde hazırlanması, serebral kan akışı regülasyonunu incelemek için gösterilmiştir. Ayrıca, bu endotel çalışma modelinin floresan görüntüleme ve anahtar hücresel sinyal yollarının elektrofizyoloji ölçümü için, hücre içi [Ca2+] ve membran potansiyelindeki değişiklikler de dahil olmak üzere deneysel güçlerini gösteriyoruz.
Abstract
Serebral kan akımı vasküler direnç arterleri ve aşağı akış parankimal arteriolleri ile iletilir. Kan akışına karşı kararlı durum vasküler direnci, arterlerden sonuçta kılcal damarlara beslenen arteriollere kadar azalan çapla artar. Parankimdeki daha küçük boyutları ve konumları nedeniyle, arterioller nispeten az çalışılmış ve bulgularda yüzey pial arterlerine göre daha az tekrarlanabilirliğe sahiptir. Ne olursa olsun, arteriyolar endotel hücre yapısı ve fonksiyonu - kronik dejeneratif hastalıkların fizyolojisi ve etiyolojisinin ayrılmaz bir parçası - kapsamlı bir araştırma gerektirir. Özellikle, ortaya çıkan kanıtlar, tehlikeye giren endotel fonksiyonunun bilişsel bozukluk ve demanstan önce geldiğini ve şiddetlendirdiğini göstermektedir.
Parankimal mikrosirkülasyonda, endotel K + kanal fonksiyonu, nöronal aktivite alanlarına kan akışındaki artışları teşvik etmek için vazodilatasyonun yayılmasını hassas bir şekilde kontrol etmek için en sağlam uyarandır. Bu yazıda, sağlam ve elektriksel olarak eşleşmiş endotel "tüplerinin" (çap, ~ 25 μm) fare beyni parankimal arteriollerinden taze izole edilmesi için rafine bir yöntem gösterilmektedir. Arteriyolar endotel tüpleri, hücre içi Ca2+ dinamikleri, membran potansiyelindeki değişiklikler ve membran lipid regülasyonu dahil olmak üzere K + kanal fonksiyonunu ve regülasyonunu kapsayan deneysel değişkenleri çözmek için fizyolojik koşullar (37 ° C, pH 7.4) sırasında sabitlenir. Arteriyel endotele karşı belirgin bir teknik avantaj, hücre ve organel (örneğin, mitokondri) boyutlarının artmış morfolojik çözünürlüğüdür ve bu da bu tekniğin kullanışlılığını arttırır. Yaşam boyunca sağlıklı serebral perfüzyon, parankimal arteriollerde sağlam endotel fonksiyonu gerektirir ve kan akışını beynin kesin anatomik bölgeleri boyunca nöronal ve glial aktivitenin körüklenmesine doğrudan bağlar. Bu nedenle, bu yöntemin sağlıklı ve hastalıklı beyin ile ilgili vasküler fizyoloji ve sinirbilim hakkındaki genel bilgileri önemli ölçüde ilerletmesi beklenmektedir.
Introduction
Parankimal arterioller doğrudan beyin boyunca gerekli oksijen ve besinleri sağlar1. Kılcal damarlarla arayüz oluştururken, yüksek vazoaktif arterioller, spesifik nöronal bölgelerden metabolik sinyalleri algılayan kılcal iyon kanalları tarafından başlatılan retrograd sinyalizasyona yanıt verir2. Beyin parankimi tarihsel olarak araştırmanın büyük kısmını almış olmakla birlikte, endotel disfonksiyonunun rolü, demansın altında yatan çeşitli serebrovasküler bozukluklarla ilişkili patolojik mekanizmaları açıklığa kavuşturmak için ortaya çıkmıştır (örneğin, iskemik inme, Alzheimer hastalığı)3,4,5,6 . Endotel, vasküler segmentler boyunca genetiğin, yapının ve fonksiyonun heterojenliği ile uyumlu olarak beynin perfüzyonunun ayrılmaz bir parçasıdır7. Pial arterler nispeten büyük boyutları, yüksek segmental vasküler dirençleri ve altta yatan serebrum 8,9'a kan akımı dağılımındaki rolleri nedeniyle kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Bu nedenle, arteriyolar endotel mekanizmalarının daha iyi anlaşılması, yeni terapötik rejimlerin geliştirilmesine yönelik sağlık ve hastalıkta beyin kan akımı düzenlemesinin anlaşılmasını artıracaktır.
Ortaya çıkan kanıtlar, farklı sinyal yolları ve hastalıklarla ilgili olarak parankimal arteriollerin incelenmesinin önemini vurgulamaktadır 8,10. Bununla birlikte, bu yaklaşım sağlam basınçlı arteriol11 ve/veya kılcal-parankimal arteriol (CaPA) preparatları12 kullanımı ile sınırlıdır. Yeni izole edilmiş, diğer hücre tiplerinden yoksun doğal serebral arteriyolar endotel hücreleri ve kafa karıştırıcı faktörler, muhtemelen izolasyonlarındaki teknik zorluklar nedeniyle incelenmemiştir. Bu yazıda, pial arteriyel endotel13'ün izolasyonunu vurgulayan önceki bir teknik, beyin parankimal arteriollerinin endotelini güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde izole etmek için ilerletmektedir (genişlik: ~25 μm, uzunluk: ~250 μm). Bu teknik, elektriksel ve kimyasal olarak bağlanmış hücrelerin bireysel yönelimlerinde ve hücresel ağlarında optimum çözünürlük elde etmelerine yardımcı olur.
İlgilenilen anahtar yollar, hücre içi Ca 2 + ([Ca2 +]i) sinyallemesinin etkileşimini ve membran potansiyelinin hiperpolarizasyonunun (Vm) 14,15 - vazodilatasyonun ayrılmazbir parçası 16 - kanın kılcal damarlara girmesine ve aktif parankim 17'ye oksijen ve besin vermesine izin vermeyi içermektedir. Bu preparatlar, Ca2 + geçirgen, geçici reseptör potansiyeli (TRP) ve K + kanalları dahil olmak üzere iyon kanallarının gerçek zamanlı elektrofizyolojik kayıtlarına ve / veya endotel hücre tüpleri içindeki hücre içi organellerin floresan görüntülemesine yakın fizyolojik koşullarda izin verir. Bu, beyin parankimine serebral kan akımı iletiminin endotel hücre kontrolünü yöneten fizyolojik hücresel mekanizmalarla ilgilenen araştırmacılar için uygun bir tekniktir. Toplamda, bu teknik, araştırmacıların beyin parankimine gömülü arteriollerin temel endotel sinyal yollarını ve ağ iletişimini daha iyi anlamalarına yardımcı olurken, serebrovasküler fizyoloji ve patoloji ile ilgili soruları ele alacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneyciler, belirlenmiş hayvan kullanımının ve ilgili protokollerin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmasını ve Ulusal Araştırma Konseyi'nin "Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu" (8. Baskı, 2011) ve ARRIVE kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmesini sağlamalıdır. Loma Linda Üniversitesi IACUC ve Arizona Üniversitesi, C57BL/6N ve 3xTg-AD fareleri (erkekler ve kadınlar; yaş aralığı: 2-30 ay) için bu makale için kullanılan tüm protokolleri onaylamıştır. Beynin fare parankimal arteriollerinden yeni izole edilen arteriyolar endotel tüplerinin izolasyonuna ve muayenesine genel bir bakış olarak Şekil 1'e bakınız.
1. Malzemeler ve ekipmanlar
NOT: Bu protokol için gerekli olan tüm reaktifler ve malzemeler için Malzeme Tablosuna bakınız. Ek olarak, gerektiğinde ilgili satıcılarla ilişkili kılavuzlara ve web sitelerine de danışılabilir. Diseksiyon istasyonlarının ve deney cihazlarının illüstrasyonları daha önce sağlanmıştı13.
- Akış odası
- Bir süperfüzyon odasını cam kapaklı bir şekilde eloksallı alüminyumdan oluşan bir platforma sabitleyin. Platformu odacıkla alüminyum mikroskop aşamasına sabitleyin.
- Alüminyum mikroskop aşamasında platformun her iki ucunda bir iğneleme pipeti tutan bir mikromanipülatör ayarlayın.
NOT: Gerekirse, güvenli, izole edilmiş bir endotel tüpünü deney için bir mikroskop cihazından diğerine taşımak için akış odası ünitesine sahip aktarılabilir bir sahne aparatı kullanın.
- Mikroskoplar
- Diseksiyon prosedürleri için stereomikroskoplar (5x ila 50x büyütme aralığı) ve fiber optik ışık kaynakları kullanın.
- Endotel tüplerinin izolasyonu için, faz kontrastı veya diferansiyel girişim kontrastı (DIC) uyumlu hedefler (10x, 20x ve 40x) ve bir alüminyum aşama ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop teçhizatı kullanın.
- Endotel tüplerini kısmen sindirilmiş kan damarlarından izole etmeye adanmış aparatın yanında bir mikroşırınga pompası kontrol cihazı hazırlayın.
- Ters çevrilmiş bir mikroskop (hedefler: 4x, 10x, 20x, 40x ve 60x) ve bir titreşim yalıtım tablosu üzerinde manuel bir alüminyum sahne düzenleyerek deneysel cihazı kurun.
- Hücre içi Vm kayıt cihazları
- Elektrometreyi uyumlu bir ana merkeze bağlayın. Akım enjeksiyonu gerektiren protokoller için fonksiyon üreteci ve uyarıcı gibi aksesuarlar kullanın.
- Amplifikatör çıkışlarını bir veri sayısallaştırıcı sisteme, osiloskop ve sesli taban çizgisi monitörlerine bağlayın. Referans banyosu elektrodunu (Ag/AgCl peleti) akış odası çıkışının yakınına sabitleyin.
- Endotel hücrelerinde [Ca2+]i ölçmek için floresan sistemi arayüzünün, yüksek yoğunluklu ark lambasının ve güç kaynağının, hiperswitch'in, fotoçarpan tüpünün (veya PMT) ve kameranın entegre bileşenleri ile bir fotometrik sistem monte edin.
- Deney boyunca fizyolojik bir sıcaklığı (37 ° C) yükseltmek ve korumak için sıralı bir ısıtıcı ile donatılmış bir sıcaklık kontrol cihazı monte edin.
- Çözeltilerin hazneye sabitlenmiş endotel tüplerine iletilmesini kontrol etmek için bir hat içi akış kontrol vanası ile bir valf kontrolörüne bağlı çok kanallı bir platform monte edin.
- Mikropipetler ve keskin elektrotlar
NOT: Deneycinin tritürasyon hazırlamak ve pipetleri sabitlemek için bir elektronik cam çektirmeye ve bir mikrodövmeye ihtiyacı olacaktır.- Endotel tüpünü kısmen sindirilmiş arteriyolar segmentten ayırmak için, borosilikat cam kılcal damarlardan ısıl cilalı tritürasyon pipetleri (iç uç çapı: 30-50 μm) hazırlayın.
- Endotel tüpünü süperfüzyon odasına sabitlemek için, ince duvarlı borosilikat cam kılcal damarlardan hazırlanmış, körelmiş, küresel uçlu (dış çap: 50-70 μm) ısı ile parlatılmış iğneleme pipetleri hazırlayın.
- Bir endotel hücresinin Vm'sini kaydetmek için, sadece cam çektirmeyi kullanarak cam kılcal damarlardan ~ 150 ± 30 MΩ uç direncine sahip keskin elektrotlar hazırlayın.
2. Çözümler ve ilaçlar
- Fizyolojik tuz çözeltisi (PSS)
- 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 10 mM N-2-hidroksietiliperarazin-N'-2-etansülfonik asit (HEPES) ve 10 mM glikoz kullanarak en az 1 L PSS hazırlayın.
- Serebral arteriyollerin diseksiyonu ve endotel tüpünün izolasyonu için CaCl 2(sıfır Ca2+ PSS) içermeyen gerekli solüsyonları hazırlayın.
NOT: Tüm çözeltileri ultra saf deiyonizeH2O'da hazırlayın, ardından filtrasyon (0,22 μm). Nihai ürünün, ozmolalitesi 290 ila 300 mOsm arasında olan bir pH 7.4 içerdiğinden emin olun.
- Sığır serum albümini (BSA, %10)
- Liyofilize BSA tozunun 1 g'ını 10 mL'lik sıfır Ca2 + PSS'lik bir beher içinde çözün. Beheri örtün ve BSA'nın çözünmesi için yavaş karıştırma ile en az 2 saat bekleyin.
- 10 mL'lik bir şırınga artı 0,22 μm filtre kullanarak çözeltiyi filtreleyin ve -20 ° C'de saklanmak üzere 1 mL alikot hazırlayın.
- Diseksiyon çözümü
- Toplam 50 mL hacim için 49,5 mL'lik sıfır Ca2+ PSS'ye 500 μL BSA (%10) ekleyin.
- Arteriyolar diseksiyonlar için bir Petri kabına transfer çözeltisi.
- Ayrışma çözümü
- Toplam 50 mL hacim için 5 μL CaCl2 çözeltisi (1 M) ve 500 μL BSA (%10) ile 49,5 mL sıfır Ca2+ PSS ekleyin. Çözeltiyi oda sıcaklığında en az 1 saat inkübe edin.
- Enzim
- 100 μg / mL papain, 170 μg / mL ditiyoeritritol, 250 μg / mL kollajenaz (H tipi karışım) ve 40 μg / mL elastaz ile 1 mL sindirim çözeltisi hazırlayın.
NOT: Enzim aktiviteleri değişebilir, ancak başarılı protokoller muhtemelen aşağıdaki enzimatik aktiviteleri gerektirecektir: ≥ papain için 10 birim / mg, kollajenaz için ≥ 1 birim / mg ve elastaz için ≥ 5 birim / mg.
- 100 μg / mL papain, 170 μg / mL ditiyoeritritol, 250 μg / mL kollajenaz (H tipi karışım) ve 40 μg / mL elastaz ile 1 mL sindirim çözeltisi hazırlayın.
- Fura-2 ve farmakolojik ajanlar
- Fura-2 stoğunu dimetil sülfoksitte (DMSO; 1 mM) hazırlayın. Yükleme için 495 μL PSS'ye 5 μL stok ekleyerek 500 μL çalışma konsantrasyonu (10 μM) hazırlayın.
- PSS veya DMSO'da farmakolojik ajanların en az 50 mL çalışma konsantrasyonunu uygun şekilde hazırlayın.
- İletken çözüm
- KCl'yi deiyonize H 2 O'da çözerek2M KCl hazırlayın (50 mL'likH2O'da 7.455 g KCl). Keskin elektrotları geri doldurmadan önce çözeltiyi 0,22 μm filtreli bir şırıngadan geçirin.
- Floresan organel izleyiciler ve antikorlar
- Plazma zarı veya organellar (örneğin, çekirdek, endoplazmik retikulum) izleyicileri, üreticinin talimatlarına göre uygun fizyolojik salin çözeltisinde hazırlayın.
- Birincil ve ikincil antikorları, uygun fizyolojik tuz çözeltisinde üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
3. Fare serebral arteriollerinin diseksiyonu ve izolasyonu
NOT: Tüm bu diseksiyon prosedürlerinde numune büyütme (50x'e kadar) için stereomikroskoplar ve keskinleştirilmiş mikrodiseksiyon aletleri (örneğin, ince uçlu forsepsler, Vannas tarzı diseksiyon makasları) kullanılmalıdır.
- Fare beyninin izolasyonu
- İzofluran inhalasyonu (2-3 dakika boyunca% 3) kullanarak standart bir laboratuvar faresini (örneğin, C57BL / 6, 3xTg-AD; 2-30 aylık, erkek veya dişi) anestezi altına alın, ardından IACUC onayına göre keskin makas veya giyotin kullanılarak derhal kafa kesme işlemi yapılır. Fare kafasını soğuk (4 °C) diseksiyon çözeltisi içeren bir Petri kabına (çap 10 cm, derinlik 1,5 cm) yerleştirin.
- Bir stereomikroskop altında izlerken, kafatasının üzerindeki cildi ve kılları çıkarın ve aşırı kanı soğuk diseksiyon çözeltisi ile yıkayın. Standart diseksiyon makaslarının uçlarını (örneğin, 24 mm'lik bıçaklar) kullanarak, oksipital kemikten başlayarak kafatasının burun kemiğinden yukarı doğru uzanan bir kesi yapın. Kafatasını insizyon boyunca dikkatlice açmak için kaba uçlu forseps kullanın ve sağlam bir Willis Çemberi içeren beyni izole etmek için ayrı bağ dokusu (meningeal membran) kullanın.
- Beynin yüzeyinden kalan kanı çıkarmak için izole edilmiş beyni bir beher veya Petri kabında soğuk diseksiyon çözeltisi ile yıkayın. Beyin ventral tarafını yukarı bakacak şekilde, parankimal arteriollerin izolasyonu için soğuk diseksiyon çözeltisi içeren bir odaya yerleştirin (Şekil 2A).
- Parankimal arteriollerin izolasyonu
NOT: Orta serebral arterlerden (MCA'lar) kaynaklanan ve beyin parankimine gömülü arterioller bu protokol için seçilmiştir. Arterioller daha önce tarif edildiği gibiizole edilir 11, modifikasyon ile.- İzole edilmiş beyni, kömürle aşılanmış silikon polimer kaplama (derinlik ≥ 50 cm) içeren bir Petri kabında soğuk diseksiyon çözeltisinde sabitlemek için çelik pimler (çap: 0,2 mm, uzunluk: 11 ila 12 mm) kullanın.
- Keskin ve hizalanmış diseksiyon makası kullanarak, MCA'nın etrafındaki bir beyin dokusu dikdörtgenini (uzunluk: 5 mm, genişlik: 3 mm) (Şekil 2B) keserken, doku segmentinin üst kısmının Willis Çemberi'nden dallanma noktasını geçmesini sağlayın. Gerekirse daha fazla arteriol'e erişmek için beynin diğer yarımküresinden başka bir beyin dokusu dikdörtgeni kesin.
- Ayrılmış beyin dokusu segmentini, MCA yukarı bakacak şekilde (Willis Çemberi'nden distal) çelik pimler (çap: 0,1 mm, uzunluk: 13 ila 14 mm) kullanarak çanağa sabitleyin. Piayı küçük forsepslerle çıkarmak için pimlerin yakınında sığ bir kesi yapın, bir uçtan diğerine doğru yavaşça soyun (Şekil 2C). Gerekirse daha fazla arteriole erişmek için piayı diğer doku segmentinden çıkarın. İzole piayı, çanaktaki MCA'dan dallanmış parankimal arteriollerle pimlerle dikkatlice sabitleyin ve parankimal arteriolleri diseke edin (Şekil 2D), arteriollerin zarar görmemesini sağlayın.
NOT: Arterioller parankimden pia ile kolayca çekilmezse, ince forseps kullanın ve Willis Çemberi'nden MCA dal noktasından başlayarak beynin içine kazın. Arteriolün yerini bulun, arteriollerin etrafındaki dokuyu dikkatlice gevşetin (Şekil 2E) ve arteriolün üst ucunu tutarak arteriolün parankimden yavaşça dışarı çekin (Şekil 2F). Çoklu arterioller (uzunluk: ~ 1.5-2 mm) beyin dokusunun bir dikdörtgeninden izole edilebilir. - Arteriolün kendisine bağlı doku olmadan temiz olduğundan emin olun ve kalan distal dalları kesin (Şekil 3A). Enzimatik sindirim için bu temiz, sağlam arteriol kullanın. Alternatif olarak, istenirse endotel tüplerinin hazırlanması için enzimatik sindirim için her bir arteriol iki parçaya (uzunluk: 0.75-1 mm) kesin.
4. Parankimal arteriollerin sindirimi ve endotel tüplerinin hazırlanması
- Ekipman ve pipetlerin düzenlenmesi
NOT: Arteriyel endotel tüplerinin beyinden izolasyonu daha önce13,18 olarak tanımlanmıştır. Mevcut protokol, endotelin parankimal (intraserebral) arteriollerden izolasyonu için modifikasyonlar içermektedir. Enzimatik sindirim için çoklu arterioller veya / ve arteriol parçaları birlikte kullanılabilir.- Bir odayı ve mikromanipülatörleri destekleyen alüminyum bir aşama kullanarak endotel tüplerini hazırlamak için tritürasyon aparatı13'ü monte edin. Hedeflerle (5x-60x) donatılmış bir mikroskop ve bir bilgisayar monitörüne bağlı bir kamera monte edin. Sahnenin ve numunenin yanında bir pompa kontrolörü ile bir mikroşırıngayı sabitleyin.
- Mikroşırınga pistonunun üzerine mineral yağ ile doldurulmuş bir tritürasyon pipeti sabitleyin. Pipetteki hava kabarcıklarını önlemeye özen gösterirken ayrışma solüsyonunu mineral yağın üstündeki tritürasyon pipetine (~130 nL) çekmek için pompa kontrol cihazıyla birlikte mikroşırıngayı kullanın.
- Arteriyolar segmentlerin kısmi sindirimi
- Bozulmamış arteriyolar segmentleri, 100 μg / mL papain, 170 μg / mL ditiyoeritritol, 250 μg / mL kollajenaz ve 40 μg / mL elastaz içeren 10 mL'lik bir cam tüp içinde 1 mL ayrışma çözeltisine yerleştirin. Arteriyolar segmentleri 10-12 dakika boyunca 34 °C'de inkübe edin.
- Sindirimden sonra, enzim çözeltisini oda sıcaklığında 3-4 mL taze ayrışma çözeltisi ile değiştirin.
- Arteriyolar endotel tüpünün izolasyonu
NOT: Enzim çözeltisinin sindirimi ve değiştirilmesini takiben, bir veya daha fazla kısmen sindirilmiş segmenti, bir mobil platforma bağlı bir süperfüzyon odasında ayrışma çözeltisine aktarın. 100x ila 200x büyütmede görüntülerken, kısmen sindirilmiş ancak kırılmamış bir damar segmenti seçin ve mikroskop altında odaklanın.- Mikroşırınga enjektörüne bağlı tritürasyon pipetini odadaki ayrışma çözeltisine yerleştirin ve sindirilmiş damar segmentinin bir ucuna yakın bir yere yerleştirin. Nazik tritürasyon için pompa kontrolöründe 1-3 nL/s aralığında bir hız ayarlayın.
- 100x ila 200x büyütmeyi korurken, arteriyolar segmenti pipete çekin ve ardından adventiti ve düz kas hücrelerini ayırmak için dışarı çıkarın (Şekil 3B). Tüm düz kas hücreleri ayrışana kadar damar segmentini tritüre edin ve sadece endotel hücreleri sağlam bir "tüp" olarak kalır.
NOT: Tritürasyon sırasında gerekirse, ayrışmış adventitiyi ve iç elastik laminayı endotel tüpünden çıkarmak için ince uçlu forseps kullanın. Tipik olarak, sadece birkaç tritürasyon döngüsü sağlam bir endotel tüpü verir. - Odadaki cam kapak kayması üzerindeki endotel tüpünün her bir ucunu borosilikat cam sabitleme pipetleri ile sabitlemek için mikromanipülatörler kullanın (Şekil 3C, D).
- Arteriyolar endotel tüpünün sabitlenmesi
- Endotel dışı materyalin odadan yıkanmasını sağlarken ayrışma çözeltisini süperfüzyon çözeltisi (2 mM CaCl2 içeren PSS) ile değiştirin.
- Mobil platformdaki güvenli endotel tüpünü, sürekli süperfüzyon ve hücre içi veya floresan kayıtlar/görüntüleme için tasarlanmış mikroskop donanımına aktarın.
- Deneme sırasında PSS'nin sürekli teslimini uygulayın. Hat içi akış kontrol vanasını kullanarak deney boyunca akış hızını (5-7 mL/dak) laminer akışla tutarlı bir şekilde manuel olarak ayarlayın ve çözelti akışının beslemesini vakum emme derecesine göre eşleştirin. Arka plan verilerini ve / veya boya yüklemesini almadan önce endotel tüpünün süperfüzyonu için odaya ≥5 dakikalık PSS akışı sağlayın.
5. Hücresel fizyolojinin incelenmesinde arteriyolar endotel tüplerinin kullanımı
NOT: İzole ve güvenli arteriyolar endotel tüpleri, daha önce gösterildiği gibi sırasıyla fotometri ve keskin elektrot elektrofizyolojisi kullanılarak [Ca2+]i dinamiği ve Vm'nin hücre içi kayıtları içinkullanılabilir (Şekil 4). [Ca2+] i ve Vm, gerektiğinde ayrı veya birleşik deneysel değişkenler olarak ölçülebilir13 (Şekil 4). Bununla birlikte, arteriyolar endotel tüpleri arteriyel endotelden daha hassastır ve deney süresi 1 saati geçmemelidir.
- [Ca2+]i ölçümü
- [Ca2+]i kayıtları için ekipmanı ve yazılımı açarken, 5-7 mL/dak akış hızında sürekli süperfüzyonu koruyun.
- Endotel tüpünü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca Ca2+ boya Fura-2 ile yükleyin. Banyo sıcaklığını kademeli olarak 37 ° C'ye yükseltirken hücreleri 20-30 dakika daha süperfüzyon çözeltisi ile yıkayın. Deney boyunca sıcaklığı 37 ° C'de tutun.
- ~20 endotel hücresine odaklanmak için fotometri yazılımını kullanarak görüntüleme penceresini manuel olarak ayarlayın (Şekil 4A). Işık yokluğunda, PMT'yi floresan arayüzünde çevirin ve 510 nm'de floresan emisyonu toplarken Fura-2'yi dönüşümlü olarak (≥10 Hz) 340 nm ve 380 nm'de heyecanlandırarak [Ca2+]i elde etmeye başlayın. [Ca2+]i'nin kararlı bir başlangıç kaydı oluşturulduktan sonra, deneysel amaç başına farmakolojik ajanlar (örneğin, pürinerjik reseptör agonistleri) uygulayın (Şekil 4B).
- Vm ölçümü
- Vm kayıtları için ekipmanı ve yazılımı açın ve 5-7 mL/dak akış hızında sürekli süperfüzyonu korurken veri toplama hızını (≥10 Hz) ayarlayın. Banyo sıcaklığını kademeli olarak 37 ° C'ye yükseltin ve deneyin sonuna kadar koruyun.
- Bir borosilikat cam kılcal damar kullanarak keskin bir elektrot çekin, 2 M KCl ile doldurun ve bir elektrometreye bağlı pipet tutucusunda klorürle kaplı gümüş bir tel üzerine sabitleyin, bu da bir mikromanipülatör tarafından tutulur.
- 4x hedefini izlerken, keskin elektrot ucunu arteriyolar endotel tüpünün bir hücresinin hemen üzerine dikkatlice yerleştirmek için bir mikromanipülatör kullanın.
- Büyütmeyi kademeli olarak 400x'e yükseltin ve elektrot ucunu gerektiği gibi yeniden konumlandırın.
- Mikromanipülatörü kullanarak, keskin bir elektrotun ucunu endotel tüpünün hücrelerinden birine yavaşça yerleştirin ve bir elektrometre kullanarak Vm kaydetmeye başlayın (Şekil 4A).
- Endotel istirahati Vm stabil olduğunda (-30 ila -40 mV), deneysel amaç başına istenen farmakolojik ajanları uygulayın (Şekil 4C).
6. Hücresel görüntüleme
NOT: Mobil platformun odasına sabitlenmiş endotel tüpleri, standart floresan veya konfokal mikroskopi kullanılarak hem canlı hem de sabit koşullarda19 mikroskobik görüntüleme için de kullanılabilir. Reseptörler ve iyon kanalları için farklı antikorlara sahip immünohistokimya da daha önce tarif edildiği gibi uygulanabilir20.
- Endotel tüpünü, plazma zarı veya istenen organel (örneğin, çekirdek, endoplazmik retikulum) için floresan izleyici ile 15-30 dakika boyunca 37 ° C'de yükleyin.
- Hücreleri taze süperfüzyon PSS ile yıkayın ve canlı hücreleri mikroskop altında ilgili boyaların uyarma dalga boyunda görüntüleyin (Şekil 4D, E).
NOT: İmmünohistokimya, bu tüp modelinde ilgili antikorlar kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolün bir gösterimi Şekil 1'de arteriyoler diseksiyon ve endotel tüp izolasyon basamakları ile sırasıyla Şekil 2 ve Şekil 3 olarak gösterilmiştir. Burada, endotel fonksiyonu, 37 ° C'de güçlü bir pürinerjik reseptör (P2YR) agonisti olan 2-metiltiyoadenozin difosfat (MTA), güçlü bir pürinerjik reseptör (P2YR) agonisti] yanıtında Fura-2 fotometrisi ve keskin elektrot elektrofizyolojisi (Şekil 4A) kullanılarak [Ca 2+]i ve Vm ölçülerek değerlendirildi. MTA (1 μM) uygulandığında, [Ca2+]i, eşlik eden bir hiperpolarizasyon (Şekil 4C) ile hızla artar (Şekil 4B). Bu ölçümler, Gq-protein bağlantılı reseptörlerin (P2YR'ler) aktivasyonunun bir yansımasıdır, ardından endotele bağımlı hiperpolarizasyon (EDH) vazodilatatör bir yol başlatan küçük ve ara iletkenlik Ca2 + - aktive K + kanallarının (SKCa / IKCa) aktivasyonudur. Bu nedenle, parankimal bir arteriolden izole edilen endotel izolasyonda işlevseldir ve [Ca2 +] i'nin mobilizasyonunu ve / veya Vm'nin K + kanalları aracılığıyla düzenlenmesini içeren yolakların anahtar bileşenlerini incelemek için kullanılabilir.
Ayrıca, bozulmamış endotel, hücresel morfolojiyi incelemek için görselleştirme için floresan izleyicilerle 37 ° C'de inkübe edildi. Canlı endotel hücre görüntülemesinde plazma membranı (yeşil) ve çekirdekler (kırmızı) için ko-boyanma görülmektedir (Şekil 4D). Şekil 4E'de, plazma zarı (yeşil) bir endoplazmik retikulum (ER; kırmızı) floresan boyası ile birlikte boyandı, böylece plazma zarının yakınında ER'nin görünür örtüşme alanları turuncu görünür (Şekil 4E). Bu floresan görüntüler ayrıca arteriyolar endotelin hücresel bütünlüğünü ve bileşke membran komplekslerinde bulunan sinyal mikroalanlarını incelemek için olası kullanımlarını ortaya koymaktadır.
Şekil 1: Fare parankimal arteriolünden yeni izole edilen arteriyoler endotel tüpünün incelenmesi. Gösterildiği gibi, beyin bir fareden izole edilir ve MCA'yı içeren dikdörtgen bir beyin dokusu parçası çıkarılır. MCA'dan dallanan ve beyin parankimine giren parankimal arterioller izole edilir. Arterioller enzimatik olarak sindirilir ve tritüre edilir, bu da çalışma için sağlam bir endotel tüpü üretir. Hazırlanan endotel tüpü, hücre içi Ca2+ dinamiklerinin ve Vm'nin ölçülmesini sağlarken, floresan görüntüleme ve immünohistokimya için hücresel görüntülemeyi de mümkün kılar. Kısaltmalar: MCA = orta serebral arter; Vm = membran potansiyeli. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Parankimal arteriollerin diseksiyonu ve izolasyonu. (A) Willis'in sağlam Çemberi ile izole edilmiş fare beyni. (B) MCA'yı (beyaz ok) içeren disseke edilmiş dikdörtgen bir beyin dokusu parçası. (C) Pia'nın dokunun üst kısmından izolasyonu (arteriol, mavi ok). (D) Orta serebral arterlere (sarı oklar) bağlı arterioller (mavi ok uçlarıyla özetlenmiş). (E) Beyin dokusunda tanımlanmış arteriol (mavi ok). (F) Gevşemiş dokudan arteriol (mavi ok) çekilmesi. E ve F panellerinin arteriolün izolasyonu için alternatif bir yöntem gösterdiğini unutmayın (bkz. protokol adımı 3.2.3). Ölçek çubukları = 2 mm (A,B,C), 0,2 mm (D) ve 1 mm (E,F). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Parankimal arteriollerden endotel tüplerinin hazırlanması. (A) İzole ve temiz arteriol (mavi ok). (B) Kısmen enzim tarafından sindirilmiş arteriolün tritürasyonu. (C) Sabitleme pipetleri kullanılarak cam kapak kapağı üzerine hazırlanmış ve sabitlenmiş sağlam endotel tüpü (büyütme: 100x). (D) 200x büyütmede endotel tüpü. Ölçek çubukları = 0,2 mm (A), 0,1 mm (B, C) ve 0,05 mm (D). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kan akımı regülasyonu ile ilgili yolakların fizyolojik incelemesi için endotel tüpünün uygulanması. (A) Fotometri için veri toplama penceresine odaklanmış bir endotel tüpünün hücresine keskin bir elektrot (mor ok) yerleştirilir. (B) MTA'ya (1 μM) yanıt olarak Fura-2 fotometrisikullanılarak hücre içi Ca 2+'nın temsili kaydı. (C) B panelinde hücre içi Ca2+ izi ile eşzamanlı olarak Vm'nin temsili kaydı. (D) Floresan boyalarla boyanmış canlı endotel hücrelerinin plazma zarının (yeşil) ve çekirdeklerinin (kırmızı) temsili görüntüsü. (E) Floresan boyalarla boyanmış canlı endotel hücrelerinin plazma zarının (yeşil) ve endoplazmik retikulumun (ER, kırmızı) temsili görüntüsü. ER ve plazma zarı için yakınlık alanları turuncu renkle belirtilmiştir. Görüntüler tek renkli bir kamera kullanılarak elde edildi ve sahte renkliydi. Ölçek çubukları = 20 μm (D), 10 μm (E). Kısaltmalar: MTA = 2-metiltiyoadenozin difosfat; F340/F380 = Fura-2 boya oranı sinyali; Vm = membran potansiyeli; PM = plazma zarı; ER = endoplazmik retikulum. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Artan kanıtlar, serebrovasküler hastalık (CVD), yaşlanma ve Alzheimer hastalığının güçlü bir şekilde ilişkili olduğunu ve demans araştırmalarının güncel bir konusu olduğunu göstermektedir 4,8,14,21. Bu nedenle, serebrovasküler ağ çalışmalarının sağlık üzerinde geniş bir etkiye sahip olacağı ve hastalık koşulları sırasında sürekli kapsamlı araştırmalar gerektireceği açıktır. Serebral perfüzyon için vasküler direncin önemli bir noktası olarak, parankimal arteriollerin KVH'nin etiyolojisi ve gelişimindeki genel önemi 50 yılı aşkın bir süredir vurgulanmıştır22.
Bununla birlikte, izole edilmiş, basınçlı parankimal arteriol11 ve CaPA12 preparatları gibi ex vivo yaklaşımların yakın zamanda başlamasına kadar bozulmamış parankimal arteriolleri ve kompozit hücre tiplerini incelemek için bilimsel inceleme araçları yeterince geliştirilmemiştir. Serebrovasküler fizyoloji alanı, spesifik hücre tiplerine ve serebral kan akımı regülasyonu ve kan-beyin bariyeri (BBB) geçirgenliğinin altında yatan genetik ve farmakolojik özelliklerine odaklanmak için homosellüler çalışma modellerinde (düz kas, perisitler ve endotel) tamamlayıcı tekniklerden de yararlanacaktır.
Endotel, beyin de dahil olmak üzere vücuttaki diğer tüm organları "besleyen" merkezi bir düzenleyici organdır23. Tüm vasküler segmentler (arterler, arterioller, kılcal damarlar, venüller, venler) serebral perfüzyon için gerekli olmasına rağmen, arteriollerin endoteli, serebrovasküler otoregülasyon ve nörovasküler kuplajın merkezi bir bileşeni olarak özel bir araştırma gerektirir24. Ayrıca, Ca 2+ sinyal 25 ve K+ kanal aktivitesi17,26, pial arterlere göre parankimal arteriollerde miyojenik tonun düzenlenmesi sırasında artmış gibi görünmektedir. Bu nedenle, pial serebral arterler (posterior)13 için daha önce kurulmuş olan yöntemi parankimal arteriollere genişlettik.
Daha önce gösterilen bu yaklaşımlara göre11,13, bu protokol, parankimal arteriollerden sağlam endotel tüplerini çoğaltılabilir bir şekilde vermek için çeşitli adımları (örneğin, enzimatik tedavi, tritürasyon) ampirik olarak ayarlayarak rafine edildi. Ek olarak, bu protokol, hücresel fotometri, elektrofizyoloji ve floresan görüntüleme uygulamasını optimize etmek için bu çalışma modelinin kullanımını göstermektedir (Şekil 4). Fura-2 fotometrisinin genel güçleri ve sınırlamaları ve daha önce ayrıntılı olarak13'te açıklanan keskin elektrot elektrofizyolojisi ile, deneycinin ilgilendiği spesifik hipotezleri test etmek için bir dizi diğer Ca2+ sinyalleme ve iyon kanalı tahlillerini denemesi teşvik edilir. Ayrıca, endotel hücresine özgü genetik olarak kodlanmış göstergelere (örneğin [Ca2+]i27 ve voltaj28 göstergeleri) sahip yeni genetik modellerin ilerlemesi ve üretilmesi, bu preparatın kullanışlılığını artırabilir.
Araştırmacı bağlam için, bu izole endotel modeli, arteriyolar endotelin vasküler dinamiklerin düzenlenmesindeki rolünün incelenmesini gerektiren araştırma soruları için yararlıdır, bu nedenle yüz ölçümleri küçük boyutlarından dolayı deneysel olarak mümkün değildir. Serebral kan akımının endotel regülasyonu, çeşitli G-protein eşleşmiş reseptörlerinin (örneğin, pürinerjik, muskarinik)18 ve iyon kanallarının (TRPV329, TRPA15, NMDA reseptörleri8) aktivasyonu ile başlar. Gq-tipi reseptörlerin aktivasyonu, inositol trisfosfat (IP3) üretmek için fosfatidilinositol 4,5-bisfosfat (PIP2) lipolizi ve [Ca2+]i mobilizasyonu için diasilgliserol gerektirir ve daha sonra Vm15'teki değişiklikler için K+ kanal aktivasyonuna aracılık edebilir. K+ kanal aktivitesi ve dolayısıyla tek başına Vm, doğrudan fizyolojik koşullar2 altında veya belirli farmakolojik hedefleme30 yoluyla da incelenebilir. Ayrıca, arteriyolar endotel tüpü, seçilmiş plazma zarı yeniden şekillenmesinin (örneğin, Filipin-III), hücre içi organellerin (örneğin, ER izleyici) ve hücreden hücreye eşleşmenin (örneğin, propidium iyodür) floresan görselleştirmesinin geliştirilmesini sağlar18,19. Bu nedenle, çalışma modelinin bir başka özelliği, hücresel morfoloji ve histolojinin, yaşlanmada ve kronik hastalıkların gelişiminde Ca2 + ve elektrik sinyalizasyonu gibi fonksiyon parametreleri ile etkili bir şekilde eşleştirilmesini gerektirir.
Protokolün özel ilgiyi hak eden bileşenleri arteriyolar diseksiyon, enzimatik sindirim, tritürasyon ve ölçümler için arteriyolar endotel tüpünün sabitlenmesidir. Beyinden diseksiyon sırasında, sağlam ve fonksiyonel bir endotel tabakasını izole etmek için başarılı sindirim ve tritürasyon sağlamak için parankimal arteriol hasarından ne paladyal olursa olsun kaçınılmalıdır. Ayrıca, endotel tüpünü perfüzyon odasına sabitlerken aşırı gerilme, preparasyonu da tahrip edecek ve önceki tüm protokol adımlarını etkili bir şekilde reddedecektir.
Canlılık testleri, arteriyolar endotel tüplerinin, G-protein kuplajlı reseptörlerin uyarılmasını takiben Ca 2+ sinyallemesi (akın ve / veya hücre içi salınım), Vm hiperpolarizasyonunun derecesi ve boşluk kavşakları18,23 yoluyla sağlam hücreler arası eşleşme gibi anahtar fizyolojik bileşenlere göre fonksiyonel olmasını sağlamak için uygulanmalıdır. Bu tür kontrollere örnek olarak MTA (1 μM; Δ[Ca2+]i ~ 300 nM; ≥10 mV hiperpolarizasyon; Şekil 4B,C), NS309 (1 μM; ≥20 mV hiperpolarizasyon) kullanılarak geri dönüşümlü SK Ca/IKCa aktivasyonu ve/veya bir hücreye akım enjeksiyonu (örneğin, ~-1 nA) ile ≥250μm 18,31 mesafede diğerinin V m yanıtları (~-10 mV) arasındaki yazışmalar. Uygulama, özen ve deneysel titizlikle, öğrencinin sabrı ve azmi varsa tüm protokol tekrarlanabilir.
Bu yöntemin, numunelerin yetersiz bolluğu (örneğin, nükleik asitler, proteinler ve lipitler) ve sırasıyla biyokimyasal deneyler ve canlı hücre kayıtları için göreceli kırılganlık gibi ele alınması gereken önemli sınırlamaları vardır. Bununla birlikte, bu moleküler biyoloji uyarısı, birkaç hayvandan bir araya getirilerek ve / veya daha yüksek hassasiyet ve verime sahip nicel yöntemler tasarlayarak önlenebilir. Fizyolojik sıcaklık 37 ° C'de tutulacaksa, sadece odaklanmış farmakolojik müdahalelerle kısa deneysel zaman dilimleri (≤1 saat) gerekecektir. Ek olarak, arteriyolar endotel tüplerini yakın süreli veya yenidoğan (<1 aylık) hayvanlardan izole etmek son derece zor olacaktır, bu da potansiyel olarak serebral vasküler gelişim çalışmalarını engelleyecektir.
Diğer hususlar, potansiyel olarak immünofloresan ve elektrofizyolojinin seçilmiş yaklaşımlarını gerektiren serebral vasküler endotel tüplerinin hassas bileşimini kapsar. Örneğin, bazal membran (esas olarak kollajen IV, laminin ve fibronektinden oluşur) serebral vasküler ağaç boyunca uzanır. Beyin kılcal endotel hücreleri tarafından oluşturulan BBB'nin bütünlüğüne katkısı ile bilinir32. Bu çalışma modelinin BBB geçirgenlik deneyleri için uygun olmayabileceği unutulmamalıdır, çünkü bazal membran bileşenleri, arteriyolar endotel tüplerinin, özellikle de kollajenaz H karışımının kısmi sindirimi için kullanılan enzim kokteylinin substratlarıdır. Ayrıca, seçici bir enzim kokteylinin uygulanması, iç elastik laminanın çıkarılması ve yapı başına endotel hücrelerinin net bir şekilde tanımlanması (düz kas hücreleri için paralel düzenlemeye karşı çevresel), morfoloji ("endotel hücrelerinin gözyaşı damlası" şekline karşı iğ şeklindeki düz kas hücreleri) ve elektrofizyoloji (örneğin, GPCR stimülasyonuna hiperpolarizasyon), düz kas hücrelerinin ve perisitlerin fizyolojik katkılarını ortadan kaldırır. Son olarak, deneyci, beyin bölgesine (örneğin, korteks 9,34, hipokampus10) ve ilgili vasküler segmentasyona (örneğin, arterler, arteriollerve kılcal damarlar 9,34,35) ek olarak, organ tipi başına endotel hücre heterojenitesini (örneğin, beyin, kalp, akciğer 33) not etmelidir. ). Bu nedenle, serebral kan akımı regülasyonu ile ilgili kapsamlı bir çalışma, sağlam vasküler segmentlerin ve ağların tamamlayıcı ex vivo (örneğin, intravasküler basınç miyografisi, kılcal-parankimal arteriol preparatı) ve in vivo (örneğin, intraserebral Lazer Doppler) yaklaşımlarını da gerektirecektir.
Özetle, bu yazıda fare beyni parankimal arteriollerinden yeni izole edilmiş sağlam bir endotel tüpünün nasıl hazırlanacağını gösteren ileri bir teknik sunulmaktadır. Bu yaklaşımın in vivo ve bozulmamış vasküler çalışma modellerini tamamlayacağını ve / veya oluşturacağını tahmin ediyoruz. Genel amaç, fizyoloji için temel düzeyde serebral kan akışını destekleyen mekanizmaları anlamak için yeni bilgiler üretmek ve tedavi için patolojiye geçişleri seçmektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (R00AG047198 & R56AG062169) EJB'ye; R00HL140106'dan PWP'ye) ve Alzheimer Derneği (AZRGD-21-805835'ten PWP'ye). İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri veya Alzheimer Derneği'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
| Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
| Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
| Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
| Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
| NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
| Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |
References
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Kelleher, R. J., Soiza, R. L. Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder. American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium. Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).
- Pires, P. W., Earley, S. Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke. elife. 7, 35316 (2018).
- Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease. Function. 2 (2), (2021).
- Zhao, L., et al. Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain. Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).
- Peters, E. C., et al. Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease. Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).
- Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).
- Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex. Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).
- Behringer, E. J., Hakim, M. A. Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).
- Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice. Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).
- Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).
- Attems, J., Jellinger, K. A. The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology. BMC Medicine. 12, 206 (2014).
- Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).
- Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Chen, Y. L., et al. Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice. Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).
- Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators. Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).
- Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).
- Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain. Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. elife. 9, 51413 (2020).
- Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).
- Chen, M. B., et al. Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues. Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).
