Summary
대뇌 실질 세동맥으로부터의 무손상 마우스 대뇌 내피 "튜브"의 집중적 인 준비는 뇌 혈류 조절을 연구하기 위해 예시된다. 또한, 우리는 세포 내 [Ca2+] 및 막 전위의 변화를 포함한 주요 세포 신호 전달 경로의 형광 이미징 및 전기 생리학 측정을위한 내피 연구 모델의 실험 강점을 입증합니다.
Abstract
대뇌 혈류는 혈관 저항성 동맥과 하류 실질 세동맥에 의해 전달된다. 혈류에 대한 정상 상태 혈관 저항은 궁극적으로 모세 혈관으로 공급되는 동맥에서 세동맥까지 직경이 감소함에 따라 증가합니다. 실질의 크기와 위치가 작기 때문에 세동맥은 상대적으로 과소 연구되었으며 표면 경동맥보다 소견에서 재현성이 떨어집니다. 그럼에도 불구하고, 동맥 내피 세포 구조와 기능 - 만성 퇴행성 질환의 생리학 및 병인학에 필수적인 - 광범위한 조사가 필요합니다. 특히, 새로운 증거는 손상된 내피 기능이인지 장애와 치매보다 선행하고 악화된다는 것을 보여줍니다.
실질 미세 순환에서 내피 K + 채널 기능은 신경 활동 영역으로의 혈류 증가를 촉진하기 위해 혈관 확장의 확산을 미세하게 조절하는 가장 강력한 자극입니다. 이 논문은 마우스 뇌 실질 세동맥으로부터 온전하고 전기적으로 결합된 내피 "튜브"(직경, ∼25 μm)를 신선하게 분리하기 위한 정제된 방법을 예시한다. 동맥 내피 튜브는 생리적 조건 (37°C, pH 7.4) 동안 확보되어 세포내Ca2+ 역학, 막 전위의 변화 및 막 지질 조절을 포함한 K+ 채널 기능 및 그 조절을 포괄하는 실험 변수를 해결합니다. 동맥 내피에 비해 뚜렷한 기술적 이점은 세포 및 소기관 (예를 들어, 미토콘드리아) 치수의 향상된 형태 학적 분해능이며,이 기술의 유용성을 확장시킨다. 평생 동안 건강한 대뇌 관류는 실질 세동맥의 강력한 내피 기능을 수반하며, 혈류를 뇌의 정확한 해부학 적 영역에 걸쳐 신경 및 신경교 활동의 촉진과 직접 연결합니다. 따라서이 방법은 건강하고 병든 뇌에 관한 혈관 생리학 및 신경 과학에 대한 일반적인 지식을 상당히 발전시킬 것으로 예상됩니다.
Introduction
실질 세동맥은 뇌 전체에 필수 산소와 영양소를 직접 전달합니다1. 모세혈관과 상호 작용하는 동안, 고도로 혈관 활성 세동맥은 특정 신경 영역으로부터의 대사 신호를 감지하는 모세관 이온 채널에 의해 개시되는 역행 신호전달에 반응한다2. 뇌 실질이 역사적으로 많은 조사를 받음에 따라, 치매의 기초가되는 다양한 뇌 혈관 장애 (예 : 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머 병)와 관련된 병리학 적 메커니즘을 명확히하기위한 내피 기능 장애의 역할이 등장했습니다.3,4,5,6 . 내피는 혈관 세그먼트 전반에 걸쳐 유전학, 구조 및 기능의 이질성에 따라 뇌의 관류에 필수적입니다7. Pial 동맥은 상대적으로 큰 크기, 높은 분절 혈관 저항성 및 기저 대뇌 8,9로의 혈류 분포의 역할로 인해 광범위하게 연구되었습니다. 따라서, 동맥 내피 메커니즘에 대한 더 나은 이해는 새로운 치료 요법의 개발을 향한 건강 및 질병에서의 뇌 혈류 조절에 대한 이해를 향상시킬 것입니다.
새로운 증거는 다른 신호 전달 경로 및 질병 8,10과 관련하여 실질 세동맥을 연구하는 것의 중요성을 강조합니다. 그러나, 이러한 접근법은 무손상 가압된 세동맥(11) 및/또는 모세관-실질 세동맥(CaPA) 제제(12)를 사용하는 것으로 제한되었다. 갓 분리된, 다른 세포 유형 및 교란 요인이 결여된 원시적 대뇌 동맥 내피 세포는 그들의 분리에 있어서 기술적인 어려움 때문에 검사되지 않았다. 이 논문은 pial 동맥 내피13의 분리를 강조하는 이전 기술을 발전시켜 뇌 실질 세동맥의 내피를 안정적이고 재현 가능하게 분리합니다 (폭 : ~ 25 μm, 길이 : ~ 250 μm). 이 기술은 개별 방향 및 세포 네트워크에서 전기적, 화학적으로 결합 된 세포의 최적 분해능을 달성하는 데 도움이됩니다.
관심의 주요 경로에는 세포 내 Ca2+ ([Ca2+]i) 신호 전달의 상호 작용과 혈관 확장에 필수적인 막 전위 (Vm) 14,15 (혈관 확장에 필수적 임)14,15의 과분극이 포함되어있어 혈액이 모세 혈관에 들어가고 활성 실질에 산소와 영양소를 전달할 수 있습니다 17. 이러한 제제는Ca2+-투과, TRP(transient receptor potential) 및 K+ 채널 및/또는 거의 생리학적 조건에서 내피 세포관 내의 세포내 소기관의 형광 이미징을 포함하는 이온 채널의 실시간 전기생리학적 기록을 허용한다. 이것은 뇌 실질로의 대뇌 혈류 전달의 내피 세포 조절을 지배하는 생리적 세포 메커니즘에 관심이있는 연구자들에게 적합한 기술입니다. 전체적으로,이 기술은 연구자가 뇌 혈관 생리학 및 병리학과 관련된 질문을 해결하면서 뇌 실질에 내장 된 세동맥의 근본적인 내피 신호 전달 경로 및 네트워크 통신을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
실험자는 동물 및 관련 프로토콜의 지정된 사용이 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받고 국가 연구위원회의 "실험실 동물의 관리 및 사용 가이드"(8th Edition, 2011) 및 ARRIVE 지침에 따라 수행되도록해야합니다. Loma Linda University와 University of Arizona의 IACUC는 C57BL / 6N 및 3xTg-AD 마우스 (남성과 여성, 연령대 : 2-30 개월)에 대한이 원고에 사용되는 모든 프로토콜을 승인했습니다. 뇌의 마우스 실질 세동맥으로부터 갓 분리된 동맥 내피 튜브의 분리 및 검사에 대한 개요로서 도 1 을 참조한다.
1. 재료 및 장비
참고: 이 프로토콜에 필요한 모든 시약 및 재료에 대해서는 재료 표를 참조하십시오. 또한 필요에 따라 각 공급 업체와 관련된 매뉴얼 및 웹 사이트도 참조 할 수 있습니다. 해부 스테이션 및 실험 장치의 예시는 이전에 제공되었다13.
- 교류 약실
- 유리 커버슬립이 있는 수퍼퓨전 챔버를 양극 산화 처리된 알루미늄으로 구성된 플랫폼에 고정합니다. 챔버로 플랫폼을 알루미늄 현미경 스테이지에 고정하십시오.
- 알루미늄 현미경 단계에서 플랫폼의 양쪽 끝에 핀 피펫을 고정하는 마이크로 조작기를 설정하십시오.
참고: 필요한 경우, 유동 챔버 유닛이 있는 이송 가능한 스테이지 장치를 사용하여 고정되고 격리된 내피 튜브를 한 현미경 장치에서 다른 현미경 장치로 이동시켜 실험을 진행하십시오.
- 현미경
- 해부 절차를 위해 입체 현미경 (5x ~ 50x 배율 범위)과 광섬유 광원을 사용하십시오.
- 내피 튜브를 분리하려면 위상 대비 또는 차동 간섭 대비(DIC) 호환 목표(10x, 20x 및 40x)와 알루미늄 스테이지가 장착된 반전 현미경 장비를 사용하십시오.
- 부분적으로 소화 된 혈관에서 내피 튜브를 분리하는 데 전념하는 장치 옆에 미세주사기 펌프 컨트롤러를 준비하십시오.
- 진동 격리 테이블에 반전 현미경 (목표 : 4x, 10x, 20x, 40x 및 60x)과 수동 알루미늄 스테이지를 배치하여 실험 장치를 설정하십시오.
- 세포 내 Vm 녹음 장비
- 전자계를 호환 가능한 헤드 스테이지에 연결하십시오. 전류 주입이 필요한 프로토콜에 대해 함수 생성기 및 자극기와 같은 액세서리를 사용하십시오.
- 증폭기 출력을 데이터 디지타이저 시스템, 오실로스코프 및 가청 기준 모니터에 연결합니다. 기준 배스 전극(Ag/AgCl 펠릿)을 유동 챔버 출구 근처에 고정시킵니다.
- 형광 시스템 인터페이스, 고강도 아크 램프 및 전원 공급 장치, 하이퍼 스위치, 광승수 튜브 (또는 PMT) 및 카메라의 통합 구성 요소로 광도 측정 시스템을 조립하여 내피 세포에서 [Ca2+]i 를 측정하십시오.
- 인라인 히터가 장착된 온도 컨트롤러를 조립하여 실험 전반에 걸쳐 생리적 온도(37°C)를 상승시키고 유지한다.
- 인라인 유량 제어 밸브가있는 밸브 컨트롤러에 연결된 다중 채널 플랫폼을 조립하여 챔버에 고정 된 내피 튜브에 대한 솔루션 전달을 제어하십시오.
- 마이크로 피펫 및 날카로운 전극
참고 : 실험자는 분쇄 및 고정 피펫을 준비하기위한 전자 유리 풀러와 마이크로 단조가 필요합니다.- 부분적으로 소화된 동맥 세그먼트로부터 내피 튜브를 분리하려면, 붕규산염 유리 모세관으로부터 열 연마된 분쇄 피펫(내부 팁 직경: 30-50 μm)을 준비한다.
- 내피 튜브를 과융합 챔버에 고정시키기 위해, 얇은 벽 붕규산염 유리 모세관으로부터 제조된 둔탁한 구형 단부(외경: 50-70 μm)를 갖는 열 연마된 피펫을 준비한다.
- 내피 세포의Vm 을 기록하려면 유리 풀러만을 사용하여 유리 모세 혈관에서 ~ 150 ± 30MΩ의 팁 저항을 가진 날카로운 전극을 준비하십시오.
2. 해결책과 마약
- 생리 학적 소금 용액 (PSS)
- 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mMMgCl2, 10 mMN-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산(HEPES) 및 10 mM 글루코스를 사용하여 최소 1 L의 PSS를 제조하였다.
- 대뇌동맥의 해 부 및 내피 튜브의 분리를 위해 CaCl2 (제로Ca2 + PSS)가 부족한 필요한 용액을 준비하십시오.
참고: 모든 용액을 초순수 탈이온화H2O로 준비한 후 여과(0.22μm)하십시오. 최종 제품에 삼투압이 290 ~ 300 mOsm인 pH 7.4가 포함되어 있는지 확인하십시오.
- 소 혈청 알부민 (BSA, 10%)
- 동결건조된 BSA 분말 1 g을Ca2+ PSS제로 10 mL의 비이커에 용해시킨다. 비커를 덮고 BSA가 용해되도록 천천히 교반하면서 적어도 2 시간을 허용하십시오.
- 필터 용액 10 mL 시린지를 사용하여 0.22 μm 필터를 더하고 -20°C에서 저장되도록 1 mL 분취량을 제조하였다.
- 해부 용액
- 50 mL의 총 부피에 대해 500 μL의 BSA (10%)를 제로Ca2+ PSS의 49.5 mL에 첨가한다.
- 동맥 박리를 위해 페트리 접시에 용액을 옮깁니다.
- 해리 솔루션
- 50 mL의 총 부피에 대해 5 μL의CaCl2 용액 (1 M) 및 500 μL의 BSA (10%)를 제로Ca2+ PSS의 49.5 mL에 첨가한다. 용액을 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션한다.
- 효소
- 100 μg/mL 파파인, 170 μg/mL 디티오에리트리톨, 250 μg/mL 콜라게나제(타입 H 블렌드) 및 40 μg/mL 엘라스타제로 소화액 1 mL를 준비하십시오.
참고: 효소 활성은 다양할 수 있지만, 성공적인 프로토콜에는 다음과 같은 효소 활동이 필요할 수 있습니다: 파파인의 경우 ≥ 10 unit/mg, 콜라게나제의 경우 ≥ 1 unit/mg, 엘라스타제의 경우 ≥ 5 unit/mg.
- 100 μg/mL 파파인, 170 μg/mL 디티오에리트리톨, 250 μg/mL 콜라게나제(타입 H 블렌드) 및 40 μg/mL 엘라스타제로 소화액 1 mL를 준비하십시오.
- Fura-2 및 약리학 적 제제
- Fura-2 AM 스톡을 디메틸설폭사이드(DMSO; 1 mM)로 준비한다. 로딩을 위해 495 μL의 PSS에 스톡 5 μL를 첨가하여 500 μL의 작동 농도 (10 μM)를 준비한다.
- PSS 또는 DMSO에 적어도 50 mL의 작동 농도의 약리학 제제를 적절하게 준비하십시오.
- 전도 솔루션
- KCl을 탈이온화 H2O (50 mL의H2O중 7.455 g의 KCl)에 용해시켜2M KCl을 제조하였다. 날카로운 전극을 백필하기 전에 0.22 μm 필터로 주사기를 통해 용액을 통과시킵니다.
- 형광 소기관 추적기 및 항체
- 제조업체의 지시에 따라 적절한 생리 식염수 용액에서 원형질막 또는 오르가넬라 (예를 들어, 핵, 소포체) 추적기를 준비하십시오.
- 적절한 생리 소금 용액에서 제조업체의 지시에 따라 일차 및 이차 항체를 준비하십시오.
3. 마우스 대뇌 세동맥의 해부와 분리
참고: 입체 현미경 및 선명한 미세 해부 도구(예: 미세 팁이 달린 포셉, Vannas 스타일 해부 가위)는 이러한 모든 해부 절차에서 시편 확대(최대 50배)에 사용해야 합니다.
- 마우스 뇌의 분리
- 이소플루란 흡입 (2-3 분 동안 3 %)을 사용하여 표준 실험실 마우스 (예 : C57BL / 6, 3xTg-AD; 2-30 개월, 남성 또는 여성)를 마취 한 다음 IACUC 승인에 따라 날카로운 가위 또는 단두대를 사용하여 즉시 탈구하십시오. 마우스 머리를 차가운 (4°C) 해부 용액이 들어있는 페트리 접시 (직경 10 cm, 깊이 1.5 cm)에 놓는다.
- 입체 현미경으로 보면서 두개골 위의 피부와 머리카락을 제거하고 차가운 해부 용액으로 과도한 혈액을 씻어 내십시오. 표준 해부 가위 (예 : 24mm 블레이드)의 팁을 사용하여 후두골부터 시작하여 두개골의 비강 뼈를 통해 확장되는 절개를하십시오. 굵은 팁이 달린 포셉을 사용하여 절개를 따라 두개골을 조심스럽게 열고 결합 조직 (수막)을 분리하여 손상되지 않은 윌리스 서클을 포함하는 뇌를 분리하십시오.
- 고립 된 뇌를 비커 또는 페트리 접시에 차가운 해부 용액으로 씻어 뇌 표면에서 남아있는 혈액을 제거하십시오. 뇌 복부 쪽을 위로 향하게 하여 실질 세동맥을 분리하기 위해 차가운 해부 용액이 들어있는 챔버에 놓습니다(그림 2A).
- 실질 세동맥의 분리
참고 : 중간 대뇌 동맥 (MCA)에서 발생하고 뇌 실질에 내장 된 동맥은이 프로토콜을 위해 선택됩니다. 세동맥은 앞서 기술한바와 같이 단리되고, 변형된다.- 강철 핀(직경: 0.2mm, 길이: 11 ~ 12mm)을 사용하여 숯이 주입된 실리콘 폴리머 코팅(깊이 ≥ 50cm)이 들어있는 페트리 접시의 냉간 해부 용액에 분리된 뇌를 고정시킵니다.
- 날카롭고 정렬된 해부 가위를 사용하여 MCA 주위의 뇌 조직의 직사각형(길이: 5mm, 너비: 3mm)(그림 2B)을 자르고 조직 세그먼트의 윗부분이 윌리스 원의 분기점을 지나도록 합니다. 필요한 경우 뇌의 다른 반구에서 뇌 조직의 다른 직사각형을 잘라 더 많은 세동맥에 접근하십시오.
- 분리 된 뇌 조직 세그먼트를 강철 핀 (직경 : 0.1mm, 길이 : 13 ~ 14mm)을 사용하여 MCA가 위쪽을 향하게하여 접시에 고정하십시오 (윌리스 원에서 원위). 핀 근처에서 조심스럽게 얕은 절개를 만들어 작은 집게로 피아를 제거하고 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝으로 부드럽게 벗겨냅니다 (그림 2C). 필요한 경우 다른 조직 세그먼트에서 피아를 제거하여 더 많은 세동맥에 접근하십시오. MCA에서 분기된 실질 세동맥으로 분리된 피아를 핀으로 접시에 조심스럽게 고정시키고, 실질 세동맥을 해부하여(그림 2D), 세동맥이 손상되지 않도록 한다.
참고 : 세동맥이 실질에서 피아로 쉽게 빠져 나오지 않으면 미세한 포셉을 사용하고 윌리스 서클의 MCA 분기점에서 시작하여 뇌를 파헤 치십시오. 세동맥을 찾아 세동맥 주위의 조직을 조심스럽게 느슨하게 한 다음(그림 2E), 세동맥을 실질에서 부드럽게 잡아당겨 세동맥의 위쪽 끝을 잡습니다(그림 2F). 여러 세동맥 (길이 : ~ 1.5-2mm)은 뇌 조직의 한 직사각형에서 분리 될 수 있습니다. - 세동맥이 부착된 조직이 없어도 깨끗한지 확인하고 남아있는 원위 가지를 잘라냅니다(그림 3A). 이 깨끗하고 손상되지 않은 세동맥을 효소 소화에 사용하십시오. 또는 원하는 경우 내피 튜브를 준비하기위한 효소 소화를 위해 각 세동맥을 두 조각 (길이 : 0.75-1mm)으로 자릅니다.
4. 실질 세동맥의 소화 및 내피 튜브의 준비
- 장비 및 피펫 배치
참고 : 뇌에서 동맥 내피 튜브의 분리는 이전에13,18에 기술되었습니다. 현재의 프로토콜은 실질 (대뇌 내) 세동맥에서 내피를 분리하기위한 변형을 통합합니다. 여러 세동맥 또는 / 및 세동맥 조각을 효소 소화를 위해 함께 사용할 수 있습니다.- 챔버 및 미세 조작기를 지지하는 알루미늄 스테이지를 사용하여 내피 튜브를 제조하기 위한 분쇄 장치(13 )를 조립한다. 목표물 (5x-60x)이 장착 된 현미경과 컴퓨터 모니터에 연결된 카메라를 조립하십시오. 스테이지와 시편 옆에 펌프 컨트롤러가 있는 미세주사기를 고정합니다.
- 미네랄 오일로 채워진 분쇄 피펫을 미세주사기 피스톤 위에 고정시킨다. 펌프 컨트롤러와 함께 미세 주사기를 사용하여 해리 용액을 미네랄 오일 상단의 분쇄 피펫 (~ 130 nL)으로 인출하면서 피펫의 기포를 피하십시오.
- 동맥 세그먼트의 부분 소화
- 손상되지 않은 동맥 세그먼트를 100 μg/mL 파파인, 170 μg/mL 디티오에리트리톨, 250 μg/mL 콜라게나제 및 40 μg/mL 엘라스타제가 포함된 10 mL 유리 튜브에 해리 용액 1 mL에 넣으십시오. 동맥 절편을 34°C에서 10-12분 동안 인큐베이션한다.
- 소화 후, 효소 용액을 실온에서 3-4 mL의 신선한 해리 용액으로 교체하십시오.
- 동맥 내피 튜브의 분리
참고: 효소 용액의 소화 및 교체 후, 하나 또는 여러 개의 부분적으로 소화된 세그먼트를 모바일 플랫폼에 부착된 수퍼퓨전 챔버의 해리 용액으로 옮깁니다. 100x ~ 200x 배율로 보는 동안 부분적으로 소화되었지만 깨지지 않은 용기 세그먼트를 선택하고 현미경으로 초점을 맞춥니다.- 미세주사기 주입기와 부착된 분쇄 피펫을 챔버 내의 해리 용액에 놓고 소화된 용기 세그먼트의 한쪽 끝 가까이에 위치시킨다. 부드러운 분쇄를 위해 펌프 컨트롤러에서 1-3nL/s 범위 내의 속도를 설정하십시오.
- 100x 내지 200x 배율을 유지하면서 동맥 세그먼트를 피펫으로 인출한 다음 배출하여 재림 및 평활근 세포를 해리시킨다(그림 3B). 모든 평활근 세포가 해리 될 때까지 혈관 세그먼트를 트리튜레이트하고 내피 세포 만 손상되지 않은 "튜브"로 남아 있습니다.
참고: 분쇄 중에 필요한 경우, 조심스럽게 미세한 팁이 달린 포셉을 사용하여 내피 튜브에서 해리 된 재림 및 내부 탄성 라미나를 제거하십시오. 전형적으로, 단지 몇 번의 사이클의 분쇄만이 손상되지 않은 내피 튜브를 산출한다. - 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 챔버의 유리 커버슬립에 있는 내피 튜브의 양쪽 끝을 보로실리케이트 유리 핀닝 피펫으로 고정합니다(그림 3C,D).
- 동맥 내피관 확보
- 해리 용액을 비내피 물질이 챔버 밖으로 세척되도록 하면서 과융합 용액 (2 mM CaCl2를 함유하는 PSS)으로 교체한다.
- 모바일 플랫폼의 보안 내피 튜브를 연속 과융합 및 세포 내 또는 형광 기록 / 이미징을 위해 설계된 현미경 장비로 옮깁니다.
- 실험 중에 PSS의 지속적인 전달을 적용하십시오. 인라인 유량 제어 밸브를 사용하여 실험 전반에 걸쳐 유량 (5-7 mL / min)을 수동으로 설정하고, 층류와 일치하면서 용액 흐름의 공급을 진공 흡입 정도까지 일치시킵니다. 배경 데이터 및/또는 염료 로딩을 획득하기 전에 내피 튜브의 과융합을 위해 챔버로 PSS 유동의 ≥5분을 허용하십시오.
5. 세포 생리학 검사를위한 동맥 내피 튜브의 활용
참고: 분리되고 확보된 동맥 내피관은 앞서 예시된바와 같이 각각 광도계 및 예리전극 전기생리학을 사용하여 [Ca2+]i 역학 및 Vm의 세포내 기록에 사용될 수 있다(그림 4). [카2+] i 및Vm은 필요에 따라 별도의 또는 조합된 실험 변수(13)로서 측정될 수 있다(그림 4). 그러나 동맥 내피 튜브는 동맥 내피보다 섬세하며 실험 시간은 1 시간을 초과해서는 안됩니다.
- [Ca2+]i의 측정
- 5-7 mL/min의 유속으로 연속 과융합을 유지하면서 [Ca2+]i 레코딩용 장비 및 소프트웨어를 켭니다.
- 상온에서 30분 동안Ca2+ 염료 Fura-2 AM으로 내피 튜브를 로딩하십시오. 세포를 또 다른 20-30분 동안 과융합 용액으로 세척하면서 욕조 온도를 37°C로 서서히 상승시킨다. 실험 내내 온도를 37°C로 유지한다.
- 광도계 소프트웨어를 사용하여 이미징 창을 수동으로 조정하여 ~20개의 내피 세포에 초점을 맞춥니다(그림 4A). 빛이 없을 때, 형광 계면에서 PMT를 돌리고 510nm에서 형광 방출을 수집하면서 340nm 및 380nm에서 교대로 (≥10Hz) 흥미 진진한 Fura-2에 의해 [Ca2+]i 의 획득을 시작하십시오. 일단 [Ca2+]i 의 안정한 기준선 기록이 확립되면, 실험 목적에 따라 약리학적 제제(예를 들어, 퓨리너성 수용체 작용제)를 적용한다(도 4B).
- Vm의 측정
- Vm 레코딩용 장비 및 소프트웨어를 켜고 5-7mL/min의 유속으로 연속 과융합을 유지하면서 데이터 수집 속도(≥10Hz)를 설정합니다. 욕조 온도를 37°C로 서서히 올리고 실험이 끝날 때까지 유지한다.
- 붕규산염 유리 모세관, 2 M KCl로 백필을 사용하여 날카로운 전극을 당기고 전자계에 부착 된 피펫 홀더의 염화물로 코팅 된은 와이어 위에 고정하고, 차례로 마이크로 매니퓰레이터에 의해 고정됩니다.
- 4x 목표를 통해 보는 동안 미세 조작기를 사용하여 동맥 내피 튜브의 셀 바로 위에 날카로운 전극 팁을 챔버의 흐르는 PSS로 조심스럽게 배치하십시오.
- 점차적으로 배율을 400x로 늘리고 필요에 따라 전극 팁을 재배치합니다.
- 미세 조작기를 사용하여 날카로운 전극의 끝을 내피 튜브의 셀 중 하나에 부드럽게 삽입하고 전자계를 사용하여 Vm을 기록하기 시작합니다 (그림 4A).
- 일단 내피 휴지Vm 이 안정하면(-30 내지 -40 mV), 실험 목적에 따라 원하는 약리학적 제제를 적용한다(도 4C).
6. 세포 영상
참고: 모바일 플랫폼의 챔버에 고정된 내피 튜브는 표준 형광 또는 공초점 현미경을 사용하여 라이브 및 고정 조건(19 ) 모두에서 현미경 이미징에도 사용할 수 있습니다. 수용체 및 이온 채널에 대한 상이한 항체를 갖는 면역조직화학은 또한 앞서 기술된 바와 같이 적용될 수 있다(20).
- 내피 튜브를 원형질막 또는 원하는 소기관(예를 들어, 핵, 소포체)에 대한 형광 추적기로 로딩하여 37°C에서 15-30분 동안 로딩한다.
- 세포를 신선한 과융합 PSS로 세척하고 각 염료의 여기 파장에서 현미경으로 살아있는 세포를 이미지화하십시오 (그림 4D, E).
참고: 면역조직화학은 관심있는 항체를 사용하여 이 튜브 모델에서 수행될 수 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
프로토콜의 데모는 각각 도 2 및 도 3과 같이 동맥 박리 및 내피관 분리 단계를 갖는 도 1에 도시되어 있다. 여기서, 내피 기능은 37°C에서 약리학적 제제[2-메틸티오아데노신 디포스페이트(MTA), 강력한 퓨리네르성 수용체(P2YR) 작용제]에 반응하여 Fura-2 광도계 및 샤프 전극 전기생리학(도 4A)을 사용하여 [Ca2+]i 및 Vm을 측정함으로써 평가하였다. MTA(1 μM)를 적용하면, [Ca2+]i는 수반되는 과분극과 함께 급속히 증가한다(도 4B). 이러한 측정은Gq-단백질 결합 수용체(P2YR)의 활성화에 이어 내피 의존성 과분극(EDH) 혈관 확장 경로를 개시하는 소-중간 및 중간 전도도Ca2+-활성화된 K+ 채널(SK Ca/IKCa)의 활성화를 반영한 것이다. 따라서, 실질 세동맥으로부터 분리된 내피는 단리에서 기능적이며, K+ 채널을 통한 [Ca2+]i의 동원 및/또는Vm의 조절을 포함하는 경로의 주요 성분을 연구하는데 사용될 수 있다.
또한, 무손상 내피를 가시화를 위해 형광 추적기와 함께 37°C에서 인큐베이션하여 세포 형태를 조사하였다. 살아있는 내피 세포 영상은 원형질막(녹색) 및 핵(적색)에 대한 공동 염색을 보여준다(도 4D). 도 4E에서, 원형질막(녹색)은 소포체(ER; 적색) 형광 염색과 함께 염색되었고, 이에 의해 원형질막의 근접성 내에서 ER의 겉보기 중첩의 영역은 주황색으로 나타난다(도 4E). 이러한 형광 이미지는 동맥 내피의 세포 완전성과 접합막 복합체에 위치한 신호 전달 마이크로도메인을 연구하는 데 사용 가능한 것을 추가로 보여줍니다.
그림 1: 마우스 실질 동맥으로부터 갓 분리한 동맥 내피관의 검사. 도시된 바와 같이, 뇌는 마우스로부터 분리되고, MCA를 함유하는 직사각형 뇌 조직의 조각이 제거되었다. 실질 세동맥은 MCA에서 분기하고 뇌 실질에 들어가 격리됩니다. 동맥은 효소적으로 소화되고 분쇄되어 연구를 위해 손상되지 않은 내피 튜브를 생성합니다. 준비된 내피 튜브는 세포 내Ca2+ 역학 및Vm 의 측정을 가능하게 하는 동시에 형광 이미징 및 면역조직화학을 위한 세포 이미징을 가능하게 합니다. 약어: MCA = 중간 대뇌 동맥; Vm = 막 전위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 실질 세동맥의 해부 및 분리. (A) 윌리스의 원형이 손상되지 않은 격리된 마우스 뇌. (B) MCA를 함유하는 뇌 조직의 해부된 직사각형 조각(백색 화살표). (c) 조직의 상부로부터 피아의 분리 (동맥, 파란색 화살표). (D) 중간 대뇌 동맥 (노란색 화살표)에 연결된 동맥 (파란색 화살촉으로 윤곽선). (e) 뇌 조직에서 세동맥(파란색 화살표)을 확인하였다. (f) 느슨해진 조직으로부터 세동맥(파란색 화살표)을 뽑아낸다. 패널 E 및 F는 세동맥의 단리를 위한 대안적인 방법을 나타낸다는 점에 유의한다(프로토콜 단계 3.2.3 참조). 스케일 막대 = 2mm(A,B,C), 0.2mm(D) 및 1mm(E,F)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 실질 세동맥으로부터 내피 튜브의 제조. (A) 분리되고 깨끗한 세동맥 (파란색 화살표). (b) 부분적으로 효소-소화된 동맥류의 분쇄. (c) 무손상 내피관(배율: 100x)을 준비하여 피펫을 이용하여 유리 커버슬립에 고정한다. (d) 200x 배율에서의 내피 튜브. 스케일 막대 = 0.2mm(A), 0.1mm(B, C) 및 0.05mm(D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 혈류 조절과 관련된 경로의 생리 학적 검사를위한 내피 튜브의 적용. (A) 날카로운 전극 (보라색 화살표)이 광도계를위한 데이터 수집 창에 초점을 맞춘 내피 튜브의 세포에 위치합니다. (b) MTA (1 μM)에 반응하여 Fura-2 광도측정법을 이용한 세포내 Ca2+의 대표적인 기록. (c) 패널 B에서 세포내Ca2+ 트레이스와 동시에Vm의 대표적인 기록. (d) 형광염료로 염색된 살아있는 내피세포의 원형질막(녹색)과 핵(적색)의 대표적인 이미지. (e) 형광염료로 염색된 살아있는 내피세포의 원형질막(녹색)과 소포체(ER, 적색)의 대표적인 이미지. ER 및 원형질막에 대한 근접 영역은 주황색으로 표시됩니다. 이미지는 흑백 카메라를 사용하여 획득되었으며 의사 색상으로 처리되었습니다. 스케일 바 = 20 μm (D), 10 μm (E). 약어: MTA = 2-메틸티오아데노신 디포스페이트; F340/F380 = Fura-2 염료 비 신호; Vm = 막 전위; PM = 원형질막; ER = 소포체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
성장하는 증거는 뇌 혈관 질환 (CVD), 노화 및 알츠하이머 병이 강하게 상관 관계가 있으며 치매 연구4,8,14,21의 현재 주제임을 시사합니다. 따라서 뇌 혈관 네트워크에 대한 연구가 건강에 광범위한 영향을 미치면서 질병 상태 동안 지속적인 광범위한 조사가 필요하다는 것은 분명합니다. 뇌 관류에 대한 혈관 저항의 중요한 포인트로서, CVD의 병인 및 발달에서 실질 세동맥의 일반적인 중요성은 50 년 이상22 년 동안 강조되었습니다.
그러나, 과학적 검사 도구는 단리된, 가압된 실질 세동맥11 및 CaPA12 제제와 같은 생체외 접근법의 최근 개시 전까지 온전한 실질 세동맥 및 이들의 복합 세포 유형을 연구하기 위해 적절하게 개발되지 않았다. 뇌 혈관 생리학 분야는 또한 동종 세포 연구 모델 (평활근, 혈관주위 세포 및 내피)의 보완 기술로부터 특정 세포 유형과 뇌 혈류 조절 및 혈액 뇌 장벽 (BBB) 투과성의 기초가되는 유전 적 및 약리학 적 특성에 초점을 맞출 것입니다.
내피는 뇌(23)를 포함한 몸 전체의 다른 모든 장기를 "공급"하는 중앙 조절 기관이다. 모든 혈관 세그먼트 (동맥, 세동맥, 모세 혈관, 정맥, 정맥)가 뇌 관류에 필수적이지만, 세동맥의 내피는 뇌 혈관 자동 조절 및 신경 혈관 결합24의 중심 구성 요소로서 헌신적 인 조사가 필요합니다. 또한,Ca2+ 신호전달 25 및 K+ 채널 활성17,26은 피알 동맥에 비해 실질 세동맥에서 근생성 톤의 조절 동안 강화되는 것으로 보인다. 따라서, 우리는 이제 pial 대뇌 동맥 (후방)13에 대한 이전에 확립 된 방법을 실질 세동맥으로 확장했습니다.
이들 이전에 예시된 접근법(11,13)에 대하여, 이 프로토콜은 실질 세동맥으로부터 무손상 내피 튜브를 재현가능하게 산출하기 위해 다양한 단계들(예를 들어, 효소적 처리, 분쇄)을 경험적으로 조정함으로써 정제되었다. 또한, 이 프로토콜은 세포 광도측정, 전기생리학 및 형광 이미징의 적용을 최적화하기 위해 이 연구 모델의 사용을 입증한다(그림 4). Fura-2 광도계 및 샤프 전극 전기생리학의 일반적인 강점과 한계로 인해 앞서13에서 자세히 설명했듯이, 실험자는 관심있는 특정 가설을 테스트하기 위해 다른Ca2+ 신호전달 및 이온 채널 분석의 어레이를 시도하는 것이 좋습니다. 또한, 내피 세포 특이적 유전적으로 암호화된 지표(예를 들어, [Ca2+]i27 및 전압 28 지표)를 갖는 신규한 유전자 모델의 발전 및 생성은 이 제제의 유용성을 확장시킬 수 있다.
조사 맥락을 위해,이 고립 된 내피 모델은 혈관 역학의 조절에서 동맥 내피의 역할을 연구해야하는 연구 질문에 유용하며, 이로 인해 얼굴 측정은 크기가 작기 때문에 실험적으로 실현 가능하지 않습니다. 대뇌 혈류의 내피 조절은 다양한 G-단백질 결합 수용체 (예를 들어, 화농성, 무스카린성)18 및 이온 채널 (TRPV329, TRPA15, NMDA 수용체8)의 활성화로 시작된다. Gq형 수용체의 활성화는 포스파티딜이노시톨 4,5-비스포스페이트(PIP2) 지방분해를 수반하여 이노시톨 트리스포스페이트(IP3) 및 디아실글리세롤을 생성하고, 이어서Vm15의 변화에 대한 K+ 채널 활성화를 매개할 수 있는 [Ca2+]i 동원을 수반한다. K+ 채널 활성은, 이에 의해Vm 단독으로, 또한 생리학적 조건(2) 하에서 또는 선택된 약리학적 표적화(30)를 통해 직접 연구될 수 있다. 더욱이, 동맥 내피 튜브는 선택된 원형질막 리모델링 (예를 들어, Filipin-III), 세포내 소기관 (예를 들어, ER 추적기), 및 세포-세포 커플링 (예를 들어, 프로피듐 요오드화물)18,19의 향상된 형광 시각화를 가능하게 한다. 따라서, 연구 모델의 또 다른 특징은 노화 및 만성 질환의 발달에서Ca2+ 및 전기 신호전달과 같은 기능의 파라미터와 세포 형태학 및 조직학의 효과적인 결합을 수반한다.
특별한주의를 기울여야하는 프로토콜의 구성 요소는 동맥 해부, 효소 소화, 분쇄 및 측정을위한 동맥 내피 튜브의 확보입니다. 뇌에서 해부하는 동안, 실질 세동맥의 손상은 손상되지 않은 기능적 내피층을 격리하기위한 성공적인 소화 및 분쇄를 보장하기 위해 모든 비용으로 피해야합니다. 또한, 관류 챔버 내에 내피 튜브를 고정시키면서 과도한 연신은 또한 준비를 파괴하여, 이전의 모든 프로토콜 단계를 효과적으로 부정할 것이다.
생존력 시험은 G-단백질 결합 수용체의 자극,Vm 과분극의 정도, 갭 접합18,23을 통한 강력한 세포 간 결합에 따른Ca2+ 신호전달(유입 및/또는 세포내 방출)과 같은 주요 생리적 성분과 관련하여 동맥 내피관이 기능적인지 확인하기 위해 적용되어야 한다. 이러한 조절의 예에는 MTA를 이용한 가역적 순수성 자극 (1 μM; Δ[Ca2+]i ~ 300 nM; ≥10 mV 과분극; 도 4B,C), NS309를 이용한 가역적 SKCa/IKCa 활성화(1 μM; ≥20 mV 초분극), 및/또는 ≥250 μm 18,31의 거리에서 한 셀로의 전류 주입(예를 들어, ~-1 nA)과 다른 셀의Vm 응답(~-10 mV) 사이의 대응. 연습, 보살핌 및 실험적 엄격함으로 학습자가 인내와 인내심을 가지고 있다면 전체 프로토콜을 재현 할 수 있습니다.
이 방법은 샘플의 불충분한 풍부도 (예를 들어, 핵산, 단백질 및 지질) 및 생화학적 실험 및 살아있는 세포 기록에 대한 상대적 취약성과 같은 각각의 해결에 대한 주요 한계를 갖는다. 그러나, 이러한 분자 생물학 주의사항은 여러 동물로부터 풀링하거나 더 높은 감도와 처리량의 정량화 방법을 고안함으로써 피할 수 있다. 생리학적 온도가 37°C로 유지되어야 하는 경우, 짧은 실험 시간(≤1 h)은 집중된 약리학적 개입만으로 요구될 것이다. 또한 동맥 내피 튜브를 단기 또는 신생아 (<1 개월) 동물로부터 분리하는 것은 매우 어려울 수 있으므로 뇌 혈관 발달에 대한 연구가 잠재적으로 배제 될 수 있습니다.
다른 고려 사항은 뇌 혈관 내피 튜브의 정확한 구성을 포함하며, 잠재적으로 면역 형광 및 전기 생리학의 선택 접근법이 필요합니다. 예를 들어, 기저막 (주로 콜라겐 IV, 라미닌 및 피브로넥틴으로 구성됨)은 대뇌 혈관 트리를 따라 달린다. 뇌 모세관 내피 세포(32)에 의해 형성된 BBB의 완전성에 대한 그의 기여로 알려져 있다. 이 연구 모델은 기저막 성분이 동맥 내피 튜브, 특히 콜라게나제 H 블렌드의 부분 소화에 사용되는 효소 칵테일의 기질이기 때문에 BBB 투과성 실험에 적합하지 않을 수 있다는 점에 유의해야 한다. 또한, 선택적 효소 칵테일의 적용, 내부 탄성 라미나의 제거, 및 구조당 내피 세포의 명확한 확인(평활근 세포에 대한 평행 배열 대 원주), 형태학(내피 세포 대 스핀들 형상 평활근 세포의 "눈물방울" 형태), 및 전기생리학(예를 들어, GPCR 자극에 대한 과분극)은 평활근 세포 및 혈관주위세포의 생리학적 기여를 제거한다. 마지막으로, 실험자는 뇌 영역(예를 들어, 피질 9,34, 해마10) 이외에 기관 유형(예를 들어, 뇌, 심장, 폐 33) 및 각각의 혈관 분할(예를 들어, 동맥, 세동맥 및 모세혈관 9,34,35)당 내피 세포 이질성(유전자 발현 프로필, 구조, 기능)을 주목해야 한다. ). 따라서, 뇌 혈류 조절에 대한 포괄적인 연구는 또한 무손상 혈관 세그먼트 및 네트워크의 상보적인 생체외 (예를 들어, 혈관내 압력 근촬영, 모세혈관-실질 세동맥 제제) 및 생체내 (예를 들어, 인tracerebral Laser Doppler) 접근법을 필요로 할 것이다.
요약하면,이 논문은 마우스 뇌 실질 세동맥에서 새로 분리 된 손상되지 않은 내피 튜브를 준비하는 방법을 보여주는 고급 기술을 제시합니다. 우리는이 접근법이 생체 내 및 손상되지 않은 혈관 연구 모델을 보완 및 / 또는 구축 할 것으로 기대합니다. 전반적인 목표는 생리학의 기본 수준에서 뇌 혈류를 뒷받침하는 메커니즘을 이해하기위한 새로운 정보를 생성하고 치료를위한 병리학으로의 전환을 선택하는 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 보건원 (R00AG047198 & R56AG062169)의 보조금으로 EJB에 지원되었습니다. R00HL140106 내지 PWP) 및 알츠하이머 협회(AZRGD-21-805835 내지 PWP). 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원 또는 알츠하이머 협회의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
| Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
| Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
| Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
| Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
| NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
| Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |
References
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Kelleher, R. J., Soiza, R. L. Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder. American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium. Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).
- Pires, P. W., Earley, S. Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke. elife. 7, 35316 (2018).
- Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease. Function. 2 (2), (2021).
- Zhao, L., et al. Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain. Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).
- Peters, E. C., et al. Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease. Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).
- Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).
- Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex. Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).
- Behringer, E. J., Hakim, M. A. Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).
- Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice. Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).
- Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).
- Attems, J., Jellinger, K. A. The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology. BMC Medicine. 12, 206 (2014).
- Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).
- Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Chen, Y. L., et al. Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice. Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).
- Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators. Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).
- Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).
- Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain. Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. elife. 9, 51413 (2020).
- Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).
- Chen, M. B., et al. Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues. Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).
