Summary
Intensiv forberedelse av intakt mus cerebral endoteliale "rør" fra cerebral parenchymale arterioler er illustrert for å studere cerebral blodstrømsregulering. Videre demonstrerer vi de eksperimentelle styrkene til denne endotelstudiemodellen for fluorescensavbildning og elektrofysiologimåling av viktige cellulære signalveier, inkludert endringer i intracellulær [Ca2+] og membranpotensial.
Abstract
Cerebral blodstrøm formidles av vaskulære resistensarterier og nedstrøms parenchymale arterioler. Steady-state vaskulær motstand mot blodstrøm øker med synkende diameter fra arterier til arterioler som til slutt mates inn i kapillærene. På grunn av deres mindre størrelse og plassering i parenchyma, har arterioler blitt relativt undervurdert og med mindre reproduserbarhet i funn enn overflatepialarterier. Uansett krever arteriolar endotelcellestruktur og funksjon – integrert i fysiologien og etiologien til kroniske degenerative sykdommer – omfattende undersøkelser. Spesielt viser nye bevis at kompromittert endotelfunksjon går foran og forverrer kognitiv svikt og demens.
I den parenchymale mikrosirkulasjonen er endotel K + kanalfunksjon den mest robuste stimulansen for å finstyre spredningen av vasodilatasjon for å fremme økning i blodstrømmen til områder av nevronaktivitet. Dette papiret illustrerer en raffinert metode for fersk isolering av intakte og elektrisk koblede endoteliale "rør" (diameter, ~ 25 μm) fra musens hjerneparenchymale arterioler. Arteriolar endotelrør er sikret under fysiologiske forhold (37 °C, pH 7,4) for å løse eksperimentelle variabler som omfatter K+ kanalfunksjon og deres regulering, inkludert intracellulær Ca2+ dynamikk, endringer i membranpotensial og membran lipidregulering. En tydelig teknisk fordel versus arteriell endotel er den forbedrede morfologiske oppløsningen av celle- og organelledimensjoner (f.eks. mitokondrier), som utvider nytten av denne teknikken. Sunn cerebral perfusjon gjennom livet innebærer robust endotelfunksjon i parenchymale arterioler, som direkte knytter blodstrømmen til drivstoff av nevronal og glial aktivitet gjennom presise anatomiske regioner i hjernen. Dermed forventes det at denne metoden vil fremme den generelle kunnskapen om vaskulær fysiologi og nevrovitenskap angående den sunne og syke hjernen betydelig.
Introduction
Parenchymale arterioler leverer direkte essensiell oksygen og næringsstoffer i hele hjernen1. Mens interfacing med kapillærer, svært vasoaktive arterioler reagerer på retrograd signalering initiert av kapillær ion kanaler som føler metabolske signaler fra spesifikke nevronale regioner2. Med hjerneparenchyma som historisk har fått mesteparten av undersøkelsen, har det nå oppstått en rolle for endoteldysfunksjon for å avklare patologiske mekanismer forbundet med ulike cerebrovaskulære lidelser som ligger til grunn for demens (f.eks. iskemisk hjerneslag, Alzheimers sykdom)3,4,5,6 . Endotelet er integrert i perfusjon av hjernen i samsvar med heterogeniteten til genetikk, struktur og funksjon gjennom vaskulære segmenter7. Pial arterier har blitt grundig studert på grunn av deres relativt store størrelse, høy segmentell vaskulær motstand, og rolle i blodstrømsfordeling til underliggende cerebrum 8,9. Dermed vil en bedre forståelse av arteriolar endotelmekanismer sannsynligvis forbedre forståelsen av hjernens blodstrømsregulering i helse og sykdom mot utvikling av nye terapeutiske regimer.
Nye bevis fremhever viktigheten av å studere parenchymale arterioler i forhold til forskjellige signalveier og sykdommer 8,10. Denne tilnærmingen har imidlertid vært begrenset til bruk av intakte trykkarteriole11 og/eller kapillær-parenchymale arteriole (CaPA) preparater12. Nyisolerte, innfødte cerebral arteriolar endotelceller uten andre celletyper og forvirrende faktorer har ikke blitt undersøkt, sannsynligvis på grunn av tekniske vanskeligheter i isolasjonen. Dette papiret fremmer en tidligere teknikk som fremhever isolering av pial arteriell endotel13 for nå pålitelig og reproduserer endothelium av hjernen parenchymale arterioler (bredde: ~ 25 μm, lengde: ~ 250 μm). Denne teknikken bidrar til å oppnå optimal oppløsning av elektrisk og kjemisk koblede celler i deres individuelle orientering og mobilnettverk.
Viktige veier av interesse har inkludert samspillet mellom intracellulær Ca2+ ([Ca2+]i) signalering og hyperpolarisering av membranpotensialet (Vm)14,15 - integrert i vasodilatasjon16 - for å tillate blod å komme inn i kapillærene og levere oksygen og næringsstoffer til aktiv parenchyma17. Disse preparatene tillater sanntids elektrofysiologiske opptak av ionkanaler, inkludert Ca2 + permeant, forbigående reseptorpotensial (TRP) og K + kanaler og / eller fluorescerende avbildning av intracellulære organeller innen endotelale cellerør under nesten fysiologiske forhold. Dette er en egnet teknikk for forskere som er interessert i fysiologiske cellulære mekanismer som styrer endotelcellekontroll av cerebral blodstrømslevering til hjernens parenchyma. Til sammen vil denne teknikken hjelpe forskere til å bedre forstå grunnleggende endotelsignaleringsveier og nettverkskommunikasjon av arterioler innebygd i hjerneparenchyma mens de tar opp spørsmål relatert til cerebrovaskulær fysiologi og patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimenter bør sørge for at utpekt bruk av dyr og tilhørende protokoller godkjennes av deres Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og utføres i samsvar med National Research Councils "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (8th Edition, 2011) og ARRIVE-retningslinjene. IACUC ved Loma Linda University og University of Arizona har godkjent alle protokoller som brukes for dette manuskriptet for C57BL/6N- og 3xTg-AD-mus (menn og kvinner, aldersgruppe: 2-30 måneder). Se figur 1 som en oversikt over isolering og undersøkelse av arteriolar endotelrør som er fersk isolert fra hjernens parenchymale arterioler.
1. Materialer og utstyr
MERK: Se materialtabellen for alle reagenser og materialer som kreves for denne protokollen. I tillegg kan håndbøker og nettsteder knyttet til de respektive leverandørene også konsulteres etter behov. Illustrasjoner av disseksjonsstasjoner og eksperimentelle apparater er tidligere levert13.
- Strømningskammer
- Fest et superfusjonskammer med glassdeksler på en plattform som består av anodisert aluminium. Fest plattformen med kammeret på et mikroskoptrinn i aluminium.
- Sett en mikromanipulator som holder en pipette i hver ende av plattformen på aluminiumsmikroskopstadiet.
MERK: Bruk om nødvendig et overførbart sceneapparat med en strømningskammerenhet for å flytte et sikret, isolert endotelrør fra ett mikroskopapparat til et annet for eksperimentering.
- Mikroskop
- Bruk stereomikroskoper (5x til 50x forstørrelsesområde) og fiberoptiske lyskilder for disseksjonsprosedyrer.
- For isolering av endotelrør, bruk en invertert mikroskoprigg utstyrt med fasekontrast- eller differensialinterferenskontrast (DIC)-kompatible mål (10x, 20x og 40x) og et aluminiumsstadium.
- Ha en mikrosyringe pumpekontroller klar ved siden av apparatet dedikert til å isolere endotelrør fra delvis fordøyde blodkar.
- Sett opp det eksperimentelle apparatet ved å arrangere et invertert mikroskop (mål: 4x, 10x, 20x, 40x og 60x) og et manuelt aluminiumsstadium på et vibrasjonsisolasjonsbord.
- Intracellulært Vm opptaksutstyr
- Koble elektrometeret til et kompatibelt hodestempel. Bruk tilbehør, for eksempel en funksjonsgenerator og stimulator, til protokoller som krever gjeldende injeksjon.
- Koble forsterkerutganger til et data digitaliseringssystem, oscilloskop og hørbare basislinjemonitorer. Fest referansebadelektroden (Ag/AgCl pellet) nær avkjørselen til strømningskammeret.
- Sett sammen et fotometrisk system med integrerte komponenter i et fluorescenssystemgrensesnitt, høyintensitets lysbuelampe og strømforsyning, hyperbryter, fotomultiplierrør (eller PMT) og kamera for å måle [Ca2+]i i endotelceller.
- Monter en temperaturregulator utstyrt med en innebygd varmeapparat for å heve og opprettholde en fysiologisk temperatur (37 °C) gjennom hele eksperimentet.
- Monter en flerkanalsplattform koblet til en ventilregulator med en innebygd strømningsventil for å kontrollere levering av løsninger til endotelrør sikret i kammeret.
- Mikropipetter og skarpe elektroder
MERK: Eksperimentet trenger en elektronisk glasstrekker og en mikroforge for å forberede triturering og pinning pipetter.- For å skille endotelrøret fra det delvis fordøyde arteriolarsegmentet, lag varmepolerte triturasjonspipetter (innvendig spissdiameter: 30-50 μm) fra borosilikatglasskapillærer.
- For å sikre endotelrøret i superfusjonskammeret, lag varmepolerte pinningspipetter med en sløv, sfærisk ende (ytre diameter: 50-70 μm) fremstilt av tynnveggede borosilikatglasskapillærer.
- For å registrere Vm av en endotelcelle, lag skarpe elektroder med en spissmotstand på ~ 150 ± 30 MΩ fra glasskapillær bare ved hjelp av glasstrekkeren.
2. Løsninger og narkotika
- Fysiologisk saltoppløsning (PSS)
- Forbered minimum 1 L PSS ved hjelp av 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM N-2-hydroksyetylpiperazin-N'-2-etsulfonsyre (HEPES) og 10 mM glukose.
- Forbered nødvendige løsninger som mangler CaCl2 (null Ca2 + PSS) for disseksjon av cerebral arterioler og isolering av endotelrør.
MERK: Klargjør alle løsninger i ultrarent deionisert H2O, etterfulgt av filtrering (0,22 μm). Påse at sluttproduktet inneholder en pH 7,4 med osmolalitet mellom 290 og 300 mOsm.
- Bovine serumalbumin (BSA, 10%)
- Løs opp 1 g av det lyofiliserte BSA-pulveret i et beger på 10 ml null Ca2+ PSS. Dekk begeret og la minst 2 timer med langsom omrøring for BSA oppløses.
- Filterløsning ved hjelp av en 10 ml sprøyte pluss et 0,22 μm filter og lag 1 ml aliquots som skal lagres ved -20 °C.
- Disseksjonsløsning
- Tilsett 500 μL BSA (10 %) til 49,5 ml null Ca2+ PSS for et totalt volum på 50 ml.
- Overfør løsningen til en Petri-tallerken for arteriolar disseksjoner.
- Dissosiasjonsløsning
- Tilsett 5 μL CaCl2-oppløsning (1 M) og 500 μL BSA (10 %) til 49,5 ml null Ca2+ PSS for et totalt volum på 50 ml. Inkuber oppløsning ved romtemperatur i minst 1 time.
- Enzymer
- Forbered 1 ml fordøyelsesløsning med 100 μg/ml papain, 170 μg/ml dithioerythritol, 250 μg/ml kollagenase (Type H-blanding) og 40 μg/ml elastase.
MERK: Enzymaktiviteter kan variere, selv om vellykkede protokoller sannsynligvis vil kreve følgende enzymatiske aktiviteter: ≥ 10 enheter/mg for papain, ≥ 1 enhet/mg for kollagenase og ≥ 5 enheter/mg for elastase.
- Forbered 1 ml fordøyelsesløsning med 100 μg/ml papain, 170 μg/ml dithioerythritol, 250 μg/ml kollagenase (Type H-blanding) og 40 μg/ml elastase.
- Fura-2 og farmakologiske midler
- Forbered Fura-2 AM lager i dimetylsulfoksid (DMSO; 1 mM). Forbered 500 μL arbeidskonsentrasjon (10 μM) ved å tilsette 5 μL av lageret til 495 μL PSS for lasting.
- Forbered minst 50 ml arbeidskonsentrasjoner av farmakologiske midler i PSS eller DMSO etter behov.
- Gjennomføring av løsning
- Forbered 2 M KCl ved å oppløse KCl i deionisert H2O (7.455 g KCl i 50 ml H2O). Før oppløsningen gjennom en sprøyte med et filter på 0,22 μm før du fyller på de skarpe elektrodene igjen.
- Fluorescerende organelle trackere og antistoffer
- Forbered plasmamembran eller organellar (f.eks. kjerne, endoplasmisk retikulum) trackere i riktig fysiologisk saltløsning i henhold til produsentens instruksjoner.
- Forbered primære og sekundære antistoffer i henhold til produsentens instruksjoner i riktig fysiologisk saltoppløsning.
3. Disseksjon og isolering av musen cerebral arterioles
MERK: Stereomikroskoper og skjerpede mikrodeseksjonsverktøy (f.eks. finspissede tang, Vannas-stil disseksjonssaks) må brukes til prøveforstørrelse (opptil 50x) i alle disseksjonsprosedyrene.
- Isolering av musehjerne
- Bedøv en standard laboratoriemus (f.eks. C57BL/6, 3xTg-AD; 2-30 måneder gammel, mann eller kvinne) ved hjelp av isofluraninnånding (3% i 2-3 min), etterfulgt av umiddelbar halshugging ved hjelp av skarp saks eller giljotin per IACUC-godkjenning. Plasser musehodet i en Petri-tallerken (diameter 10 cm, dybde 1,5 cm) som inneholder kald (4 °C) disseksjonsløsning.
- Mens du ser under et stereomikroskop, fjern huden og håret over skallen og vask bort overdreven blod med kald disseksjonsløsning. Bruk spissene på standard disseksjonssaks (f.eks. 24 mm kniver), lag et snitt som starter med oksipitalt bein og strekker seg opp gjennom nesebenet på skallen. Bruk grovspisset tang for å forsiktig åpne skallen langs snittet, og separat bindevev (meningealmembran) for å isolere hjernen som inneholder en intakt Sirkel av Willis.
- Vask den isolerte hjernen med kald disseksjonsløsning i et beger eller Petri-tallerken for å fjerne gjenværende blod fra overflaten av hjernen. Plasser hjernens ventrale side vendt opp i et kammer som inneholder kald disseksjonsløsning for isolering av parenchymale arterioler (figur 2A).
- Isolering av parenchymale arterioler
MERK: Arterioles som oppstår fra de midterste cerebral arteriene (MCA) og innebygd i hjernen parenchyma er valgt for denne protokollen. Arteriolene er isolert som tidligere beskrevet11, med modifikasjon.- Bruk stålpinner (diameter: 0,2 mm, lengde: 11 til 12 mm) for å sikre den isolerte hjernen i kald disseksjonsløsning i en Petri-tallerken som inneholder et kulltilsatt silisiumpolymerbelegg (dybde ≥ 50 cm).
- Bruk skarp og justert disseksjonssaks, klipp et rektangel av hjernevev (lengde: 5 mm, bredde: 3 mm) (figur 2B) rundt MCA, samtidig som du sikrer at den øvre delen av vevssegmentet er forbi forgreningspunktet fra Willis sirkel. Klipp et annet rektangel av hjernevev fra den andre halvkule av hjernen for å få tilgang til flere arterioler om nødvendig.
- Fest det separerte hjernevevsegmentet i parabolen med MCA vendt oppover (distal fra Willis-sirkelen) ved hjelp av stålpinner (diameter: 0,1 mm, lengde: 13 til 14 mm). Lag forsiktig et grunt snitt nær pinnene for å fjerne pia med små tang, forsiktig peeling fra den ene enden mot den andre (figur 2C). Fjern pia fra det andre vevssegmentet for å få tilgang til flere arterioler om nødvendig. Fest forsiktig den isolerte piaen med parenchymale arterioler forgrenet fra MCA i parabolen med pinnene, og disseker de parenchymale arteriolene (figur 2D), og sørg for at arteriolene ikke blir skadet.
MERK: Hvis arteriolene ikke lett trekkes ut med pia fra parenchyma, bruk fine tang og grav inn i hjernen, fra MCA-grenpunktet fra Willis-sirkelen. Finn arteriolen, løsne forsiktig vevet rundt arterioler (figur 2E), og trekk arterien forsiktig ut av parenchymaen, hold den øvre enden av arteriolen (figur 2F). Flere arterioler (lengde: ~ 1,5-2 mm) kan isoleres fra ett rektangel av hjernevev. - Sørg for at arteriolen er ren uten vev festet til den, og kutt av eventuelle gjenværende distale grener (figur 3A). Bruk denne rene, intakte arteriolen for enzymatisk fordøyelse. Alternativt kan du kutte hver arteriole i to stykker (lengde: 0,75-1 mm) for enzymatisk fordøyelse for fremstilling av endotelrør om ønskelig.
4. Fordøyelse av parenchymale arterioler og fremstilling av endotelrør
- Arrangement av utstyr og pipetter
MERK: Isolering av arterielle endotelrør fra hjernen er beskrevet tidligere13,18. Den nåværende protokollen inkorporerer modifikasjoner for isolering av endotel fra parenchymale (intracerebral) arterioler. Flere arterioler eller/og biter av arterioler kan brukes sammen for enzymatisk fordøyelse.- Monter triturasjonsapparatet13 for å forberede endotelrør ved hjelp av et aluminiumstrinn som støtter et kammer og mikromanipulatorer. Sett sammen et mikroskop utstyrt med mål (5x-60x) og et kamera koblet til en dataskjerm. Sikre en mikrosyringe med en pumperegulator ved siden av scenen og prøven.
- Sikre en triturasjonspipette fylt med mineralolje over mikrosyringestempelet. Bruk mikrosyringen med pumpekontrolleren til å trekke dissosiasjonsløsningen inn i triturasjonspipetten (~130 nL) på toppen av mineraloljen mens du må passe på å unngå luftbobler i pipetten.
- Delvis fordøyelse av arteriolarsegmenter
- Plasser intakte arteriolarsegmenter i 1 ml dissosiasjonsløsning i et 10 ml glassrør som inneholder 100 μg/ml papain, 170 μg/ml dithioerythritol, 250 μg/ml kollagenase og 40 μg/ml elastase. Inkuber arteriolarsegmenter ved 34 °C i 10–12 minutter.
- Etter fordøyelsen, erstatt enzymoppløsningen med 3-4 ml frisk dissosiasjonsløsning ved romtemperatur.
- Isolering av arteriolar endotelrør
MERK: Etter fordøyelsen og utskiftingen av enzymoppløsningen, overfør ett eller flere delvis fordøyde segmenter til dissosiasjonsløsningen i et superfusjonskammer festet til en mobil plattform. Mens du ser på 100x til 200x forstørrelse, velg en delvis fordøyd, men ubrutt fartøysegment og fokuser på det under mikroskopet.- Plasser triturasjonspipetten festet med mikrosyringinjektoren i dissosiasjonsløsningen i kammeret og plasser den nær den ene enden av det fordøyde karsegmentet. Still inn en hastighet innenfor området 1-3 nL/s på pumpekontrolleren for skånsom trianturering.
- Mens du opprettholder 100x til 200x forstørrelse, trekk arteriolar segmentet inn i pipetten og deretter kaste ut for å dissosiere adventitia og glatte muskelceller (figur 3B). Triturer karsegmentet til alle glatte muskelceller er dissosiert, og bare endotelceller forblir som et intakt "rør".
MERK: Bruk om nødvendig finspissede tang under trianturering for å fjerne den dissosierte adventitiaen og den indre elastiske laminaen fra endotelrøret. Vanligvis gir bare noen få sykluser med triturasjon et intakt endotelrør. - Bruk mikromanipulatorer til å feste hver ende av endotelrøret på glassdekslene i kammeret med borosilikatglasspinnepipetter (figur 3C,D).
- Sikring av arteriolar endotelrør
- Bytt ut dissosiasjonsløsningen med superfusjonsløsning (PSS som inneholder 2 mM CaCl2) samtidig som du sikrer at ikke-permanent materiale vaskes ut av kammeret.
- Overfør sikret endotelrør i den mobile plattformen til mikroskopriggen designet for kontinuerlig superfusjon og intracellulære eller fluorescerende opptak / avbildning.
- Påfør kontinuerlig levering av PSS under eksperimentet. Still inn strømningshastigheten manuelt (5-7 ml/min) gjennom hele eksperimentet ved hjelp av den innebygde strømningsventilen, i samsvar med laminærstrømmen, samtidig som den samsvarer med oppløsningsstrømmens fôr i omfanget av vakuumsuging. La ≥5 min PSS-strømning til kammeret for superfusjon av endotelrøret før du skaffer bakgrunnsdata og / eller fargestoffbelastning.
5. Utnyttelse av arteriolar endotelrør for undersøkelse av cellulær fysiologi
MERK: Isolerte og sikrede arteriolar endotelrør kan brukes til intracellulære opptak av [Ca2+]i dynamikk og Vm ved hjelp av henholdsvis fotometri og skarp elektrodeelektrofysiologi, som tidligere illustrert13 (figur 4). [Ca. 2+] i og Vm kan måles som separate eller kombinerte eksperimentelle variabler etter behov13 (figur 4). Imidlertid er arteriolar endotelrør mer delikate enn arteriell endotel, og eksperimenteringstiden bør ikke overstige 1 time.
- Måling av [Ca2+]i
- Slå på utstyret og programvaren for [Ca2+]i-opptak , samtidig som kontinuerlig superfusjon opprettholdes med en strømningshastighet på 5-7 ml/min.
- Legg endotelrøret med Ca2+ fargestoffet Fura-2 AM i 30 minutter ved romtemperatur. Vask cellene med superfusjonsløsning i ytterligere 20-30 min mens du gradvis øker badetemperaturen til 37 °C. Opprettholde temperaturen ved 37 °C gjennom hele eksperimentet.
- Juster bildevinduet manuelt ved hjelp av fotometriprogramvare for å fokusere på ~20 endotelceller (figur 4A). I mangel av lys, snu PMT på fluorescensgrensesnittet og begynn oppkjøpet av [Ca2 +]i av spennende Fura-2 vekselvis (≥10 Hz) ved 340 nm og 380 nm mens du samler fluorescensutslipp ved 510 nm. Når en stabil basislinjeregistrering av [Ca2+]i er etablert, bruk farmakologiske midler (f.eks. purinergiske reseptoragonister) per eksperimentelt mål (figur 4B).
- Måling av Vm
- Slå på utstyret og programvaren for Vm-opptak og angi datainnsamlingshastigheten (≥10 Hz) samtidig som du opprettholder kontinuerlig superfusjon med en strømningshastighet på 5-7 ml / min. Øk badetemperaturen gradvis til 37 °C og oppretthold den til slutten av eksperimentet.
- Trekk en skarp elektrode ved hjelp av en borosilikatglasskapillær, fyll på med 2 M KCl, og fest den over en sølvtråd belagt med klorid i pipetteholderen festet til et elektrometer, som igjen holdes av en mikromanipulator.
- Mens du ser gjennom 4x-målet, bruk en mikromanipulator for å forsiktig plassere den skarpe elektrodespissen like over en celle i arteriolar endotelrøret inn i den flytende PSS i kammeret.
- Øk forstørrelsen gradvis til 400x og omplasser elektrodespissen etter behov.
- Bruk mikromanipulatoren til å sette spissen av en skarp elektrode forsiktig inn i en av cellene i endotelrøret og begynn å registrere Vm ved hjelp av et elektrometer (figur 4A).
- Når endotel hvile Vm er stabil (−30 til -40 mV), bruk de ønskede farmakologiske midlene i henhold til eksperimentelt mål (figur 4C).
6. Mobilbilder
MERK: Endotelrør som er festet i kammeret på mobilplattformen, kan også brukes til mikroskopisk avbildning under både levende og faste forhold19 ved hjelp av standard fluorescens eller konfektmikroskopi. Immunhiistokjemi med ulike antistoffer mot reseptorer og ionkanaler kan også brukes som tidligere beskrevet20.
- Last endotelrøret med fluorescenssporeren for plasmamembranen eller ønsket organell (f.eks. kjerne, endoplasmisk retikulum) ved 37 °C i 15–30 minutter.
- Vask cellene med fersk superfusjon PSS og bilde levende celler under mikroskopet ved eksitasjon bølgelengden av respektive fargestoffer (Figur 4D, E).
MERK: Immunhiistokjemi kan utføres på denne rørmodellen ved hjelp av antistoffer av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En demonstrasjon av protokollen er vist i figur 1 med arteriell disseksjon og endotelrørisolasjonstrinn som henholdsvis figur 2 og figur 3. Her ble endotelfunksjon vurdert ved å måle [Ca2+]i og Vm ved hjelp av Fura-2 fotometri og skarp elektrodeelektrofysiologi (figur 4A) som svar på et farmakologisk middel [2-metylthioadenosin difosfat (MTA), en potent purinergisk reseptor (P2YR) agonist] ved 37 °C. Ved påføring av MTA (1 μM) øker [Ca. 2+]i raskt (figur 4B) med samtidig hyperpolarisering (figur 4C). Disse målingene er en refleksjon av aktiveringen av G q-protein-koblede reseptorer (P2YRs) etterfulgt av aktivering av små- og mellomledning Ca2 +-aktiverte K + kanaler (SKCa / IKCa), som starter en endotelavhengig hyperpolarisering (EDH) vasodilaterende bane. Endothelium isolert fra en parenchymal arteriole er derfor funksjonell isolert og kan brukes til å studere viktige komponenter i veier som involverer mobilisering av [Ca2+]i og/eller regulering av Vm via K+ kanaler.
Videre ble det intakte endotelet inkubert ved 37 °C med fluorescerende trackere for visualisering for å undersøke cellulær morfologi. Levende endotelcelleavbildning viser samtidig farging for plasmamembran (grønn) og kjerner (rød) (figur 4D). I figur 4E ble plasmamembranen (grønn) farget sammen med en endoplasmisk retikulum (ER; rød) fluorescerende flekk, der områder med tilsynelatende overlapping av ER i nærheten av plasmamembranen vises oransje (figur 4E). Disse fluorescerende bildene avslører videre den cellulære integriteten til arteriolar endotel og deres mulige bruk for å studere signalmikrodomener som ligger ved koblingsmembrankomplekser.
Figur 1: Undersøkelse av arteriolar endotelrør ferskt isolert fra musen parenchymal arteriole. Som avbildet er hjernen isolert fra en mus, og et stykke rektangulært hjernevev som inneholder MCA ble fjernet. Parenchymale arterioler som forgrener seg fra MCA og går inn i hjernen parenchyma er isolert. Arterioles er enzymatisk fordøyd og triturert, og produserer et intakt endotelrør for studier. Det forberedte endotelrøret muliggjør måling av intracellulær Ca2+ dynamikk og Vm , samtidig som det muliggjør cellulær avbildning for fluorescensavbildning og immunhiistokjemi. Forkortelser: MCA = midterste cerebral arterie; Vm = membranpotensial. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Disseksjon og isolering av parenchymale arterioler. (A) Isolert musehjerne med intakt Sirkel av Willis. (B) Et dissekert rektangulært stykke hjernevev som inneholder MCA (hvit pil). (C) Isolering av pia fra den øvre delen av vevet (arteriole, blå pil). (D) Arterioles (skissert med blå pilspisser) koblet til midtre cerebral arterier (gule piler). (E) Identifisert arteriole (blå pil) i hjernevevet. (F) Trekke ut arteriolen (blå pil) fra det løsnede vevet. Merk at panelene E og F indikerer en alternativ metode for isolering av arteriolen (se protokolltrinn 3.2.3). Skalastenger = 2 mm (A, B, C), 0,2 mm (D) og 1 mm (E,F). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fremstilling av endotelrør fra parenchymale arterioler. (A) Isolert og ren arteriole (blå pil). (B) Triturering av delvis enzymfordøyd arteriole. (C) Intakt endotelrør (forstørrelse: 100x) klargjort og festet på glassdekslene ved hjelp av festepipetter. (D) Endotelrør ved 200x forstørrelse. Skalastenger = 0,2 mm (A), 0,1 mm (B, C) og 0,05 mm (D). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Påføring av endotelrør for fysiologisk undersøkelse av veier relatert til blodstrømsregulering. (A) En skarp elektrode (lilla pil) er plassert i en celle i et endotelrør fokusert i datainnsamlingsvinduet for fotometri. (B) Representativ opptak av intracellulær Ca2+ ved bruk av Fura-2 fotometri som svar på MTA (1 μM). (C) Representativ opptak av Vm samtidig med intracellulær Ca2+ spor i panel B. (D) Representativt bilde av plasmamembran (grønn) og kjerner (rød) av levende endotelceller farget med fluorescerende fargestoffer. (E) Representativt bilde av plasmamembran (grønn) og endoplasmisk retikulum (ER, rød) av levende endotelceller farget med fluorescerende fargestoffer. Områder av nærhet for ER og plasmamembran er indikert i oransje. Bilder ble anskaffet ved hjelp av et monokrom kamera og var pseudofarget. Skalastenger = 20 μm (D), 10 μm (E). Forkortelser: MTA = 2-metylthioadenosin difosfat; F340/F380 = Fura-2 fargeforholdssignal; Vm = membranpotensial; PM = plasmamembran; ER = endoplasmisk retikulum. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Økende bevis tyder på at cerebrovaskulær sykdom (CVD), aldring og Alzheimers sykdom er sterkt korrelert og er et aktuelt tema for demensforskning 4,8,14,21. Dermed er det åpenbart at studier av det cerebrovaskulære nettverket vil ha stor innvirkning på helsen samtidig som det krever fortsatt omfattende undersøkelse under sykdomstilstander. Som et betydelig punkt av vaskulær motstand for cerebral perfusjon, har den generelle betydningen av parenchymale arterioler i etiologien og utviklingen av CVD blitt fremhevet i over 50 år22.
Imidlertid er vitenskapelige undersøkelsesverktøy ikke tilstrekkelig utviklet for å studere intakte parenchymale arterioler og deres sammensatte celletyper før den nylige utbruddet av ex vivo nærmer seg som de isolerte, trykksatte parenchymale arteriolen11 og CaPA12-preparatene . Det cerebrovaskulære fysiologifeltet vil også dra nytte av komplementære teknikker i homocellulære studiemodeller (glatt muskel, pericytter og endotel) for å fokusere på spesifikke celletyper og deres genetiske og farmakologiske egenskaper som ligger til grunn for cerebral blodstrømsregulering og blod-hjernebarriere (BBB) permeabilitet.
Endotelet er et sentralt reguleringsorgan som "mater" alle andre organer i hele kroppen, inkludert hjernen23. Selv om alle vaskulære segmenter (arterier, arterioler, kapillærer, venuler, årer) er avgjørende for cerebral perfusjon, krever endotelet av arterioler dedikert undersøkelse som en sentral komponent for cerebrovaskulær autoregulering og nevrovaskulær kobling24. Videre ser ca2 + signalering25 og K + kanalaktivitet17,26 ut til å bli forbedret under regulering av myogen tone i parenchymale arterioler i forhold til pial arterier. Dermed har vi nå utvidet den tidligere etablerte metoden for pial cerebral arterier (posterior)13 til parenchymale arterioler.
I forhold til disse tidligere illustrerte tilnærmingene11,13 ble denne protokollen raffinert ved empirisk justering av ulike trinn (f.eks. enzymatisk behandling, triturasjon) for å reprodusere intakte endotelrør fra parenchymale arterioler. I tillegg viser denne protokollen bruken av denne studiemodellen for å optimalisere anvendelsen av cellulær fotometri, elektrofysiologi og fluorescerende avbildning (figur 4). Med generelle styrker og begrensninger av Fura-2 fotometri og skarp elektrode elektrofysiologi tidligere beskrevet i detalj13, oppfordres eksperimentet til å prøve en rekke andre Ca2 + signalering og ionkanalanalyser for å teste spesifikke hypoteser av interesse. Videre kan fremskritt og generering av nye genetiske modeller med endotelcellespesifikke genetisk kodede indikatorer (f.eks. [Ca2+]i27 og spenning28-indikatorer) utvide nytten av dette preparatet.
For undersøkende kontekst er denne isolerte endotelmodellen nyttig for forskningsspørsmål som krever å studere arteriolar endotelets rolle i regulering av vaskulær dynamikk, hvorved en ansiktsmålinger ikke er eksperimentelt gjennomførbare på grunn av deres lille størrelse. Endotelregulering av cerebral blodstrøm begynner med aktivering av ulike G-proteinkoblede reseptorer (f.eks. purinergisk, muskarinisk)18 og ionkanaler (TRPV329, TRPA15,NMDA-reseptorer 8). Aktivering av Gq-type reseptorer innebærer fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat (PIP2) lipolyse for å generere inositoltrisporosfat (IP3) og diacylglycerol for [Ca2+]i mobilisering som deretter kan megle K + kanalaktivering for endringer i Vm15. K + kanalaktivitet, og dermed Vm alene, kan også studeres direkte under fysiologiske forhold2 eller via utvalgte farmakologiske målretting30. Videre muliggjør arteriolar endotelrøret forbedret fluorescerende visualisering av ombygging av utvalgte plasmamembraner (f.eks. filipin-III), intracellulære organeller (f.eks. ER-tracker) og celle-til-celle-kobling (f.eks. propidiumjodid)18,19. Dermed innebærer en annen funksjon av studiemodellen effektiv sammenkobling av cellulær morfologi og histologi med funksjonsparametere, som Ca2+ og elektrisk signalering, i aldring og utvikling av kroniske sykdommer.
Komponentene i protokollen som fortjener spesiell oppmerksomhet er arteriolar disseksjon, enzymatisk fordøyelse, triturasjon og sikring av arteriolar endotelrøret for målinger. Under disseksjon fra hjernen bør skade på parenchymal arteriole unngås for enhver pris for å sikre vellykket fordøyelse og trianturasjon for å isolere et intakt og funksjonelt endotellag. Videre vil overdreven strekking mens du sikrer endotelrøret i perfusjonskammeret også ødelegge preparatet, og effektivt alle tidligere protokolltrinn.
Levedyktighetstester bør brukes for å sikre at arteriolar endotelialrør er funksjonelle med hensyn til viktige fysiologiske komponenter som Ca2+ signalering (tilstrømning og / eller intracellulær frigjøring) etter stimulering av G-proteinkoblede reseptorer, omfanget av Vm hyperpolarisering og robust intercellulær kobling gjennom gapkryss18,23. Eksempler på slike kontroller inkluderer reversibel purinergisk stimulering ved hjelp av MTA (1 μM; Δ [Ca2+]i ~ 300 nM; ≥10 mV hyperpolarisering; Figur 4B,C), reversibel SKCa/IKCa-aktivering ved hjelp av NS309 (1 μM; ≥20 mV hyperpolarisering) og/eller korrespondanse mellom gjeldende injeksjon (f.eks. ~-1 nA) i én celle og Vm svar (~-10 mV) av en annen i en avstand på ≥250 μm18,31. Med praksis, omsorg og eksperimentell strenghet er hele protokollen reproduserbar hvis eleven har tålmodighet og utholdenhet.
Denne metoden har viktige begrensninger å ta tak i, for eksempel utilstrekkelig overflod av prøver (f.eks. nukleinsyrer, proteiner og lipider) og relativ skjørhet for henholdsvis biokjemiske eksperimenter og live-celleopptak. Denne molekylærbiologiske advarselen kan imidlertid unngås ved å samle seg fra flere dyr og/eller utarbeide kvantitetsmetoder med høyere følsomhet og gjennomstrømning. Hvis den fysiologiske temperaturen skal opprettholdes ved 37 °C, vil korte eksperimentelle tidsrammer (≤1 t) bare være nødvendig med fokuserte farmakologiske intervensjoner. I tillegg ville det være ekstremt utfordrende å isolere arteriolar endotelrør fra nær-sikt eller nyfødte (<1 måneder gamle) dyr, potensielt utelukke studier av cerebral vaskulær utvikling.
Andre hensyn omfatter den nøyaktige sammensetningen av cerebral vaskulære endotelrør, som potensielt krever utvalgte tilnærminger til immunfluorescens og elektrofysiologi. For eksempel går kjellermembranen (bestående hovedsakelig av kollagen IV, laminin og fibronectin) langs hjernevaskulært tre. Det er kjent for sitt bidrag til integriteten til BBB dannet av hjernekapillære endotelceller32. Det skal bemerkes at denne studiemodellen kanskje ikke passer for BBB-permeabilitetseksperimenter, da kjellermembrankomponenter er substrater av enzymcocktailen som brukes til delvis fordøyelse av arteriolar endotelrør, spesielt kollagenase H-blandingen. Videre, anvendelse av en selektiv enzymcocktail, fjerning av den indre elastiske lamina, og klar identifisering av endotelceller per struktur (parallelt arrangement vs. omkrets for glatte muskelceller), morfologi ("teardrop" form av endotelceller vs. spindelformede glatte muskelceller), og elektrofysiologi (f.eks. hyperpolarisering til GPCR-stimulering), eliminerer fysiologiske bidrag av glatte muskelceller og pericyr. Til slutt må eksperimentatoren notere seg endotelcelle heterogenitet (genuttrykksprofil, struktur, funksjon) per organtype (f.eks. hjerne, hjerte, lunge33) i tillegg til hjerneregionen (f.eks. cortex 9,34, hippocampus10) og respektive vaskulær segmentering (f.eks. arterier, arterioler og kapillærarterier 9,34,35 ). Dermed vil en omfattende studie av cerebral blodstrømsregulering også kreve komplementær ex vivo (f.eks. intravaskulær trykkmiologi, kapillær-parenchymal arteriell forberedelse) og in vivo (f.eks. intracerebral Laser Doppler) tilnærminger av intakte vaskulære segmenter og nettverk.
Oppsummert presenterer dette papiret en avansert teknikk som demonstrerer hvordan du forbereder et intakt endotelrør som er ferskt isolert fra musehjernen parenchymale arterioler. Vi forventer at denne tilnærmingen vil utfylle og/eller bygge fra in vivo og intakte vaskulære studiemodeller. Det overordnede målet er å generere ny informasjon for å forstå mekanismer som underbygger cerebral blodstrøm på grunnleggende nivå for fysiologi og velge overganger mot patologi for terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskningen har blitt støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (R00AG047198 &R56AG062169 til EJB; R00HL140106 til PWP) og Alzheimers forening (AZRGD-21-805835 til PWP). Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health eller Alzheimers Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
| Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
| Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
| Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
| Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
| NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
| Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |
References
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Kelleher, R. J., Soiza, R. L. Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder. American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium. Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).
- Pires, P. W., Earley, S. Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke. elife. 7, 35316 (2018).
- Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease. Function. 2 (2), (2021).
- Zhao, L., et al. Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain. Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).
- Peters, E. C., et al. Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease. Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).
- Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).
- Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex. Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).
- Behringer, E. J., Hakim, M. A. Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).
- Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice. Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).
- Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).
- Attems, J., Jellinger, K. A. The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology. BMC Medicine. 12, 206 (2014).
- Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).
- Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Chen, Y. L., et al. Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice. Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).
- Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators. Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).
- Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).
- Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain. Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. elife. 9, 51413 (2020).
- Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).
- Chen, M. B., et al. Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues. Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).
