Summary
来自脑实质小动脉的完整小鼠脑内皮“管”的强化制备用于研究脑血流调节。此外，我们证明了这种内皮研究模型在荧光成像和关键细胞信号通路的电生理学测量方面的实验优势，包括细胞内[Ca2 +]和膜电位的变化。
Abstract
脑血流通过血管阻力动脉和下游实质小动脉输送。稳态血管对血流的阻力随着从动脉到最终进入毛细血管的小动脉直径减小而增加。由于它们在实质中较小的尺寸和位置，小动脉的研究相对不足，并且与表皮动脉相比，其结果的可重复性较低。无论如何，小动脉内皮细胞结构和功能是慢性退行性疾病生理学和病因学不可或缺的一部分，需要广泛的研究。特别是，新出现的证据表明，内皮功能受损先于并加重认知障碍和痴呆。
在实质微循环中，内皮K+ 通道功能是精细控制血管舒张扩散以促进流向神经元活动区域血流的增加的最强大的刺激。本文说明了一种从小鼠脑实质小动脉中新鲜分离完整和电耦合的内皮“管”（直径，〜25μm）的改进方法。在生理条件下（37°C，pH 7.4）固定小动脉内皮管，以解析包含K + 通道功能及其调节的实验变量，包括细胞内Ca2 + 动力学，膜电位变化和膜脂质调节。与动脉内皮相比，一个明显的技术优势是增强了细胞和细胞器（例如线粒体）尺寸的形态学分辨率，这扩大了该技术的实用性。终生健康的脑灌注需要实质小动脉的强大内皮功能，直接将血液流动与大脑精确解剖区域的神经元和神经胶质活动提供燃料联系起来。因此，预计这种方法将显着推进有关健康和患病大脑的血管生理学和神经科学的一般知识。
Introduction
实质小动脉直接在整个大脑中输送必需的氧气和营养物质1.在与毛细血管连接时，高度血管活性的小动脉对由毛细血管离子通道启动的逆行信号作出反应，这些通道感知来自特定神经元区域的代谢信号2。由于脑实质历来接受了大部分研究，内皮功能障碍在阐明与痴呆症（例如缺血性卒中，阿尔茨海默病）相关的各种脑血管疾病（例如缺血性卒中，阿尔茨海默病）的病理机制方面已经出现的作用3，4，5，6.内皮是大脑灌注的组成部分，符合整个血管节段的遗传学，结构和功能的异质性7。Pial动脉由于其相对较大的尺寸，高节段血管阻力以及在向下层大脑的血流分布中的作用8，9，已被广泛研究。因此，更好地了解小动脉内皮机制可能会增强对健康和疾病中脑血流调节的理解，以开发新的治疗方案。
新出现的证据强调了研究实质小动脉与不同信号通路和疾病的关系的重要性8，10。然而，这种方法仅限于使用完整的加压小动脉11 和/或毛细血管 - 实质小动脉（CaPA）制剂12。尚未检查新鲜分离的天然脑小动脉内皮细胞，这可能是由于分离的技术困难。本文推进了先前的技术，突出了pial动脉内皮13 的分离，现在可靠且可重复地分离脑实质小动脉的内皮（宽度：〜25μm，长度：〜250μm）。该技术有助于在电耦合和化学耦合细胞的个体方向和细胞网络中实现最佳分辨率。
感兴趣的关键途径包括细胞内Ca2 +（[Ca2 + ]i）信号传导和膜电位（Vm）14，15的超极化 - 血管舒张16的组成部分 - 允许血液进入毛细血管并将氧气和营养物质输送到活动性实质17。这些制剂允许对离子通道进行实时电生理学记录，包括Ca2 +通透性，瞬时受体电位（TRP）和K +通道和/或在近生理条件下内皮细胞管内细胞器的荧光成像。对于对控制内皮细胞控制脑血流输送到脑实质的生理细胞机制感兴趣的研究人员来说，这是一种合适的技术。总而言之，这项技术将帮助研究人员更好地了解嵌入脑实质的小动脉的基本内皮信号通路和网络通信，同时解决与脑血管生理学和病理学相关的问题。
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Protocol
实验人员应确保动物的指定使用和相关协议得到其机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并按照国家研究委员会的“实验动物护理和使用指南”（第 8版，2011年）和ARRARD指南进行。Loma Linda大学的IACUC和亚利桑那大学已经批准了用于C57BL / 6N和 3xTg-AD 小鼠（雄性和雌性;年龄范围：2-30个月）的所有手稿方案。参见 图1 作为从小鼠脑实质小动脉新鲜分离的小动脉内皮管的分离和检查的概述。
1. 材料和设备
注：参见 材料表， 了解本方案所需的所有试剂和材料。此外，还可以根据需要查阅与相应供应商相关的手册和网站。解剖站和实验装置的插图先前已提供13。
- 流动室
- 用玻璃盖玻片将超聚变室固定在由阳极氧化铝组成的平台上。将带有腔室的平台固定在铝制显微镜载物台上。
- 在铝显微镜载物台上，在平台的两端设置一个显微操作器，固定一个固定移液器。
注意：如有必要，请使用带有流动室单元的可转移载物台设备将安全，隔离的内皮管从一个显微镜设备移动到另一个显微镜设备进行实验。
- 显微镜
- 使用立体显微镜（5x至50x放大倍率范围）和光纤光源进行解剖手术。
- 为了隔离内皮管，请使用配备相差或差分干涉对比（DIC）兼容物镜（10x，20x和40x）和铝载物台的倒置显微镜装置。
- 在专用于将内皮管与部分消化的血管隔离的装置旁边准备好一个微量注射器泵控制器。
- 通过在隔振台上布置倒置显微镜（物镜：4x，10x，20x，40x和60x）和手动铝载物台来设置实验装置。
- 细胞内Vm 记录设备
- 将静电计连接到兼容的头台。使用附件（如函数发生器和激励器）进行需要电流注入的协议。
- 将放大器输出连接到数据数字化仪系统、示波器和可听基线监视器。将参比浴电极（Ag/AgCl 沉淀）固定在流动室出口附近。
- 组装一个光度测量系统，其中包含荧光系统接口，高强度弧光灯和电源，超开关，光电倍增管（或PMT）和相机的集成组件，以测量内皮细胞中的[Ca2 + ]i 。
- 组装一个配备在线加热器的温度控制器，以在整个实验过程中提高并保持生理温度（37°C）。
- 组装一个连接到阀门控制器的多通道平台，带有在线流量控制阀，以控制溶液向固定在腔室中的内皮管的输送。
- 微量移液器和尖锐电极
注意：实验者将需要一个电子玻璃拉拔器和一个微锻造机来准备研磨和固定移液器。- 为了将内皮管与部分消化的小动脉段分离，从硼硅酸盐玻璃毛细管中制备热抛光研磨移液管（内尖直径：30-50μm）。
- 为了将内皮管固定在超融合室中，制备由薄壁硼硅酸盐玻璃毛细管制备的钝球形末端（外径：50-70μm）的热抛光销式移液器。
- 为了记录内皮细胞的Vm ，仅使用玻璃拉拔器从玻璃毛细管制备尖端电阻约为150±30 MΩ的尖锐电极。
2. 解决方案和药物
- 生理盐溶液
- 使用140mM NaCl，5mM KCl，2 mM CaCl2，1 mMMgCl 2，10 mM N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸（HEPES）和10mM葡萄糖制备至少1 L PSS。
- 准备缺乏CaCl2 （零Ca2 + PSS）的必要溶液，用于解剖脑小动脉和隔离内皮管。
注意：在超纯去离子H2O中制备所有溶液，然后过滤（0.22μm）。确保最终产品的pH值为7.4，渗透压在290至300 mOsm之间。
- 牛血清白蛋白（BSA，10%）
- 将1克冻干BSA粉末溶解在10mL零Ca2 + PSS的烧杯中。盖上烧杯，缓慢搅拌至少2小时，使BSA溶解。
- 使用10 mL注射器加0.22μm过滤器过滤溶液，并制备1mL等分试样以储存在-20°C。
- 解剖液
- 将 500 μL BSA （10%） 加入 49.5 mL 零 Ca2+ PSS 中，总体积为 50 mL。
- 将溶液转移到培养皿中进行小动脉夹层。
- 解离解决方案
- 将5μL氯化钙2溶液（1 M）和500μLBSA（10%）加入49.5mL零Ca2 + PSS中，总体积为50mL。将溶液在室温下孵育至少1小时。
- 酶
- 用100μg/ mL木瓜蛋白酶，170μg/ mL二硫代赤藓糖醇，250μg/ mL胶原酶（H型混合物）和40μg/ mL弹性蛋白酶制备1mL消化溶液。
注意：酶活性可能会有所不同，尽管成功的方案可能需要以下酶活性：木瓜蛋白酶≥10单位/mg，胶原酶≥1单位/mg，弹性蛋白酶≥5单位/mg。
- 用100μg/ mL木瓜蛋白酶，170μg/ mL二硫代赤藓糖醇，250μg/ mL胶原酶（H型混合物）和40μg/ mL弹性蛋白酶制备1mL消化溶液。
- 呋喃-2和药理剂
- 在二甲基亚砜（DMSO;1 mM）中制备Fura-2 AM储备。通过将5μL储备液加入495μLPS中以加载来制备500μL工作浓度（10μM）。
- 根据需要准备至少50 mL工作浓度的PSS或DMSO中的药理剂。
- 传导解决方案
- 通过将KCl溶解在去离子的H2O中（7.455g KCl在50mL H 2 O中）来制备2MKCl。在回填尖锐电极之前，将溶液通过带有0.22μm过滤器的注射器。
- 荧光细胞器跟踪仪和抗体
- 根据制造商的说明，在适当的生理盐水溶液中制备质膜或有机体（例如，细胞核，内质网）跟踪器。
- 根据制造商的说明在适当的生理盐溶液中制备一抗和二抗。
3.小鼠脑小动脉的解剖和分离
注意：在所有这些解剖手术中，必须使用立体显微镜和锐化显微切割工具（例如，细尖镊子，Vannas式解剖剪刀）进行标本放大倍率（高达50倍）。
- 小鼠大脑的隔离
- 使用吸入异氟醚（3%，持续 2-3 分钟）麻醉标准实验室小鼠（例如 C57BL/6， 3xTg-AD;2-30 个月大，男性或雌性），然后根据 IACUC 批准，使用锋利的剪刀或断头台立即斩首。将小鼠头置于含有冷（4°C）解剖溶液的培养皿（直径10厘米，深度1.5厘米）中。
- 在立体显微镜下观察时，去除颅骨上的皮肤和毛发，并用冷解剖液冲洗掉多余的血液。使用标准解剖剪刀的尖端（例如，24 mm刀片），从枕骨开始，通过颅骨的鼻骨向上延伸，做一个切口。使用粗尖端的镊子沿着切口小心地打开颅骨，并分离结缔组织（脑膜）以分离含有完整威利斯环的大脑。
- 在烧杯或培养皿中用冷解剖溶液清洗分离的大脑，以清除大脑表面残留的血液。将脑腹侧朝上放置在含有冷解剖溶液的腔室中，以隔离实质小动脉（图2A）。
- 实质小动脉的分离
注意：该方案选择由大脑中动脉（MCAs）引起并嵌入脑实质中的小动脉。如前所述11分离小动脉，并进行修改。- 使用钢针（直径：0.2毫米，长度：11至12毫米）将分离的大脑固定在含有注入木炭的硅聚合物涂层（深度≥50厘米）的培养皿中的冷解剖溶液中。
- 使用锋利且对齐的解剖剪刀，在MCA周围切割一个矩形的脑组织（长度：5 mm，宽度：3 mm）（图2B），同时确保组织段的上部超过威利斯圆的分支点。如有必要，从大脑的另一半球切下另一个矩形脑组织，以进入更多的小动脉。
- 使用钢销（直径：0.1 mm，长度：13至14 mm）将分离的脑组织段固定到培养皿中，MCA朝上（威利斯圆的远端）。小心地在针脚附近做一个浅切口，用小镊子去除pia，从一端向另一端轻轻剥离（图2C）。如果需要，从其他组织段取出软脑膜以进入更多小动脉。用针在培养皿中小心地用从MCA分支的实质小动脉小心地固定孤立的pia，并解剖实质小动脉（图2D），确保小动脉不受损。
注意：如果小动脉不容易用软脑从实质上拔出，请使用细镊子并挖掘大脑，从威利斯圈的MCA分支点开始。定位小动脉，小心地松弛小动脉周围的组织（图2E），并轻轻地将小动脉从实质中拉出，保持小动脉的上端（图2F）。可以从一个矩形的脑组织中分离出多个小动脉（长度：~1.5-2 mm）。 - 确保小动脉清洁，没有组织附着在它上面，并切断任何剩余的远端分支（图3A）。使用这种干净、完整的小动脉进行酶消化。或者，根据需要将每个小动脉切成两块（长度：0.75-1mm）进行酶消化，以制备内皮管。
4.实质小动脉的消化和内皮管的制备
- 设备和移液器的布置
注意：从大脑中分离动脉内皮管之前已经描述了13，18。目前的方案包括从实质（脑内）小动脉中分离内皮的修改。多个小动脉或/和小动脉碎片可以一起使用进行酶消化。- 组装研磨装置13 ，用于制备内皮管，使用铝制阶段支撑腔室和显微操作器。组装配备物镜（5x-60x）的显微镜和连接到计算机监视器的相机。使用载物台和试样旁边的泵控制器固定微量注射器。
- 将回填矿物油的研磨移液器固定在微量注射器活塞上。使用带有泵控制器的微量注射器将解离溶液吸入矿物油顶部的研磨移液器（~130 nL），同时注意避免移液器中的气泡。
- 小动脉段部分消化
- 将完整的小动脉段放入1 mL解离溶液中，放入含有100μg/ mL木瓜蛋白酶，170μg/ mL二硫代赤藓糖醇，250μg/ mL胶原酶和40μg/ mL弹性蛋白酶的10mL玻璃管中。在34°C下孵育小动脉段10-12分钟。
- 消化后，在室温下用3-4mL新鲜解离溶液代替酶溶液。
- 小动脉内皮管的隔离
注意：在酶溶液消化和置换后，将一个或多个部分消化的片段转移到连接到移动平台的超融合室中的解离溶液中。在100x至200x放大倍率下观察时，选择一个部分消化但未断裂的血管段，并在显微镜下聚焦。- 将与微量注射器注射器连接在腔室中的解离溶液中，并将其放置在靠近消化容器段的一端的一端。在泵控制器上将速率设置在 1-3 nL/s 的范围内，以实现轻柔的研磨。
- 在保持100x至200x放大倍率的同时，将小动脉段撤回移液管中，然后弹出以解离外翻和平滑肌细胞（图3B）。对血管段进行研磨，直到所有平滑肌细胞解离，只有内皮细胞保持为完整的“管子”。
注意：如果在磨痂过程中有必要，请小心使用细尖的镊子从内皮管中取出解离的外切和内部弹性层。通常，只有几个周期的磨痂产生完整的内皮管。 - 使用显微操作器将内皮管的每一端固定在腔室中的玻璃盖玻片上，使用硼硅酸盐玻璃固定移液器（图3C，D）。
- 固定小动脉内皮管
- 用超融合溶液（含有2mMCaCl 2的PSS）代替解离溶液，同时确保非内皮材料被洗出腔室。
- 将移动平台中的固定内皮管转移到专为连续超融合和细胞内或荧光记录/成像而设计的显微镜装置上。
- 在实验期间应用 PSS 的持续递送。使用在线流量控制阀在整个实验过程中手动设置流量（5-7 mL/min），与层流一致，同时将溶液流量的进料匹配到真空抽吸的程度。在获取背景数据和/或染料上样之前，允许≥5分钟的PSS流到腔室中以进行内皮管的超灌注。
5.利用小动脉内皮管检查细胞生理学
注意：分离和固定的小动脉内皮管可用于使用光度测定和锐电极电生理学分别用于[Ca2 + ]i 动力学和Vm 的细胞内记录，如前面所示13 （图4）。[钙2+]i 和Vm 可以根据需要作为单独的或组合的实验变量13 进行测量（图4）。但小动脉内皮管比动脉内皮更细腻，实验时间不应超过1 h。
- [钙2+]i 的测量
- 打开用于[Ca2+]i记录的设备和软件， 同时以5-7 mL/min的流速保持连续的超融合。
- 在室温下用Ca2 + 染料Fura-2 AM加载内皮管30分钟。用超融合溶液再次洗涤细胞20-30分钟，同时逐渐将浴温提高到37°C。 在整个实验过程中将温度保持在37°C。
- 使用光度法软件手动调整成像窗口，聚焦约20个内皮细胞（图4A）。在没有光的情况下，打开荧光界面上的PMT并开始通过340nm和380nm处交替激发Fura-2（≥10 Hz）来获取[Ca2 + ]i ，同时在510nm处收集荧光发射。一旦建立了[Ca2+]i 的稳定基线记录，根据实验目标应用药理学药物（例如，嘌呤能受体激动剂）（图4B）。
- Vm 的测量
- 打开用于Vm 记录的设备和软件并设置数据采集速率（≥10 Hz），同时以5-7 mL / min的流速保持连续超融合。逐渐将浴温升高至37°C并保持至实验结束。
- 使用硼硅酸盐玻璃毛细管拉动尖锐的电极，用2 M KCl回填，并将其固定在连接到静电计的移液器支架中涂有氯化物的银丝上，该移液器又由显微操作器固定。
- 在通过4x物镜观察时，使用显微操纵器小心地将尖锐的电极尖端定位在小动脉内皮管的细胞上方，进入腔室中流动的PSS。
- 逐渐将放大倍率增至400倍，并根据需要重新定位电极尖端。
- 使用显微操作器，轻轻地将尖锐电极的尖端插入内皮管的一个细胞中，并使用静电计开始记录Vm （图4A）。
- 一旦内皮静息Vm 稳定（−30至−40mV），根据实验目标应用所需的药理药物（图4C）。
6. 细胞成像
注：固定在移动平台腔室中的内皮管也可用于使用标准荧光或共聚焦显微镜在活体和固定条件下的显微成像19 。具有针对受体和离子通道的不同抗体的免疫组织化学也可以如前面描述的那样应用20。
- 在37°C下用质膜或所需细胞器（例如，细胞核，内质网）的荧光跟踪器加载内皮管15-30分钟。
- 用新鲜的超融合PSS洗涤细胞，并在显微镜下以相应染料的激发波长对活细胞进行成像（图4D，E）。
注意：可以使用感兴趣的抗体在此管模型上进行免疫组化。
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Representative Results
方案的演示如图1所示，小动脉夹层和内皮管分离步骤分别如图2和图3所示。在这里，通过使用Fura-2光度测定法和锐电极电生理学（图4A）测量[Ca2 + ]i和Vm来评估内皮功能，以响应药理学剂[2-甲基硫代腺苷二磷酸（MTA），一种有效的嘌呤能受体（P2YR）激动剂]在37°C下。 在应用MTA（1μM）时，[Ca2 + ]i迅速增加（图4B），伴随超极化（图4C）。这些测量结果反映了Gq蛋白偶联受体（P2YRs）的激活，随后是小和中电导Ca2 +激活的K +通道（SKCa / IKCa）的激活，其启动了内皮依赖性超极化（EDH）血管舒张途径。因此，从实质小动脉分离的内皮是孤立的功能，可用于研究涉及[Ca2 +]i的动员和/或通过K +通道调节Vm的途径的关键成分。
此外，将完整的内皮在37°C下用荧光跟踪仪孵育以进行可视化以检查细胞形态。活内皮细胞成像显示质膜（绿色）和细胞核（红色）的共染色（图4D）。在 图4E中，质膜（绿色）与内质网（ER;红色）荧光染色一起染色，从而在质膜附近明显重叠的ER区域显示为橙色（图4E）。这些荧光图像进一步揭示了小动脉内皮的细胞完整性及其可能用于研究位于连接膜复合物处的信号传导微结构域。
图1：检查刚从小鼠实质小动脉中分离出来的小动脉内皮管。 如图所示，大脑与小鼠分离，并且移除了一块含有MCA的矩形脑组织。从MCA分支并进入脑实质的实质小动脉被分离出来。小动脉被酶消化和研磨，产生完整的内皮管用于研究。制备的内皮管可以测量细胞内Ca2 + 动力学和Vm ，同时还可以进行细胞成像以进行荧光成像和免疫组化。缩写：MCA =大脑中动脉;Vm = 膜电位。 请点击此处查看此图的大图。
图2：实质小动脉的解剖和分离（A）具有完整的威利斯圆环的孤立小鼠大脑。（B）含有MCA（白色箭头）的解剖矩形脑组织。（C）从组织上部（小动脉，蓝色箭头）中分离软脑膜。（D）小动脉（用蓝色箭头勾勒）连接到大脑中动脉（黄色箭头）。（E）在脑组织中识别小动脉（蓝色箭头）。（F）从松动的组织中拔出小动脉（蓝色箭头）。请注意，图E和F表示分离小动脉的替代方法（参见方案步骤3.2.3）。比例尺 = 2 毫米 （A，B，C）、0.2 毫米 （深） 和 1 毫米 （E，F）。请点击此处查看此图的大图。
图3：从实质小动脉制备内皮管。 （A）孤立和干净的小动脉（蓝色箭头）。（B）部分酶消化的小动脉的磨痧。（C）使用固定移液器制备并固定在玻璃盖玻片上的完整内皮管（放大倍率：100x）。（D）200倍放大倍率的内皮管。比例尺 = 0.2 毫米 （A）、0.1 毫米 （B、C） 和 0.05 毫米 （深）。 请点击此处查看此图的大图。
图4：应用内皮管对与血流调节相关的途径进行生理检查。 （A）将尖锐的电极（紫色箭头）定位在内皮管的细胞中，聚焦在数据采集窗口中进行光度测定。（B）使用Fura-2光度测定法响应MTA（1μM）的细胞内Ca 2+ 的代表性记录。（C）图B中Vm 与细胞内Ca2+ 痕量同时记录 的代表性记录。（D）用荧光染料染色的活内皮细胞的质膜（绿色）和细胞核（红色）的代表性图像。（E）用荧光染料染色的活内皮细胞的质膜（绿色）和内质网（ER，红色）的代表性图像。急诊室和质膜的邻近区域以橙色表示。图像是使用单色相机获取的，并且是伪彩色的。比例尺= 20 μm （D）， 10 μm （E）。简称：MTA = 2-甲基硫代腺苷二磷酸;F340/F380 = Fura-2 染料比信号;Vm = 膜电位;PM = 质膜;ER = 内质网。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
越来越多的证据表明，脑血管疾病（CVD），衰老和阿尔茨海默病密切相关，并且是痴呆症研究的当前主题4，8，14，21。因此，很明显，对脑血管网络的研究将对健康产生广泛影响，同时需要在疾病条件下继续进行广泛的调查。作为脑灌注血管阻力的重要点，实质小动脉在CVD的病因和发展中的一般重要性已经突出了50多年22。
然而，科学检查工具尚未得到充分开发以研究完整的实质小动脉及其复合细胞类型，直到最近开始的 离体 方法，例如分离的加压实质小动脉11 和CaPA12 制剂。脑血管生理学领域还将受益于同细胞研究模型（平滑肌，周细胞和内皮）中的互补技术，以关注特定细胞类型及其遗传和药理学特征，这些特征是脑血流量调节和血脑屏障（BBB）通透性的基础。
内皮是一个中央调节器官，它“喂养”全身所有其他器官，包括大脑23。虽然所有血管节段（动脉，小动脉，毛细血管，小静脉，静脉）对于脑灌注都是必不可少的，但小动脉内皮需要专门研究作为脑血管自调节和神经血管偶联的核心组成部分24。此外，Ca2 + 信号传导25 和K + 通道活性17，26 似乎在相对于pial动脉的实质小动脉的肌源性张力调节期间增强。因此，我们现在已经将先前建立的pial脑动脉（后部）13 的方法扩展到了实质小动脉。
相对于这些先前说明的方法11，13，该方案通过经验性调整各种步骤（例如，酶处理，三玫）来改进，以可重复地从实质小动脉产生完整的内皮管。此外，该协议还演示了使用该研究模型来优化细胞光度测定，电生理学和荧光成像的应用（图4）。由于Fura-2光度测定和锐电极电生理学的一般优势和局限性，前面详细描述了13，鼓励实验者尝试一系列其他Ca2 + 信号和离子通道测定来测试感兴趣的特定假设。此外，具有内皮细胞特异性遗传编码指示剂（例如[Ca2+]i27 和电压28 指示剂）的新型遗传模型的进步和生成可以扩大该制剂的有用性。
对于调查背景，这种孤立的内皮模型对于需要研究小动脉内皮在血管动力学调节中的作用的研究问题很有用，其中由于体积小， 面部 测量在实验上不可行。脑血流的内皮调节始于各种G蛋白偶联受体（例如，嘌呤能，毒蕈碱）18 和离子通道（TRPV329，TRPA15，NMDA受体8）的激活。Gq型受体的激活需要磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（PIP2）脂肪分解以产生肌醇三磷酸（IP3）和二酰基甘油用于[Ca2 + ]i 动员，然后可以介导K + 通道激活Vm15的变化。K+ 通道活性，因而单独使用Vm ，也可以在生理条件下直接研究2 或通过选择药理靶向30。此外，小动脉内皮管能够增强所选质膜重塑（例如，Filipin-III），细胞内细胞器（例如，ER跟踪器）和细胞间偶联（例如，碘化丙啶）的荧光可视化18，19。因此，研究模型的另一个特征是将细胞形态和组织学与功能参数（如Ca2 + 和电信号传导）在衰老和慢性疾病发展中有效配对。
该方案中值得特别注意的组成部分是小动脉解剖，酶消化，研磨和固定小动脉内皮管以进行测量。在从脑中解剖过程中，应不惜一切代价避免对实质小动脉的损伤，以确保成功消化和研磨以分离完整和功能性的内皮层。此外，在将内皮管固定在灌注室中的过度拉伸也会破坏制剂，从而有效地否定所有先前的方案步骤。
应应用活力试验以确保小动脉内皮管相对于关键生理成分具有功能，例如G蛋白偶联受体刺激后的Ca2 +信号传导（流入和/或细胞内释放），Vm超极化的程度以及通过间隙连接18，23的鲁棒细胞间偶联。这种对照的例子包括使用MTA的可逆嘌呤能刺激（1μM;Δ[Ca2+]i~300 nM;≥10 mV超极化;图4B，C），使用NS309（1μM;≥20 mV超极化）和/或电流注入（例如，~-1 nA）到一个电池中的电流与另一个电池的Vm响应（~-10 mV）之间的对应关系，距离为≥250μm18，31。通过实践，谨慎和实验的严谨性，如果学习者有耐心和毅力，整个实验方案是可重复的。
该方法具有需要解决的关键局限性，例如样品（例如，核酸，蛋白质和脂质）丰度不足以及生化实验和活细胞记录的相对脆弱性。然而，这种分子生物学警告可以通过从几种动物中汇集和/或设计具有更高灵敏度和通量的定量方法来避免。如果要将生理温度维持在37°C，则需要较短的实验时间范围（≤1小时），仅进行重点药物干预。此外，从近足月或新生儿（<1个月大）动物中分离小动脉内皮管将极具挑战性，这可能会排除脑血管发育的研究。
其他考虑因素包括脑血管内皮管的精确组成，可能需要选择免疫荧光和电生理学方法。例如，基底膜（主要由胶原IV，层粘连蛋白和纤连蛋白组成）沿着脑血管树运行。它以其对由脑毛细血管内皮细胞32形成的BBB的完整性的贡献而闻名。应该注意的是，该研究模型可能不适合BBB通透性实验，因为基底膜组分是用于部分消化小动脉内皮管的酶混合物的底物，特别是胶原酶H混合物。此外，应用选择性酶混合物，去除内部弹性层，并清晰地鉴定每个结构的内皮细胞（平滑肌细胞的平行排列与圆周），形态（内皮细胞的“泪滴”形状与纺锤形平滑肌细胞）和电生理学（例如，对GPCR刺激的超极化），消除了平滑肌细胞和周细胞的生理贡献。最后，实验者必须注意每个器官类型（例如，脑，心，肺33）的内皮细胞异质性（基因表达谱，结构，功能）以及大脑区域（例如，皮质9，34，海马体10）和相应的血管分割（例如，动脉，小动脉和毛细血管9，34，35）).因此，对脑血流调节的全面研究还需要对完整的血管段和网络进行互补的 离体 （例如，血管内压肌造影，毛细血管 - 实质小动脉制备）和 体内 （例如，脑内激光多普勒）方法。
综上所述，本文提出了一种先进的技术，展示了如何制备从小鼠脑实质小动脉中新鲜分离的完整内皮管。我们预计这种方法将补充和/或建立 体内 和完整的血管研究模型。总体目标是产生新的信息，以便在生理学的基本水平上理解支撑脑血流的机制，并选择向病理学的过渡进行治疗。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了美国国立卫生研究院（R00AG047198和R56AG062169）的资助。R00HL140106至PWP）和阿尔茨海默氏症协会（AZRGD-21-805835至PWP）。内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院或阿尔茨海默氏症协会的官方观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
| Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
| Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
| Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
| Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
| NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
| Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |
References
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