Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

בידוד וניתוח פונקציונלי של אנדותל עורקי של מפרקת מוח עכבר

Published: March 11, 2022 doi: 10.3791/63463
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Basic Sciences, Loma Linda University, 2Departments of Physiology, Surgery and Neurosurgery and Sarver Heart Center, University of Arizona College of Medicine Tucson

Summary

הכנה אינטנסיבית של "צינורות" אנדותל מוחיים של עכבר שלמים מעורקיים פרנצ'ימליים מוחיים מודגמת לחקר ויסות זרימת הדם במוח. יתר על כן, אנו מדגימים את החוזקות הניסיוניות של מודל מחקר אנדותל זה להדמיית פלואורסצנטיות ומדידה אלקטרופיזיולוגית של מסלולי איתות תאיים מרכזיים, כולל שינויים בתאיים [Ca2+] ופוטנציאל הממברנה.

Abstract

זרימת הדם המוחית מועברת על ידי עורקי התנגדות כלי דם ועורקים פרנצ'ימליים במורד הזרם. עמידות כלי דם במצב יציב לזרימת הדם עולה עם קוטר פוחת מעורקים לעורקים שבסופו של דבר ניזונים לנימים. בשל גודלם הקטן יותר ומיקומם בפרנצ'ימה, arterioles כבר understudied יחסית עם פחות רבייה בממצאים מאשר עורקי pial פני השטח. כך או כך, מבנה ותפקוד תאי אנדותל אנדותל עורקיים – חלק בלתי נפרד מהפיזיולוגיה והאטיולוגיה של מחלות ניווניות כרוניות – דורשים חקירה מקיפה. בפרט, ראיות המתעוררות מדגימות כי תפקוד אנדותל נפגע מקדים ומחריף פגיעה קוגניטיבית ודמנציה.

במיקרו-סירקולציה parenchymal, פונקציית ערוץ K + אנדותל הוא הגירוי החזק ביותר כדי לשלוט דק על התפשטות vasodilation כדי לקדם את העליות בזרימת הדם לאזורים של פעילות עצבית. מאמר זה ממחיש שיטה מעודנת לבידוד טרי של "צינורות" אנדותל שלמים ומצמידים חשמלית (קוטר, ~ 25 מיקרומטר) מעורקי מפרקי מוח העכבר. צינורות אנדותל Arteriolar מאובטחים במהלך תנאים פיזיולוגיים (37 °C, pH 7.4) כדי לפתור משתנים ניסיוניים המקיפים פונקציית ערוץ K + ואת הרגולציה שלהם, כולל דינמיקה Ca2 + תאיים, שינויים בפוטנציאל הממברנה, ויסות השומנים הממברנה. יתרון טכני מובהק לעומת אנדותל עורקי הוא הרזולוציה המורפולוגית המשופרת של ממדי התא והאברונל (למשל, המיטוכונדריה), המרחיבה את התועלת של טכניקה זו. זלוף מוחי בריא לאורך החיים כרוך בתפקוד אנדותל חזק בעורקים פרנצ'ימליים, המקשר ישירות את זרימת הדם לתדלוק של פעילות עצבית וגליאלית בכל האזורים האנטומיים המדויקים של המוח. לכן, צפוי כי שיטה זו תקדם באופן משמעותי את הידע הכללי של פיזיולוגיה של כלי הדם ומדעי המוח לגבי המוח הבריא והחולני.

Introduction

עורקי Parenchymal ישירות לספק חמצן חיוני וחומרים מזינים ברחבי המוח1. תוך כדי התממשקות עם נימים, arterioles vasoactive מאוד להגיב איתות מדרדר ביוזמת ערוצי יון נימי לחוש אותות מטבוליים מאזורים עצביים ספציפיים2. עם parenchyma המוח לאחר שקיבלה היסטורית את עיקר החקירה, תפקיד לתפקוד לקוי של אנדותל התפתח כעת להבהרת מנגנונים פתולוגיים הקשורים להפרעות שונות בכלי הדם במוח שבבסיס דמנציה (למשל, שבץ איסכמי, מחלת אלצהיימר)3,4,5,5,6 . האנדותל הוא חלק בלתי נפרד מהזלוף של המוח בהתאם להטרוגניות של גנטיקה, מבנה ותפקוד בכל מגזרי כלי הדם7. עורקי פיאל נחקרו בהרחבה בשל גודלם הגדול יחסית, עמידות גבוהה של כלי דם מגזריים, ותפקידם בהתפלגות זרימת הדם למוח המוח הבסיסי 8,9. לכן, הבנה טובה יותר של מנגנוני אנדותל arteriolar סביר להניח לשפר את ההבנה של ויסות זרימת הדם במוח בבריאות ומחלות לקראת התפתחות של משטרים טיפוליים חדשניים.

ראיות המתעוררות מדגיש את החשיבות של לימוד עורקים parenchymal ביחס מסלולי איתות שונים ומחלות 8,10. עם זאת, גישה זו הוגבלה לשימוש בעורק בלחץ שלם11 ו/או נימי-parenchymal arteriole (CaPA)הכנות 12. מבודדים טריים, תאי אנדותל מוחיים מקומיים נטולי סוגי תאים אחרים וגורמים מבלבלים לא נבדקו, ככל הנראה בשל קשיים טכניים בבידודם. נייר זה מקדם טכניקה קודמת המדגישה את הבידוד של אנדותל עורקי פיאלי13 כדי כעת לבודד באופן אמין ורבייה את האנדותל של עורקי פרנצ'ימל במוח (רוחב: ~ 25 מיקרומטר, אורך: ~ 250 מיקרומטר). טכניקה זו מסייעת להשיג רזולוציה אופטימלית של תאים מצמידים חשמלית וכימית באוריינטציה האישית שלהם וברשתות הסלולריות שלהם.

נתיבים מרכזיים של עניין כללו את האינטראקציה של Ca2+ תאיים ([Ca2+]i) איתות והיפר-קוטביזציה של פוטנציאל הממברנה (Vm)14,15 – אינטגרלי להתרחבות כלי דם16 – כדי לאפשר לדם להיכנס לנימים ולספק חמצן וחומרים מזינים לפרנצ'ימהפעילה 17. תכשירים אלה מאפשרים הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בזמן אמת של ערוצי יונים, כולל Ca2 + -permeant, פוטנציאל קולטן חולף (TRP) ו- K + ערוצים ו / או הדמיה פלואורסצנטית של אברונים תאיים בתוך צינורות תא אנדותל בתנאים כמעט פיזיולוגיים. זוהי טכניקה מתאימה לחוקרים המעוניינים במנגנונים תאיים פיזיולוגיים השולטים בשליטה בתאי אנדותל על אספקת זרימת הדם המוחית לפרנצ'ימה במוח. בסך הכל, טכניקה זו תסייע לחוקרים להבין טוב יותר מסלולי איתות אנדותל בסיסיים ותקשורת רשת של עורקים המוטמעים בפרנצ'ימה במוח תוך התייחסות לשאלות הקשורות לפיזיולוגיה ופתולוגיה של כלי הדם במוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

על הנסיינים לוודא כי שימוש ייעודי בבעלי חיים ובפרוטוקולים הקשורים אליהם יאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) ויבוצע בהתאם ל"מדריך הטיפול והשימוש בחיות מעבדה" של מועצת המחקרהלאומית ( מהדורה 8, 2011) והנחיות ARRIVE. IACUC של אוניברסיטת לומה לינדה ואוניברסיטת אריזונה אישר את כל הפרוטוקולים המשמשים עבור כתב יד זה עבור C57BL / 6N ו 3xTg-AD עכברים (זכרים ונקבות; טווח גילאים: 2-30 חודשים). ראו איור 1 בסקירה כללית של הבידוד והבדיקה של צינורות אנדותל עורקיים המבודדים זה עתה מעורקי הפרנצ'ימליה של המוח.

1. חומרים וציוד

הערה: עיין בטבלת החומרים עבור כל הריאגנטים והחומרים הדרושים לפרוטוקול זה. בנוסף, ניתן להתייעץ גם עם מדריכים ואתרי אינטרנט המשויכים לספקים המתאימים לפי הצורך. איורים של תחנות ניתוח ומנגנוני ניסוי סופקו בעבר13.

  1. תא זרימה
    1. הדקו תא על עם כיסוי זכוכית על פלטפורמה המורכבת מאלומיניום אנודייז. אבטחו את הפלטפורמה עם התא על במת מיקרוסקופ אלומיניום.
    2. הגדר מיקרו-מניפולטור המחזיק פיפטה מצמידה בכל קצה של הפלטפורמה על במת מיקרוסקופ האלומיניום.
      הערה: במידת הצורך, השתמש במנגנון שלב הניתן להעברה עם יחידת תא זרימה כדי להעביר צינור אנדותל מאובטח ומבודד ממנגנון מיקרוסקופ אחד למשנהו לצורך ניסויים.
  2. מיקרוסקופים
    1. השתמשו בסטריומימיקרוסקופים (טווח הגדלה של פי 5 עד פי 50) ובמקורות אור סיבים אופטיים להליכי ניתוח.
    2. לבידוד צינורות אנדותל, השתמש באסדת מיקרוסקופ הפוכה המצוידת במטרות תואמות ניגודיות פאזה או הפרעות דיפרנציאליות (DIC) (10x, 20x ו- 40x) ושלב אלומיניום.
    3. יש בקר משאבת מיקרו מזרק מוכן ליד המנגנון המוקדש בידוד צינורות אנדותל מכלי דם מתעכלים חלקית.
    4. הגדר את המנגנון הניסיוני על ידי סידור מיקרוסקופ הפוך (מטרות: 4x, 10x, 20x, 40x ו- 60x) ושלב אלומיניום ידני על שולחן בידוד רטט.
  3. ציוד הקלטה Vm תאי
    1. חבר את האלקטרומטר לבמה תואמת. השתמש באביזרים, כגון מחולל פונקציות וממריץ, עבור פרוטוקולים הדורשים הזרקה נוכחית.
    2. חבר יציאות מגבר למערכת דיגיטציה של נתונים, אוסצילוסקופ וצגים בסיסיים נשמעים. אבטחו את אלקטרודת אמבט הייחוס (גלולה Ag/AgCl) ליד היציאה מתא הזרימה.
    3. להרכיב מערכת פוטומטרית עם רכיבים משולבים של ממשק מערכת פלואורסצנטיות, מנורת קשת בעוצמה גבוהה ואספקת חשמל, hyperswitch, צינור פוטומולטיפלייר (או PMT), ומצלמה כדי למדוד [Ca2 +]i בתאי אנדותל.
    4. להרכיב בקר טמפרטורה מצויד תנור מוטבע כדי להעלות ולשמור על טמפרטורה פיזיולוגית (37 °F) לאורך כל הניסוי.
    5. להרכיב פלטפורמה רב ערוצית מחובר בקר שסתום עם שסתום בקרת זרימה מוטבעת כדי לשלוט באספקת פתרונות צינורות אנדותל מאובטח בתא.
  4. מיקרופיפטיות ואלקטרודות חדות
    הערה: הנסיין יזדקק למושך זכוכית אלקטרוני ולמיקרו-פורג' להכנת טריטוריה והצמדת פיפטות.
    1. כדי להפריד את צינור האנדותל ממקטע arteriolar מתעכל חלקית, להכין פיפטות trituration מלוטשות חום (קוטר קצה פנימי: 30-50 מיקרומטר) מן נימי זכוכית borosilicate.
    2. כדי לאבטח את צינור האנדותל בתא superfusion, להכין פיפטות הצמדה מלוטשות בחום עם קצה כדורי קהה (קוטר חיצוני: 50-70 מיקרומטר) מוכן נימי זכוכית בורוסיליקט קיר דק.
    3. כדי להקליט Vm של תא אנדותל, להכין אלקטרודות חדות עם התנגדות קצה של ~ 150 ± 30 MΩ מנימי זכוכית באמצעות מושך זכוכית בלבד.

2. פתרונות ותרופות

  1. תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS)
    1. הכן מינימום של 1 L של PSS באמצעות 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 מ"מ MgCl2, 10 מ"מ N-2-הידרוקסיאתילפיפרזין-N'-2-חומצה אתנולפית (HEPES), ו 10 מ"מ גלוקוז.
    2. הכן פתרונות הכרחיים חסר CaCl2 (אפס Ca2 + PSS) עבור ניתוח של arterioles המוחי ובידוד של צינור אנדותל.
      הערה: הכן את כל הפתרונות ב- H2O שעבר אולטרה-רפוי, ולאחר מכן סינון (0.22 מיקרומטר). ודא שהמוצר הסופי מכיל pH 7.4 עם osmolality בין 290 ל 300 mOsm.
  2. אלבומין סרום בקר (BSA, 10%)
    1. להמיס 1 גרם של אבקת BSA lyophilized בכוס של 10 מ"ל של אפס Ca2 + PSS. מכסים את הכוס ולאפשר לפחות 2 שעות עם ערבוב איטי עבור BSA להתמוסס.
    2. פתרון סינון באמצעות מזרק 10 מ"ל בתוספת מסנן 0.22 מיקרומטר ולהכין aliquots 1 מ"ל לאחסן ב -20 °C (60 °F).
  3. פתרון ביתור
    1. הוסף 500 μL של BSA (10%) ל 49.5 מ"ל של אפס Ca2 + PSS עבור נפח כולל של 50 מ"ל.
    2. מעבירים את התמיסה לצלחת פטרי לניתוחים עורקיים.
  4. פתרון דיסוציאציה
    1. הוסף 5 μL של פתרון CaCl2 (1 M) ו 500 μL של BSA (10%) ל 49.5 מ"ל של אפס Ca2 + PSS עבור נפח כולל של 50 מ"ל. פתרון דגירה בטמפרטורת החדר לפחות 1 שעות.
  5. אנזימים
    1. הכינו 1 מ"ל של פתרון עיכול עם 100 מיקרוגרם / מ"ל פפאין, 170 מיקרוגרם / מ"ל dithioerythritol, 250 מיקרוגרם / מ"ל קולגנאז (תערובת סוג H), ו 40 מיקרוגרם / מ"ל אלסטאז.
      הערה: פעילויות אנזימים יכולות להשתנות, אם כי פרוטוקולים מוצלחים עשויים לדרוש את הפעילויות אנזימטיות הבאות: ≥ 10 יחידות / מ"ג עבור פפאין, ≥ 1 יחידה / מ"ג עבור collagenase, ו ≥ 5 יחידות / מ"ג עבור אלסטאז.
  6. פורה-2 וסוכנים פרמקולוגיים
    1. הכינו מלאי פורה-2 AM בדימתיל סולפוקסיד (DMSO; 1 מ"מ). הכן 500 μL של ריכוז עבודה (10 μM) על ידי הוספת 5 μL של המניה ל 495 μL של PSS לטעינה.
    2. הכן לפחות 50 מ"ל של ריכוזי עבודה של סוכנים פרמקולוגיים ב- PSS או DMSO לפי הצורך.
  7. פתרון ניהול
    1. הכן 2 M KCl על ידי המסת KCl ב H2O deionized (7.455 גרם של KCl ב 50 מ"ל של H2O). העבירו את הפתרון דרך מזרק עם מסנן של 0.22 מיקרומטר לפני מילוי האלקטרודות החדות.
  8. גששי אברונים פלואורסצנטיים ונוגדנים
    1. הכן קרום פלזמה או organellar (למשל, גרעין, reticulum אנדופלסמי) גששים בתמיסת המלח הפיזיולוגית המתאימה על פי הוראות היצרן.
    2. הכן נוגדנים ראשוניים ומשניים בהתאם להוראות היצרן בתמיסת המלח הפיזיולוגית המתאימה.

3. ביתור ובידוד של עורקים מוחיים של עכבר

הערה: סטריאומיקרוסקופים וכלי מיקרודיסקציה מחודדים (לדוגמה, מלקחיים בעלי קצה דק, מספריים לחיתוך בסגנון ואנה) חייבים לשמש להגדלת דגימה (עד פי 50) בכל הליכי הניתוח האלה.

  1. בידוד של מוח העכבר
    1. להרדים עכבר מעבדה סטנדרטי (למשל, C57BL/6, 3xTg-AD; בן 2-30 חודשים, זכר או נקבה) באמצעות שאיפת איזופלוראן (3% במשך 2-3 דקות), ואחריו עריפת ראש מיידית באמצעות מספריים חדים או גיליוטינה לכל אישור IACUC. מניחים את ראש העכבר בצלחת פטרי (קוטר 10 ס"מ, עומק 1.5 ס"מ) המכילה פתרון ביתור קר (4 °C (6 °F).
    2. בעת צפייה תחת סטריאומיקרוסקופ, להסיר את העור והשיער מעל הגולגולת ולשטוף דם מוגזם עם פתרון ביתור קר. באמצעות קצות מספריים ביתור סטנדרטיים (למשל, להבי 24 מ"מ), לעשות חתך החל מהעצם העורפית ולהשתרע למעלה דרך עצם האף של הגולגולת. השתמש במלקחיים גסים כדי לפתוח בזהירות את הגולגולת לאורך החתך, ולהפריד רקמת חיבור (קרום המוח) כדי לבודד את המוח המכיל מעגל שלם של ויליס.
    3. לשטוף את המוח המבודד עם פתרון ביתור קר בכוס או צלחת פטרי כדי להסיר את הדם הנותר מפני השטח של המוח. מניחים את צד הגחן של המוח פונה כלפי מעלה בתא המכיל תמיסת כריתה קרה לבידוד של עורקים פרנצימליים (איור 2A).
  2. בידוד של עורקים פרנצ'ימליים
    הערה: Arterioles הנובעים מהעורקים המוחיים האמצעיים (MCAs) ומוטמעים בפרנצ'ימה במוח נבחרים עבור פרוטוקול זה. העורקים מבודדים כפי שתואר בעבר11, עם שינוי.
    1. השתמש סיכות פלדה (קוטר: 0.2 מ"מ, אורך: 11 עד 12 מ"מ) כדי לאבטח את המוח המבודד בתמיסת כריתה קרה בצלחת פטרי המכילה ציפוי סיליקון פולימר חדורי פחם (עומק ≥ 50 ס"מ).
    2. בעזרת מספריים חדים ומיושרים, חותכים מלבן של רקמת המוח (אורך: 5 מ"מ, רוחב: 3 מ"מ) (איור 2B) סביב ה-MCA תוך הבטחה שהחלק העליון של מקטע הרקמה נמצא מעבר לנקודת ההסתעפות ממעגל וויליס. חותכים מלבן נוסף של רקמת המוח מחצי הכדור האחר של המוח כדי לגשת לעורקיים נוספים במידת הצורך.
    3. אבטחו את מקטע רקמת המוח המופרדת לתוך המנה כאשר ה- MCA פונה כלפי מעלה (דיסטלי ממעגל ויליס) באמצעות סיכות פלדה (קוטר: 0.1 מ"מ, אורך: 13 עד 14 מ"מ). בצעו בזהירות חתך רדוד ליד הפינים כדי להסיר את הפיה עם מלקחיים קטנים, תוך קילוף עדין מקצה אחד לכיוון השני (איור 2C). הסר את הפיה ממקטע הרקמה האחר כדי לגשת לעורקים נוספים במידת הצורך. אבטחו בקפידה את הפיה המבודדת עם עורקים פרנצ'ימליים המסתעפים מ-MCA בצלחת עם הסיכות, וניתחו את העורקים הפרנצ'ימליים (איור 2D), כדי להבטיח שהעורקים לא ייפגעו.
      הערה: אם העורקים אינם נשלפים בקלות עם הפיה מהפרנצ'ימה, השתמשו במלקחיים עדינים וחפרו במוח, החל בנקודת הסניף של MCA ממעגל וויליס. אתר את העורקים, שחרר בזהירות את הרקמה סביב עורקים (איור 2E), ומשוך בעדינות את העורקים מהפרנצ'ימה, תוך החזקת הקצה העליון של העורקים (איור 2F). עורקים מרובים (אורך: ~ 1.5-2 מ"מ) ניתן לבודד מלבן אחד של רקמת המוח.
    4. ודאו שהעורקים נקיים ללא רקמות מחוברות אליו, וחתכו את כל הענפים הדיסטליים הנותרים (איור 3A). השתמש בעורק העורקים הנקי והשלם הזה לעיכול אנזימטי. לחלופין, לחתוך כל arteriole לשני חלקים (אורך: 0.75-1 מ"מ) לעיכול אנזימטי להכנת צינורות אנדותל אם תרצה.

4. עיכול של עורקי parenchymal והכנת צינורות אנדותל

  1. סידור ציוד ופיפטות
    הערה: בידוד של צינורות אנדותל עורקיים מהמוח תואר בעבר13,18. הפרוטוקול הנוכחי משלב שינויים לבידוד של אנדותל מעורקי פרנצ'ימלי (תוך מוחי). עורקים מרובים או /וחתיכות של arterioles ניתן להשתמש יחד לעיכול אנזימטי.
    1. להרכיב את מנגנון trituration13 להכנת צינורות אנדותל באמצעות שלב אלומיניום התומך תא micromanipulators. הרכב מיקרוסקופ המצויד במטרות (5x-60x) ומצלמה המחוברת לצג מחשב. אבטחו מיקרו-מזרק עם בקר משאבה ליד הבמה והדגימה.
    2. אבטחו פיפטה משולשת ממולאת בשמן מינרלי מעל בוכנה מיקרו-מזרקית. השתמש במיקרו-מזרק עם בקר המשאבה כדי למשוך את פתרון הדיסוציאציה לפיפטה trituration (~ 130 nL) על גבי השמן המינרלי תוך הקפדה על הימנעות מבועות אוויר בפיפטה.
  2. עיכול חלקי של מקטעי עורקים
    1. מניחים מקטעי arteriolar שלמים לתוך 1 מ"ל של פתרון דיסוציאציה בצינור זכוכית 10 מ"ל המכיל פפאין 100 מיקרוגרם / מ"ל, 170 מיקרוגרם / מ"ל dithioerythritol, 250 מיקרוגרם / מ"ל קולגנאז, ו 40 מיקרוגרם / מ"ל אלסטאז. אינגרה מקטעים arteriolar ב 34 °C (50 °F) במשך 10-12 דקות.
    2. לאחר העיכול, החליפו את תמיסת האנזים ב-3-4 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה טרייה בטמפרטורת החדר.
  3. בידוד של צינור אנדותל עורקי
    הערה: לאחר עיכול והחלפת תמיסת האנזים, העבר מקטע אחד או יותר מתעכל חלקית לפתרון הניתוק בתא superfusion המחובר לפלטפורמה ניידת. בעת צפייה בהגדלה של פי 100 עד 200, בחר מקטע כלי אחד מתעכל חלקית אך לא שבור והתמקד בו מתחת למיקרוסקופ.
    1. מניחים את פיפטת הטריטורציה המחוברת למזרק המיקרו-מזרק בתמיסת הדיסוציאציה בתא ומקם אותה קרוב לקצה אחד של קטע כלי השיט המעוכל. הגדר קצב בטווח של 1-3 nL/s בבקר המשאבה לטריטורציה עדינה.
    2. תוך שמירה על הגדלה של פי 100 עד פי 200, משכו את מקטע העורקים לתוך הפיפטה ולאחר מכן הוציאו כדי לנתק את ההמצאה ואת תאי השריר החלקים (איור 3B). בצע טריטורציה של מקטע כלי הדם עד שכל תאי השריר החלקים יתנתקו, ורק תאי אנדותל יישארו כ"צינור" שלם.
      הערה: במידת הצורך במהלך הטריטורציה, יש להשתמש בזהירות במלקחיים עדינים כדי להסיר את ההרפתנטיה המנותקת ואת הלמינה האלסטית הפנימית מצינור האנדותל. בדרך כלל, רק כמה מחזורים של טריטורציה מניבים צינור אנדותל שלם.
    3. השתמשו במיקרו-מניפולטורים כדי לאבטח כל קצה של צינור האנדותל על כיסוי הזכוכית בתא עם פיפטות מצמידות זכוכית בורוסיליקט (איור 3C,D).
  4. אבטחת צינור האנדותל העורקים
    1. החלף את פתרון הפירוק בתמיסת superfusion (PSS המכיל 2 mM CaCl2) תוך הקפדה על כך שחומר לא נדלי נשטף מהתא.
    2. העבר צינור אנדותל מאובטח בפלטפורמה הניידת לאסדת המיקרוסקופ המיועדת לתוספת-על רציפה ולהקלטות/הדמיה תאיות או פלואורסצנטיות.
    3. החל אספקה רציפה של PSS במהלך הניסוי. הגדר באופן ידני את קצב הזרימה (5-7 מ"ל / דקה) לאורך כל הניסוי באמצעות שסתום בקרת הזרימה המוטבעת, בקנה אחד עם זרימת למינאר, תוך התאמת ההזנה של זרימת הפתרון למידת יניקת ואקום. אפשר ≥5 דקות של זרימת PSS לתא לציפוי-על של צינור האנדותל לפני רכישת נתוני רקע ו/או טעינת צבע.

5. ניצול צינורות אנדותל עורקיים לבדיקת פיזיולוגיה תאית

הערה: צינורות אנדותל עורקיים מבודדים ומאובטחים יכולים לשמש להקלטות תאיות של [Ca2+]i dynamics ו- Vm באמצעות פוטומטריה ואלקטרופיזיולוגיה אלקטרודה חדה, בהתאמה, כפי שהודגם בעבר13 (איור 4). [Ca2+] i ו-Vm ניתנים למדידה כמשתנים ניסיוניים נפרדים או משולבים לפי הצורך13 (איור 4). עם זאת, צינורות אנדותל arteriolar הם עדינים יותר מאשר אנדותל עורקי, וזמן הניסויים לא יעלה על 1 h.

  1. מדידה של [Ca2+]i
    1. הפעל את הציוד והתוכנה להקלטות [Ca2+]i תוך שמירה על עירוך-על רציף בקצב זרימה של 5-7 מ"ל/דקה.
    2. טען את צינור האנדותל עם Ca2 + צבע Fura - 2 AM במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים עם פתרון superfusion עוד 20-30 דקות תוך העלאת טמפרטורת האמבטיה בהדרגה ל 37 °C (50 °F). שמור על הטמפרטורה ב 37 °C (50 °F) לאורך כל הניסוי.
    3. התאם ידנית את חלון ההדמיה באמצעות תוכנת פוטומטריה כדי להתמקד בכ-20 תאי אנדותל (איור 4A). בהיעדר אור, הפעל את ה- PMT בממשק הפלואורסצנטיות ולהתחיל ברכישת [Ca2+]i על ידי Fura-2 מרגש לסירוגין (≥10 הרץ) ב 340 ננומטר ו 380 ננומטר תוך איסוף פליטת פלואורסצנטיות ב 510 ננומטר. לאחר שהוקמה הקלטה בסיסית יציבה של [Ca2+]i , יש למרוח חומרים פרמקולוגיים (למשל, אגוניסטים של קולטן פורינרגי) לכל מטרה ניסיונית (איור 4B).
  2. מדידה של Vm
    1. הפעל את הציוד והתוכנה עבור הקלטות Vm והגדר את קצב רכישת הנתונים (≥10 הרץ) תוך שמירה על superfusion מתמשך בקצב זרימה של 5-7 מ"ל / דקה. בהדרגה להעלות את טמפרטורת האמבטיה ל 37 °C (50 °F) ולשמור אותו עד סוף הניסוי.
    2. משוך אלקטרודה חדה באמצעות נימי זכוכית בורוסיליקט, מילוי אחורי עם 2 M KCl, ואבטח אותו מעל חוט כסף מצופה כלוריד במחזיק פיפטה המחובר אלקטרומטר, כי בתורו, מוחזק על ידי micromanipulator.
    3. בעת צפייה דרך המטרה 4x, להשתמש micromanipulator כדי למקם בזהירות את קצה האלקטרודה החד רק מעל תא של צינור אנדותל arteriolar לתוך PSS זורם בתא.
    4. הגדל בהדרגה את ההגדלה ל-400x ומקם מחדש את קצה האלקטרודה לפי הצורך.
    5. בעזרת המיקרו-מניפולטור, הכנס בעדינות את קצה האלקטרודה החדה לאחד מתאי צינור האנדותל והתחל להקליט Vm באמצעות אלקטרומטר (איור 4A).
    6. לאחר שה-Vm במנוחה של האנדותל יציב (−30 עד −40 mV), החל את הסוכנים הפרמקולוגיים הרצויים לפי יעד ניסיוני (איור 4C).

6. הדמיה תאית

הערה: צינורות אנדותל המאובטחים בחדר של הפלטפורמה הניידת יכולים לשמש גם להדמיה מיקרוסקופית הן בתנאים חיים והן בתנאים קבועים19 באמצעות פלואורסצנטיות סטנדרטית או מיקרוסקופיה קונפוקלית. אימונוהיסטוכימיה עם נוגדנים שונים עבור קולטנים וערוצי יונים ניתן ליישם גם כפי שתואר בעבר20.

  1. טען את צינור אנדותל עם גשש פלואורסצנטיות עבור קרום הפלזמה או אברון הרצוי (למשל, גרעין, רשתית אנדופלסמית) ב 37 °C (65 °F) במשך 15-30 דקות.
  2. שטפו את התאים עם PSS טרי של עירוי-על ותאים חיים של תמונה מתחת למיקרוסקופ באורך הגל של העירור של הצבעים המתאימים (איור 4D,E).
    הערה: אימונוהיסטוכימיה יכולה להתבצע במודל צינור זה באמצעות נוגדנים מעניינים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הדגמה של הפרוטוקול מוצגת באיור 1 עם ניתוח עורקי וצעדי בידוד צינור אנדותל כאיור 2 ואיור 3, בהתאמה. כאן, תפקוד אנדותל הוערך על ידי מדידה [Ca2+]i ו- Vm באמצעות פוטומטריה Fura-2 ואלקטרופיזיולוגיה אלקטרודה חדה (איור 4A) בתגובה לסוכן תרופתי [2-מתילתיואדינוסין דיפוספט (MTA), אגוניסט קולטן פורינרגי חזק (P2YR) ב 37 °C (37 °C). עם יישום MTA (1 מיקרומטר), [Ca2+]i גדל במהירות (איור 4B) עם היפר-קוטביות בו זמנית (איור 4C). מדידות אלה הן השתקפות של ההפעלה של קולטנים Gq-חלבון מצמידים (P2YRs) ואחריו ההפעלה של קטן ובינוני מוליכות Ca2 + ערוצי K + מופעל (SKCa / IKCa), אשר ליזום אנדותל תלוי אנדותל hyperpolarization (EDH) vasodilatory מסלול. לכן, אנדותל מבודד מן arteriole parenchymal הוא פונקציונלי בבידוד והוא יכול לשמש כדי ללמוד מרכיבים מרכזיים של מסלולים הכוללים גיוס של [Ca2 +]i ו / או רגולציה של Vm באמצעות ערוצי K + .

יתר על כן, אנדותל שלם היה דגירה ב 37 °C (50 °F) עם גששים פלואורסצנטיים להדמיה כדי לבחון מורפולוגיה תאית. הדמיית תאי אנדותל חיים מראה כתמים משותפים עבור קרום פלזמה (ירוק) וגרעינים (אדום) (איור 4D). באיור 4E, קרום הפלזמה (ירוק) הוכתם יחד עם כתם רטיקולום אנדופלסמי (ER; אדום) פלואורסצנטי, לפיו אזורים של חפיפה לכאורה של ER בסמיכות לקרום הפלזמה נראים כתומים (איור 4E). תמונות פלואורסצנטיות אלה חושפות עוד יותר את השלמות התאית של אנדותל עורקי ואת השימוש האפשרי שלהם כדי לחקור מיקרודומיין איתות הממוקם במתחמי ממברנות צומת.

Figure 1
איור 1: בדיקה של צינור אנדותל עורקי מבודד טרי מן העורקים parenchymal העכבר. כפי שמתואר, המוח מבודד מעכבר, ופיסת רקמת מוח מלבנית המכילה את ה- MCA הוסרה. עורקים פרנצ'ימליים המסתעפים מה- MCA ונכנסים לפרנצ'ימה במוח מבודדים. Arterioles מתעכלים אנזימטית triturated, לייצר צינור אנדותל שלם למחקר. צינור האנדותל המוכן מאפשר מדידה של דינמיקה תאית Ca2 + ו- Vm תוך מתן אפשרות גם הדמיה תאית להדמיית פלואורסצנטיות ואימונוהיסטוכימיה. קיצורים: MCA = עורק מוחי אמצעי; Vm = פוטנציאל ממברנה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ניתוח ובידוד של עורקים פרנצ'ימליים. (A) מוח עכבר מבודד עם מעגל וויליס שלם. (B) חתיכה מלבנית מנותחת של רקמת מוח המכילה את ה- MCA (חץ לבן). (ג) בידוד של פיא מהחלק העליון של הרקמה (עורקי, חץ כחול). (D) Arterioles (מסומן בראשי חץ כחולים) המחוברים לעורקים מוחיים אמצעיים (חצים צהובים). (ה) זיהה עורק (חץ כחול) ברקמת המוח. (ו) הוצאת העורקים (חץ כחול) מהרקמה המשוחררת. שים לב כי לוחות E ו - F מציינים שיטה חלופית לבידוד העורקים (ראה שלב פרוטוקול 3.2.3). סרגלי קנה מידה = 2 מ"מ (A, B, C), 0.2 מ"מ (D) ו 1 מ"מ (E, F). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הכנת צינורות אנדותל מעורקיים פרנצימליים. (A) עורקים מבודדים ונקיים (חץ כחול). (B) טריטורציה של עורקים מתעכלים חלקית באנזים. (ג) צינור אנדותל שלם (הגדלה: 100x) מוכן ומאובטח על כיסוי הזכוכית באמצעות פיפטות הצמדה. (D) צינור אנדותל בהגדלה של פי 200. סרגלי קנה מידה = 0.2 מ"מ (A), 0.1 מ"מ (B, C) ו- 0.05 מ"מ (D). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: יישום צינור אנדותל לבדיקה פיזיולוגית של מסלולים הקשורים לוויסות זרימת הדם. (A) אלקטרודה חדה (חץ סגול) ממוקמת בתא של צינור אנדותל המתמקד בחלון רכישת הנתונים לפוטומטריה. (ב) הקלטה מייצגת של Ca2 תאיים + באמצעות פוטומטריה Fura-2 בתגובה MTA (1 μM). (ג) הקלטה מייצגת של Vm בו זמנית עם מעקב Ca2 + תאיים בלוח B. (D) תמונה מייצגת של קרום פלזמה (ירוק) וגרעינים (אדום) של תאי אנדותל חיים מוכתמים בצבעי פלואורסצנט. (E) תמונה מייצגת של קרום פלזמה (ירוק) ורשת רטיקולום אנדופלסמי (ER, אדום) של תאי אנדותל חיים מוכתמים בצבעים פלואורסצנטיים. אזורי קרבה לחדר מיון וקרום פלזמה מסומנים בכתום. התמונות נרכשו באמצעות מצלמה בשחור-לבן והיו בצבע פסאודו. סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר (D), 10 מיקרומטר (E). קיצורים: MTA = 2-מתילתיואדינוסין דיפוספט; F340/F380 = אות יחס צבע פורה-2; Vm = פוטנציאל ממברנה; PM = קרום פלזמה; ER = רשתית אנדופלסמית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ראיות הולכות וגדלות מצביעות על כך שמחלות כלי דם במוח (CVD), הזדקנות ומחלת אלצהיימר קשורות קשר הדוק והן נושא נוכחי של מחקר דמנציה 4,8,14,21. לכן, ברור כי מחקרים של רשת כלי הדם במוח תהיה השפעה רחבה על הבריאות תוך דרישת המשך חקירה מקיפה במהלך תנאי המחלה. כנקודה משמעותית של עמידות כלי דם עבור זלוף מוחי, החשיבות הכללית של arterioles parenchymal באטיולוגיה ופיתוח של CVD הודגש במשך 50 שנים22.

עם זאת, כלי בדיקה מדעיים לא פותחו כראוי כדי לחקור עורקי parenchymal שלמים וסוגי התאים המורכבים שלהם עד הופעתם האחרונה של גישות ex vivo כגון מבודד, בלחץ parenchymal arteriole11 ו CaPA12 הכנות. תחום הפיזיולוגיה של כלי הדם במוח ייהנה גם מטכניקות משלימות במודלים של מחקר הומו-תאי (שרירים חלקים, פריקיטים ואנדותל) כדי להתמקד בסוגי תאים ספציפיים ובמאפיינים הגנטיים והפרמקולוגיים שלהם שבבסיס ויסות זרימת הדם המוחית וחדירות מחסום הדם - מוח (BBB).

האנדותל הוא איבר רגולטורי מרכזי ש"מזין" את כל האיברים האחרים בכל הגוף, כולל המוח23. למרות כל מקטעי כלי הדם (עורקים, arterioles, נימים, venules, ורידים) חיוניים עבור זלוף מוחי, אנדותל של arterioles דורש חקירה ייעודית כמרכיב מרכזי autoregulation כלי דם במוח צימוד נוירווסקולרי24. יתר על כן, Ca2 + איתות25 ו K + פעילות ערוץ17,26 נראה משופרת במהלך הרגולציה של טון myogenic ב arterioles parenchymal ביחס לעורקי pial. לכן, עכשיו הרחבנו את השיטה שנקבעה בעבר עבור העורקים המוחיים pial (האחורי)13 כדי arterioles parenchymal.

יחסית לגישות אלה שאוירו בעבר 11,13, פרוטוקול זה שוכלל על ידי התאמה אמפירית של צעדים שונים (למשל, טיפול אנזימטי, טריטורציה) כדי להניב באופן רבייה צינורות אנדותל שלמים מעורקי פרנכימל. בנוסף, פרוטוקול זה מדגים את השימוש במודל מחקר זה כדי לייעל את היישום של פוטומטריה תאית, אלקטרופיזיולוגיה והדמיה פלואורסצנטית (איור 4). עם עוצמות ומגבלות כלליות של פוטומטריה Fura-2 ואלקטרופיזיולוגיה אלקטרודה חדה שתוארה בעבר בפירוט13, הנסיין מוזמן לנסות מערך של בדיקות אחרות של Ca2 + איתותים וערוץ יונים כדי לבדוק השערות ספציפיות של עניין. יתר על כן, קידום ויצירת מודלים גנטיים חדשניים עם אינדיקטורים מקודדים גנטית ספציפיים לתאי אנדותל (למשל [Ca2+]i27 ואינדיקטורים מתח28) יכולים להרחיב את התועלת של הכנה זו.

להקשר חקירתי, מודל אנדותל מבודד זה שימושי לשאלות מחקר הדורשות ללמוד את תפקידו של האנדותל העורקים בוויסות דינמיקת כלי הדם, לפיה מדידות פנים en אינן אפשריות מבחינה ניסיונית בשל גודלם הקטן. ויסות אנדותל של זרימת הדם במוח מתחיל עם הפעלה של קולטנים שונים G-חלבון מצמיד (למשל, purinergic, muscarinic)18 ו יון ערוצים (TRPV329, TRPA15, קולטני NMDA8). הפעלה של קולטני G-סוגq כרוכה phosphatidylinositol 4,5-ביספוספט (PIP2) lipolysis כדי ליצור אינוזיטול טריספורספט (IP3) ו diacylglycerol עבור [Ca2+]i גיוס שיכול לתווך הפעלת ערוץ K + לשינויים Vm15. פעילות ערוץ K + , ובכך Vm בלבד, ניתן ללמוד גם ישירות בתנאים פיזיולוגיים2 או באמצעות פילוח פרמקולוגי נבחר30. יתר על כן, צינור אנדותל arteriolar מאפשר הדמיה פלואורסצנטית משופרת של שיפוץ קרום פלזמה נבחר (למשל, פיליפין-III), אברונים תאיים (למשל, גשש ER), צימוד תא לתא (למשל, יודיד פרופילום)18,19. לפיכך, תכונה נוספת של מודל המחקר כרוכה בשיוך יעיל של מורפולוגיה תאית והיסטולוגיה עם פרמטרים של תפקוד, כגון Ca2 + ואיתות חשמלי, בהזדקנות ובהתפתחות מחלות כרוניות.

מרכיבי הפרוטוקול הראויים לתשומת לב מיוחדת הם ניתוח עורקי, עיכול אנזימטי, טריטורציה, ואבטחת צינור האנדותל העורקים למדידות. במהלך ניתוח מהמוח, יש להימנע מנזק לעורקי הפרנצ'ימלי בכל מחיר כדי להבטיח עיכול וטריטורציה מוצלחים לבידוד שכבת אנדותל שלמה ותפקודית. יתר על כן, מתיחה מוגזמת תוך אבטחת צינור האנדותל בתא הזלוף תהרוס גם את ההכנה, ולמעשה תשלול את כל שלבי הפרוטוקול הקודמים.

בדיקות הכדאיות יש ליישם כדי להבטיח כי צינורות אנדותל arteriolar מתפקדים ביחס לרכיבים פיזיולוגיים מפתח כגון Ca2 + איתות (זרם ו /או שחרור תאי) בעקבות גירוי של קולטנים מצמידים חלבון G, מידת Vm hyperpolarization, צימוד בין תאי חזק דרך צמתים פער18,23. דוגמאות לבקרות כאלה כוללות גירוי פורינרגי הפיך באמצעות MTA (1 מיקרומטר; Δ[Ca2+]i ~ 300 nM; ≥10 mV hyperpolarization; איור 4B,C), הפעלה הפיכה של SKCa/IKCa באמצעות NS309 (1 מיקרומטר; ≥20 mV hyperpolarization), ו/או התכתבות בין ההזרקה הנוכחית (למשל, ~-1 nA) לתא אחד ותגובות Vm (~-10 mV) של אחר במרחק של ≥250 מיקרומטר18,31. עם תרגול, טיפול והקפדה ניסיונית, הפרוטוקול כולו ניתן לשחזור אם ללומד יש סבלנות והתמדה.

לשיטה זו יש מגבלות מרכזיות לטיפול, כגון שפע לא מספיק של דגימות (למשל, חומצות גרעין, חלבונים ושומנים) ושבריריות יחסית לניסויים ביוכימיים והקלטות תאים חיים, בהתאמה. עם זאת, ניתן להימנע מאזהרת ביולוגיה מולקולרית זו על ידי איגום ממספר בעלי חיים ו / או פיתוח שיטות כמות של רגישות ותפוקה גבוהות יותר. אם הטמפרטורה הפיזיולוגית תישמר על 37 °C (50 °F), מסגרות זמן ניסיוניות קצרות (≤1 שעות) יידרשו עם התערבויות פרמקולוגיות ממוקדות בלבד. בנוסף, זה יהיה מאתגר מאוד לבודד צינורות אנדותל arteriolar מבעלי חיים לטווח קרוב או שזה עתה נולדו (<-1 חודשים), פוטנציאל מניעת מחקרים של התפתחות כלי דם מוחיים.

שיקולים אחרים מקיפים את ההרכב המדויק של צינורות אנדותל כלי דם מוחיים, פוטנציאל הדורש גישות נבחרות של immunofluorescence ואלקטרופיזיולוגיה. לדוגמה, קרום המרתף (המורכב בעיקר קולגן 4, למינין ופיברונקטין) פועל לאורך עץ כלי הדם במוח. זה ידוע בתרומתו לשלמות של BBB שנוצר על ידי תאי אנדותל נימי המוח32. יש לציין כי מודל מחקר זה לא יכול להיות מתאים לניסויים חדירות BBB כמו רכיבי קרום המרתף הם מצעים של קוקטייל האנזים המשמש לעיכול חלקי של צינורות אנדותל arteriolar, בפרט, תערובת קולגנאז H. יתר על כן, יישום של קוקטייל אנזים סלקטיבי, הסרת הלמינה האלסטית הפנימית, וזיהוי ברור של תאי אנדותל לכל מבנה (סידור מקביל לעומת היקף לתאי שריר חלקים), מורפולוגיה (צורת "דמעה" של תאי אנדותל לעומת תאי שריר חלקים בצורת ציר), ואלקטרופיזיולוגיה (למשל, היפר-קוטביזציה לגירוי GPCR), מבטלת תרומות פיזיולוגיות של תאי שריר חלקים ופריקים. לבסוף, הנסיין חייב לשים לב להטרוגניות של תאי אנדותל (פרופיל ביטוי גנים, מבנה, פונקציה) לכל סוג איבר (למשל, מוח, לב, ריאה33) בנוסף לאזור המוח (למשל, קליפת המוח 9,34, היפוקמפוס10) ופילוח כלי דם בהתאמה (למשל, עורקים, עורקים ונימים 9,34,35 ). לכן, מחקר מקיף של ויסות זרימת הדם במוח ידרוש גם ex vivo משלים (למשל, מיאוגרפיה בלחץ תוך וסקולרי, הכנה עורקית נימית-parenchymal) ו in vivo (למשל, דופלר לייזר תוך מוחי) גישות של מקטעי ורשתות כלי דם שלמים.

לסיכום, מאמר זה מציג טכניקה מתקדמת המדגימה כיצד להכין צינור אנדותל שלם מבודד טרי מן העורקים parenchymal המוח עכבר. אנו צופים כי גישה זו תשלים ו/או תבנה ממודלים של מחקר כלי דם שלמים . המטרה הכוללת היא לייצר מידע חדש להבנת מנגנונים העומדים בבסיס זרימת הדם המוחית ברמה הבסיסית לפיזיולוגיה ולבחור מעברים לפתולוגיה לטיפול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (R00AG047198 & R56AG062169 ל- EJB; R00HL140106 ל- PWP) ואיגוד האלצהיימר (AZRGD-21-805835 ל- PWP). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות או האגודה לאלצהיימר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifiers Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Audible baseline monitors Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA  BM-A-TM
Bath Chiller (Isotemp 500LCU) ThermoFisher Scientific 13874647
Borosilicate glass capillaries (Pinning) Warner Instruments G150T-6
Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) Warner Instruments GC100F-10
Borosilicate glass capillaries (Trituration) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA 1B100-4
BSA: Bovine Serum Albumin Sigma A7906
CaCl2: Calcium Chloride Sigma 223506
Collagenase (Type H Blend) Sigma C8051
Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) ThermoFisher Scientific 12-548-5M
Data Acquision Digitizer Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Digidata 1550A
Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA DD-90-S-BLK
Dithioerythritol Sigma D8255
DMSO: Dimethyl Sulfoxide Sigma D8418
Elastase (porcine pancreas) Sigma E7885
Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) ThermoFisher Scientific E34250
Fiber optic light sources  Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss Fostec 8375
Flow Control Valve Warner Instruments  FR-50
Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA IonOptix Systems
Forceps (Fine-tipped, sharpened) FST Dumont #5 & Dumont #55
Function Generator EZ Digital, Seoul, South Korea FG-8002
Fura-2 AM dye Invitrogen, Carlsbad, CA, USA F14185
Glucose Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) G7021
HCl: Hydrochloric Acid ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) A466250
Headstages Molecular Devices HS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) Sigma H4034
Inline Solution Heater Warner Instruments SH-27B
KCl: Potassium Chloride Sigma P9541
MgCl2: Magnesium Chloride Sigma M2670
Microforge Narishige, East Meadow, NY, USA  MF-900
Micromanipulator Siskiyou  MX10
Micropipette puller (digital) Sutter Instruments, Novato, CA, USA P-97 or P-1000
Microscope (Nikon-inverted) Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA Ts2
Microscope (Nikon-inverted) Nikon Instruments Inc Eclipse TS100
Microscope objectives Nikon Instruments Inc 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor)
Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) Warner Instruments PM6 or PH6
Microscope Stage (Aluminum) Siskiyou, Grants Pass, OR, USA 8090P
Microsyringe Pump Controller World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA SYS-MICRO4
MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt Tocris 1624
NaCl: Sodium Chloride Sigma S7653
NaOH: Sodium Hydroxide Sigma S8045
Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) ThermoFisher Scientific R37605
Oscilloscope Tektronix, Beaverton, Oregon, USA  TDS 2024B
Papain Sigma P4762
Phase contrast objectives Nikon Instruments Inc  (Ph1 DL; 10X & 20X)
Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) ThermoFisher Scientific C10046
Plexiglas superfusion chamber Warner Instruments, Camden, CT, USA RC-27
Scissors (3 mm & 7 mm blades) Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA Moria MC52 & 15000-00
Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) World Precision Instruments 555640S, 14364
Stereomicroscopes Zeiss, NY, USA Stemi 2000 & 2000-C
Syringe filter (0.22 µm) ThermoFisher Scientific 722-2520
Temperature Controller (Dual Channel) Warner Instruments TC-344B or C
Valve Control System Warner Instruments VC-6
Vibration Isolation Table Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA  Micro-g

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
  2. Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
  3. Kelleher, R. J., Soiza, R. L. Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder. American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).
  4. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium. Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).
  5. Pires, P. W., Earley, S. Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke. elife. 7, 35316 (2018).
  6. Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease. Function. 2 (2), (2021).
  7. Zhao, L., et al. Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain. Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).
  8. Peters, E. C., et al. Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).
  9. De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
  10. Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease. Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).
  11. Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).
  12. Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).
  13. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).
  14. Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex. Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).
  15. Behringer, E. J., Hakim, M. A. Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).
  16. Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).
  17. Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
  18. Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).
  19. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice. Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).
  20. Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).
  21. Attems, J., Jellinger, K. A. The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology. BMC Medicine. 12, 206 (2014).
  22. Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).
  23. Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
  24. Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).
  25. Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
  26. Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
  27. Chen, Y. L., et al. Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice. Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).
  28. Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators. Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).
  29. Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).
  30. Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).
  31. Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).
  32. Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain. Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).
  33. Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. elife. 9, 51413 (2020).
  34. Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).
  35. Chen, M. B., et al. Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues. Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).

Tags

ביולוגיה גיליון 181 מיקרו-סירקולציה במוח היפר-קוטביות אנדותל Ca2+ איתות ערוצי K+ הדמיה תאית אלקטרופיזיולוגיה
בידוד וניתוח פונקציונלי של אנדותל עורקי של מפרקת מוח עכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hakim, M. A., Pires, P. W.,… More

Hakim, M. A., Pires, P. W., Behringer, E. J. Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma. J. Vis. Exp. (181), e63463, doi:10.3791/63463 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter