La preparación intensiva de “tubos” endoteliales cerebrales intactos de ratón de las arteriolas del parénquima cerebral se ilustra para estudiar la regulación del flujo sanguíneo cerebral. Además, demostramos las fortalezas experimentales de este modelo de estudio endotelial para imágenes de fluorescencia y medición electrofisiológica de vías clave de señalización celular, incluidos los cambios en el [Ca2+] intracelular y el potencial de membrana.
El flujo sanguíneo cerebral es transmitido por las arterias de resistencia vascular y las arteriolas parenquimatosas aguas abajo. La resistencia vascular en estado estacionario al flujo sanguíneo aumenta con la disminución del diámetro de las arterias a las arteriolas que finalmente se alimentan de los capilares. Debido a su menor tamaño y ubicación en el parénquima, las arteriolas han sido relativamente poco estudiadas y con menos reproducibilidad en los hallazgos que las arterias piales superficiales. En cualquier caso, la estructura y función de las células endoteliales arteriolares, parte integral de la fisiología y etiología de las enfermedades degenerativas crónicas, requiere una amplia investigación. En particular, la evidencia emergente demuestra que la función endotelial comprometida precede y exacerba el deterioro cognitivo y la demencia.
En la microcirculación parenquimatosa, la función del canal K+ endotelial es el estímulo más robusto para controlar finamente la propagación de la vasodilatación para promover aumentos en el flujo sanguíneo a áreas de actividad neuronal. Este artículo ilustra un método refinado para aislar recién aislados “tubos” endoteliales intactos y acoplados eléctricamente (diámetro, ~ 25 μm) de arteriolas parenquimatosas del cerebro de ratón. Los tubos endoteliales arteriolares se aseguran durante condiciones fisiológicas (37 °C, pH 7.4) para resolver variables experimentales que abarcan la función del canal K + y su regulación, incluida la dinámica intracelular de Ca2 + , los cambios en el potencial de membrana y la regulación lipídica de membrana. Una clara ventaja técnica frente al endotelio arterial es la resolución morfológica mejorada de las dimensiones celulares y orgánulos (por ejemplo, mitocondrias), lo que amplía la utilidad de esta técnica. La perfusión cerebral saludable a lo largo de la vida implica una función endotelial robusta en las arteriolas parenquimatosas, vinculando directamente el flujo sanguíneo con el combustible de la actividad neuronal y glial a través de regiones anatómicas precisas del cerebro. Por lo tanto, se espera que este método avance significativamente en el conocimiento general de la fisiología vascular y la neurociencia con respecto al cerebro sano y enfermo.
Las arteriolas parenquimatosas suministran directamente oxígeno y nutrientes esenciales en todo el cerebro1. Mientras interactúan con los capilares, las arteriolas altamente vasoactivas responden a la señalización retrógrada iniciada por los canales iónicos capilares que detectan las señales metabólicas de regiones neuronales específicas2. Dado que el parénquima cerebral ha recibido históricamente la mayor parte de la investigación, ahora ha surgido un papel para la disfunción endotelial para aclarar los mecanismos patológicos asociados con diversos trastornos cerebrovasculares que subyacen a la demencia (por ejemplo, accidente cerebrovascular isquémico, enfermedad de Alzheimer)3,4,5,6 . El endotelio es parte integral de la perfusión del cerebro de acuerdo con la heterogeneidad de la genética, la estructura y la función a lo largo de los segmentos vasculares7. Las arterias piales han sido ampliamente estudiadas debido a su tamaño relativamente grande, alta resistencia vascular segmentaria y papel en la distribución del flujo sanguíneo al cerebro subyacente 8,9. Por lo tanto, una mejor comprensión de los mecanismos endoteliales arteriolares probablemente mejorará la comprensión de la regulación del flujo sanguíneo cerebral en la salud y la enfermedad hacia el desarrollo de nuevos regímenes terapéuticos.
La evidencia emergente destaca la importancia de estudiar las arteriolas parenquimatosas en relación con diferentes vías de señalización y enfermedades 8,10. Sin embargo, este enfoque se ha limitado al uso de arteriola11 presurizada intacta y/o preparaciones de arteriola capilar-parenquimatosa (CaPA)12. Las células endoteliales arteriolares cerebrales nativas recién aisladas, desprovistas de otros tipos de células y factores de confusión no han sido examinadas, probablemente debido a dificultades técnicas en su aislamiento. En este trabajo se adelanta una técnica previa destacando el aislamiento del endotelio arterial pial13 para aislar ahora de forma fiable y reproducible el endotelio de las arteriolas parenquimatosas cerebrales (ancho: ~25 μm, longitud: ~250 μm). Esta técnica ayuda a lograr una resolución óptima de las células acopladas eléctrica y químicamente en su orientación individual y redes celulares.
Las vías clave de interés han incluido la interacción de la señalización intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i) y la hiperpolarización del potencial de membrana (Vm)14,15, integral a la vasodilatación16, para permitir que la sangre ingrese a los capilares y entregue oxígeno y nutrientes al parénquima activo17. Estas preparaciones permiten registros electrofisiológicos en tiempo real de canales iónicos, incluidos Ca2+ permeante, canales de potencial de receptor transitorio (TRP) y K+ y / o imágenes fluorescentes de orgánulos intracelulares dentro de tubos celulares endoteliales en condiciones casi fisiológicas. Esta es una técnica adecuada para investigadores interesados en los mecanismos celulares fisiológicos que gobiernan el control de las células endoteliales del suministro de flujo sanguíneo cerebral al parénquima cerebral. En conjunto, esta técnica ayudará a los investigadores a comprender mejor las vías fundamentales de señalización endotelial y la comunicación en red de las arteriolas incrustadas en el parénquima cerebral, al tiempo que aborda cuestiones relacionadas con la fisiología y la patología cerebrovasculares.
La creciente evidencia sugiere que la enfermedad cerebrovascular (ECV), el envejecimiento y la enfermedad de Alzheimer están fuertemente correlacionados y son un tema actual de la investigación de la demencia 4,8,14,21. Por lo tanto, es obvio que los estudios de la red cerebrovascular tendrían un amplio impacto en la salud, al tiempo que requerirían una investigación exhaustiva continua du…
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación ha sido apoyada por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R00AG047198 y R56AG062169 a EJB; R00HL140106 a PWP) y la Asociación de Alzheimer (AZRGD-21-805835 a PWP). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud o la Asociación de Alzheimer.
Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
Papain | Sigma | P4762 | |
Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |