Summary
Intensiv beredning av intakta mus cerebral endoteliala "rör" från cerebral parenkymala arterioler illustreras för att studera cerebral blodflödesreglering. Vidare demonstrerar vi de experimentella styrkorna hos denna endotelstudiemodell för fluorescensavbildning och elektrofysiologisk mätning av viktiga cellulära signalvägar, inklusive förändringar i intracellulär [Ca2+] och membranpotential.
Abstract
Cerebralt blodflöde förmedlas av vaskulära resistensartärer och nedströms parenkymala arterioles. Steady-state vaskulär resistens mot blodflödet ökar med minskande diameter från artärer till arterioler som i slutändan matar in i kapillärer. På grund av deras mindre storlek och placering i parenkymen har arterioles varit relativt understuderade och med mindre reproducerbarhet i fynd än ytpialartärer. Oavsett, arteriolär endotelcellstruktur och funktion - integrerad i fysiologin och etiologin för kroniska degenerativa sjukdomar - kräver omfattande undersökning. I synnerhet visar nya bevis att komprometterad endotelfunktion föregår och förvärrar kognitiv försämring och demens.
I den parenkymala mikrocirkulationen är endotelial K + -kanalfunktion den mest robusta stimulansen för att fint kontrollera spridningen av vasodilatation för att främja ökningar av blodflödet till områden med neuronal aktivitet. Detta dokument illustrerar en förfinad metod för att nyligen isolera intakta och elektriskt kopplade endoteliala "rör" (diameter, ~ 25 μm) från mushjärnparenkymala arterioler. Arteriolära endotelrör säkras under fysiologiska förhållanden (37 ° C, pH 7,4) för att lösa experimentella variabler som omfattar K + -kanalfunktion och deras reglering, inklusive intracellulär Ca2 + - dynamik, förändringar i membranpotential och membranlipidreglering. En distinkt teknisk fördel jämfört med arteriell endotel är den förbättrade morfologiska upplösningen av cell- och organelldimensioner (t.ex. mitokondrier), vilket utökar användbarheten av denna teknik. Hälsosam cerebral perfusion under hela livet medför robust endotelfunktion i parenkymala arterioles, som direkt kopplar blodflödet till bränslet av neuronal och glial aktivitet i hela exakta anatomiska regioner i hjärnan. Således förväntas det att denna metod avsevärt kommer att främja den allmänna kunskapen om vaskulär fysiologi och neurovetenskap om den friska och sjuka hjärnan.
Introduction
Parenkymala arterioles levererar direkt essentiellt syre och näringsämnen i hela hjärnan1. Vid samverkan med kapillärer svarar mycket vasoaktiva arterioler på retrograd signalering initierad av kapillärjonkanaler som känner av metaboliska signaler från specifika neuronala regioner2. Med hjärnparenkym som historiskt har fått huvuddelen av undersökningen har en roll för endoteldysfunktion nu uppstått för att klargöra patologiska mekanismer associerade med olika cerebrovaskulära störningar som ligger till grund för demens (t.ex. ischemisk stroke, Alzheimers sjukdom)3,4,5,6 . Endotelet är integrerat i perfusion av hjärnan i enlighet med heterogeniteten hos genetik, struktur och funktion i hela vaskulära segment7. Pialartärer har studerats i stor utsträckning på grund av deras relativt stora storlek, höga segmentella vaskulära resistens och roll i blodflödesfördelningen till den underliggande storhjärnan 8,9. Således kommer en bättre förståelse av arteriolär endotelmekanismer sannolikt att öka förståelsen för hjärnans blodflödesreglering i hälsa och sjukdom mot utvecklingen av nya terapeutiska regimer.
Nya bevis belyser vikten av att studera parenkymala arterioles i förhållande till olika signalvägar och sjukdomar 8,10. Detta tillvägagångssätt har emellertid begränsats till användning av intakta trycksatta arteriole11 och/eller kapillärparenkymala arterioleparat (CaPA)12. Nyisolerade, inhemska cerebrala arteriolära endotelceller utan andra celltyper och förvirrande faktorer har inte undersökts, sannolikt på grund av tekniska svårigheter i deras isolering. Detta dokument främjar en tidigare teknik som belyser isoleringen av pial arteriell endotel13 för att nu på ett tillförlitligt och reproducerbart sätt isolera endotelet i hjärnans parenkymala arterioler (bredd: ~ 25 μm, längd: ~ 250 μm). Denna teknik hjälper till att uppnå optimal upplösning av elektriskt och kemiskt kopplade celler i deras individuella orientering och cellulära nätverk.
Viktiga vägar av intresse har inkluderat interaktionen mellan intracellulär Ca2+ ([Ca2+]i) signalering och hyperpolarisering av membranpotential (Vm)14,15 - integrerad i vasodilatation16 - för att tillåta blod att komma in i kapillärerna och leverera syre och näringsämnen till aktivt parenkym17. Dessa preparat möjliggör elektrofysiologiska registreringar i realtid av jonkanaler, inklusive Ca2+-permeant, transient receptorpotential (TRP) och K+-kanaler och/eller fluorescerande avbildning av intracellulära organeller i endotelcellsrör under nära fysiologiska förhållanden. Detta är en lämplig teknik för forskare som är intresserade av fysiologiska cellulära mekanismer som styr endotelcellskontroll av cerebral blodflödesleverans till hjärnparenkymen. Sammantaget kommer denna teknik att hjälpa forskare att bättre förstå grundläggande endotelsignalvägar och nätverkskommunikation av arterioles inbäddade i hjärnparenkym samtidigt som man tar itu med frågor relaterade till cerebrovaskulär fysiologi och patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Försöksdjur bör se till att utsedd användning av djur och tillhörande protokoll godkänns av deras institutionella djurvårds- och användningskommitté (IACUC) och utförs i enlighet med National Research Councils "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (8: e upplagan, 2011) och ARRIVE-riktlinjerna. IACUC vid Loma Linda University och University of Arizona har godkänt alla protokoll som används för detta manuskript för C57BL / 6N och 3xTg-AD möss (män och kvinnor; åldersintervall: 2-30 månader). Se figur 1 som en översikt över isolering och undersökning av arteriolär endotelrör som nyligen isolerats från musparenkymala arterioler i hjärnan.
1. Material och utrustning
OBS: Se materialförteckningen för alla reagenser och material som krävs för detta protokoll. Dessutom kan manualer och webbplatser som är associerade med respektive leverantörer också konsulteras efter behov. Illustrationer av dissektionsstationer och experimentapparater har tidigare tillhandahållits13.
- Flödeskammare
- Fäst en superfusionskammare med en glasöverdragslip på en plattform bestående av anodiserad aluminium. Säkra plattformen med kammaren på ett aluminiummikroskopsteg.
- Ställ in en mikromanipulator som håller en stiftpipett i varje ände av plattformen på aluminiummikroskopsteget.
OBS: Använd vid behov en överförbar scenapparat med en flödeskammarenhet för att flytta ett säkrat, isolerat endotelrör från en mikroskopapparat till en annan för experiment.
- Mikroskop
- Använd stereomikroskop (5x till 50x förstoringsområde) och fiberoptiska ljuskällor för dissektionsprocedurer.
- För isolering av endotelrör, använd en inverterad mikroskoprigg utrustad med faskontrast- eller differentialinterferenskontrast (DIC)-kompatibla mål (10x, 20x och 40x) och ett aluminiumsteg.
- Ha en mikrosyringpumpregulator redo bredvid apparaten avsedd att isolera endotelrör från delvis smälta blodkärl.
- Ställ in experimentapparaten genom att ordna ett inverterat mikroskop (mål: 4x, 10x, 20x, 40x och 60x) och ett manuellt aluminiumsteg på ett vibrationsisoleringsbord.
- Intracellulär Vm inspelningsutrustning
- Anslut elektrometern till en kompatibel huvudduk. Använd tillbehör, såsom en funktionsgenerator och stimulator, för protokoll som kräver ströminjektion.
- Anslut förstärkarutgångar till ett datadigitatorsystem, oscilloskop och hörbara baslinjemonitorer. Fäst referensbadelektroden (Ag/AgCl-pellets) nära flödeskammarens utgång.
- Montera ett fotometriskt system med integrerade komponenter i ett fluorescenssystemgränssnitt, högintensiv båglampa och strömförsörjning, hyperbrytare, fotomultiplikatorrör (eller PMT) och kamera för att mäta [Ca2+] i endotelceller.
- Montera en temperaturregulator utrustad med en inline-värmare för att höja och bibehålla en fysiologisk temperatur (37 ° C) under hela experimentet.
- Montera en flerkanalig plattform ansluten till en ventilregulator med en inbyggd flödesreglerventil för att styra leveransen av lösningar till endotelrör säkrade i kammaren.
- Mikropipetter och vassa elektroder
OBS: Experimenten behöver en elektronisk glasavdragare och en mikrosmedja för att förbereda triturering och fästpipetter.- För att separera endotelröret från det delvis smälta arteriolärsegmentet, förbered värmepolerade triturationspipetter (inre spetsdiameter: 30-50 μm) från borosilikatglaskapillärer.
- För att säkra endotelröret i superfusionskammaren, förbered värmepolerade pinningspipetter med en trubbig, sfärisk ände (ytterdiameter: 50-70 μm) framställd av tunnväggiga borosilikatglaskapillärer.
- För att registrera Vm av en endotelcell, förbered skarpa elektroder med ett spetsmotstånd på ~ 150 ± 30 MΩ från glaskapillärer med endast glasavdragaren.
2. Lösningar och droger
- Fysiologisk saltlösning (PSS)
- Förbered minst 1 liter PSS med 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM N-2-hydroxietylpiperazin-N'-2-etansulfonsyra (HEPES) och 10 mM glukos.
- Förbered nödvändiga lösningar som saknar CaCl2 (noll Ca2 + PSS) för dissektion av cerebrala arterioles och isolering av endotelrör.
OBS: Förbered alla lösningar i ultrarena avjoniseradeH2O, följt av filtrering (0,22 μm). Se till att slutprodukten innehåller ett pH 7,4 med osmolalitet mellan 290 och 300 mOsm.
- Albumin från bovint serum (BSA, 10%)
- Lös upp 1 g av det lyofiliserade BSA-pulvret i en bägare med 10 ml noll Ca2+ PSS. Täck bägaren och låt minst 2 timmar under långsam omrörning för att BSA ska lösas upp.
- Filtrera lösningen med en 10 ml spruta plus ett 0,22 μm filter och förbered 1 ml alikvoter som ska förvaras vid -20 °C.
- Dissektionslösning
- Tillsätt 500 μL BSA (10 %) till 49,5 ml noll Ca2+ PSS för en total volym på 50 ml.
- Överför lösningen till en petriskål för arteriolära dissektioner.
- Dissociationslösning
- Tillsätt 5 μL CaCl2-lösning (1 M) och 500 μL BSA (10%) till 49,5 ml noll Ca2+ PSS för en total volym på 50 ml. Inkubera lösning vid rumstemperatur i minst 1 timme.
- Enzymer
- Förbered 1 ml rötningslösning med 100 μg/ml papain, 170 μg/ml ditioerytritol, 250 μg/ml kollagenas (typ H-blandning) och 40 μg/ml elastas.
OBS: Enzymaktiviteter kan variera, även om framgångsrika protokoll sannolikt kommer att kräva följande enzymatiska aktiviteter: ≥ 10 enheter / mg för papain, ≥ 1 enhet / mg för kollagenas och ≥ 5 enheter / mg för elastas.
- Förbered 1 ml rötningslösning med 100 μg/ml papain, 170 μg/ml ditioerytritol, 250 μg/ml kollagenas (typ H-blandning) och 40 μg/ml elastas.
- Fura-2 och farmakologiska medel
- Förbered Fura-2 AM-beståndet i dimetylsulfoxid (DMSO; 1 mM). Förbered 500 μL arbetskoncentration (10 μM) genom att tillsätta 5 μL av beståndet till 495 μL PSS för lastning.
- Förbered minst 50 ml arbetskoncentrationer av farmakologiska medel i PSS eller DMSO, efter behov.
- Genomförande av lösning
- Förbered 2 M KCl genom att lösa upp KCl i avjoniseratH2O(7,455 g KCl i 50 mlH2O). För lösningen genom en spruta med ett 0,22 μm filter innan du fyller på de skarpa elektroderna.
- Fluorescerande organellspårare och antikroppar
- Förbered plasmamembran eller organellära (t.ex. kärna, endoplasmatisk retikulum) trackers i lämplig fysiologisk saltlösning enligt tillverkarens instruktioner.
- Förbered primära och sekundära antikroppar enligt tillverkarens instruktioner i lämplig fysiologisk saltlösning.
3. Dissektion och isolering av mus cerebrala arterioles
OBS: Stereomikroskop och skärpta mikrodissektionsverktyg (t.ex. finspetsade pincett, Vannas-stil dissektionssax) måste användas för provförstoring (upp till 50x) i alla dessa dissektionsprocedurer.
- Isolering av mushjärna
- Bedöva en vanlig laboratoriemus (t.ex. C57BL/6, 3xTg-AD; 2-30 månader gammal, man eller hona) med isofluraninandning (3% i 2-3 min), följt av omedelbar halshuggning med vass sax eller giljotin per IACUC-godkännande. Placera mushuvudet i en petriskål (diameter 10 cm, djup 1,5 cm) som innehåller kall (4 °C) dissektionslösning.
- När du tittar under ett stereomikroskop, ta bort huden och håret över skallen och tvätta bort överdrivet blod med kall dissektionslösning. Använd spetsarna på standarddissektionssax (t.ex. 24 mm blad), gör ett snitt som börjar med occipitalbenet och sträcker sig upp genom näsbenet i skallen. Använd grovspetsade pincett för att försiktigt öppna skallen längs snittet och separera bindväv (meningealmembran) för att isolera hjärnan som innehåller en intakt cirkel av Willis.
- Tvätta den isolerade hjärnan med kall dissektionslösning i en bägare eller petriskål för att ta bort återstående blod från hjärnans yta. Placera hjärnans ventrala sida uppåt i en kammare som innehåller kall dissektionslösning för isolering av parenkymala arterioles (Figur 2A).
- Isolering av parenkymala arterioles
OBS: Arterioles som härrör från de mellersta cerebrala artärerna (MCA) och inbäddade i hjärnparenkym väljs för detta protokoll. Arteriolerna isoleras som tidigare beskrivits11, med modifiering.- Använd stålstift (diameter: 0,2 mm, längd: 11 till 12 mm) för att säkra den isolerade hjärnan i kall dissektionslösning i en petriskål som innehåller en kolinfunderad kiselpolymerbeläggning (djup ≥ 50 cm).
- Skär en rektangel av hjärnvävnad (längd: 5 mm, bredd: 3 mm) (figur 2B) runt MCA med en vass och inriktad dissektionssax samtidigt som du ser till att den övre delen av vävnadssegmentet är förbi förgreningspunkten från Willis cirkel. Skär en annan rektangel av hjärnvävnad från den andra halvklotet i hjärnan för att komma åt fler arterioles om det behövs.
- Säkra det separerade hjärnvävnadssegmentet i skålen med MCA vänd uppåt (distal från Willis cirkel) med stålstift (diameter: 0,1 mm, längd: 13 till 14 mm). Gör försiktigt ett grunt snitt nära stiften för att ta bort pia med små pincett, försiktigt skala från ena änden mot den andra (Figur 2C). Ta bort pia från det andra vävnadssegmentet för att komma åt fler arterioles om det behövs. Säkra försiktigt den isolerade pia med parenkymala arterioler grenade från MCA i skålen med stiften och dissekera parenkymala arterioler (figur 2D), så att arteriolerna inte skadas.
OBS: Om arteriolerna inte lätt dras ut med pia från parenkymen, använd fina pincett och gräva in i hjärnan, med början vid MCA-grenpunkten från Willis cirkel. Leta reda på arteriolen, lossa försiktigt vävnaden runt arterioler (figur 2E) och dra försiktigt arteriolen ur parenkymen och håll den övre änden av arteriolen (Figur 2F). Flera arterioler (längd: ~ 1,5-2 mm) kan isoleras från en rektangel av hjärnvävnad. - Se till att arteriolen är ren utan vävnad fäst vid den och skär av eventuella återstående distala grenar (Figur 3A). Använd denna rena, intakta arteriole för enzymatisk matsmältning. Alternativt skär varje arteriole i två bitar (längd: 0,75-1 mm) för enzymatisk matsmältning för beredning av endotelrör om så önskas.
4. Digestion av parenkymala arterioles och beredning av endotelrör
- Arrangemang av utrustning och pipetter
OBS: Isolering av arteriella endotelrör från hjärnan har beskrivits tidigare13,18. Det nuvarande protokollet innehåller modifieringar för isolering av endotel från parenkymala (intracerebrala) arterioles. Flera arterioles eller / och bitar av arterioles kan användas tillsammans för enzymatisk matsmältning.- Montera triturationsapparaten13 för beredning av endotelrör med hjälp av ett aluminiumsteg som stöder en kammare och mikromanipulatorer. Montera ett mikroskop utrustat med mål (5x-60x) och en kamera ansluten till en datorskärm. Säkra en mikrosyringe med en pumpregulator bredvid scenen och provet.
- Säkra en triturationspipett återfylld med mineralolja över mikrosyringkolven. Använd mikrosyringen med pumpregulatorn för att dra ut dissociationslösningen i triturationspipetten (~ 130 nL) ovanpå mineraloljan samtidigt som du är noga med att undvika luftbubblor i pipetten.
- Delvis matsmältning av arteriolära segment
- Placera intakta arteriolära segment i 1 ml dissociationslösning i ett 10 ml glasrör innehållande 100 μg / ml papain, 170 μg / ml dithioerytritol, 250 μg / ml kollagenas och 40 μg / ml elastas. Inkubera arteriolära segment vid 34 ° C i 10-12 min.
- Efter matsmältningen, ersätt enzymlösningen med 3-4 ml färsk dissociationslösning vid rumstemperatur.
- Isolering av arteriolär endotelrör
OBS: Efter matsmältning och ersättning av enzymlösningen, överför ett eller flera delvis smälta segment till dissociationslösningen i en superfusionskammare fäst vid en mobil plattform. När du tittar med 100x till 200x förstoring, välj ett delvis smält men obrutet kärlsegment och fokusera på det under mikroskopet.- Placera triturationspipetten fäst med mikrosyringinjektorn i dissociationslösningen i kammaren och placera den nära ena änden av det smälta kärlsegmentet. Ställ in en hastighet inom intervallet 1-3 nL/s på pumpregulatorn för skonsam triturering.
- Medan du behåller 100x till 200x förstoring, dra tillbaka det arteriolära segmentet i pipetten och mata sedan ut för att dissociera adventitia och glattmuskelceller (Figur 3B). Triturera kärlsegmentet tills alla glatta muskelceller är dissocierade, och endast endotelceller förblir som ett intakt "rör".
OBS: Om det behövs under triturering, använd försiktigt finspetsade pincett för att ta bort den dissocierade adventitien och den inre elastiska lamina från endotelröret. Vanligtvis ger endast några cykler av triturering ett intakt endotelrör. - Använd mikromanipulatorer för att säkra varje ände av endotelröret på glasöverdraget i kammaren med borosilikatglasstiftande pipetter (Figur 3C,D).
- Säkra det arteriolära endotelröret
- Byt ut dissociationslösningen mot superfusionslösning (PSS innehållande 2 mM CaCl2) samtidigt som du ser till att icke-endotelmaterial tvättas ur kammaren.
- Överför säkrat endotelrör i den mobila plattformen till mikroskopriggen avsedd för kontinuerlig superfusion och intracellulära eller fluorescerande inspelningar/avbildningar.
- Använd kontinuerlig leverans av PSS under experimentet. Ställ in flödeshastigheten manuellt (5-7 ml / min) under hela experimentet med hjälp av den inbyggda flödesreglerventilen, som överensstämmer med det laminära flödet, samtidigt som du matchar matningen av lösningsflödet i den utsträckning som vakuumsugning. Låt ≥5 minuter PSS-flöde till kammaren för superfusion av endotelröret innan du får bakgrundsdata och/eller färgämnesladdning.
5. Användning av arteriolär endotelrör för undersökning av cellulär fysiologi
OBS: Isolerade och säkrade arteriolära endotelrör kan användas för intracellulära inspelningar av [Ca2+]i-dynamik och Vm med hjälp av fotometri respektive skarp elektrodelektrofysiologi, som tidigareillustrerats 13 (Figur 4). [Ca2+] i och Vm kan mätas som separata eller kombinerade experimentella variabler efter behov13 (figur 4). Arteriolär endotelrör är emellertid mer känsliga än arteriell endotel, och experimenttiden bör inte överstiga 1 timme.
- Mätning av [Ca2+]i
- Slå på utrustningen och programvaran för [Ca2+]i-inspelningar samtidigt som kontinuerlig superfusion bibehålls med en flödeshastighet på 5–7 ml/min.
- Ladda endotelröret med Ca2 + färgämne Fura-2 AM i 30 minuter vid rumstemperatur. Tvätta cellerna med superfusionslösning i ytterligare 20-30 minuter samtidigt som badtemperaturen gradvis höjs till 37 °C. Håll temperaturen vid 37 °C under hela experimentet.
- Justera bildfönstret manuellt med hjälp av fotometriprogramvara för att fokusera på ~ 20 endotelceller (figur 4A). I avsaknad av ljus, vrid PMT på fluorescensgränssnittet och börja förvärva [Ca2+]i genom spännande Fura-2 växelvis (≥10 Hz) vid 340 nm och 380 nm medan du samlar fluorescensutsläpp vid 510 nm. När en stabil baslinjeregistrering av [Ca2+]i har fastställts, använd farmakologiska medel (t.ex. purinerga receptoragonister) per experimentellt mål (figur 4B).
- Mätning av Vm
- Slå på utrustningen och programvaran för Vm-inspelningar och ställ in datainsamlingshastigheten (≥10 Hz) samtidigt som kontinuerlig superfusion bibehålls med en flödeshastighet på 5-7 ml / min. Höj gradvis badtemperaturen till 37 ° C och behåll den till slutet av experimentet.
- Dra en skarp elektrod med en borosilikatglaskapillär, fyll på med 2 M KCl och säkra den över en silvertråd belagd med klorid i pipetthållaren fäst vid en elektrometer, som i sin tur hålls av en mikromanipulator.
- När du tittar igenom 4x-målet, använd en mikromanipulator för att försiktigt placera den skarpa elektrodspetsen strax över en cell i det arteriolära endotelröret i det flytande PSS i kammaren.
- Öka gradvis förstoringen till 400x och flytta elektrodspetsen efter behov.
- Använd mikromanipulatorn och sätt försiktigt in spetsen på en skarp elektrod i en av cellerna i endotelröret och börja spela in Vm med hjälp av en elektrometer (Figur 4A).
- När endotelvilningen Vm är stabil (−30 till −40 mV), applicera de önskade farmakologiska medlen per experimentellt mål (figur 4C).
6. Cellulär avbildning
OBS: Endotelrör säkrade i den mobila plattformens kammare kan också användas för mikroskopisk avbildning under både levande och fasta förhållanden19 med standardfluorescens eller konfokalmikroskopi. Immunohistokemi med olika antikroppar för receptorer och jonkanaler kan också appliceras som tidigare beskrivits20.
- Ladda endotelröret med fluorescensspåraren för plasmamembranet eller önskad organell (t.ex. kärna, endoplasmatisk retikulum) vid 37 ° C i 15-30 min.
- Tvätta cellerna med färsk superfusion PSS och avbilda levande celler under mikroskopet vid excitationsvåglängden för respektive färgämnen (figur 4D,E).
OBS: Immunohistokemi kan utföras på denna rörmodell med hjälp av antikroppar av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En demonstration av protokollet visas i figur 1 med arteriolär dissektion och endotelrörsisoleringssteg som figur 2 respektive figur 3. Här bedömdes endotelfunktionen genom att mäta [Ca2+]i och Vm med hjälp av Fura-2 fotometri och skarp elektrodelektrofysiologi (figur 4A) som svar på ett farmakologiskt medel [2-metyltioadenosindifosfat (MTA), en potent purinerg receptoragonist (P2YR)] vid 37 °C. Vid applicering av MTA (1 μM) ökar [Ca2+]i snabbt (figur 4B) med en samtidig hyperpolarisering (figur 4C). Dessa mätningar är en återspegling av aktiveringen av G q-proteinkopplade receptorer (P2YR) följt av aktiveringen av små- och mellankonduktans Ca2+-aktiverade K+-kanaler (SKCa/IKCa), som initierar en endotelberoende hyperpolarisering (EDH) vasodilatatorisk väg. Således är endotel isolerat från en parenkymal arteriole funktionell isolerat och kan användas för att studera nyckelkomponenter i vägar som involverar mobilisering av [Ca2+]i och / eller reglering av Vm via K + -kanaler.
Vidare inkuberades det intakta endotelet vid 37 ° C med fluorescerande spårare för visualisering för att undersöka cellulär morfologi. Levande endotelcellsavbildning visar samfärgning för plasmamembran (grönt) och kärnor (rött) (figur 4D). I figur 4E färgades plasmamembranet (grönt) tillsammans med en endoplasmatisk retikulum (ER; röd) fluorescerande fläck, varigenom områden med uppenbar överlappning av ER i närheten av plasmamembranet verkar orange (figur 4E). Dessa fluorescerande bilder avslöjar vidare den cellulära integriteten hos arteriolär endotel och deras möjliga användning för att studera signalmikrodomäner belägna vid korsningsmembrankomplex.
Figur 1: Undersökning av arteriolär endotelrör nyligen isolerat från musparenkymal arteriole. Som avbildat isoleras hjärnan från en mus, och en bit rektangulär hjärnvävnad som innehåller MCA avlägsnades. Parenkymala arterioler som förgrenar sig från MCA och kommer in i hjärnparenkymen isoleras. Arterioles är enzymatiskt smälta och triturated, vilket ger ett intakt endotelrör för studier. Det beredda endotelröret möjliggör mätning av intracellulär Ca2+ dynamik och Vm samtidigt som det möjliggör cellulär avbildning för fluorescensavbildning och immunohistokemi. Förkortningar: MCA = mellersta hjärnartären; Vm = membranpotential. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Dissektion och isolering av parenkymala arterioler. (A) Isolerad mushjärna med intakt cirkel av Willis. (B) En dissekerad rektangulär bit hjärnvävnad som innehåller MCA (vit pil). (C) Isolering av pia från den övre delen av vävnaden (arteriole, blå pil). (D) Arterioles (skisserade med blå pilspetsar) anslutna till mellersta cerebrala artärer (gula pilar). (E) Identifierad arteriole (blå pil) i hjärnvävnaden. (F) Dra ut arteriolen (blå pil) från den lossna vävnaden. Observera att panelerna E och F anger en alternativ metod för isolering av arteriolen (se protokollsteg 3.2.3). Skalstänger = 2 mm (A,B,C), 0,2 mm (D) och 1 mm (E,F). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Beredning av endotelrör från parenkymala arterioler. (A) Isolerad och ren arteriole (blå pil). (B) Triturering av delvis enzymsmält arteriole. (C) Intakt endotelrör (förstoring: 100x) beredd och säkrad på glasskivan med hjälp av fästpipetter. (D) Endotelrör vid 200x förstoring. Skalstänger = 0,2 mm (A), 0,1 mm (B, C) och 0,05 mm (D). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Applicering av endotelrör för fysiologisk undersökning av vägar relaterade till blodflödesreglering. (A) En skarp elektrod (lila pil) är placerad i en cell i ett endotelrör fokuserat i datainsamlingsfönstret för fotometri. (B) Representativ registrering av intracellulär Ca2+ med användning av Fura-2-fotometri som svar på MTA (1 μM). (C) Representativ registrering av Vm samtidigt med intracellulärt Ca2+ spår i panel B. (D) Representativ bild av plasmamembran (grönt) och kärnor (rött) av levande endotelceller färgade med fluorescerande färgämnen. (E) Representativ bild av plasmamembran (grönt) och endoplasmatiskt retikulum (ER, rött) av levande endotelceller färgade med fluorescerande färgämnen. Närhetsområden för ER och plasmamembran anges i orange. Bilder förvärvades med hjälp av en monokrom kamera och var pseudofärgade. Skalstänger = 20 μm (D), 10 μm (E). Förkortningar: MTA = 2-metyltioadenosindifosfat; F340 / F380 = Fura-2 färgförhållandesignal; Vm = membranpotential; PM = plasmamembran; ER = endoplasmatisk retikulum. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Växande bevis tyder på att cerebrovaskulär sjukdom (CVD), åldrande och Alzheimers sjukdom är starkt korrelerade och är ett aktuellt ämne för demensforskning 4,8,14,21. Således är det uppenbart att studier av det cerebrovaskulära nätverket skulle ha en bred inverkan på hälsan samtidigt som det krävs fortsatt omfattande undersökningar under sjukdomsförhållanden. Som en viktig punkt för vaskulär resistens för cerebral perfusion har den allmänna betydelsen av parenkymala arterioler i etiologin och utvecklingen av CVD belysts i över 50 år22.
Vetenskapliga undersökningsverktyg har emellertid inte utvecklats tillräckligt för att studera intakta parenkymala arterioler och deras sammansatta celltyper förrän den senaste tidens början av ex vivo-metoder såsom de isolerade, trycksatta parenkymala arteriole11- och CaPA 12-preparaten. Det cerebrovaskulära fysiologiska fältet skulle också dra nytta av kompletterande tekniker i homocellulära studiemodeller (glatt muskulatur, pericyter och endotel) för att fokusera på specifika celltyper och deras genetiska och farmakologiska egenskaper som ligger till grund för cerebral blodflödesreglering och blod-hjärnbarriär (BBB) permeabilitet.
Endotelet är ett centralt reglerande organ som "matar" alla andra organ i hela kroppen, inklusive hjärnan23. Även om alla vaskulära segment (artärer, arterioler, kapillärer, venuler, vener) är väsentliga för cerebral perfusion, kräver endotelet av arterioler särskild undersökning som en central komponent för cerebrovaskulär autoreglering och neurovaskulär koppling24. Vidare verkar Ca2+ signalering25 och K + kanalaktivitet17,26 förbättras under regleringen av myogen ton i parenkymala arterioler i förhållande till pialartärer. Således har vi nu utvidgat den tidigare etablerade metoden för de piala cerebrala artärerna (bakre)13 till parenkymala arterioles.
I förhållande till dessa tidigare illustrerade tillvägagångssätt11,13 förfinades detta protokoll genom att empiriskt justera olika steg (t.ex. enzymatisk behandling, triturering) för att reproducerbart ge intakta endotelrör från parenkymala arterioles. Dessutom visar detta protokoll användningen av denna studiemodell för att optimera tillämpningen av cellulär fotometri, elektrofysiologi och fluorescerande avbildning (Figur 4). Med allmänna styrkor och begränsningar av Fura-2 fotometri och skarp elektrodelektrofysiologi som tidigare beskrivits i detalj13 uppmuntras experimenteraren att prova en rad andra Ca2+ signalerings- och jonkanalanalyser för att testa specifika hypoteser av intresse. Vidare kan utvecklingen och genereringen av nya genetiska modeller med endotelcellspecifika genetiskt kodade indikatorer (t.ex. [Ca2+]i27 och spänning28 indikatorer) utöka användbarheten av detta preparat.
För undersökande sammanhang är denna isolerade endotelmodell användbar för forskningsfrågor som kräver att man studerar rollen av det arteriolära endotelet vid reglering av vaskulär dynamik, varigenom ansiktsmätningar inte är experimentellt genomförbara på grund av deras lilla storlek. Endotelreglering av cerebralt blodflöde börjar med aktiveringen av olika G-proteinkopplade receptorer (t.ex. purinerga, muskariniska)18 och jonkanaler (TRPV329, TRPA15, NMDA-receptorer8). Aktivering av G q-typreceptorer medför fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat (PIP2) lipolys för att generera inositoltrisfosfat (IP3) och diacylglycerol för [Ca2+]i mobilisering som sedan kan förmedla K + kanalaktivering för förändringar i Vm15. K+ kanalaktivitet, och därmed Vm ensam, kan också studeras direkt under fysiologiska förhållanden2 eller via selektiv farmakologisk inriktning30. Dessutom möjliggör det arteriolära endotelröret förbättrad fluorescerande visualisering av selektiv plasmamembranremodellering (t.ex. Filipin-III), intracellulära organeller (t.ex. ER-tracker) och cell-till-cell-koppling (t.ex. propidiumjodid)18,19. Således innebär en annan egenskap hos studiemodellen effektiv parning av cellulär morfologi och histologi med funktionsparametrar, såsom Ca2+ och elektrisk signalering, vid åldrande och utveckling av kroniska sjukdomar.
Komponenterna i protokollet som förtjänar särskild uppmärksamhet är arteriolär dissektion, enzymatisk matsmältning, triturering och säkring av det arteriolära endotelröret för mätningar. Under dissektion från hjärnan bör skador på parenkymarteriolen undvikas till varje pris för att säkerställa framgångsrik matsmältning och triturering för att isolera ett intakt och funktionellt endotelskikt. Vidare kommer överdriven sträckning medan endotelröret säkras i perfusionskammaren också att förstöra preparatet, vilket effektivt förnekar alla tidigare protokollsteg.
Viabilitetstester bör tillämpas för att säkerställa att arteriolära endotelrör är funktionella med avseende på viktiga fysiologiska komponenter såsom Ca2+ signalering (tillströmning och/eller intracellulär frisättning) efter stimulering av G-proteinkopplade receptorer, omfattningen av Vm hyperpolarisering och robust intercellulär koppling genom gapkorsningar18,23. Exempel på sådana kontroller inkluderar reversibel purinerg stimulering med mta (1 μM; Δ[Ca2+]i ~ 300 nM; ≥10 mV hyperpolarisering; Figur 4B,C), reversibel SKCa/IKCa-aktivering med NS309 (1 μM; ≥20 mV hyperpolarisering) och/eller korrespondens mellan ströminjektion (t.ex. ~-1 nA) i en cell och Vm-svar (~-10 mV) hos en annan på ett avstånd av ≥250 μm18,31. Med övning, omsorg och experimentell noggrannhet är hela protokollet reproducerbart om eleven har tålamod och uthållighet.
Denna metod har viktiga begränsningar att ta itu med, såsom otillräcklig överflöd av prover (t.ex. nukleinsyror, proteiner och lipider) och relativ bräcklighet för biokemiska experiment respektive live-cellinspelningar. Detta molekylärbiologiska förbehåll kan dock undvikas genom sammanslagning från flera djur och / eller utformning av kvantitationsmetoder med högre känslighet och genomströmning. Om den fysiologiska temperaturen ska hållas vid 37 °C krävs korta experimentella tidsramar (≤1 timme) endast med fokuserade farmakologiska ingrepp. Dessutom skulle det vara extremt utmanande att isolera arteriolära endotelrör från kortvariga eller nyfödda (<1 månader gamla) djur, vilket potentiellt utesluter studier av cerebral vaskulär utveckling.
Andra överväganden omfattar den exakta sammansättningen av cerebrala vaskulära endotelrör, vilket potentiellt kräver utvalda metoder för immunofluorescens och elektrofysiologi. Till exempel löper basalmembranet (som huvudsakligen består av kollagen IV, laminin och fibronektin) längs det cerebrala vaskulära trädet. Det är känt för sitt bidrag till integriteten hos BBB som bildas av hjärnans kapillärendotelceller32. Det bör noteras att denna studiemodell kanske inte är lämplig för BBB-permeabilitetsexperiment eftersom basalmembrankomponenter är substrat för enzymcocktailen som används för partiell matsmältning av arteriolära endotelrör, i synnerhet kollagenas H-blandningen. Vidare eliminerar applicering av en selektiv enzymcocktail, avlägsnande av den inre elastiska laminen och tydlig identifiering av endotelceller per struktur (parallellt arrangemang kontra omkrets för glattmuskelceller), morfologi ("tårdroppe" -form av endotelceller kontra spindelformade glattmuskelceller) och elektrofysiologi (t.ex. hyperpolarisering till GPCR-stimulering) fysiologiska bidrag från glattmuskelceller och pericyter. Slutligen måste experimenteraren notera endotelcellens heterogenitet (genuttrycksprofil, struktur, funktion) per organtyp (t.ex. hjärna, hjärta,lunga 33) utöver hjärnregionen (t.ex. cortex 9,34, hippocampus10) och respektive vaskulär segmentering (t.ex. artärer, arterioler och kapillärer 9,34,35 ). Således kommer en omfattande studie av cerebral blodflödesreglering också att kräva komplementär ex vivo (t.ex. intravaskulär tryckminografi, kapillärparenkymal arteriolepreparat) och in vivo (t.ex. intracerebral laserdopler) metoder för intakta vaskulära segment och nätverk.
Sammanfattningsvis presenterar detta dokument en avancerad teknik som visar hur man förbereder ett intakt endotelrör som nyligen isolerats från mushjärnparenkymala arterioler. Vi förväntar oss att detta tillvägagångssätt kommer att komplettera och / eller bygga från in vivo och intakta vaskulära studiemodeller. Det övergripande målet är att generera ny information för att förstå mekanismer som ligger till grund för cerebralt blodflöde på den grundläggande nivån för fysiologi och välja övergångar mot patologi för terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna forskning har fått stöd av bidrag från National Institutes of Health (R00AG047198 & R56AG062169 till EJB; R00HL140106 till PWP) och Alzheimers Association (AZRGD-21-805835 till PWP). Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health eller Alzheimers Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
| Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
| Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
| Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
| Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
| NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
| Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |
References
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Kelleher, R. J., Soiza, R. L. Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder. American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium. Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).
- Pires, P. W., Earley, S. Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke. elife. 7, 35316 (2018).
- Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease. Function. 2 (2), (2021).
- Zhao, L., et al. Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain. Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).
- Peters, E. C., et al. Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease. Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).
- Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).
- Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex. Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).
- Behringer, E. J., Hakim, M. A. Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).
- Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice. Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).
- Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).
- Attems, J., Jellinger, K. A. The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology. BMC Medicine. 12, 206 (2014).
- Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).
- Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Chen, Y. L., et al. Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice. Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).
- Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators. Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).
- Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).
- Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain. Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. elife. 9, 51413 (2020).
- Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).
- Chen, M. B., et al. Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues. Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).
