Summary
脳実質細動脈からの無傷のマウス脳内皮「チューブ」の集中的な調製は、脳血流調節を研究するために例示される。さらに、我々は、細胞内[Ca2+]および膜電位の変化を含む重要な細胞シグナル伝達経路の蛍光イメージングおよび電気生理学的測定のためのこの内皮研究モデルの実験的強みを実証する。
Abstract
脳血流は、血管抵抗動脈および下流実質細動脈によって搬送される。血流に対する定常状態の血管抵抗は、動脈から細動脈までの直径の減少とともに増加し、最終的に毛細血管に供給される。細動脈は実質におけるサイズと位置が小さいため、比較的研究されておらず、表面の円錐骨動脈よりも所見の再現性が低い。いずれにせよ、慢性変性疾患の生理学および病因に不可欠な動脈内皮細胞の構造および機能は、広範な調査を必要とする。特に、新たな証拠は、侵害された内皮機能が認知障害および認知症に先行し、悪化することを示している。
実質微小循環において、内皮K+チャネル機能は、血管拡張の広がりを細かく制御し、ニューロン活性領域への血流の増加を促進する最も堅牢な刺激である。この論文は、マウス脳実質細動脈から無傷で電気的に結合された内皮「チューブ」(直径、〜25μm)を新たに単離するための洗練された方法を示す。動脈内皮チューブは、生理学的条件(37°C、pH7.4)中に固定され、細胞内Ca2+ダイナミクス、膜電位の変化、膜脂質調節など、K+チャネル機能とその調節を包含する実験変数を解く。動脈内皮に対する明確な技術的利点は、細胞および細胞小器官(例えば、ミトコンドリア)次元の形態学的分解能の増強であり、これはこの技術の有用性を拡大する。生涯を通じて健康な脳灌流は、実質細動脈における堅牢な内皮機能を伴い、血流を脳の正確な解剖学的領域全体にわたるニューロンおよびグリア活性の燃料供給に直接結びつける。したがって、この方法は、健康な脳と病気の脳に関する血管生理学と神経科学の一般的な知識を著しく進歩させることが期待されます。
Introduction
実質細動脈は、脳全体に必須の酸素と栄養素を直接供給します1。毛細血管とインターフェースしている間、血管活性の高い細動脈は、特定のニューロン領域2からの代謝シグナルを感知する毛細血管イオンチャネルによって開始される逆行性シグナル伝達に応答する。脳実質が歴史的に多くの研究を受けてきたことから、認知症の根底にある様々な脳血管障害(虚血性脳卒中、アルツハイマー病など)に関連する病理学的メカニズムを明らかにするために、内皮機能障害の役割が浮上しています3,4,5,6 .内皮は、血管セグメント全体にわたる遺伝学、構造、および機能の不均一性に従って、脳の灌流に不可欠である7。膝動脈は、その比較的大きなサイズ、高い分節性血管抵抗、および基礎となる大脳への血流分布における役割のために広範囲に研究されている8,9。したがって、動脈内皮機構のよりよい理解は、新しい治療レジメンの開発に向けて、健康および疾患における脳血流調節の理解を深める可能性が高い。
新たな証拠は、異なるシグナル伝達経路および疾患に関連して実質細動脈を研究することの重要性を強調している8,10。しかしながら、このアプローチは、無傷の加圧細動脈11および/または毛細血管実質細動脈(CaPA)調製物12を使用することに限定されている。新たに単離された、他の細胞型および交絡因子を欠いた天然の大脳動脈内皮細胞は、おそらくそれらの単離における技術的困難のために、検査されていない。本稿は、鰭状動脈内皮13の単離を強調した以前の技術を進化させ、脳実質細動脈の内皮を確実かつ再現性よく単離する(幅:~25μm、長さ:~250μm)。この技術は、個々の配向および細胞ネットワークにおける電気的および化学的に結合された細胞の最適な分解能を達成するのに役立つ。
関心のある主要な経路には、血管拡張16に不可欠な膜電位(Vm)14,15の細胞内Ca2+([Ca2+]i)シグナル伝達および過分極の相互作用が含まれ、血液が毛細血管に入り、酸素および栄養素を活動実質に送達することを可能にする17。これらの調製物は、Ca2+透過性、一過性受容器電位(TRP)およびK+チャネルを含むイオンチャネルのリアルタイム電気生理学的記録および/またはほぼ生理学的条件下での内皮細胞管内の細胞内小器官の蛍光イメージングを可能にする。これは、脳実質への脳血流送達の内皮細胞制御を支配する生理学的細胞機構に関心のある研究者にとって適切な技術である。全体として、この技術は、脳血管生理学および病理学に関連する質問に対処しながら、脳実質に埋め込まれた細動脈の基本的な内皮シグナル伝達経路およびネットワーク通信をよりよく理解するのに役立ちます。
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Protocol
実験者は、動物の指定された使用および関連するプロトコルが、施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、国立研究評議会の「実験動物のケアおよび使用のためのガイド」(第 8版、2011年)およびARRIVEガイドラインに従って実施されることを確認する必要があります。ロマリンダ大学とアリゾナ大学のIACUCは、C57BL/6Nおよび 3xTg-AD マウス(雄および雌;年齢範囲:2〜30ヶ月)について、この原稿に使用されるすべてのプロトコルを承認した。マウス実質脳の細動脈から新たに単離された動脈内皮管の単離および検査の概要として 図1 を参照されたい。
1. 材料・設備
メモ: このプロトコルに必要なすべての試薬および材料については、材料 表 を参照してください。さらに、必要に応じて、各ベンダーに関連するマニュアルやWebサイトも参照できます。解剖ステーションおよび実験装置のイラストは、予め提供されている13。
- フローチャンバー
- ガラスカバースリップを備えたスーパーフュージョンチャンバーを陽極酸化アルミニウムで構成されたプラットフォームに固定します。チャンバーのあるプラットフォームをアルミ顕微鏡ステージに固定します。
- プラットフォームの両端にピニングピペットを保持するマイクロマニピュレータをアルミニウム顕微鏡ステージ上にセットする。
注:必要に応じて、フローチャンバユニットを備えた移送可能なステージ装置を使用して、固定された単離された内皮チューブを実験のためにある顕微鏡装置から別の顕微鏡装置に移動します。
- 顕微鏡
- 解剖手順には、実体顕微鏡(倍率5倍~50倍)と光ファイバー光源を使用してください。
- 内皮チューブを分離するには、位相コントラストまたは微分干渉コントラスト(DIC)互換の対物レンズ(10x、20x、および40x)とアルミニウムステージを備えた倒立顕微鏡リグを使用してください。
- 部分的に消化された血管から内皮管を隔離する専用の装置の隣にマイクロシリンジポンプコントローラを用意してください。
- 防振テーブル上に倒立顕微鏡(対物レンズ:4x、10x、20x、40x、60x)と手動アルミステージを配置して実験装置を設置した。
- 細胞内VM 記録装置
- 電気計を互換性のあるヘッドステージに接続します。ファンクションジェネレータや刺激器などのアクセサリは、電流注入を必要とするプロトコルに使用します。
- アンプ出力をデータデジタイザシステム、オシロスコープ、可聴ベースラインモニタに接続します。参照バス電極(Ag/AgClペレット)をフローチャンバ出口近くに固定します。
- 蛍光システムインターフェース、高輝度有電極ランプと電源、ハイパースイッチ、光電子増倍管(またはPMT)、およびカメラのコンポーネントを統合した測光システムを組み立て、内皮細胞の[Ca2+]i を測定します。
- インラインヒーターを備えた温度コントローラを組み立て、実験を通して生理学的温度(37°C)を上昇および維持する。
- インライン流量制御バルブを備えたバルブコントローラに接続されたマルチチャネルプラットフォームを組み立てて、チャンバ内に固定された内皮チューブへの溶液の送達を制御します。
- マイクロピペットとシャープな電極
注:実験者は、粉砕および固定ピペットを準備するための電子ガラスプーラーとマイクロフォージを必要とする。- 内皮チューブを部分的に消化された動脈セグメントから分離するために、ホウケイ酸ガラス毛細血管から熱研磨された摩砕ピペット(内端径:30〜50μm)を調製する。
- 内皮チューブをスーパーフュージョンチャンバに固定するには、薄肉ホウケイ酸ガラス毛細血管から調製した鈍い球状端部(外径:50〜70μm)を備えた熱研磨ピニングピペットを調製する。
- 内皮細胞のVm を記録するには、ガラスプーラーのみを使用して、ガラス毛細血管から約150±30MΩの先端抵抗を有する鋭い電極を作製する。
2. 溶液と薬
- 生理食塩溶液(PSS)
- 140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl 2、1 mM MgCl2、10 mM N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸(HEPES)、および10 mM グルコースを使用して、最低1 LのPSSを調製する。
- CaCl2(ゼロCa2+ PSS)を欠く脳細動脈の解剖および内皮管の単離に必要な溶液を調製する。
注:すべての溶液を超高純度脱イオン化H2Oで調製し、続いて濾過(0.22μm)を行う。最終製品に、オスモル濃度が 290 ~ 300 mOsm の pH 7.4 が含まれていることを確認します。
- ウシ血清アルブミン(BSA、10%)
- 凍結乾燥BSA粉末1gを、10mLのゼロCa2+ PSSのビーカーに溶解する。ビーカーを覆い、BSAが溶解するまでゆっくりと攪拌しながら少なくとも2時間待ちます。
- フィルター溶液に0.22 μmフィルターを加えた10 mLシリンジを使用し、-20°Cで保存する1 mLアリコートを調製する。
- 解剖溶液
- 500 μL の BSA (10%) を 49.5 mL のゼロ Ca2+ PSS に加え、総容量を 50 mL にします。
- 動脈解剖のためのペトリ皿への溶液の移送。
- 解離溶液
- 5 μL の CaCl2 溶液 (1 M) および 500 μL の BSA (10%) を 49.5 mL のゼロ Ca2+ PSS に加え、総容量を 50 mL にします。溶液を室温で少なくとも1時間インキュベートする。
- 酵素
- 100 μg/mL パパイン、170 μg/mL ジチオエリスリトール、250 μg/mL コラゲナーゼ(タイプHブレンド)、および 40 μg/mL エラスターゼを含む消化液 1 mL を調製します。
注:酵素活性はさまざまですが、プロトコルを成功させるには、パパインの場合は≥10単位/ mg、コラゲナーゼの場合は≥1単位/ mg、エラスターゼの場合は≥5単位/ mgの酵素活性が必要になる可能性があります。
- 100 μg/mL パパイン、170 μg/mL ジチオエリスリトール、250 μg/mL コラゲナーゼ(タイプHブレンド)、および 40 μg/mL エラスターゼを含む消化液 1 mL を調製します。
- Fura-2および薬理学的薬剤
- ジメチルスルホキシド(DMSO;1mM)中のFura-2 AMストックを調製する。負荷のために495 μLのPSSに5 μLのストックを加えて、500 μLの作業濃度(10 μM)を調製する。
- PSSまたはDMSO中の薬理学的薬剤の作用濃度の少なくとも50mLを適宜調製する。
- 導電性ソリューション
- KClを脱イオン化したH2O(50 mLのH2O中の7.455 gのKCl)に溶解して2M KClを調製する。鋭利な電極をバックフィルする前に、0.22μmフィルターを備えたシリンジに溶液を通す。
- 蛍光オルガネラトラッカーおよび抗体
- 原形質膜またはオルガネラー(例えば、核、小胞体)トラッカーを適切な生理食塩水に調製し、製造業者の指示に従ってください。
- 一次抗体および二次抗体は、製造者の指示に従って、適切な生理塩溶液中に調製する。
3. マウス大脳細動脈の解剖と単離
注:実体顕微鏡および鋭利な微小解剖ツール(例えば、先端の細かい鉗子、Vannasスタイルの解剖はさみ)は、これらすべての解剖手順において試料倍率(最大50倍)に使用する必要があります。
- マウス脳の単離
- 標準的な実験用マウス(例えば、C57BL/6、 3xTg-AD;生後2〜30ヶ月、雄または雌)をイソフルラン吸入(3%、2〜3分間)を用いて麻酔し、続いてIACUCの承認に従って鋭いはさみまたはギロチンを用いて即時断頭する。マウスヘッドを、冷たい(4°C)解剖溶液を含むペトリ皿(直径10cm、深さ1.5cm)に入れる。
- 実体顕微鏡で見ながら、頭蓋骨の上の皮膚や毛髪を取り除き、冷たい解剖液で余分な血液を洗い流してください。標準的な解剖ハサミ(例えば、24mmの刃)の先端を使用して、後頭骨から始まり、頭蓋骨の鼻骨まで伸びる切開を行う。粗い先端の鉗子を使用して切開部に沿って頭蓋骨を慎重に開き、結合組織(髄膜)を分離して、無傷の円オブウィリスを含む脳を隔離します。
- ビーカーまたはペトリ皿に入れた冷たい解剖溶液で孤立した脳を洗浄し、脳の表面から残りの血液を除去する。実質細動脈を単離するための冷間解剖溶液を含むチャンバー内に脳腹側を上向きに配置する(図2A)。
- 実質細動脈の単離
注:中大脳動脈(MCA)から生じ、脳実質に埋め込まれた細動脈が、このプロトコルのために選択される。細動脈は、先に記載した11のように単離され、改変を伴う。- スチールピン(直径:0.2mm、長さ:11〜12mm)を使用して、木炭を注入したシリコンポリマーコーティング(深さ≥50cm)を含むペトリ皿の冷たい解剖溶液で単離された脳を固定する。
- 鋭く整列した解剖ハサミを使用して、組織セグメントの上部がウィリスの円からの分岐点を過ぎていることを確認しながら、MCAの周りの脳組織の長方形(長さ:5mm、幅:3mm)(図2B)を切断する。必要に応じて、脳の他の半球から脳組織の別の長方形を切断して、より多くの細動脈にアクセスします。
- 分離した脳組織セグメントを、MCAを上向き(ウィリスの円から遠位)にスチールピン(直径:0.1mm、長さ:13〜14mm)で皿に固定します。ピンの近くに浅い切開を慎重に行い、小さな鉗子でピアを取り除き、一方の端から他方の端に向かって静かに剥がします(図2C)。必要に応じて、他の組織セグメントからピアを取り外して、より多くの細動脈にアクセスします。MCAから分岐した実質細動脈を有する孤立したピアをピン付き皿に注意深く固定し、実質細動脈を解剖し(図2D)、細動脈が損傷していないことを確認する。
注:細動脈が実質からピアで簡単に引き抜かれない場合は、細かい鉗子を使用して、ウィリスのサークルからのMCA分岐点から始めて脳を掘り下げてください。細動脈の位置を特定し、細動脈の周りの組織を慎重に緩め(図2E)、細動脈の上端を保持して実質から細動脈を静かに引き出します(図2F)。複数の細動脈(長さ:〜1.5〜2mm)を脳組織の1つの長方形から単離することができる。 - 細動脈が清潔で、組織が付着していないことを確認し、残りの遠位枝を切り取ります(図3A)。酵素消化のためにこの清潔で無傷の細動脈を使用してください。あるいは、必要に応じて内皮チューブを調製するための酵素消化のために、各細動脈を2個(長さ:0.75〜1mm)に切断する。
実質細動脈の消化と内皮チューブの調製
- 機器・ピペットの配置
注:脳からの動脈内皮管の単離は、以前に記載されている13、18。現在のプロトコルは、実質(脳内)細動脈からの内皮の単離のための修正を組み込んでいる。複数の細動脈または細動脈の断片を酵素消化のために一緒に使用することができる。- チャンバーとマイクロマニピュレータを支持するアルミニウムステージを用いて内皮チューブを調製するための摩砕装置13 を組み立てる。対物レンズ(5x-60x)を搭載した顕微鏡と、コンピュータモニタに接続されたカメラを組み立てます。ステージと試料の隣にポンプコントローラを備えたマイクロシリンジを固定します。
- 鉱物油を詰めた粉砕ピペットをマイクロシリンジピストンの上に固定します。ポンプコントローラ付きのマイクロシリンジを使用して、ピペット内の気泡を避けるように注意しながら、鉱物油の上にある摩砕ピペット(〜130nL)に解離溶液を引き出します。
- 動脈セグメントの部分消化
- 100 μg/mL のパパイン、170 μg/mL のジチオエリスリトール、250 μg/mL のコラゲナーゼ、および 40 μg/mL のエラスターゼを含む 10 mL のガラス管に、無傷の動脈セグメントを 1 mL の解離溶液に入れます。動脈セグメントを34°Cで10〜12分間インキュベートする。
- 消化後、酵素溶液を室温で3〜4mLの新鮮な解離溶液と交換する。
- 動脈内皮管の単離
注:酵素溶液の消化および置換に続いて、1つまたは複数の部分的に消化されたセグメントを、モバイルプラットフォームに取り付けられたスーパーフュージョンチャンバ内の解離溶液に移す。100倍から200倍の倍率で見ながら、部分的に消化されたが壊れていない血管セグメントを1つ選択し、顕微鏡下でそれに焦点を合わせる。- マイクロシリンジインジェクタに取り付けられた摩砕ピペットをチャンバ内の解離溶液中に置き、それを消化容器セグメントの一端の近くに配置する。ポンプコントローラで1〜3 nL/sの範囲内で速度を設定し、穏やかな摩砕を実現します。
- 100倍〜200倍の倍率を維持しながら、動脈セグメントをピペットに引き抜き、次いで排出して外膜細胞および平滑筋細胞を解離させる(図3B)。すべての平滑筋細胞が解離するまで血管セグメントを粉砕し、内皮細胞のみが無傷の「チューブ」として残る。
注:粉砕中に必要に応じて、先端の細かい鉗子を慎重に使用して、解離した外膜および内部弾性薄板を内皮管から除去する。典型的には、粉砕のほんの数サイクルのみが無傷の内皮管を生じる。 - マイクロマニピュレーターを使用して、ホウケイ酸ガラスピニングピペットでチャンバー内のガラスカバースリップに内皮チューブの両端を固定します(図3C、D)。
- 動脈内皮管の固定
- 解離溶液をスーパーフュージョン溶液(2mM CaCl2を含むPSS)と交換しながら、非内皮物質がチャンバーから洗い流されるようにする。
- モバイルプラットフォームで固定された内皮チューブを、連続スーパーフュージョンおよび細胞内または蛍光記録/イメージング用に設計された顕微鏡リグに移します。
- 実験中に PSS の継続的配信を適用します。インライン流量制御バルブを使用して実験全体を通して流量(5-7 mL/分)を手動で設定し、層流と一致しながら、溶液流の供給を真空吸引の程度に一致させます。バックグラウンドデータおよび/または色素負荷を取得する前に、内皮チューブのスーパーフュージョンのためにチャンバにPSSを≥5分間流します。
5. 細胞生理学検査のための動脈内皮管の活用
注:単離および固定された動脈内皮管は、前述のように、それぞれ測光およびシャープな電極電気生理学を用いて[Ca2+]i ダイナミクスおよびVm の細胞内記録に使用することができる13 (図4)。[Ca2+]i およびVm は、必要に応じて別個のまたは組み合わせた実験変数として測定することができる13 (図4)。しかし、動脈内皮管は動脈内皮よりも繊細であり、実験時間は1時間を超えてはならない。
- [Ca2+]iの測定
- [Ca2+]i 録音用の機器とソフトウェアの電源を入れ、5~7mL/minの流量で連続スーパーフュージョンを維持します。
- 内皮チューブにCa2+ 色素Fura-2 AMを室温で30分間ロードする。浴温を徐々に37°Cまで上昇させながら、さらに20〜30分間、細胞をスーパーフュージョン溶液で洗浄する。 実験中、温度を37°Cに維持する。
- 測光ソフトウェアを使用してイメージングウィンドウを手動で調整し、約20個の内皮細胞に焦点を合わせます(図4A)。光がない場合は、蛍光界面のPMTを回し、510nmで蛍光発光を収集しながら、340nmと380nmで交互にFura-2を励起(≥10Hz)して[Ca2+]i の取得を開始します。[Ca2+]i の安定したベースライン記録が確立されたら、薬理学的薬剤(例えば、プリン作動性受容体アゴニスト)を実験目的ごとに適用する(図4B)。
- Vmの測定
- Vm 録音用の機器とソフトウェアの電源を入れ、5-7 mL/minの流量で連続スーパーフュージョンを維持しながら、データ収集速度(≥10 Hz)を設定します。浴温を徐々に37°Cまで上げ、実験が終わるまで維持する。
- ホウケイ酸ガラスキャピラリーを使用して鋭利な電極を引っ張り、2 M KClで埋め戻し、電気計に取り付けられたピペットホルダー内の塩化物でコーティングされた銀線の上に固定し、マイクロマニピュレータによって保持される。
- 4倍の対物レンズを通して見ながら、マイクロマニピュレータを使用して、動脈内皮チューブのセルのすぐ上の鋭い電極先端をチャンバ内の流れるPSSに慎重に配置します。
- 倍率を徐々に400倍に上げ、必要に応じて電極先端の位置を変えます。
- マイクロマニピュレータを使用して、鋭利な電極の先端を内皮管のセルの1つに静かに挿入し、電気計を使用してVm の記録を開始します(図4A)。
- 内皮安静時Vm が安定(−30〜−40mV)になったら、実験目的ごとに所望の薬理学的薬剤を適用する(図4C)。
6. 細胞イメージング
注:モバイルプラットフォームのチャンバー内に固定された内皮チューブは、標準的な蛍光または共焦点顕微鏡を用いて、ライブ条件および固定条件19 の両方における顕微鏡イメージングにも使用することができる。受容体およびイオンチャネルに対する異なる抗体を用いた免疫組織化学もまた、前述のように適用することができる20。
- 内皮チューブに原形質膜または所望の細胞小器官(例えば、核、小胞体)用の蛍光トラッカーを37°Cで15〜30分間ロードする。
- 新鮮なスーパーフュージョンPSSで細胞を洗浄し、それぞれの色素の励起波長で顕微鏡下で生細胞を画像化する(図4D、E)。
注:免疫組織化学は、目的の抗体を使用してこのチューブモデルに対して行うことができる。
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Representative Results
プロトコルのデモンストレーションを図1に示し、動脈解剖および内皮管単離ステップをそれぞれ図2および図3として示す。ここで、内皮機能は、薬理学的物質[2−メチルチオアデノシン二リン酸(MTA)、強力なプリン作動性受容体(P2YR)アゴニスト]に応答して、Fura−2測光法およびシャープ電極電気生理学(図4A)を用いて[Ca2+]iおよびVmを測定することによって評価した。 MTA(1μM)を印加すると、[Ca2+]iは急速に増加し(図4B)、付随する過分極(図4C)を伴う。これらの測定は、Gqタンパク質共役型受容体(P2YR)の活性化とそれに続く、内皮依存性過分極(EDH)血管拡張経路を開始する小中コンダクタンスCa2+活性化K+チャネル(SKCa/IKCa)の活性化を反映したものである。したがって、実質細動脈から単離された内皮は、単離して機能的であり、K+チャネルを介した[Ca2+]iの動員および/またはVmの調節を含む経路の主要成分を研究するために使用することができる。
さらに、無傷の内皮を、可視化のために蛍光トラッカーと共に37°Cでインキュベートし、細胞形態を調べた。生内皮細胞イメージングは、原形質膜(緑)および核(赤)に対する共染色を示す(図4D)。図4Eでは、原形質膜(緑色)を小胞体(ER;赤色)蛍光染色と共に染色し、それによって原形質膜の近くにERの明らかな重なり合う領域がオレンジ色に見える(図4E)。これらの蛍光画像はさらに、動脈内皮の細胞完全性および接合膜複合体に位置するシグナル伝達マイクロドメインを研究するためのそれらの可能な使用を明らかにする。
図1:マウス実質細動脈から新たに単離した動脈内皮管の検査。 描かれているように、脳はマウスから単離され、MCAを含む矩形の脳組織の断片が除去された。MCAから分岐して脳実質に入る実質細動脈は単離される。細動脈は酵素的に消化され、粉砕され、研究のために無傷の内皮管を産生する。調製した内皮チューブは、細胞内Ca2+ ダイナミクスおよびVm の測定を可能にすると同時に、蛍光イメージングおよび免疫組織化学のための細胞イメージングも可能にする。略語: MCA = 中大脳動脈;Vm = 膜電位。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:実質細動脈の解剖と 単離(A)ウィリスの円を無傷で有する単離マウス脳。(b)MCAを含む脳組織の解剖された長方形の断片(白矢印)。(C)組織の上部からのぴあの単離(細動脈、青い矢印)。(D)中大脳動脈(黄色の矢印)に接続された細動脈(青い矢印で輪郭を描いている)。(e)脳組織における細動脈(青色矢印)の同定。(f)緩んだ組織から細動脈(青い矢印)を引き抜く。パネル E および F は、細動脈の単離のための代替方法を示すことに留意されたい(プロトコルステップ3.2.3を参照のこと)。スケール バー = 2 mm (A、B、C)、0.2 mm (D)、および 1 mm (E、F) です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:実質細動脈からの内皮チューブの調製。(b)部分的に酵素消化された細動脈の摩砕。(c)無傷の内皮チューブ(倍率:100倍)を調製し、ピニングピペットを用いてガラスカバースリップ上に固定した。(d)200倍の倍率で内皮チューブ。スケール バー = 0.2 mm (A)、0.1 mm (B、C)、および 0.05 mm (奥行き)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:血流調節に関連する経路の生理学的検査のための内皮チューブの適用。 (A)測光のためのデータ収集ウィンドウに焦点を合わせた内皮チューブの細胞内に鋭い電極(紫色の矢印)が配置されている。(b)MTA(1μM)に応答したFura−2測光法を用いた細胞内Ca2+の代表的な記録。(c)パネルBにおける細胞内Ca2+トレースと同時にVmの代表的な記録。(d)蛍光色素で染色した生内皮細胞の原形質膜(緑)と核(赤)の代表的な画像。(e)蛍光色素で染色した生内皮細胞の原形質膜(緑)と小胞体(ER、赤)の代表的な画像。ERと原形質膜の近接領域はオレンジ色で示されています。画像はモノクロカメラを使用して取得され、疑似カラー化されました。スケールバー = 20 μm (D)、10 μm (E)。略語:MTA=2-メチルチオアデノシン二リン酸;F340/F380 = Fura-2色素比シグナル;Vm = 膜電位;PM = 原形質膜;ER = 小胞体。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
増え続ける証拠は、脳血管疾患(CVD)、老化、およびアルツハイマー病が強く相関しており、認知症研究の現在のトピックであることを示唆している4,8,14,21。したがって、脳血管網の研究は健康に広範な影響を与える一方で、疾患の状態の間、継続的な広範な調査を必要とすることは明らかである。脳灌流に対する血管抵抗の重要な点として、CVDの病因および発達における実質細動脈の一般的な重要性は、50年以上にわたって強調されてきた22。
しかしながら、単離された加圧実質細動脈11およびCaPA12調製物のようなエキソビボアプローチの最近の発症まで、無傷の実質細動脈およびそれらの複合細胞型を研究するための科学的検査ツールは十分に開発されていない。脳血管生理学分野はまた、特定の細胞型および脳血流調節および血液脳関門(BBB)透過性の根底にあるそれらの遺伝的および薬理学的特徴に焦点を当てるために、ホモセル研究モデル(平滑筋、周皮細胞、および内皮)における補完的技術の恩恵を受けるであろう。
内皮は、脳23を含む全身の他のすべての器官を「摂食」する中枢調節器官である。すべての血管セグメント(動脈、細動脈、毛細血管、細静脈、静脈)は脳灌流に必須であるが、細動脈の内皮は、脳血管自己調節および神経血管結合の中心成分として専用の調査を必要とする24。さらに、Ca2+シグナル伝達25およびK+チャネル活性17、26は、鰨毛動脈に対する実質細動脈における筋原性緊張の調節の間に増強されるようである。そこで、これまで確立した鰭大脳動脈(後部)13の手法を実質細動脈まで拡張しました。
これらの先に例示したアプローチ11、13と比較して、このプロトコールは、実質細動脈から無傷の内皮チューブを再現性よく得るために、様々なステップ(例えば、酵素処理、摩砕)を経験的に調整することによって洗練された。さらに、このプロトコルは、この研究モデルを使用して、細胞測光、電気生理学、および蛍光イメージングの適用を最適化することを示しています(図4)。Fura-2測光法およびシャープ電極電気生理学の一般的な強みと限界(13)により、実験者は、関心のある特定の仮説をテストするために、他のCa2+シグナル伝達およびイオンチャネルアッセイのアレイを試すことが奨励される。さらに、内皮細胞特異的に遺伝的にコードされた指標(例えば[Ca2+]i27および電圧28指標)を有する新規遺伝子モデルの進歩および生成は、この調製物の有用性を拡大することができる。
調査の文脈のために、この単離された内皮モデルは、血管ダイナミクスの調節における動脈内皮の役割を研究することを必要とする研究課題に有用であり、それによって、顔の測定は、そのサイズが小さいために実験的に実現不可能である。脳血流の内皮調節は、様々なGタンパク質共役型受容体(例えば、プリン作動性、ムスカリン性)18およびイオンチャネル(TRPV329、TRPA15、NMDA受容体8)の活性化から始まる。Gq型受容体の活性化は、ホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェート(PIP2)脂肪分解を伴い、[Ca2+]i動員のためのイノシトール三リン酸(IP3)およびジアシルグリセロールを生成し、その後、Vm15の変化に対するK+チャネル活性化を媒介することができる。K+チャネル活性、およびそれによってVmのみを、生理学的条件2下で直接、または選択された薬理学的標的化30を介して研究することもできる。さらに、動脈内皮管は、選択された原形質膜リモデリング(例えば、Filipin-III)、細胞内小器官(例えば、ERトラッカー)、および細胞間結合(例えば、ヨウ化プロピジウム)の増強された蛍光可視化を可能にする18,19。したがって、研究モデルの別の特徴は、老化および慢性疾患の発症において、細胞形態および組織学とCa2+および電気シグナル伝達などの機能パラメータとの効果的な組み合わせを伴う。
特別な注意に値するプロトコルの構成要素は、動脈解剖、酵素消化、摩砕、および測定のための動脈内皮管の固定である。脳からの解剖中、実質細動脈への損傷は、無傷で機能的な内皮層を単離するための消化および摩砕を確実に成功させるために、いかなる犠牲を払っても避けるべきである。さらに、内皮チューブを灌流チャンバー内に固定しながら過度の延伸を行うこともまた、調製物を破壊し、すべての先行プロトコールステップを効果的に否定する。
生存率試験は、Gタンパク質共役型受容体の刺激後のCa2+シグナル伝達(流入および/または細胞内放出)、Vm過分極の程度、およびギャップ接合部を介した堅牢な細胞間結合などの重要な生理学的成分に関して動脈内皮管が機能的であることを確認するために適用されるべきである18,23。このような対照の例には、MTAを用いた可逆的純粋作用刺激(1μM;Δ[Ca2+]i〜300nM;≥10mV過分極;図4B,C)、NS309を用いた可逆的なSKCa/IKCa活性化(1 μM; ≥20 mV過分極)、および/または1つのセルへの電流注入(例えば、〜-1nA)と、≥250μmの距離での別のセルのVm応答(〜-10mV)との対応18,31。練習、注意、実験の厳密さにより、学習者が忍耐力と忍耐力を持っている場合、プロトコル全体が再現可能です。
この方法には、サンプル(核酸、タンパク質、脂質など)の不十分な量や、生化学的実験や生細胞記録の相対的な脆弱性など、対処すべき重要な制限があります。しかし、この分子生物学の警告は、いくつかの動物からプールしたり、より高い感度とスループットの定量方法を考案したりすることによって回避することができます。生理学的温度を37°Cに維持する場合、焦点を絞った薬理学的介入のみで、短い実験時間枠(≤1時間)が必要となる。さらに、短期または新生児(生後1ヶ月)の動物から動脈内皮管を単離することは非常に困難<であり、脳血管発達の研究を妨げる可能性がある。
他の考慮事項は、脳血管内皮管の正確な組成を包含し、潜在的に免疫蛍光および電気生理学の選択されたアプローチを必要とする。例えば、基底膜(主にコラーゲンIV、ラミニン、およびフィブロネクチンからなる)は、大脳血管樹に沿って走っている。脳毛細血管内皮細胞32によって形成されるBBBの完全性へのその寄与で知られている。なお、この研究モデルは、動脈内皮管の部分消化に使用される酵素カクテルの基質である基底膜成分、特にコラゲナーゼHブレンドの基質であるため、BBB透過性実験には適切ではない可能性があることに留意されたい。さらに、選択的酵素カクテルの適用、内部弾性薄層の除去、および構造ごとの内皮細胞の明確な同定(平滑筋細胞に対する平行配置対円周)、形態学(内皮細胞対紡錘形平滑筋細胞の「涙滴」形状)、および電気生理学(例えば、GPCR刺激に対する過分極)は、平滑筋細胞および周皮細胞の生理学的寄与を排除する。最後に、実験者は、脳領域(例えば、皮質9、34、海馬10)およびそれぞれの血管セグメンテーション(例えば、動脈、細動脈、および毛細血管9、34、35)に加えて、器官タイプ(例えば、脳、心臓、肺33)ごとの内皮細胞の不均一性(遺伝子発現プロファイル、構造、機能)に注意を払わなければならない。).したがって、脳血流調節の包括的な研究はまた、インビボ(例えば、血管内圧筋グラフィ、毛細血管実質細動脈調製)およびインビボ(例えば、脳内レーザードップラー)のインビボアプローチを無傷の血管セグメントおよびネットワークに相補的に必要とするであろう。
要約すると、この論文は、マウス脳実質細動脈から単離されたばかりの無傷の内皮チューブを調製する方法を実証する高度な技術を提示する。我々は、このアプローチが 、in vivo および無傷の血管研究モデルを補完および/または構築することを期待している。全体的な目標は、生理学の基礎レベルで脳血流を支えるメカニズムを理解するための新しい情報を生成し、治療のための病理学への移行を選択することです。
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Disclosures
著者らは利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、米国国立衛生研究所(R00AG047198 & R56AG062169からEJBへの助成金)によって支援されています。R00HL140106からPWP)およびアルツハイマー病協会(AZRGD-21-805835からPWP)が挙げられる。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所またはアルツハイマー病協会の公式見解を表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
| Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
| Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
| Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
| Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
| NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
| Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |
References
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