Summary

Aislamiento y análisis funcional del endotelio arteriolar del parénquima cerebral de ratón

Published: March 11, 2022
doi:

Summary

La preparación intensiva de “tubos” endoteliales cerebrales intactos de ratón de las arteriolas del parénquima cerebral se ilustra para estudiar la regulación del flujo sanguíneo cerebral. Además, demostramos las fortalezas experimentales de este modelo de estudio endotelial para imágenes de fluorescencia y medición electrofisiológica de vías clave de señalización celular, incluidos los cambios en el [Ca2+] intracelular y el potencial de membrana.

Abstract

El flujo sanguíneo cerebral es transmitido por las arterias de resistencia vascular y las arteriolas parenquimatosas aguas abajo. La resistencia vascular en estado estacionario al flujo sanguíneo aumenta con la disminución del diámetro de las arterias a las arteriolas que finalmente se alimentan de los capilares. Debido a su menor tamaño y ubicación en el parénquima, las arteriolas han sido relativamente poco estudiadas y con menos reproducibilidad en los hallazgos que las arterias piales superficiales. En cualquier caso, la estructura y función de las células endoteliales arteriolares, parte integral de la fisiología y etiología de las enfermedades degenerativas crónicas, requiere una amplia investigación. En particular, la evidencia emergente demuestra que la función endotelial comprometida precede y exacerba el deterioro cognitivo y la demencia.

En la microcirculación parenquimatosa, la función del canal K+ endotelial es el estímulo más robusto para controlar finamente la propagación de la vasodilatación para promover aumentos en el flujo sanguíneo a áreas de actividad neuronal. Este artículo ilustra un método refinado para aislar recién aislados “tubos” endoteliales intactos y acoplados eléctricamente (diámetro, ~ 25 μm) de arteriolas parenquimatosas del cerebro de ratón. Los tubos endoteliales arteriolares se aseguran durante condiciones fisiológicas (37 °C, pH 7.4) para resolver variables experimentales que abarcan la función del canal K + y su regulación, incluida la dinámica intracelular de Ca2 + , los cambios en el potencial de membrana y la regulación lipídica de membrana. Una clara ventaja técnica frente al endotelio arterial es la resolución morfológica mejorada de las dimensiones celulares y orgánulos (por ejemplo, mitocondrias), lo que amplía la utilidad de esta técnica. La perfusión cerebral saludable a lo largo de la vida implica una función endotelial robusta en las arteriolas parenquimatosas, vinculando directamente el flujo sanguíneo con el combustible de la actividad neuronal y glial a través de regiones anatómicas precisas del cerebro. Por lo tanto, se espera que este método avance significativamente en el conocimiento general de la fisiología vascular y la neurociencia con respecto al cerebro sano y enfermo.

Introduction

Las arteriolas parenquimatosas suministran directamente oxígeno y nutrientes esenciales en todo el cerebro1. Mientras interactúan con los capilares, las arteriolas altamente vasoactivas responden a la señalización retrógrada iniciada por los canales iónicos capilares que detectan las señales metabólicas de regiones neuronales específicas2. Dado que el parénquima cerebral ha recibido históricamente la mayor parte de la investigación, ahora ha surgido un papel para la disfunción endotelial para aclarar los mecanismos patológicos asociados con diversos trastornos cerebrovasculares que subyacen a la demencia (por ejemplo, accidente cerebrovascular isquémico, enfermedad de Alzheimer)3,4,5,6 . El endotelio es parte integral de la perfusión del cerebro de acuerdo con la heterogeneidad de la genética, la estructura y la función a lo largo de los segmentos vasculares7. Las arterias piales han sido ampliamente estudiadas debido a su tamaño relativamente grande, alta resistencia vascular segmentaria y papel en la distribución del flujo sanguíneo al cerebro subyacente 8,9. Por lo tanto, una mejor comprensión de los mecanismos endoteliales arteriolares probablemente mejorará la comprensión de la regulación del flujo sanguíneo cerebral en la salud y la enfermedad hacia el desarrollo de nuevos regímenes terapéuticos.

La evidencia emergente destaca la importancia de estudiar las arteriolas parenquimatosas en relación con diferentes vías de señalización y enfermedades 8,10. Sin embargo, este enfoque se ha limitado al uso de arteriola11 presurizada intacta y/o preparaciones de arteriola capilar-parenquimatosa (CaPA)12. Las células endoteliales arteriolares cerebrales nativas recién aisladas, desprovistas de otros tipos de células y factores de confusión no han sido examinadas, probablemente debido a dificultades técnicas en su aislamiento. En este trabajo se adelanta una técnica previa destacando el aislamiento del endotelio arterial pial13 para aislar ahora de forma fiable y reproducible el endotelio de las arteriolas parenquimatosas cerebrales (ancho: ~25 μm, longitud: ~250 μm). Esta técnica ayuda a lograr una resolución óptima de las células acopladas eléctrica y químicamente en su orientación individual y redes celulares.

Las vías clave de interés han incluido la interacción de la señalización intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i) y la hiperpolarización del potencial de membrana (Vm)14,15, integral a la vasodilatación16, para permitir que la sangre ingrese a los capilares y entregue oxígeno y nutrientes al parénquima activo17. Estas preparaciones permiten registros electrofisiológicos en tiempo real de canales iónicos, incluidos Ca2+ permeante, canales de potencial de receptor transitorio (TRP) y K+ y / o imágenes fluorescentes de orgánulos intracelulares dentro de tubos celulares endoteliales en condiciones casi fisiológicas. Esta es una técnica adecuada para investigadores interesados en los mecanismos celulares fisiológicos que gobiernan el control de las células endoteliales del suministro de flujo sanguíneo cerebral al parénquima cerebral. En conjunto, esta técnica ayudará a los investigadores a comprender mejor las vías fundamentales de señalización endotelial y la comunicación en red de las arteriolas incrustadas en el parénquima cerebral, al tiempo que aborda cuestiones relacionadas con la fisiología y la patología cerebrovasculares.

Protocol

Los experimentadores deben asegurarse de que el uso designado de animales y los protocolos asociados sean aprobados por su Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y se realicen de acuerdo con la “Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio” del Consejo Nacional de Investigación (8ª Edición, 2011) y las pautas de ARRIVE. El IACUC de la Universidad de Loma Linda y la Universidad de Arizona han aprobado todos los protocolos utilizados para este manuscrito para ratones C57BL / 6N y…

Representative Results

Una demostración del protocolo se muestra en la Figura 1 con los pasos de disección arteriolar y aislamiento del tubo endotelial como la Figura 2 y la Figura 3, respectivamente. Aquí, la función endotelial se evaluó midiendo [Ca2+]i y Vm utilizando fotometría Fura-2 y electrofisiología de electrodos afilados (Figura 4A) en respuesta a un agente farmacológico [2-m…

Discussion

La creciente evidencia sugiere que la enfermedad cerebrovascular (ECV), el envejecimiento y la enfermedad de Alzheimer están fuertemente correlacionados y son un tema actual de la investigación de la demencia 4,8,14,21. Por lo tanto, es obvio que los estudios de la red cerebrovascular tendrían un amplio impacto en la salud, al tiempo que requerirían una investigación exhaustiva continua du…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación ha sido apoyada por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R00AG047198 y R56AG062169 a EJB; R00HL140106 a PWP) y la Asociación de Alzheimer (AZRGD-21-805835 a PWP). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud o la Asociación de Alzheimer.

Materials

Amplifiers Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Audible baseline monitors Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA  BM-A-TM
Bath Chiller (Isotemp 500LCU) ThermoFisher Scientific 13874647
Borosilicate glass capillaries (Pinning) Warner Instruments G150T-6
Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) Warner Instruments GC100F-10
Borosilicate glass capillaries (Trituration) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA 1B100-4
BSA: Bovine Serum Albumin Sigma A7906
CaCl2: Calcium Chloride Sigma 223506
Collagenase (Type H Blend) Sigma C8051
Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) ThermoFisher Scientific 12-548-5M
Data Acquision Digitizer Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Digidata 1550A
Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA DD-90-S-BLK
Dithioerythritol Sigma D8255
DMSO: Dimethyl Sulfoxide Sigma D8418
Elastase (porcine pancreas) Sigma E7885
Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) ThermoFisher Scientific E34250
Fiber optic light sources  Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss Fostec 8375
Flow Control Valve Warner Instruments  FR-50
Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA IonOptix Systems
Forceps (Fine-tipped, sharpened) FST Dumont #5 & Dumont #55
Function Generator EZ Digital, Seoul, South Korea FG-8002
Fura-2 AM dye Invitrogen, Carlsbad, CA, USA F14185
Glucose Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) G7021
HCl: Hydrochloric Acid ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) A466250
Headstages Molecular Devices HS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) Sigma H4034
Inline Solution Heater Warner Instruments SH-27B
KCl: Potassium Chloride Sigma P9541
MgCl2: Magnesium Chloride Sigma M2670
Microforge Narishige, East Meadow, NY, USA  MF-900
Micromanipulator Siskiyou  MX10
Micropipette puller (digital) Sutter Instruments, Novato, CA, USA P-97 or P-1000
Microscope (Nikon-inverted) Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA Ts2
Microscope (Nikon-inverted) Nikon Instruments Inc Eclipse TS100
Microscope objectives Nikon Instruments Inc 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor)
Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) Warner Instruments PM6 or PH6
Microscope Stage (Aluminum) Siskiyou, Grants Pass, OR, USA 8090P
Microsyringe Pump Controller World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA SYS-MICRO4
MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt Tocris 1624
NaCl: Sodium Chloride Sigma S7653
NaOH: Sodium Hydroxide Sigma S8045
Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) ThermoFisher Scientific R37605
Oscilloscope Tektronix, Beaverton, Oregon, USA  TDS 2024B
Papain Sigma P4762
Phase contrast objectives Nikon Instruments Inc  (Ph1 DL; 10X & 20X)
Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) ThermoFisher Scientific C10046
Plexiglas superfusion chamber Warner Instruments, Camden, CT, USA RC-27
Scissors (3 mm & 7 mm blades) Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA Moria MC52 & 15000-00
Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) World Precision Instruments 555640S, 14364
Stereomicroscopes Zeiss, NY, USA Stemi 2000 & 2000-C
Syringe filter (0.22 µm) ThermoFisher Scientific 722-2520
Temperature Controller (Dual Channel) Warner Instruments TC-344B or C
Valve Control System Warner Instruments VC-6
Vibration Isolation Table Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA  Micro-g

References

  1. Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
  2. Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
  3. Kelleher, R. J., Soiza, R. L. Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer’s disease: Is Alzheimer’s a vascular disorder. American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).
  4. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Development of Alzheimer’s disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium. Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).
  5. Pires, P. W., Earley, S. Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke. elife. 7, 35316 (2018).
  6. Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer’s disease. Function. 2 (2), (2021).
  7. Zhao, L., et al. Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain. Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).
  8. Peters, E. C., et al. Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).
  9. De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
  10. Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease. Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).
  11. Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).
  12. Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).
  13. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).
  14. Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex. Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).
  15. Behringer, E. J., Hakim, M. A. Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).
  16. Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).
  17. Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
  18. Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).
  19. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer’s disease Mice. Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).
  20. Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).
  21. Attems, J., Jellinger, K. A. The overlap between vascular disease and Alzheimer’s disease–lessons from pathology. BMC Medicine. 12, 206 (2014).
  22. Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).
  23. Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
  24. Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).
  25. Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
  26. Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
  27. Chen, Y. L., et al. Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice. Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).
  28. Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators. Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).
  29. Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).
  30. Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).
  31. Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).
  32. Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain. Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).
  33. Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. elife. 9, 51413 (2020).
  34. Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).
  35. Chen, M. B., et al. Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues. Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).

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Hakim, M. A., Pires, P. W., Behringer, E. J. Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma. J. Vis. Exp. (181), e63463, doi:10.3791/63463 (2022).

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