Summary
La preparación intensiva de "tubos" endoteliales cerebrales intactos de ratón de las arteriolas del parénquima cerebral se ilustra para estudiar la regulación del flujo sanguíneo cerebral. Además, demostramos las fortalezas experimentales de este modelo de estudio endotelial para imágenes de fluorescencia y medición electrofisiológica de vías clave de señalización celular, incluidos los cambios en el [Ca2+] intracelular y el potencial de membrana.
Abstract
El flujo sanguíneo cerebral es transmitido por las arterias de resistencia vascular y las arteriolas parenquimatosas aguas abajo. La resistencia vascular en estado estacionario al flujo sanguíneo aumenta con la disminución del diámetro de las arterias a las arteriolas que finalmente se alimentan de los capilares. Debido a su menor tamaño y ubicación en el parénquima, las arteriolas han sido relativamente poco estudiadas y con menos reproducibilidad en los hallazgos que las arterias piales superficiales. En cualquier caso, la estructura y función de las células endoteliales arteriolares, parte integral de la fisiología y etiología de las enfermedades degenerativas crónicas, requiere una amplia investigación. En particular, la evidencia emergente demuestra que la función endotelial comprometida precede y exacerba el deterioro cognitivo y la demencia.
En la microcirculación parenquimatosa, la función del canal K+ endotelial es el estímulo más robusto para controlar finamente la propagación de la vasodilatación para promover aumentos en el flujo sanguíneo a áreas de actividad neuronal. Este artículo ilustra un método refinado para aislar recién aislados "tubos" endoteliales intactos y acoplados eléctricamente (diámetro, ~ 25 μm) de arteriolas parenquimatosas del cerebro de ratón. Los tubos endoteliales arteriolares se aseguran durante condiciones fisiológicas (37 °C, pH 7.4) para resolver variables experimentales que abarcan la función del canal K + y su regulación, incluida la dinámica intracelular de Ca2 + , los cambios en el potencial de membrana y la regulación lipídica de membrana. Una clara ventaja técnica frente al endotelio arterial es la resolución morfológica mejorada de las dimensiones celulares y orgánulos (por ejemplo, mitocondrias), lo que amplía la utilidad de esta técnica. La perfusión cerebral saludable a lo largo de la vida implica una función endotelial robusta en las arteriolas parenquimatosas, vinculando directamente el flujo sanguíneo con el combustible de la actividad neuronal y glial a través de regiones anatómicas precisas del cerebro. Por lo tanto, se espera que este método avance significativamente en el conocimiento general de la fisiología vascular y la neurociencia con respecto al cerebro sano y enfermo.
Introduction
Las arteriolas parenquimatosas suministran directamente oxígeno y nutrientes esenciales en todo el cerebro1. Mientras interactúan con los capilares, las arteriolas altamente vasoactivas responden a la señalización retrógrada iniciada por los canales iónicos capilares que detectan las señales metabólicas de regiones neuronales específicas2. Dado que el parénquima cerebral ha recibido históricamente la mayor parte de la investigación, ahora ha surgido un papel para la disfunción endotelial para aclarar los mecanismos patológicos asociados con diversos trastornos cerebrovasculares que subyacen a la demencia (por ejemplo, accidente cerebrovascular isquémico, enfermedad de Alzheimer)3,4,5,6 . El endotelio es parte integral de la perfusión del cerebro de acuerdo con la heterogeneidad de la genética, la estructura y la función a lo largo de los segmentos vasculares7. Las arterias piales han sido ampliamente estudiadas debido a su tamaño relativamente grande, alta resistencia vascular segmentaria y papel en la distribución del flujo sanguíneo al cerebro subyacente 8,9. Por lo tanto, una mejor comprensión de los mecanismos endoteliales arteriolares probablemente mejorará la comprensión de la regulación del flujo sanguíneo cerebral en la salud y la enfermedad hacia el desarrollo de nuevos regímenes terapéuticos.
La evidencia emergente destaca la importancia de estudiar las arteriolas parenquimatosas en relación con diferentes vías de señalización y enfermedades 8,10. Sin embargo, este enfoque se ha limitado al uso de arteriola11 presurizada intacta y/o preparaciones de arteriola capilar-parenquimatosa (CaPA)12. Las células endoteliales arteriolares cerebrales nativas recién aisladas, desprovistas de otros tipos de células y factores de confusión no han sido examinadas, probablemente debido a dificultades técnicas en su aislamiento. En este trabajo se adelanta una técnica previa destacando el aislamiento del endotelio arterial pial13 para aislar ahora de forma fiable y reproducible el endotelio de las arteriolas parenquimatosas cerebrales (ancho: ~25 μm, longitud: ~250 μm). Esta técnica ayuda a lograr una resolución óptima de las células acopladas eléctrica y químicamente en su orientación individual y redes celulares.
Las vías clave de interés han incluido la interacción de la señalización intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i) y la hiperpolarización del potencial de membrana (Vm)14,15, integral a la vasodilatación16, para permitir que la sangre ingrese a los capilares y entregue oxígeno y nutrientes al parénquima activo17. Estas preparaciones permiten registros electrofisiológicos en tiempo real de canales iónicos, incluidos Ca2+ permeante, canales de potencial de receptor transitorio (TRP) y K+ y / o imágenes fluorescentes de orgánulos intracelulares dentro de tubos celulares endoteliales en condiciones casi fisiológicas. Esta es una técnica adecuada para investigadores interesados en los mecanismos celulares fisiológicos que gobiernan el control de las células endoteliales del suministro de flujo sanguíneo cerebral al parénquima cerebral. En conjunto, esta técnica ayudará a los investigadores a comprender mejor las vías fundamentales de señalización endotelial y la comunicación en red de las arteriolas incrustadas en el parénquima cerebral, al tiempo que aborda cuestiones relacionadas con la fisiología y la patología cerebrovasculares.
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Protocol
Los experimentadores deben asegurarse de que el uso designado de animales y los protocolos asociados sean aprobados por su Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y se realicen de acuerdo con la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" del Consejo Nacional de Investigación (8ª Edición, 2011) y las pautas de ARRIVE. El IACUC de la Universidad de Loma Linda y la Universidad de Arizona han aprobado todos los protocolos utilizados para este manuscrito para ratones C57BL / 6N y 3xTg-AD (machos y hembras; rango de edad: 2-30 meses). Vea la Figura 1 como una visión general del aislamiento y examen de los tubos endoteliales arteriolares recién aislados de las arteriolas parenquimatosas del cerebro de ratón.
1. Materiales y equipos
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para todos los reactivos y materiales necesarios para este protocolo. Además, también se pueden consultar manuales y sitios web asociados con los respectivos proveedores según sea necesario. Anteriormente se han proporcionado ilustraciones de estaciones de disección y aparatos experimentales13.
- Cámara de flujo
- Sujete una cámara de superfusión con una cubierta de vidrio a una plataforma compuesta de aluminio anodizado. Asegure la plataforma con la cámara en un escenario de microscopio de aluminio.
- Coloque un micromanipulador que sostenga una pipeta de fijación en cada extremo de la plataforma en el escenario del microscopio de aluminio.
NOTA: Si es necesario, utilice un aparato de etapa transferible con una unidad de cámara de flujo para mover un tubo endotelial aislado y seguro de un aparato de microscopio a otro para la experimentación.
- Microscopios
- Use estereomicroscopios (rango de aumento de 5x a 50x) y fuentes de luz de fibra óptica para los procedimientos de disección.
- Para el aislamiento de tubos endoteliales, utilice un equipo de microscopio invertido equipado con objetivos compatibles con contraste de fase o contraste de interferencia diferencial (DIC) (10x, 20x y 40x) y una etapa de aluminio.
- Tenga un controlador de bomba de microjeringa listo junto al aparato dedicado a aislar tubos endoteliales de vasos sanguíneos parcialmente digeridos.
- Configure el aparato experimental organizando un microscopio invertido (objetivos: 4x, 10x, 20x, 40x y 60x) y una etapa manual de aluminio en una mesa de aislamiento de vibraciones.
- Aparato de control intracelular Vm
- Conecte el electrómetro a un cabezal compatible. Use accesorios, como un generador de funciones y un estimulador, para los protocolos que requieren inyección de corriente.
- Conecte las salidas del amplificador a un sistema digitalizador de datos, osciloscopio y monitores de línea de base audibles. Asegure el electrodo de baño de referencia (pellet Ag/AgCl) cerca de la salida de la cámara de flujo.
- Ensamble un sistema fotométrico con componentes integrados de una interfaz de sistema de fluorescencia, lámpara de arco de alta intensidad y fuente de alimentación, hiperinterruptor, tubo fotomultiplicador (o PMT) y cámara para medir [Ca2+]i en células endoteliales.
- Ensamble un controlador de temperatura equipado con un calentador en línea para elevar y mantener una temperatura fisiológica (37 ° C) durante todo el experimento.
- Ensamble una plataforma multicanal conectada a un controlador de válvula con una válvula de control de flujo en línea para controlar la entrega de soluciones a los tubos endoteliales asegurados en la cámara.
- Micropipetas y electrodos afilados
NOTA: El experimentador necesitará un extractor de vidrio electrónico y una microtorra para preparar pipetas de trituración y fijación.- Para separar el tubo endotelial del segmento arteriolar parcialmente digerido, prepare pipetas de trituración pulidas térmicamente (diámetro interno de la punta: 30-50 μm) de capilares de vidrio de borosilicato.
- Para asegurar el tubo endotelial en la cámara de superfusión, prepare pipetas de fijación pulidas térmicamente con un extremo esférico embotado (diámetro exterior: 50-70 μm) preparado a partir de capilares de vidrio de borosilicato de pared delgada.
- Para registrar Vm de una celda endotelial, prepare electrodos afilados con una resistencia de punta de ~ 150 ± 30 MΩ de capilares de vidrio usando solo el extractor de vidrio.
2. Soluciones y medicamentos
- Solución salina fisiológica (PSS)
- Prepare un mínimo de 1 L de PSS usando 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico ácido (HEPES) y 10 mM de glucosa.
- Preparar las soluciones necesarias que carezcan de CaCl2 (cero Ca2+ PSS) para la disección de arteriolas cerebrales y el aislamiento del tubo endotelial.
NOTA: Preparar todas las soluciones en ultrapuro desionizado H2O, seguido de filtración (0,22 μm). Asegúrese de que el producto final contiene un pH 7.4 con osmolalidad entre 290 y 300 mOsm.
- Albúmina sérica bovina (BSA, 10%)
- Disolver 1 g del polvo de BSA liofilizado en un vaso de precipitados de 10 ml de ca2+ PSS cero. Cubra el vaso de precipitados y deje pasar al menos 2 h con agitación lenta para que el BSA se disuelva.
- Solución de filtro utilizando una jeringa de 10 ml más un filtro de 0,22 μm y preparar alícuotas de 1 ml para almacenar a -20 °C.
- Solución de disección
- Agregue 500 μL de BSA (10%) a 49.5 mL de cero Ca2+ PSS para un volumen total de 50 mL.
- Transfiera la solución a una placa de Petri para disecciones arteriolares.
- Solución de disociación
- Añadir 5 μL de solución de CaCl2 (1 M) y 500 μL de BSA (10%) a 49,5 mL de cero Ca2+ PSS para un volumen total de 50 mL. Incubar la solución a temperatura ambiente durante al menos 1 h.
- Enzimas
- Preparar 1 ml de solución de digestión con 100 μg/ml de papaína, 170 μg/ml de ditioeritritol, 250 μg/ml de colagenasa (mezcla tipo H) y 40 μg/ml de elastasa.
NOTA: Las actividades enzimáticas pueden variar, aunque los protocolos exitosos probablemente requerirán las siguientes actividades enzimáticas: ≥ 10 unidades / mg para la papaína, ≥ 1 unidad / mg para la colagenasa y ≥ 5 unidades / mg para la elastasa.
- Preparar 1 ml de solución de digestión con 100 μg/ml de papaína, 170 μg/ml de ditioeritritol, 250 μg/ml de colagenasa (mezcla tipo H) y 40 μg/ml de elastasa.
- Fura-2 y agentes farmacológicos
- Preparar fura-2 AM stock en dimetilsulfóxido (DMSO; 1 mM). Preparar 500 μL de concentración de trabajo (10 μM) añadiendo 5 μL de la culata a 495 μL de PSS para la carga.
- Preparar al menos 50 ml de concentraciones de trabajo de agentes farmacológicos en PSS o DMSO, según corresponda.
- Solución conductora
- Preparar 2 M KCl disolviendo KCl en H2O desionizado (7.455 g de KCl en 50 mL de H2O). Pase la solución a través de una jeringa con un filtro de 0,22 μm antes de rellenar los electrodos afilados.
- Rastreadores de orgánulos fluorescentes y anticuerpos
- Prepare los rastreadores de membrana plasmática u organelares (por ejemplo, núcleo, retículo endoplásmico) en la solución salina fisiológica adecuada de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Prepare anticuerpos primarios y secundarios de acuerdo con las instrucciones del fabricante en la solución de sal fisiológica adecuada.
3. Disección y aislamiento de arteriolas cerebrales de ratón
NOTA: Se deben usar estereomicroscopios y herramientas de microdisección afiladas (por ejemplo, pinzas de punta fina, tijeras de disección estilo Vannas) para la ampliación de muestras (hasta 50x) en todos estos procedimientos de disección.
- Aislamiento del cerebro del ratón
- Anestesiar un ratón de laboratorio estándar (por ejemplo, C57BL/6, 3xTg-AD; 2-30 meses de edad, macho o hembra) utilizando inhalación de isoflurano (3% durante 2-3 min), seguido de decapitación inmediata con tijeras afiladas o guillotina según la aprobación de la IACUC. Coloque la cabeza del ratón en una placa de Petri (diámetro 10 cm, profundidad 1,5 cm) que contenga una solución de disección fría (4 °C).
- Mientras se ve bajo un estereomicroscopio, retire la piel y el vello sobre el cráneo y lave el exceso de sangre con una solución de disección fría. Usando las puntas de las tijeras de disección estándar (por ejemplo, cuchillas de 24 mm), haga una incisión comenzando con el hueso occipital y extendiéndose a través del hueso nasal del cráneo. Use fórceps de punta gruesa para abrir cuidadosamente el cráneo a lo largo de la incisión y separe el tejido conectivo (membrana meníngea) para aislar el cerebro que contiene un círculo de Willis intacto.
- Lave el cerebro aislado con una solución de disección fría en un vaso de precipitados o una placa de Petri para eliminar la sangre restante de la superficie del cerebro. Coloque el lado ventral del cerebro boca arriba en una cámara que contenga solución de disección en frío para el aislamiento de las arteriolas parenquimatosas (Figura 2A).
- Aislamiento de arteriolas parenquimatosas
NOTA: Las arteriolas que surgen de las arterias cerebrales medias (MCA) e incrustadas en el parénquima cerebral se eligen para este protocolo. Las arteriolas se aíslan como se describió anteriormente11, con modificación.- Use pasadores de acero (diámetro: 0,2 mm, longitud: 11 a 12 mm) para asegurar el cerebro aislado en una solución de disección en frío en una placa de Petri que contenga un recubrimiento de polímero de silicio con infusión de carbón (profundidad ≥ 50 cm).
- Usando tijeras de disección afiladas y alineadas, corte un rectángulo de tejido cerebral (longitud: 5 mm, ancho: 3 mm) (Figura 2B) alrededor del MCA mientras se asegura de que la parte superior del segmento de tejido esté más allá del punto de ramificación del Círculo de Willis. Corte otro rectángulo de tejido cerebral del otro hemisferio del cerebro para acceder a más arteriolas si es necesario.
- Asegure el segmento de tejido cerebral separado en el plato con el MCA mirando hacia arriba (distal desde el Círculo de Willis) usando pasadores de acero (diámetro: 0.1 mm, longitud: 13 a 14 mm). Haga con cuidado una incisión poco profunda cerca de los pasadores para quitar la pia con pinzas pequeñas, pelando suavemente de un extremo hacia el otro (Figura 2C). Retire la pia del otro segmento de tejido para acceder a más arteriolas si es necesario. Asegure cuidadosamente la pia aislada con arteriolas parenquimatosas ramificadas de MCA en el plato con los alfileres, y diseccione las arteriolas parenquimatosas (Figura 2D), asegurando que las arteriolas no estén dañadas.
NOTA: Si las arteriolas no se extraen fácilmente con la pia del parénquima, use fórceps finos y profundice en el cerebro, comenzando en el punto de la rama MCA del Círculo de Willis. Localice la arteriola, afloje cuidadosamente el tejido alrededor de las arteriolas (Figura 2E) y extraiga suavemente la arteriola fuera del parénquima, sosteniendo el extremo superior de la arteriola (Figura 2F). Se pueden aislar múltiples arteriolas (longitud: ~ 1.5-2 mm) de un rectángulo de tejido cerebral. - Asegúrese de que la arteriola esté limpia sin tejido adherido a ella, y corte las ramas distales restantes (Figura 3A). Use esta arteriola limpia e intacta para la digestión enzimática. Alternativamente, corte cada arteriola en dos trozos (longitud: 0.75-1 mm) para la digestión enzimática para la preparación de tubos endoteliales si lo desea.
4. Digestión de arteriolas parenquimatosas y preparación de tubos endoteliales
- Disposición de equipos y pipetas
NOTA: El aislamiento de los tubos endoteliales arteriales del cerebro ha sido descrito previamente13,18. El protocolo actual incorpora modificaciones para el aislamiento del endotelio de las arteriolas parenquimatosas (intracerebrales). Múltiples arteriolas y / o pedazos de arteriolas se pueden usar juntos para la digestión enzimática.- Montar el aparato de trituración13 para la preparación de tubos endoteliales utilizando una etapa de aluminio que soporta una cámara y micromanipuladores. Montar un microscopio equipado con objetivos (5x-60x) y una cámara conectada a un monitor de ordenador. Asegure una microjeringa con un controlador de bomba junto al escenario y la muestra.
- Asegure una pipeta de trituración rellena con aceite mineral sobre el pistón de la microjeringa. Use la microjeringa con el controlador de la bomba para retirar la solución de disociación en la pipeta de trituración (~ 130 nL) en la parte superior del aceite mineral mientras tiene cuidado de evitar burbujas de aire en la pipeta.
- Digestión parcial de segmentos arteriolares
- Coloque los segmentos arteriolares intactos en 1 ml de solución de disociación en un tubo de vidrio de 10 ml que contenga 100 μg/ml de papaína, 170 μg/ml de ditioeritritol, 250 μg/ml de colagenasa y 40 μg/ml de elastasa. Incubar segmentos arteriolares a 34 °C durante 10-12 min.
- Después de la digestión, reemplace la solución enzimática con 3-4 ml de solución de disociación fresca a temperatura ambiente.
- Aislamiento del tubo endotelial arteriolar
NOTA: Después de la digestión y el reemplazo de la solución enzimática, transfiera uno o varios segmentos parcialmente digeridos a la solución de disociación en una cámara de superfusión conectada a una plataforma móvil. Mientras visualiza con un aumento de 100x a 200x, seleccione un segmento de vaso parcialmente digerido pero ininterrumpido y concéntrese en él bajo el microscopio.- Coloque la pipeta de trituración unida con el inyector de microjeringa en la solución de disociación en la cámara y colóquela cerca de un extremo del segmento del vaso digerido. Establezca una velocidad dentro del rango de 1-3 nL / s en el controlador de la bomba para una trituración suave.
- Mientras mantiene un aumento de 100x a 200x, retire el segmento arteriolar en la pipeta y luego expulse para disociar las células adventicias y del músculo liso (Figura 3B). Triturar el segmento del vaso hasta que todas las células del músculo liso se disocien, y solo las células endoteliales permanecen como un "tubo" intacto.
NOTA: Si es necesario durante la trituración, use cuidadosamente fórceps de punta fina para eliminar la adventicia disociada y la lámina elástica interna del tubo endotelial. Por lo general, solo unos pocos ciclos de trituración producen un tubo endotelial intacto. - Utilice micromanipuladores para asegurar cada extremo del tubo endotelial en la cubierta de vidrio de la cámara con pipetas de fijación de vidrio de borosilicato (Figura 3C, D).
- Asegurar el tubo endotelial arteriolar
- Reemplace la solución de disociación con una solución de superfusión (PSS que contiene 2 mM CaCl2) mientras se asegura de que el material no endotelial se lave fuera de la cámara.
- Transfiera el tubo endotelial asegurado en la plataforma móvil a la plataforma de microscopio diseñada para la superfusión continua y las grabaciones / imágenes intracelulares o fluorescentes.
- Aplicar la entrega continua de PSS durante el experimento. Ajuste manualmente el caudal (5-7 ml/min) a lo largo del experimento utilizando la válvula de control de flujo en línea, consistente con el flujo laminar, al tiempo que hace coincidir la alimentación del flujo de solución con la extensión de la succión al vacío. Permita ≥5 min de flujo de PSS a la cámara para la superfusión del tubo endotelial antes de adquirir datos de fondo y / o carga de tinte.
5. Utilización de tubos endoteliales arteriolares para el examen de la fisiología celular
NOTA: Los tubos endoteliales arteriolares aislados y asegurados se pueden utilizar para registros intracelulares de dinámica [Ca2+]i y Vm utilizando fotometría y electrofisiología de electrodos nítidos, respectivamente, como se ilustró anteriormente13 (Figura 4). [Ca2+] i y Vm se pueden medir como variables experimentales separadas o combinadas según sea necesario13 (Figura 4). Sin embargo, los tubos endoteliales arteriolares son más delicados que el endotelio arterial, y el tiempo de experimentación no debe exceder de 1 h.
- Medición de [Ca2+]i
- Encienda el equipo y el software para las grabaciones de [Ca2+]i mientras mantiene la superfusión continua a un caudal de 5-7 ml/min.
- Cargue el tubo endotelial con el tinte Ca2+ Fura-2 AM durante 30 min a temperatura ambiente. Lave las células con solución de superfusión durante otros 20-30 minutos mientras eleva gradualmente la temperatura del baño a 37 ° C. Mantenga la temperatura a 37 °C durante todo el experimento.
- Ajuste manualmente la ventana de imágenes utilizando un software de fotometría para enfocar ~ 20 células endoteliales (Figura 4A). En ausencia de luz, encienda el PMT en la interfaz de fluorescencia y comience la adquisición de [Ca2+]i excitando Fura-2 alternativamente (≥10 Hz) a 340 nm y 380 nm mientras recoge la emisión de fluorescencia a 510 nm. Una vez que se establece un registro basal estable de [Ca2+]i , aplicar agentes farmacológicos (por ejemplo, agonistas del receptor purinérgico) por objetivo experimental (Figura 4B).
- Medición de Vm
- Encienda el equipo y el software para grabaciones de Vm y establezca la velocidad de adquisición de datos (≥10 Hz) mientras mantiene la superfusión continua a un caudal de 5-7 ml / min. Aumente gradualmente la temperatura del baño a 37 ° C y manténgala hasta el final del experimento.
- Tire de un electrodo afilado con un capilar de vidrio de borosilicato, rellene con 2 M KCl y asegúrelo sobre un alambre de plata recubierto de cloruro en el soporte de la pipeta unido a un electrómetro, que a su vez, está sostenido por un micromanipulador.
- Mientras visualiza a través del objetivo 4x, use un micromanipulador para colocar cuidadosamente la punta del electrodo afilado justo sobre una celda del tubo endotelial arteriolar en el PSS que fluye en la cámara.
- Aumente gradualmente la ampliación a 400x y reposicione la punta del electrodo según sea necesario.
- Usando el micromanipulador, inserte suavemente la punta de un electrodo afilado en una de las celdas del tubo endotelial y comience a registrar Vm usando un electrómetro (Figura 4A).
- Una vez que el Vm en reposo endotelial sea estable (−30 a −40 mV), aplicar los agentes farmacológicos deseados por objetivo experimental (Figura 4C).
6. Imágenes celulares
NOTA: Los tubos endoteliales asegurados en la cámara de la plataforma móvil también se pueden utilizar para imágenes microscópicas tanto en condiciones vivas como fijas19 utilizando fluorescencia estándar o microscopía confocal. También se puede aplicar inmunohistoquímica con diferentes anticuerpos para receptores y canales iónicos como se describió anteriormente20.
- Cargue el tubo endotelial con el rastreador de fluorescencia para la membrana plasmática o el orgánulo deseado (por ejemplo, núcleo, retículo endoplásmico) a 37 °C durante 15-30 min.
- Lave las células con PSS de superfusión fresca e imagine células vivas bajo el microscopio en la longitud de onda de excitación de los colorantes respectivos (Figura 4D, E).
NOTA: La inmunohistoquímica se puede realizar en este modelo de tubo utilizando anticuerpos de interés.
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Representative Results
Una demostración del protocolo se muestra en la Figura 1 con los pasos de disección arteriolar y aislamiento del tubo endotelial como la Figura 2 y la Figura 3, respectivamente. Aquí, la función endotelial se evaluó midiendo [Ca2+]i y Vm utilizando fotometría Fura-2 y electrofisiología de electrodos afilados (Figura 4A) en respuesta a un agente farmacológico [2-metiltioadenosina difosfato (MTA), un potente agonista del receptor purinérgico (P2YR)] a 37 °C. Tras la aplicación de MTA (1 μM), [Ca2+]i aumenta rápidamente (Figura 4B) con una hiperpolarización concomitante (Figura 4C). Estas mediciones son un reflejo de la activación de los receptores acoplados a la proteína Gq (P2YRs) seguidos de la activación de canales K+ activados por Ca2+ de conductancia pequeña e intermedia (SKCa/IKCa), que inician una vía vasodilatadora de hiperpolarización dependiente del endotelio (EDH). Por lo tanto, el endotelio aislado de una arteriola parenquimatosa es funcional de forma aislada y se puede utilizar para estudiar componentes clave de vías que implican la movilización de [Ca2+]i y/o la regulación de Vm a través de canales K+.
Además, el endotelio intacto se incubó a 37 °C con rastreadores fluorescentes para su visualización para examinar la morfología celular. Las imágenes de células endoteliales vivas muestran tinción conjunta para la membrana plasmática (verde) y los núcleos (rojo) (Figura 4D). En la Figura 4E, la membrana plasmática (verde) se tiñó junto con una tinción fluorescente del retículo endoplásmico (ER; rojo), por lo que las áreas de aparente superposición de ER dentro de las proximidades de la membrana plasmática aparecen de color naranja (Figura 4E). Estas imágenes fluorescentes revelan aún más la integridad celular del endotelio arteriolar y su posible uso para estudiar microdominios de señalización ubicados en complejos de membranas de unión.
Figura 1: Examen del tubo endotelial arteriolar recién aislado de la arteriola parenquimatosa del ratón. Como se muestra, el cerebro está aislado de un ratón, y se eliminó un pedazo de tejido cerebral rectangular que contenía el MCA. Las arteriolas parenquimatosas que se ramifican desde el MCA y entran en el parénquima cerebral se aíslan. Las arteriolas se digieren y trituran enzimáticamente, produciendo un tubo endotelial intacto para su estudio. El tubo endotelial preparado permite la medición de la dinámica intracelular de Ca2 + y Vm , al tiempo que permite imágenes celulares para imágenes de fluorescencia e inmunohistoquímica. Abreviaturas: MCA = arteria cerebral media; Vm = potencial de membrana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Disección y aislamiento de arteriolas parenquimatosas. (A) Cerebro de ratón aislado con círculo de Willis intacto. (B) Una pieza rectangular diseccionada de tejido cerebral que contiene el MCA (flecha blanca). (C) Aislamiento de la pia de la parte superior del tejido (arteriola, flecha azul). (D) Arteriolas (delineadas con puntas de flecha azules) conectadas a las arterias cerebrales medias (flechas amarillas). (E) Arteriola identificada (flecha azul) en el tejido cerebral. (F) Sacar la arteriola (flecha azul) del tejido aflojado. Obsérvese que los paneles E y F indican un método alternativo para el aislamiento de la arteriola (véase el paso 3.2.3 del protocolo). Barras de escala = 2 mm (A, B, C), 0,2 mm (D) y 1 mm (E, F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Preparación de tubos endoteliales a partir de arteriolas parenquimatosas. (A) Arteriola aislada y limpia (flecha azul). (B) Trituración de arteriola parcialmente digerida por enzimas. (C) Tubo endotelial intacto (aumento: 100x) preparado y asegurado en la cubierta de vidrio utilizando pipetas de fijación. (D) Tubo endotelial a un aumento de 200x. Barras de escala = 0,2 mm (A), 0,1 mm (B, C) y 0,05 mm (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Aplicación del tubo endotelial para el examen fisiológico de las vías relacionadas con la regulación del flujo sanguíneo. (A) Un electrodo afilado (flecha púrpura) se coloca en una celda de un tubo endotelial enfocado en la ventana de adquisición de datos para fotometría. (B) Registro representativo de Ca2+ intracelular mediante fotometría Fura-2 en respuesta a MTA (1 μM). (C) Registro representativo de Vm simultáneamente con traza intracelular de Ca2+ en el panel B. (D) Imagen representativa de la membrana plasmática (verde) y los núcleos (rojo) de células endoteliales vivas teñidas con colorantes fluorescentes. (E) Imagen representativa de la membrana plasmática (verde) y el retículo endoplásmico (ER, rojo) de células endoteliales vivas teñidas con colorantes fluorescentes. Las áreas de proximidad para ER y membrana plasmática están indicadas en naranja. Las imágenes se adquirieron utilizando una cámara monocromática y fueron pseudo-coloreadas. Barras de escala = 20 μm (D), 10 μm (E). Abreviaturas: MTA = 2-metiltioadenosina difosfato; F340/F380 = señal de relación de colorante Fura-2; Vm = potencial de membrana; PM = membrana plasmática; ER = retículo endoplásmico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La creciente evidencia sugiere que la enfermedad cerebrovascular (ECV), el envejecimiento y la enfermedad de Alzheimer están fuertemente correlacionados y son un tema actual de la investigación de la demencia 4,8,14,21. Por lo tanto, es obvio que los estudios de la red cerebrovascular tendrían un amplio impacto en la salud, al tiempo que requerirían una investigación exhaustiva continua durante las condiciones de la enfermedad. Como punto significativo de resistencia vascular para la perfusión cerebral, la importancia general de las arteriolas parenquimatosas en la etiología y desarrollo de las ECV se ha destacado durante más de 50 años22.
Sin embargo, las herramientas de examen científico no se han desarrollado adecuadamente para estudiar las arteriolas parenquimatosas intactas y sus tipos de células compuestas hasta el reciente inicio de enfoques ex vivo , como las preparaciones aisladas y presurizadas de arteriola parenquimatosa11 y CaPA12 . El campo de la fisiología cerebrovascular también se beneficiaría de técnicas complementarias en modelos de estudio homocelulares (músculo liso, pericitos y endotelio) para centrarse en tipos celulares específicos y sus características genéticas y farmacológicas subyacentes a la regulación del flujo sanguíneo cerebral y la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BBB).
El endotelio es un órgano regulador central que "alimenta" a todos los demás órganos de todo el cuerpo, incluido el cerebro23. Aunque todos los segmentos vasculares (arterias, arteriolas, capilares, vénulas, venas) son esenciales para la perfusión cerebral, el endotelio de las arteriolas requiere una investigación dedicada como componente central de la autorregulación cerebrovascular y el acoplamiento neurovascular24. Además, la señalización de Ca2+ 25 y la actividad del canal K+17,26 parecen mejorarse durante la regulación del tono miogénico en las arteriolas parenquimatosas en relación con las arterias piales. Así, ahora hemos extendido el método previamente establecido para las arterias cerebrales piales (posterior)13 a las arteriolas parenquimatosas.
En relación con estos enfoques ilustrados anteriormente 11,13, este protocolo se refinó ajustando empíricamente varios pasos (por ejemplo, tratamiento enzimático, trituración) para producir reproduciblemente tubos endoteliales intactos de arteriolas parenquimatosas. Además, este protocolo demuestra el uso de este modelo de estudio para optimizar la aplicación de la fotometría celular, la electrofisiología y la imagen fluorescente (Figura 4). Con las fortalezas y limitaciones generales de la fotometría Fura-2 y la electrofisiología de electrodos afilados previamente descritas en detalle13, se alienta al experimentador a probar una serie de otros ensayos de señalización y canales iónicos de Ca2 + para probar hipótesis específicas de interés. Además, el avance y la generación de nuevos modelos genéticos con indicadores codificados genéticamente específicos de células endoteliales (por ejemplo, [Ca2+]i27 e indicadores de voltaje28) pueden ampliar la utilidad de esta preparación.
Para el contexto de investigación, este modelo endotelial aislado es útil para preguntas de investigación que requieren estudiar el papel del endotelio arteriolar en la regulación de la dinámica vascular, por lo que las mediciones en la cara no son experimentalmente factibles debido a su pequeño tamaño. La regulación endotelial del flujo sanguíneo cerebral comienza con la activación de varios receptores acoplados a proteínas G (por ejemplo, purinérgicos, muscarínicos)18 y canales iónicos (TRPV329, TRPA15, receptores NMDA8). La activación de los receptores de tipo Gq implica la lipólisis de fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) para generar inositol trifosfato (IP3) y diacilglicerol para la movilización de [Ca2+]i que luego puede mediar la activación del canal K+ para cambios en Vm15. La actividad del canal K+, y por lo tanto Vm sola, también se puede estudiar directamente en condiciones fisiológicas2 o a través de una selección de objetivos farmacológicos30. Además, el tubo endotelial arteriolar permite una visualización fluorescente mejorada de la remodelación selectiva de la membrana plasmática (por ejemplo, filipina III), orgánulos intracelulares (por ejemplo, rastreador ER) y acoplamiento de célula a célula (por ejemplo, yoduro de propidio)18,19. Así, otra característica del modelo de estudio implica el emparejamiento efectivo de la morfología celular y la histología con parámetros de función, como el Ca2+ y la señalización eléctrica, en el envejecimiento y el desarrollo de enfermedades crónicas.
Los componentes del protocolo que merecen especial atención son la disección arteriolar, la digestión enzimática, la trituración y la sujeción del tubo endotelial arteriolar para las mediciones. Durante la disección del cerebro, el daño a la arteriola parenquimatosa debe evitarse a toda costa para garantizar una digestión y trituración exitosas para aislar una capa endotelial intacta y funcional. Además, el estiramiento excesivo mientras se asegura el tubo endotelial en la cámara de perfusión también destruirá la preparación, negando efectivamente todos los pasos previos del protocolo.
Se deben aplicar pruebas de viabilidad para asegurar que los tubos endoteliales arteriolares son funcionales con respecto a componentes fisiológicos clave como la señalización de Ca2+ (afluencia y/o liberación intracelular) después de la estimulación de los receptores acoplados a la proteína G, la extensión de la hiperpolarización Vm y el acoplamiento intercelular robusto a través de uniones de brecha18,23. Ejemplos de tales controles incluyen estimulación purinérgica reversible utilizando MTA (1 μM; Δ[Ca2+]i ~ 300 nM; hiperpolarización de ≥10 mV; Figura 4B,C), activación reversible de SKCa/IKCa mediante NS309 (1 μM; hiperpolarización de ≥20 mV) y/o correspondencia entre la inyección de corriente (por ejemplo, ~-1 nA) en una célula y las respuestas Vm (~-10 mV) de otra a una distancia de ≥250 μm18,31. Con práctica, cuidado y rigor experimental, todo el protocolo es reproducible si el alumno tiene paciencia y perseverancia.
Este método tiene limitaciones clave que abordar, como la abundancia insuficiente de muestras (por ejemplo, ácidos nucleicos, proteínas y lípidos) y la fragilidad relativa para experimentos bioquímicos y registros de células vivas, respectivamente. Sin embargo, esta advertencia de biología molecular se puede evitar mediante la agrupación de varios animales y / o el diseño de métodos de cuantificación de mayor sensibilidad y rendimiento. Si la temperatura fisiológica debe mantenerse a 37 °C, se requerirán plazos experimentales cortos (≤1 h) con intervenciones farmacológicas específicas solamente. Además, sería extremadamente difícil aislar los tubos endoteliales arteriolares de animales cercanos al término o recién nacidos (<1 mes de edad), lo que podría impedir los estudios del desarrollo vascular cerebral.
Otras consideraciones abarcan la composición precisa de los tubos endoteliales vasculares cerebrales, lo que podría requerir enfoques seleccionados de inmunofluorescencia y electrofisiología. Por ejemplo, la membrana basal (compuesta principalmente de colágeno IV, laminina y fibronectina) corre a lo largo del árbol vascular cerebral. Es conocido por su contribución a la integridad del BBB formado por células endoteliales capilares cerebrales32. Cabe señalar que este modelo de estudio puede no ser apropiado para experimentos de permeabilidad a BBB, ya que los componentes de la membrana basal son sustratos del cóctel enzimático utilizado para la digestión parcial de los tubos endoteliales arteriolares, en particular, la mezcla de colagenasa H. Además, la aplicación de un cóctel enzimático selectivo, la eliminación de la lámina elástica interna y la identificación clara de las células endoteliales por estructura (disposición paralela vs. circunferencial para las células del músculo liso), la morfología (forma de "lágrima" de las células endoteliales frente a las células del músculo liso en forma de huso) y la electrofisiología (por ejemplo, hiperpolarización a la estimulación GPCR), elimina las contribuciones fisiológicas de las células musculares lisas y los pericitos. Finalmente, el experimentador debe tomar nota de la heterogeneidad de las células endoteliales (perfil de expresión génica, estructura, función) por tipo de órgano (por ejemplo, cerebro, corazón, pulmón33) además de la región del cerebro (por ejemplo, corteza 9,34, hipocampo10) y la segmentación vascular respectiva (por ejemplo, arterias, arteriolas y capilares 9,34,35 ). Por lo tanto, un estudio exhaustivo de la regulación del flujo sanguíneo cerebral también requerirá enfoques complementarios ex vivo (por ejemplo, miografía de presión intravascular, preparación de arteriola capilar-parenquimatosa) e in vivo (por ejemplo, Láser Doppler intracerebral) de segmentos y redes vasculares intactas.
En resumen, este trabajo presenta una técnica avanzada que demuestra cómo preparar un tubo endotelial intacto recién aislado de las arteriolas parenquimatosas cerebrales del ratón. Anticipamos que este enfoque complementará y / o construirá a partir de modelos de estudio vascular in vivo e intactos. El objetivo general es generar nueva información para comprender los mecanismos que sustentan el flujo sanguíneo cerebral en el nivel fundamental de la fisiología y seleccionar las transiciones hacia la patología para la terapia.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
Esta investigación ha sido apoyada por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R00AG047198 y R56AG062169 a EJB; R00HL140106 a PWP) y la Asociación de Alzheimer (AZRGD-21-805835 a PWP). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud o la Asociación de Alzheimer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
| Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
| Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
| Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
| Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
| NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
| Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |
References
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