Summary
La preparazione intensiva di "tubi" endoteliali cerebrali di topo intatti da arteriole parenchimali cerebrali è illustrata per lo studio della regolazione del flusso sanguigno cerebrale. Inoltre, dimostriamo i punti di forza sperimentali di questo modello di studio endoteliale per l'imaging a fluorescenza e la misurazione elettrofisiologica delle principali vie di segnalazione cellulare, compresi i cambiamenti nel potenziale intracellulare [Ca2+] e di membrana.
Abstract
Il flusso sanguigno cerebrale è trasmesso dalle arterie di resistenza vascolare e dalle arteriole parenchimali a valle. La resistenza vascolare allo stato stazionario al flusso sanguigno aumenta con la diminuzione del diametro dalle arterie alle arteriole che alla fine alimentano i capillari. A causa delle loro dimensioni e posizione più piccole nel parenchima, le arteriole sono state relativamente poco studiate e con una minore riproducibilità nei reperti rispetto alle arterie piali superficiali. Indipendentemente da ciò, la struttura e la funzione delle cellule endoteliali arteriolari, parte integrante della fisiologia e dell'eziologia delle malattie degenerative croniche, richiedono un'indagine approfondita. In particolare, prove emergenti dimostrano che la funzione endoteliale compromessa precede ed esacerba il deterioramento cognitivo e la demenza.
Nella microcircolazione parenchimale, la funzione del canale K+ endoteliale è lo stimolo più robusto per controllare finemente la diffusione della vasodilatazione per promuovere aumenti del flusso sanguigno verso le aree di attività neuronale. Questo documento illustra un metodo raffinato per isolare di nuovo "tubi" endoteliali intatti ed accoppiati elettricamente (diametro, ~ 25 μm) dalle arteriole parenchimali del cervello di topo. I tubi endoteliali arteriolari sono fissati durante le condizioni fisiologiche (37 °C, pH 7,4) per risolvere le variabili sperimentali che comprendono la funzione del canale K+ e la loro regolazione, tra cui la dinamica intracellulare di Ca2+ , i cambiamenti nel potenziale di membrana e la regolazione lipidica di membrana. Un netto vantaggio tecnico rispetto all'endotelio arterioso è la maggiore risoluzione morfologica delle dimensioni delle cellule e degli organelli (ad esempio, i mitocondri), che espande l'utilità di questa tecnica. Una sana perfusione cerebrale per tutta la vita comporta una robusta funzione endoteliale nelle arteriole parenchimali, collegando direttamente il flusso sanguigno all'alimentazione dell'attività neuronale e gliale in precise regioni anatomiche del cervello. Pertanto, si prevede che questo metodo farà progredire significativamente la conoscenza generale della fisiologia vascolare e delle neuroscienze riguardanti il cervello sano e malato.
Introduction
Le arteriole parenchimali forniscono direttamente ossigeno e sostanze nutritive essenziali in tutto il cervello1. Durante l'interfacciamento con i capillari, le arteriole altamente vasoattive rispondono alla segnalazione retrograda avviata dai canali ionici capillari che rilevano i segnali metabolici provenienti da specifiche regioni neuronali2. Con il parenchima cerebrale che ha storicamente ricevuto la maggior parte delle indagini, è ora emerso un ruolo per la disfunzione endoteliale per chiarire i meccanismi patologici associati a vari disturbi cerebrovascolari che sono alla base della demenza (ad esempio, ictus ischemico, morbo di Alzheimer)3,4,5,6 . L'endotelio è parte integrante della perfusione del cervello in accordo con l'eterogeneità della genetica, della struttura e della funzione in tutti i segmenti vascolari7. Le arterie piali sono state ampiamente studiate a causa delle loro dimensioni relativamente grandi, dell'elevata resistenza vascolare segmentale e del ruolo nella distribuzione del flusso sanguigno al cervello sottostante 8,9. Pertanto, una migliore comprensione dei meccanismi endoteliali arteriolari probabilmente migliorerà la comprensione della regolazione del flusso sanguigno cerebrale in salute e malattia verso lo sviluppo di nuovi regimi terapeutici.
Le evidenze emergenti evidenziano l'importanza di studiare le arteriole parenchimali in relazione a diverse vie di segnalazione e malattie 8,10. Tuttavia, questo approccio è stato limitato all'uso di arteriola11 pressurizzata intatta e / o preparazioni di arteriola capillare-parenchimale (CaPA)12. Le cellule endoteliali arteriolari cerebrali native appena isolate, prive di altri tipi di cellule e fattori confondenti non sono state esaminate, probabilmente a causa di difficoltà tecniche nel loro isolamento. Questo documento avanza una tecnica precedente che evidenzia l'isolamento dell'endotelio arterioso13 per isolare in modo affidabile e riproducibile l'endotelio delle arteriole parenchimali cerebrali (larghezza: ~ 25 μm, lunghezza: ~ 250 μm). Questa tecnica aiuta a raggiungere una risoluzione ottimale delle cellule accoppiate elettricamente e chimicamente nel loro orientamento individuale e nelle reti cellulari.
Le principali vie di interesse hanno incluso l'interazione della segnalazione intracellulare di Ca2+ ([Ca2+]i) e l'iperpolarizzazione del potenziale di membrana (Vm)14,15 - parte integrante della vasodilatazione16 - per consentire al sangue di entrare nei capillari e fornire ossigeno e sostanze nutritive al parenchima attivo17. Questi preparati consentono registrazioni elettrofisiologiche in tempo reale dei canali ionici, inclusi i canali Ca2+-permeant, transient receptor potential (TRP) e K+ e/o l'imaging fluorescente di organelli intracellulari all'interno di tubi cellulari endoteliali in condizioni quasi fisiologiche. Questa è una tecnica adatta per i ricercatori interessati ai meccanismi cellulari fisiologici che governano il controllo delle cellule endoteliali della consegna del flusso sanguigno cerebrale al parenchima cerebrale. Complessivamente, questa tecnica aiuterà i ricercatori a comprendere meglio le vie di segnalazione endoteliali fondamentali e la comunicazione di rete delle arteriole incorporate nel parenchima cerebrale, affrontando al contempo le domande relative alla fisiologia e alla patologia cerebrovascolare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Gli sperimentatori dovrebbero garantire che l'uso designato degli animali e dei protocolli associati sia approvato dal loro Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) ed eseguito in conformità con la "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio" del Consiglio nazionale delle ricerche (8a edizione, 2011) e le linee guida ARRIVE. La IACUC della Loma Linda University e dell'Università dell'Arizona ha approvato tutti i protocolli utilizzati per questo manoscritto per topi C57BL/6N e 3xTg-AD (maschi e femmine; fascia di età: 2-30 mesi). Vedere la Figura 1 come panoramica dell'isolamento e dell'esame dei tubi endoteliali arteriolari appena isolati dalle arteriole parenchimali del topo del cervello.
1. Materiali e attrezzature
NOTA: vedere la tabella dei materiali per tutti i reagenti e i materiali necessari per questo protocollo. Inoltre, se necessario, è possibile consultare manuali e siti Web associati ai rispettivi fornitori. Illustrazioni di stazioni di dissezione e apparati sperimentali sono state precedentemente fornite13.
- Camera di flusso
- Fissare una camera di superfusione con un coperchio di vetro su una piattaforma composta da alluminio anodizzato. Fissare la piattaforma con la camera su uno stadio di microscopio in alluminio.
- Impostare un micromanipolatore che tiene una pipetta di bloccaggio a ciascuna estremità della piattaforma sul palco del microscopio in alluminio.
NOTA: Se necessario, utilizzare un apparecchio a stadio trasferibile con un'unità a camera di flusso per spostare un tubo endoteliale isolato e protetto da un apparecchio per microscopio a un altro per la sperimentazione.
- Microscopi
- Utilizzare stereomicroscopi (intervallo di ingrandimento da 5x a 50x) e sorgenti luminose in fibra ottica per le procedure di dissezione.
- Per l'isolamento dei tubi endoteliali, utilizzare un carro per microscopio invertito dotato di obiettivi compatibili con il contrasto di fase o il contrasto di interferenza differenziale (DIC) (10x, 20x e 40x) e uno stadio in alluminio.
- Avere un controller della pompa a microsiringa pronto accanto all'apparecchio dedicato all'isolamento dei tubi endoteliali dai vasi sanguigni parzialmente digeriti.
- Impostare l'apparato sperimentale disponendo un microscopio invertito (obiettivi: 4x, 10x, 20x, 40x e 60x) e uno stadio manuale in alluminio su una tavola di isolamento dalle vibrazioni.
- Apparecchio di registrazione intracellulare Vm
- Collegare l'elettrometro a un headstage compatibile. Utilizzare accessori, come un generatore di funzioni e uno stimolatore, per i protocolli che richiedono l'iniezione di corrente.
- Collegare le uscite dell'amplificatore a un sistema di digitalizzazione dei dati, oscilloscopio e monitor di base udibili. Fissare l'elettrodo del bagno di riferimento (pellet Ag/AgCl) vicino all'uscita della camera di flusso.
- Assemblare un sistema fotometrico con componenti integrati di un'interfaccia del sistema di fluorescenza, lampada ad arco ad alta intensità e alimentatore, iperinterruttore, tubo fotomoltiplicatore (o PMT) e telecamera per misurare [Ca2+]i in celle endoteliali.
- Assemblare un regolatore di temperatura dotato di un riscaldatore in linea per aumentare e mantenere una temperatura fisiologica (37 °C) durante l'esperimento.
- Assemblare una piattaforma multicanale collegata a un controller della valvola con una valvola di controllo del flusso in linea per controllare l'erogazione di soluzioni ai tubi endoteliali fissati nella camera.
- Micropipette ed elettrodi affilati
NOTA: Lo sperimentatore avrà bisogno di un estrattore di vetro elettronico e di una microforgia per preparare pipette di triturazione e pinning.- Per separare il tubo endoteliale dal segmento arteriolare parzialmente digerito, preparare pipette di triturazione lucidate a caldo (diametro interno della punta: 30-50 μm) da capillari di vetro borosilicato.
- Per fissare il tubo endoteliale nella camera di superfusione, preparare pipette di bloccaggio lucidate a caldo con un'estremità sferica smussata (diametro esterno: 50-70 μm) preparata da capillari di vetro borosilicato a parete sottile.
- Per registrare Vm di una cella endoteliale, preparare elettrodi affilati con una resistenza della punta di ~ 150 ± 30 MΩ dai capillari di vetro utilizzando solo l'estrattore di vetro.
2. Soluzioni e farmaci
- Soluzione salina fisiologica (PSS)
- Preparare un minimo di 1 L di PSS utilizzando 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM N-2-idrossietilpiperazina-N'-2-etansolfonico acido (HEPES) e 10 mM di glucosio.
- Preparare le soluzioni necessarie prive di CaCl2 (zero Ca2+ PSS) per la dissezione delle arteriole cerebrali e l'isolamento del tubo endoteliale.
NOTA: Preparare tutte le soluzioni in H2O deionizzato ultrapuro, seguito da filtrazione (0,22 μm). Assicurarsi che il prodotto finale contenga un pH 7,4 con osmolalità compresa tra 290 e 300 mOsm.
- Albumina sierica bovina (BSA, 10%)
- Sciogliere 1 g di polvere di BSA liofilizzata in un becher da 10 ml di zero Ca2+ PSS. Coprire il becher e lasciare almeno 2 ore con agitazione lenta affinché il BSA si dissolva.
- Soluzione filtrante utilizzando una siringa da 10 mL più un filtro da 0,22 μm e preparare aliquote da 1 mL da conservare a -20 °C.
- Soluzione di dissezione
- Aggiungere 500 μL di BSA (10%) a 49,5 mL di zero Ca2+ PSS per un volume totale di 50 mL.
- Trasferire la soluzione in una capsula di Petri per dissezioni arteriolari.
- Soluzione di dissociazione
- Aggiungere 5 μL di soluzione di CaCl2 (1 M) e 500 μL di BSA (10%) a 49,5 mL di zero Ca2+ PSS per un volume totale di 50 mL. Incubare la soluzione a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
- Enzimi
- Preparare 1 mL di soluzione digestiva con 100 μg/mL di papaina, 170 μg/mL ditioeritritolo, 250 μg/mL di collagenasi (miscela di tipo H) e 40 μg/mL di elastasi.
NOTA: Le attività enzimatiche possono variare, anche se i protocolli di successo richiederanno probabilmente le seguenti attività enzimatiche: ≥ 10 unità / mg per la papaina, ≥ 1 unità / mg per la collagenasi e ≥ 5 unità / mg per l'elastasi.
- Preparare 1 mL di soluzione digestiva con 100 μg/mL di papaina, 170 μg/mL ditioeritritolo, 250 μg/mL di collagenasi (miscela di tipo H) e 40 μg/mL di elastasi.
- Fura-2 e agenti farmacologici
- Preparare lo stock di Fura-2 AM in dimetilsolfossido (DMSO; 1 mM). Preparare 500 μL di concentrazione di lavoro (10 μM) aggiungendo 5 μL di stock a 495 μL di PSS per il carico.
- Preparare almeno 50 ml di concentrazioni di lavoro di agenti farmacologici in PSS o DMSO a seconda dei casi.
- Soluzione conduttrice
- Preparare 2 M KCl sciogliendo KCl in H2O deionizzato (7.455 g di KCl in 50 mL di H2O). Passare la soluzione attraverso una siringa con un filtro da 0,22 μm prima di riempire gli elettrodi affilati.
- Inseguitori di organelli fluorescenti e anticorpi
- Preparare i tracker a membrana plasmatica o organellare (ad es. nucleo, reticolo endoplasmatico) nella soluzione salina fisiologica appropriata secondo le istruzioni del produttore.
- Preparare gli anticorpi primari e secondari secondo le istruzioni del produttore nella soluzione salina fisiologica appropriata.
3. Dissezione e isolamento delle arteriole cerebrali del topo
NOTA: gli stereomicroscopi e gli strumenti di microdissezione affilati (ad esempio, pinze a punta fine, forbici di dissezione in stile Vannas) devono essere utilizzati per l'ingrandimento del campione (fino a 50x) in tutte queste procedure di dissezione.
- Isolamento del cervello del topo
- Anestetizzare un topo da laboratorio standard (ad esempio, C57BL/6, 3xTg-AD; 2-30 mesi, maschio o femmina) utilizzando l'inalazione di isoflurano (3% per 2-3 minuti), seguita da decapitazione immediata con forbici affilate o ghigliottina per approvazione IACUC. Posizionare la testa del topo in una capsula di Petri (diametro 10 cm, profondità 1,5 cm) contenente una soluzione di dissezione fredda (4 °C).
- Durante la visualizzazione sotto uno stereomicroscopio, rimuovere la pelle e i capelli sul cranio e lavare via il sangue in eccesso con una soluzione di dissezione fredda. Usando le punte delle forbici di dissezione standard (ad esempio, lame da 24 mm), fai un'incisione che inizia con l'osso occipitale e si estende attraverso l'osso nasale del cranio. Utilizzare pinze a punta grossa per aprire con cura il cranio lungo l'incisione e separare il tessuto connettivo (membrana meningea) per isolare il cervello contenente un cerchio di Willis intatto.
- Lavare il cervello isolato con una soluzione di dissezione a freddo in un becher o in una capsula di Petri per rimuovere il sangue rimanente dalla superficie del cervello. Posizionare il lato ventrale del cervello rivolto verso l'alto in una camera contenente soluzione di dissezione a freddo per l'isolamento delle arteriole parenchimali (Figura 2A).
- Isolamento delle arteriole parenchimali
NOTA: Le arteriole derivanti dalle arterie cerebrali medie (ICM) e incorporate nel parenchima cerebrale sono scelte per questo protocollo. Le arteriole sono isolate come precedentemente descritto11, con modificazione.- Utilizzare perni in acciaio (diametro: 0,2 mm, lunghezza: da 11 a 12 mm) per fissare il cervello isolato in una soluzione di dissezione fredda in una capsula di Petri contenente un rivestimento polimerico di silicio infuso di carbone (profondità ≥ 50 cm).
- Usando forbici di dissezione affilate e allineate, taglia un rettangolo di tessuto cerebrale (lunghezza: 5 mm, larghezza: 3 mm) (Figura 2B) attorno all'MCA assicurandoti che la parte superiore del segmento tissutale sia oltre il punto di ramificazione dal Cerchio di Willis. Taglia un altro rettangolo di tessuto cerebrale dall'altro emisfero del cervello per accedere a più arteriole, se necessario.
- Fissare il segmento di tessuto cerebrale separato nel piatto con l'MCA rivolto verso l'alto (distale dal Cerchio di Willis) usando perni di acciaio (diametro: 0,1 mm, lunghezza: da 13 a 14 mm). Fare con attenzione un'incisione poco profonda vicino ai perni per rimuovere la pia con una piccola pinza, sbucciando delicatamente da un'estremità verso l'altra (Figura 2C). Rimuovere la pia dall'altro segmento tissutale per accedere a più arteriole, se necessario. Fissare con cura la pia isolata con arteriole parenchimali ramificate da MCA nel piatto con gli spilli e sezionare le arteriole parenchimali (Figura 2D), assicurandosi che le arteriole non siano danneggiate.
NOTA: Se le arteriole non sono facilmente estraibili con la pia dal parenchima, utilizzare una pinza fine e scavare nel cervello, a partire dal punto di diramazione MCA dal Cerchio di Willis. Individuare l'arteriola, allentare con cura il tessuto intorno alle arteriole (Figura 2E) e estrarre delicatamente l'arteriola dal parenchima, tenendo l'estremità superiore dell'arteriola (Figura 2F). Arteriole multiple (lunghezza: ~ 1,5-2 mm) possono essere isolate da un rettangolo di tessuto cerebrale. - Assicurarsi che l'arteriola sia pulita senza tessuto attaccato ad essa e tagliare eventuali rami distali rimanenti (Figura 3A). Utilizzare questa arteriola pulita e intatta per la digestione enzimatica. In alternativa, tagliare ogni arteriola in due pezzi (lunghezza: 0,75-1 mm) per la digestione enzimatica per la preparazione di tubi endoteliali, se lo si desidera.
4. Digestione delle arteriole parenchimali e preparazione dei tubi endoteliali
- Disposizione di attrezzature e pipette
NOTA: L'isolamento dei tubi endoteliali arteriosi dal cervello è stato descritto in precedenza13,18. L'attuale protocollo incorpora modifiche per l'isolamento dell'endotelio dalle arteriole parenchimali (intracerebrali). Arteriole multiple o / e pezzi di arteriole possono essere utilizzati insieme per la digestione enzimatica.- Assemblare l'apparato di triturazione13 per la preparazione di tubi endoteliali utilizzando uno stadio in alluminio che supporta una camera e micromanipolatori. Assemblare un microscopio dotato di obiettivi (5x-60x) e una telecamera collegata al monitor di un computer. Fissare una microsiringa con un controller della pompa accanto al palco e al campione.
- Fissare una pipetta di triturazione riempita con olio minerale sul pistone della microsiringa. Utilizzare la microsiringa con il controller della pompa per prelevare la soluzione di dissociazione nella pipetta di triturazione (~ 130 nL) sopra l'olio minerale, facendo attenzione a evitare bolle d'aria nella pipetta.
- Digestione parziale dei segmenti arteriolari
- Posizionare i segmenti arteriolari intatti in 1 mL di soluzione di dissociazione in un tubo di vetro da 10 mL contenente 100 μg/mL di papaina, 170 μg/mL ditioeritritolo, 250 μg/mL collagenasi e 40 μg/mL di elastasi. Incubare i segmenti arteriolari a 34 °C per 10-12 min.
- Dopo la digestione, sostituire la soluzione enzimatica con 3-4 ml di soluzione di dissociazione fresca a temperatura ambiente.
- Isolamento del tubo endoteliale arteriolare
NOTA: Dopo la digestione e la sostituzione della soluzione enzimatica, trasferire uno o più segmenti parzialmente digeriti nella soluzione di dissociazione in una camera di superfusione collegata a una piattaforma mobile. Durante la visualizzazione con ingrandimento da 100x a 200x, selezionare un segmento di vaso parzialmente digerito ma ininterrotto e concentrarsi su di esso al microscopio.- Posizionare la pipetta di triturazione attaccata con l'iniettore della microsiringa nella soluzione di dissociazione nella camera e posizionarla vicino a un'estremità del segmento del recipiente digerito. Impostare una velocità compresa tra 1 e 3 nL/s sul controller della pompa per una triturazione delicata.
- Pur mantenendo un ingrandimento da 100x a 200x, prelevare il segmento arteriolare nella pipetta e quindi espellere per dissociare l'avventizia e le cellule muscolari lisce (Figura 3B). Triturare il segmento del vaso fino a quando tutte le cellule muscolari lisce sono dissociate e solo le cellule endoteliali rimangono come un "tubo" intatto.
NOTA: Se necessario durante la triturazione, utilizzare con attenzione pinze a punta fine per rimuovere l'avventizia dissociata e la lamina elastica interna dal tubo endoteliale. In genere, solo pochi cicli di triturazione producono un tubo endoteliale intatto. - Utilizzare micromanipolatori per fissare ciascuna estremità del tubo endoteliale sul coperchio di vetro nella camera con pipette di bloccaggio in vetro borosilicato (Figura 3C, D).
- Fissaggio del tubo endoteliale arteriolare
- Sostituire la soluzione di dissociazione con una soluzione di superfusione (PSS contenente 2 mM CaCl2) assicurandosi che il materiale non evitaliale venga lavato fuori dalla camera.
- Trasferisci il tubo endoteliale protetto nella piattaforma mobile al carro per microscopio progettato per la superfusione continua e le registrazioni/imaging intracellulari o fluorescenti.
- Applicare la distribuzione continua di PSS durante l'esperimento. Impostare manualmente la portata (5-7 ml / min) durante l'esperimento utilizzando la valvola di controllo del flusso in linea, coerente con il flusso laminare, abbinando l'alimentazione del flusso della soluzione all'entità dell'aspirazione del vuoto. Consentire ≥5 minuti di flusso PSS alla camera per la superfusione del tubo endoteliale prima di acquisire dati di base e / o carico del colorante.
5. Utilizzo di tubi endoteliali arteriolari per l'esame della fisiologia cellulare
NOTA: I tubi endoteliali arteriolari isolati e fissati possono essere utilizzati per registrazioni intracellulari della dinamica [Ca2+]i e Vm utilizzando rispettivamente la fotometria e l'elettrofisiologia degli elettrodi affilati, come precedentemente illustrato13 (Figura 4). [Ca2+] i e Vm possono essere misurati come variabili sperimentali separate o combinate secondo necessità13 (Figura 4). Tuttavia, i tubi endoteliali arteriolari sono più delicati dell'endotelio arterioso e il tempo di sperimentazione non deve superare 1 ora.
- Misurazione di [Ca2+]i
- Accendere l'apparecchiatura e il software per le registrazioni [Ca2+]i mantenendo una superfusione continua a una portata di 5-7 ml/min.
- Caricare il tubo endoteliale con il colorante Ca2+ Fura-2 AM per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare le cellule con soluzione di superfusione per altri 20-30 minuti aumentando gradualmente la temperatura del bagno a 37 °C. Mantenere la temperatura a 37 °C per tutto l'esperimento.
- Regolare manualmente la finestra di imaging utilizzando il software di fotometria per concentrarsi su ~ 20 cellule endoteliali (Figura 4A). In assenza di luce, ruotare il PMT sull'interfaccia di fluorescenza e iniziare l'acquisizione di [Ca2+]i eccitando Fura-2 alternativamente (≥10 Hz) a 340 nm e 380 nm mentre si raccoglie l'emissione di fluorescenza a 510 nm. Una volta stabilita una registrazione basale stabile di [Ca2+]i , applicare agenti farmacologici (ad esempio, agonisti del recettore purinergico) per obiettivo sperimentale (Figura 4B).
- Misura di Vm
- Accendere l'apparecchiatura e il software per le registrazioni Vm e impostare la velocità di acquisizione dati (≥10 Hz) mantenendo la superfusione continua a una portata di 5-7 ml/min. Aumentare gradualmente la temperatura del bagno a 37 °C e mantenerla fino alla fine dell'esperimento.
- Tirare un elettrodo affilato usando un capillare di vetro borosilicato, riempirlo con 2 M KCl e fissarlo su un filo d'argento rivestito di cloruro nel supporto della pipetta collegato a un elettrometro, che a sua volta è tenuto da un micromanipolatore.
- Durante la visualizzazione attraverso l'obiettivo 4x, utilizzare un micromanipolatore per posizionare con attenzione la punta dell'elettrodo affilato appena sopra una cellula del tubo endoteliale arteriolare nel PSS che scorre nella camera.
- Aumentare gradualmente l'ingrandimento a 400x e riposizionare la punta dell'elettrodo secondo necessità.
- Utilizzando il micromanipolatore, inserire delicatamente la punta di un elettrodo affilato in una delle celle del tubo endoteliale e iniziare a registrare Vm utilizzando un elettrometro (Figura 4A).
- Una volta che il riposo endoteliale Vm è stabile (da -30 a -40 mV), applicare gli agenti farmacologici desiderati per obiettivo sperimentale (Figura 4C).
6. Imaging cellulare
NOTA: i tubi endoteliali fissati nella camera della piattaforma mobile possono essere utilizzati anche per l'imaging microscopico in condizioni sia vive che fisse19 utilizzando la fluorescenza standard o la microscopia confocale. L'immunoistochimica con anticorpi diversi per recettori e canali ionici può anche essere applicata come descritto in precedenza20.
- Caricare il tubo endoteliale con il tracker di fluorescenza per la membrana plasmatica o l'organello desiderato (ad esempio, nucleo, reticolo endoplasmatico) a 37 °C per 15-30 min.
- Lavare le cellule con PSS di superfusione fresca e visualizzare le cellule vive al microscopio alla lunghezza d'onda di eccitazione dei rispettivi coloranti (Figura 4D, E).
NOTA: L'immunoistochimica può essere eseguita su questo modello di tubo utilizzando anticorpi di interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Una dimostrazione del protocollo è mostrata in Figura 1 con le fasi di dissezione arteriolare e isolamento del tubo endoteliale come Figura 2 e Figura 3, rispettivamente. Qui, la funzione endoteliale è stata valutata misurando [Ca2+]i e Vm utilizzando la fotometria Fura-2 e l'elettrofisiologia con elettrodi affilati (Figura 4A) in risposta a un agente farmacologico [2-metiltioadenosina difosfato (MTA), un potente agonista del recettore purinergico (P2YR)] a 37 °C. Con l'applicazione di MTA (1 μM), [Ca2+]i aumenta rapidamente (Figura 4B) con una concomitante iperpolarizzazione (Figura 4C). Queste misurazioni sono un riflesso dell'attivazione dei recettori accoppiati alla proteinaG q (P2YRs) seguita dall'attivazione di canali K+ attivati da Ca2+ a conduttanza piccola e intermedia (SKCa/IKCa), che avviano una via vasodilatatoria di iperpolarizzazione endotelio-dipendente (EDH). Pertanto, l'endotelio isolato da un'arteriola parenchimale è funzionale in isolamento e può essere utilizzato per studiare componenti chiave di percorsi che coinvolgono la mobilizzazione di [Ca2+]i e / o la regolazione di Vm tramite canali K +.
Inoltre, l'endotelio intatto è stato incubato a 37 °C con tracker fluorescenti per la visualizzazione per esaminare la morfologia cellulare. L'imaging delle cellule endoteliali vive mostra la co-colorazione per la membrana plasmatica (verde) e i nuclei (rosso) (Figura 4D). Nella Figura 4E, la membrana plasmatica (verde) è stata colorata insieme a una colorazione fluorescente del reticolo endoplasmatico (ER; rosso), per cui le aree di apparente sovrapposizione di ER in prossimità della membrana plasmatica appaiono arancioni (Figura 4E). Queste immagini fluorescenti rivelano ulteriormente l'integrità cellulare dell'endotelio arteriolare e il loro possibile utilizzo per studiare i microdomini di segnalazione situati nei complessi di membrana giunzionale.
Figura 1: Esame del tubo endoteliale arteriolare appena isolato dall'arteriola parenchimale del topo. Come raffigurato, il cervello è isolato da un topo e un pezzo di tessuto cerebrale rettangolare contenente l'MCA è stato rimosso. Le arteriole parenchimali che si ramificano dall'MCA ed entrano nel parenchima cerebrale sono isolate. Le arteriole vengono digerite enzimaticamente e triturate, producendo un tubo endoteliale intatto per lo studio. Il tubo endoteliale preparato consente la misurazione della dinamica intracellulare di Ca2+ e Vm , consentendo al contempo l'imaging cellulare per l'imaging a fluorescenza e l'immunoistochimica. Abbreviazioni: MCA = arteria cerebrale media; Vm = potenziale di membrana. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Dissezione e isolamento delle arteriole parenchimali. (A) Cervello di topo isolato con Cerchio di Willis intatto. (B) Un pezzo rettangolare sezionato di tessuto cerebrale contenente l'MCA (freccia bianca). (C) Isolamento di pia dalla parte superiore del tessuto (arteriola, freccia blu). (D) Arteriole (delineate con punte di freccia blu) collegate alle arterie cerebrali medie (frecce gialle). (E) Arteriola identificata (freccia blu) nel tessuto cerebrale. (F) Estrarre l'arteriola (freccia blu) dal tessuto allentato. Si noti che i pannelli E e F indicano un metodo alternativo per l'isolamento dell'arteriola (vedere il passo del protocollo 3.2.3). Barre di scala = 2 mm (A,B,C), 0,2 mm (D) e 1 mm (E,F). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Preparazione di tubi endoteliali da arteriole parenchimali. (A) Arteriola isolata e pulita (freccia blu). (B) Triturazione di arteriola parzialmente digerita da enzimi. (C) Tubo endoteliale intatto (ingrandimento: 100x) preparato e fissato sul coperchio di vetro utilizzando pipette di bloccaggio. (D) Tubo endoteliale con ingrandimento 200x. Barre di scala = 0,2 mm (A), 0,1 mm (B, C) e 0,05 mm (D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Applicazione del tubo endoteliale per l'esame fisiologico delle vie correlate alla regolazione del flusso sanguigno. (A) Un elettrodo affilato (freccia viola) è posizionato in una cellula di un tubo endoteliale focalizzato nella finestra di acquisizione dati per la fotometria. (B) Registrazione rappresentativa di Ca2+ intracellulare utilizzando la fotometria Fura-2 in risposta a MTA (1 μM). (C) Registrazione rappresentativa di Vm simultanea con traccia intracellulare di Ca2+ nel pannello B. (D) Immagine rappresentativa della membrana plasmatica (verde) e dei nuclei (rosso) di cellule endoteliali vive colorate con coloranti fluorescenti. (E) Immagine rappresentativa della membrana plasmatica (verde) e del reticolo endoplasmatico (ER, rosso) di cellule endoteliali vive colorate con coloranti fluorescenti. Le aree di prossimità per ER e membrana plasmatica sono indicate in arancione. Le immagini sono state acquisite utilizzando una fotocamera monocromatica e sono state pseudo-colorate. Barre di scala = 20 μm (D), 10 μm (E). Abbreviazioni: MTA = 2-metiltioadenosina difosfato; F340/F380 = segnale del rapporto colorante Fura-2; Vm = potenziale di membrana; PM = membrana plasmatica; ER = reticolo endoplasmatico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prove crescenti suggeriscono che la malattia cerebrovascolare (CVD), l'invecchiamento e il morbo di Alzheimer sono fortemente correlati e sono un argomento attuale della ricerca sulla demenza 4,8,14,21. Pertanto, è ovvio che gli studi sulla rete cerebrovascolare avrebbero un ampio impatto sulla salute, pur richiedendo un'indagine approfondita continua durante le condizioni di malattia. Come punto significativo di resistenza vascolare per la perfusione cerebrale, l'importanza generale delle arteriole parenchimali nell'eziologia e nello sviluppo della CVD è stata evidenziata per oltre 50 anni22.
Tuttavia, gli strumenti di esame scientifico non sono stati adeguatamente sviluppati per studiare le arteriole parenchimali intatte e i loro tipi di cellule composite fino alla recente insorgenza di approcci ex vivo come l'arteriolaparenchimale 11 isolata e pressurizzata e i preparati CaPA12 . Il campo della fisiologia cerebrovascolare trarrebbe beneficio anche da tecniche complementari in modelli di studio omocellulari (muscolatura liscia, periciti ed endotelio) per concentrarsi su specifici tipi di cellule e le loro caratteristiche genetiche e farmacologiche alla base della regolazione del flusso sanguigno cerebrale e della permeabilità alla barriera emato-encefalica (BBB).
L'endotelio è un organo regolatore centrale che "nutre" tutti gli altri organi in tutto il corpo, incluso il cervello23. Sebbene tutti i segmenti vascolari (arterie, arteriole, capillari, venule, vene) siano essenziali per la perfusione cerebrale, l'endotelio delle arteriole richiede un'indagine dedicata come componente centrale dell'autoregolazione cerebrovascolare e dell'accoppiamento neurovascolare24. Inoltre, la segnalazione Ca2+ 25 e l'attività del canale K+ 17,26 sembrano essere migliorate durante la regolazione del tono miogenico nelle arteriole parenchimali rispetto alle arterie piali. Pertanto, abbiamo ora esteso il metodo precedentemente stabilito per le arterie cerebrali piali (posteriori)13 alle arteriole parenchimali.
Rispetto a questi approcci precedentemente illustrati11,13, questo protocollo è stato perfezionato regolando empiricamente vari passaggi (ad esempio, trattamento enzimatico, triturazione) per produrre in modo riproducibile tubi endoteliali intatti da arteriole parenchimali. Inoltre, questo protocollo dimostra l'uso di questo modello di studio per ottimizzare l'applicazione della fotometria cellulare, dell'elettrofisiologia e dell'imaging fluorescente (Figura 4). Con i punti di forza e i limiti generali della fotometria Fura-2 e dell'elettrofisiologia degli elettrodi affilati precedentemente descritti in dettaglio13, lo sperimentatore è incoraggiato a provare una serie di altri saggi di segnalazione Ca2+ e canali ionici per testare ipotesi specifiche di interesse. Inoltre, l'avanzamento e la generazione di nuovi modelli genetici con indicatori geneticamente codificati specifici per cellule endoteliali (ad esempio [Ca2+]i27 e indicatori di tensione28) possono espandere l'utilità di questa preparazione.
Per il contesto investigativo, questo modello endoteliale isolato è utile per domande di ricerca che richiedono lo studio del ruolo dell'endotelio arteriolare nella regolazione della dinamica vascolare, per cui le misurazioni en face non sono sperimentalmente fattibili a causa delle loro piccole dimensioni. La regolazione endoteliale del flusso sanguigno cerebrale inizia con l'attivazione di vari recettori accoppiati alla proteina G (ad esempio, purinergici, muscarinici)18 e canali ionici (TRPV329, TRPA15, recettori NMDA8). L'attivazione dei recettori Gdi tipo q comporta la lipolisi del fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PIP2) per generare inositolo trisfosfato (IP3) e diacilglicerolo per la mobilizzazione [Ca2+]i che può quindi mediare l'attivazione del canale K+ per i cambiamenti in Vm15. L'attività del canale K+, e quindi solo Vm, può anche essere studiata direttamente in condizioni fisiologiche2 o tramite un targeting farmacologico selezionato30. Inoltre, il tubo endoteliale arteriolare consente una migliore visualizzazione fluorescente di un rimodellamento selezionato della membrana plasmatica (ad esempio, Filipin-III), organelli intracellulari (ad esempio, ER tracker) e accoppiamento cellula-cellula (ad esempio, ioduro di propidio)18,19. Pertanto, un'altra caratteristica del modello di studio comporta un efficace abbinamento della morfologia cellulare e dell'istologia con parametri di funzione, come Ca2+ e segnalazione elettrica, nell'invecchiamento e nello sviluppo di malattie croniche.
I componenti del protocollo che meritano particolare attenzione sono la dissezione arteriolare, la digestione enzimatica, la triturazione e il fissaggio del tubo endoteliale arteriolare per le misurazioni. Durante la dissezione dal cervello, il danno all'arteriola parenchimale dovrebbe essere evitato a tutti i costi per garantire una digestione e una triturazione di successo per isolare uno strato endoteliale intatto e funzionale. Inoltre, l'eccessivo allungamento durante il fissaggio del tubo endoteliale nella camera di perfusione distruggerà anche la preparazione, annullando efficacemente tutte le precedenti fasi del protocollo.
Devono essere applicati test di vitalità per garantire che i tubi endoteliali arteriolari siano funzionali rispetto a componenti fisiologici chiave come la segnalazione di Ca2+ (afflusso e/o rilascio intracellulare) a seguito della stimolazione dei recettori accoppiati alla proteina G, l'estensione dell'iperpolarizzazione Vm e un robusto accoppiamento intercellulare attraverso giunzioni gap18,23. Esempi di tali controlli includono la stimolazione purinergica reversibile utilizzando MTA (1 μM; Δ[Ca2+]i ~ 300 nM; ≥10 mV iperpolarizzazione; Figura 4B,C), attivazione reversibile di SKCa/IKCa mediante NS309 (1 μM; iperpolarizzazione ≥20 mV) e/o corrispondenza tra iniezione di corrente (ad esempio, ~-1 nA) in una cella e risposte Vm (~-10 mV) di un'altra a una distanza di ≥250 μm18,31. Con pratica, cura e rigore sperimentale, l'intero protocollo è riproducibile se lo studente ha pazienza e perseveranza.
Questo metodo ha limitazioni chiave da affrontare, come l'insufficiente abbondanza di campioni (ad esempio, acidi nucleici, proteine e lipidi) e la relativa fragilità per esperimenti biochimici e registrazioni di cellule vive, rispettivamente. Tuttavia, questo avvertimento di biologia molecolare può essere evitato mettendo in comune diversi animali e / o ideando metodi di quantificazione di maggiore sensibilità e produttività. Se la temperatura fisiologica deve essere mantenuta a 37 °C, saranno necessari brevi intervalli di tempo sperimentali (≤1 h) con interventi farmacologici mirati. Inoltre, sarebbe estremamente difficile isolare i tubi endoteliali arteriolari da animali a breve termine o neonati (<1 mese), precludendo potenzialmente studi sullo sviluppo vascolare cerebrale.
Altre considerazioni comprendono la composizione precisa dei tubi endoteliali vascolari cerebrali, che potenzialmente richiedono approcci selezionati di immunofluorescenza ed elettrofisiologia. Ad esempio, la membrana basale (composta principalmente da collagene IV, laminina e fibronectina) corre lungo l'albero vascolare cerebrale. È noto per il suo contributo all'integrità della BBB formata dalle cellule endoteliali capillari cerebrali32. Va notato che questo modello di studio potrebbe non essere appropriato per gli esperimenti di permeabilità BBB in quanto i componenti della membrana basale sono substrati del cocktail enzimatico utilizzato per la digestione parziale dei tubi endoteliali arteriolari, in particolare la miscela di collagenasi H. Inoltre, l'applicazione di un cocktail enzimatico selettivo, la rimozione della lamina elastica interna e la chiara identificazione delle cellule endoteliali per struttura (disposizione parallela vs. circonferenziale per le cellule muscolari lisce), morfologia (forma "a goccia" delle cellule endoteliali vs cellule muscolari lisce a forma di fuso) ed elettrofisiologia (ad esempio, iperpolarizzazione alla stimolazione GPCR), elimina i contributi fisiologici delle cellule muscolari lisce e dei periciti. Infine, lo sperimentatore deve prendere nota dell'eterogeneità delle cellule endoteliali (profilo di espressione genica, struttura, funzione) per tipo di organo (ad esempio, cervello, cuore, polmone33) oltre alla regione del cervello (ad esempio, corteccia 9,34, ippocampo10) e alla rispettiva segmentazione vascolare (ad esempio, arterie, arteriole e capillari 9,34,35 ). Pertanto, uno studio completo della regolazione del flusso sanguigno cerebrale richiederà anche approcci complementari ex vivo (ad esempio, miografia della pressione intravascolare, preparazione arteriole capillare-parenchimale) e in vivo (ad esempio, Laser Doppler intracerebrale) di segmenti e reti vascolari intatti.
In sintesi, questo articolo presenta una tecnica avanzata che dimostra come preparare un tubo endoteliale intatto appena isolato dalle arteriole parenchimali del cervello di topo. Prevediamo che questo approccio completerà e / o costruirà da modelli di studio vascolare in vivo e intatti. L'obiettivo generale è quello di generare nuove informazioni per comprendere i meccanismi alla base del flusso sanguigno cerebrale a livello fondamentale per la fisiologia e selezionare le transizioni verso la patologia per la terapia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni del National Institutes of Health (R00AG047198 & R56AG062169 a EJB; R00HL140106 a PWP) e l'Alzheimer's Association (AZRGD-21-805835 a PWP). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health o dell'Alzheimer's Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
| Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
| Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
| Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
| Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
| NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
| Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |
References
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Kelleher, R. J., Soiza, R. L. Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder. American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium. Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).
- Pires, P. W., Earley, S. Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke. elife. 7, 35316 (2018).
- Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease. Function. 2 (2), (2021).
- Zhao, L., et al. Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain. Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).
- Peters, E. C., et al. Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease. Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).
- Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).
- Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex. Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).
- Behringer, E. J., Hakim, M. A. Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).
- Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice. Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).
- Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).
- Attems, J., Jellinger, K. A. The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology. BMC Medicine. 12, 206 (2014).
- Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).
- Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Chen, Y. L., et al. Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice. Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).
- Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators. Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).
- Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).
- Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain. Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. elife. 9, 51413 (2020).
- Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).
- Chen, M. B., et al. Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues. Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).
