Summary
A preparação intensiva de "tubos" endoteliais cerebrais intactos de arteriolas parenchímicas cerebrais é ilustrada para o estudo da regulação do fluxo sanguíneo cerebral. Além disso, demonstramos os pontos fortes experimentais deste modelo de estudo endotelial para a medição de imagens de fluorescência e eletrofisiologia das principais vias de sinalização celular, incluindo alterações no potencial intracelular [Ca2+] e membrana.
Abstract
O fluxo sanguíneo cerebral é transmitido por artérias de resistência vascular e artérias parenchímicas a jusante. A resistência vascular de estado estável ao fluxo sanguíneo aumenta com a diminuição do diâmetro das artérias para as artérias que, em última análise, alimentam-se de capilares. Devido ao seu menor tamanho e localização no parenchyma, as artérias têm sido relativamente subestudadas e com menos reprodutibilidade em achados do que artérias piais superficiais. Independentemente disso, a estrutura e função celular endotelial arteriolar — integrante da fisiologia e etiologia de doenças crônicas degenerativas — requer uma ampla investigação. Em particular, evidências emergentes demonstram que a função endotelial comprometida precede e exacerba o comprometimento cognitivo e a demência.
Na microcirculação parênquima, a função do canal K+ endotelial é o estímulo mais robusto para controlar finamente a propagação da vasodilatação para promover o aumento do fluxo sanguíneo para áreas de atividade neuronal. Este artigo ilustra um método refinado para isolar os "tubos" endoteliais recém-isolados e eletricamente acoplados (diâmetro, ~25 μm) de artérias parenchímicas cerebrais do rato. Os tubos endoteliais arteriolares são fixados durante condições fisiológicas (37 °C, pH 7.4) para resolver variáveis experimentais que englobam a função do canal K+ e sua regulação, incluindo dinâmica intracelular Ca2+ , alterações no potencial da membrana e regulação lipídica da membrana. Uma vantagem técnica distinta versus endotélio arterial é a maior resolução morfológica das dimensões celular e organela (por exemplo, mitocôndrias), que expande a utilidade dessa técnica. Perfusão cerebral saudável ao longo da vida implica uma função endotelial robusta em artérias parenchímicas, ligando diretamente o fluxo sanguíneo ao abastecimento da atividade neuronal e gliana em regiões anatômicas precisas do cérebro. Assim, espera-se que este método avance significativamente o conhecimento geral da fisiologia vascular e da neurociência em relação ao cérebro saudável e doente.
Introduction
As artérias parenchímicas fornecem diretamente oxigênio e nutrientes essenciais em todo o cérebro1. Ao interagir com capilares, arteriolas altamente vasoativas respondem à sinalização retrógrada iniciada por canais de íons capilares que sentem sinais metabólicos de regiões neuronais específicas2. Com o parênquim cerebral tendo recebido historicamente a maior parte da investigação, um papel para a disfunção endotelial surgiu agora para esclarecer mecanismos patológicos associados a vários distúrbios cerebrovasculares que sustentam a demência (por exemplo, derrame isquêmico, doença de Alzheimer)3,4,5,6 . O endotélio é essencial para a perfusão do cérebro de acordo com a heterogeneidade da genética, estrutura e função em todos os segmentos vasculares7. As artérias piais têm sido extensivamente estudadas devido ao seu tamanho relativamente grande, alta resistência vascular segmental e papel na distribuição do fluxo sanguíneo para o cerebrum 8,9 subjacente. Assim, uma melhor compreensão dos mecanismos endoteliais arteriolares provavelmente aumentará a compreensão da regulação do fluxo sanguíneo cerebral na saúde e na doença para o desenvolvimento de novos regimes terapêuticos.
Evidências emergentes destacam a importância de estudar arteriolos parenchímicos em relação a diferentes vias de sinalização e doenças 8,10. No entanto, esta abordagem limitou-se ao uso de artéria pressurizada intacta11 e/ou preparações de arteriola capilar-parenchymal (CaPA)12. Células endoteliais arteriolares recém-isoladas e nativas desprovidas de outros tipos de células e fatores de confusão não foram examinadas, provavelmente devido a dificuldades técnicas em seu isolamento. Este artigo avança uma técnica anterior destacando o isolamento do endotélio arterial pial13 para agora isolar de forma confiável e reprodutivelmente o endotélio das artérias parenchímicas cerebrais (largura: ~25 μm, comprimento: ~250 μm). Esta técnica ajuda a alcançar a resolução ideal de células eletricamente e quimicamente acoplada em sua orientação individual e redes celulares.
Os principais caminhos de interesse incluíram a interação da sinalização intracelular Ca2+ ([Ca2+]i) e a hiperpolarização do potencial da membrana (Vm)14,15 — integral à vasodilatação16 — para permitir que o sangue entre nos capilares e entregue oxigênio e nutrientes ao parenchymaativo 17. Essas preparações permitem gravações eletrofisiológicas em tempo real de canais de íons, incluindo ca2+permeant, potencial de receptor transitório (TRP) e K+ e/ou imagens fluorescentes de organelas intracelulares dentro de tubos de células endoteliais em condições quase fisiológicas. Esta é uma técnica adequada para pesquisadores interessados em mecanismos celulares fisiológicos que regem o controle celular endotelial da entrega do fluxo sanguíneo cerebral para o parenchyma cerebral. Ao todo, essa técnica ajudará os pesquisadores a entender melhor as vias de sinalização endotelial fundamental e a comunicação em rede de arterioles incorporados no parenchyma cerebral, ao mesmo tempo em que aborda questões relacionadas à fisiologia e patologia cerebrovasculares.
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Protocol
Os experimentadores devem garantir que o uso designado de animais e protocolos associados sejam aprovados por seu Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) e realizados de acordo com o "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório" (8ª Edição, 2011) e as diretrizes do ARRIVE. O IACUC da Universidade de Loma Linda e da Universidade do Arizona aprovou todos os protocolos utilizados para este manuscrito para camundongos C57BL/6N e 3xTg-AD (machos e fêmeas; faixa etária: 2-30 meses). Veja a Figura 1 como uma visão geral do isolamento e exame de tubos endoteliais arteriolares recém-isolados das artérias pareremínmicas do cérebro.
1. Materiais e equipamentos
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para todos os reagentes e materiais necessários para este protocolo. Além disso, manuais e sites associados aos respectivos fornecedores também podem ser consultados conforme necessário. Ilustrações de estações de dissecção e aparelhos experimentais foram previamente fornecidas13.
- Câmara de fluxo
- Aperte uma câmara de superfusão com uma tampa de vidro em uma plataforma composta de alumínio anodizado. Proteja a plataforma com a câmara em um estágio de microscópio de alumínio.
- Coloque um micromanípulo segurando uma pipeta de fixação em cada extremidade da plataforma no estágio do microscópio de alumínio.
NOTA: Se necessário, use um aparelho de estágio transferível com uma unidade de câmara de fluxo para mover um tubo endotelial seguro e isolado de um aparelho de microscópio para outro para experimentação.
- Microscópios
- Use estereóscópios (faixa de ampliação de 5x a 50x) e fontes de luz de fibra óptica para procedimentos de dissecção.
- Para o isolamento dos tubos endoteliais, utilize uma plataforma de microscópio invertida equipada com objetivos compatíveis com contraste de contraste ou interferência diferencial (DIC) e um estágio de alumínio.
- Tenha um controlador de bomba de microsiringe pronto ao lado do aparelho dedicado a isolar tubos endoteliais de vasos sanguíneos parcialmente digeridos.
- Configure o aparelho experimental organizando um microscópio invertido (objetivos: 4x, 10x, 20x, 40x e 60x) e um estágio manual de alumínio em uma mesa de isolamento de vibração.
- Equipamento de gravação Vm intracelular
- Conecte o eletrometro a um headstage compatível. Use acessórios, como um gerador de função e estimulador, para protocolos que requerem injeção atual.
- Conecte as saídas do amplificador a um sistema de digitalização de dados, osciloscópio e monitores de linha de base audíveis. Fixar o eletrodo de banho de referência (pellet Ag/AgCl) perto da saída da câmara de fluxo.
- Monte um sistema fotométrico com componentes integrados de uma interface do sistema de fluorescência, lâmpada de arco de alta intensidade e fonte de alimentação, hiperswitch, tubo fotomultiplier (ou PMT) e câmera para medir [Ca2+]i em células endoteliais.
- Monte um controlador de temperatura equipado com um aquecedor inline para elevar e manter uma temperatura fisiológica (37 °C) durante todo o experimento.
- Monte uma plataforma multicanal conectada a um controlador de válvula com uma válvula de controle de fluxo em linha para controlar a entrega de soluções para tubos endoteliais fixados na câmara.
- Micropipettos e eletrodos afiados
NOTA: O experimentador precisará de um puxador eletrônico de vidro e um microforge para preparar a trituração e fixação de pipetas.- Para separar o tubo endotelial do segmento arteriolar parcialmente digerido, prepare as pipetas de trituração polidas a calor (diâmetro da ponta interna: 30-50 μm) dos capilares de vidro borossilicato.
- Para fixar o tubo endotelial na câmara de superfusão, prepare as pipetas de fixação polidas a calor com uma extremidade esférica e sem cortes (diâmetro externo: 50-70 μm) preparadas a partir de capilares de vidro borossilicato de parede fina.
- Para gravar Vm de uma célula endotelial, prepare eletrodos afiados com uma resistência de ponta de ~150 ± 30 MΩ de capilares de vidro usando apenas o puxador de vidro.
2. Soluções e drogas
- Solução fisiológica de sal (PSS)
- Prepare um mínimo de 1 L de PSS usando 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM N-2-hidroxitilpiperazine-N'-2-ácido estilesulfônico (HEPES) e 10 mM de glicose.
- Prepare as soluções necessárias que carecem de CaCl2 (zero Ca2+ PSS) para dissecção de arterioles cerebrais e isolamento do tubo endotelial.
NOTA: Prepare todas as soluções em H2O desionizado ultrapure, seguido de filtragem (0,22 μm). Certifique-se de que o produto final contenha um pH 7.4 com osmolalidade entre 290 e 300 mOsm.
- Albumina de soro bovino (BSA, 10%)
- Dissolva 1 g do pó BSA liofilizado em um béquer de 10 mL de zero Ca2+ PSS. Cubra o béquer e deixe pelo menos 2h com agitação lenta para que o BSA se dissolva.
- Solução de filtro usando uma seringa de 10 mL mais um filtro de 0,22 μm e prepare alíquotas de 1 mL a serem armazenadas a -20 °C.
- Solução de dissecção
- Adicione 500 μL de BSA (10%) a 49,5 mL de zero Ca2+ PSS para um volume total de 50 mL.
- Transferir solução para uma placa de Petri para dissecções arteriolares.
- Solução de dissociação
- Adicione 5 μL de solução CaCl2 (1 M) e 500 μL de BSA (10%) a 49,5 mL de zero Ca2+ PSS para um volume total de 50 mL. Incubar a solução em temperatura ambiente por pelo menos 1 h.
- Enzimas
- Prepare 1 mL de solução de digestão com 100 μg/mL papain, 170 μg/mL dithioerythritritol, 250 μg/mL collagenase (mistura tipo H) e 40 μg/mL elastase.
NOTA: As atividades enzimáticas podem variar, embora os protocolos bem-sucedidos provavelmente exijam as seguintes atividades enzimáticas: ≥ 10 unidades/mg para papain, ≥ 1 unidade/mg para colagem e ≥ 5 unidades/mg para elastase.
- Prepare 1 mL de solução de digestão com 100 μg/mL papain, 170 μg/mL dithioerythritritol, 250 μg/mL collagenase (mistura tipo H) e 40 μg/mL elastase.
- Fura-2 e agentes farmacológicos
- Prepare o estoque fura-2 AM em sulfóxido de dimetila (DMSO; 1 mM). Prepare 500 μL de concentração de trabalho (10 μM) adicionando 5 μL do estoque a 495 μL de PSS para carregamento.
- Prepare pelo menos 50 mL de concentrações de trabalho de agentes farmacológicos em PSS ou DMSO conforme apropriado.
- Solução de condução
- Prepare 2 M KCl dissolvendo KCl em H2O desionizado (7.455 g de KCl em 50 mL de H2O). Passe a solução através de uma seringa com um filtro de 0,22 μm antes de encher de trás os eletrodos afiados.
- Rastreadores de organela fluorescentes e anticorpos
- Prepare rastreadores de membrana plasmática ou organellar (por exemplo, núcleo, rcíteo endoplasmático) na solução salina fisiológica apropriada de acordo com as instruções do fabricante.
- Prepare anticorpos primários e secundários de acordo com as instruções do fabricante na solução de sal fisiológico apropriada.
3. Dissecção e isolamento de arteriolas cerebrais do rato
NOTA: Os esteremoscópios e as ferramentas de microdissecção afiadas (por exemplo, fórceps de ponta fina, tesoura de dissecção estilo Vannas) devem ser usados para ampliação de amostras (até 50x) em todos esses procedimentos de dissecção.
- Isolamento do cérebro do rato
- Anestesia um rato de laboratório padrão (por exemplo, C57BL/6, 3xTg-AD; 2-30 meses de idade, homem ou mulher) usando inalação de isoflurano (3% para 2-3 min), seguido de decapitação imediata usando tesoura afiada ou guilhotina por aprovação do IACUC. Coloque a cabeça do mouse em uma placa de Petri (diâmetro de 10 cm, profundidade de 1,5 cm) contendo solução de dissecção fria (4 °C).
- Ao visualizar sob um estereomicroscope, remova a pele e o cabelo sobre o crânio e lave o sangue excessivo com solução de dissecção fria. Utilizando as pontas da tesoura de dissecção padrão (por exemplo, lâminas de 24 mm), faça uma incisão começando pelo osso occipital e estendendo-se através do osso nasal do crânio. Use fórceps de ponta grosseira para abrir cuidadosamente o crânio ao longo da incisão, e tecido conjuntivo separado (membrana meningeal) para isolar o cérebro contendo um Círculo intacto de Willis.
- Lave o cérebro isolado com solução de dissecção fria em uma placa de béquer ou Petri para remover o sangue restante da superfície do cérebro. Coloque o lado ventral do cérebro voltado para cima em uma câmara contendo solução de dissecção a frio para isolamento de artérias parenchímicas (Figura 2A).
- Isolamento de arterioles parenchímicas
NOTA: As artérias arterioles decorrentes das artérias cerebrais médias (MCAs) e embutidas no parenchyma cerebral são escolhidas para este protocolo. As artérias estão isoladas como descrito anteriormente11, com modificação.- Use pinos de aço (diâmetro: 0,2 mm, comprimento: 11 a 12 mm) para fixar o cérebro isolado em solução de dissecção a frio em uma placa de Petri contendo um revestimento de polímero de silício infundido por carvão (profundidade ≥ 50 cm).
- Usando uma tesoura de dissecção afiada e alinhada, corte um retângulo do tecido cerebral (comprimento: 5 mm, largura: 3 mm) (Figura 2B) ao redor da MCA, garantindo que a parte superior do segmento tecidual passe do ponto de ramificação do Círculo de Willis. Corte outro retângulo de tecido cerebral do outro hemisfério do cérebro para acessar mais arterioles, se necessário.
- Fixar o segmento de tecido cerebral separado no prato com o MCA voltado para cima (distal do Círculo de Willis) usando pinos de aço (diâmetro: 0,1 mm, comprimento: 13 a 14 mm). Faça cuidadosamente uma incisão rasa perto dos pinos para remover a pia com pequenas fórceps, descascando suavemente de uma extremidade em direção à outra (Figura 2C). Remova a pia do outro segmento de tecido para acessar mais artérias, se necessário. Segure cuidadosamente a pia isolada com artérias parenchímicas ramificadas da MCA no prato com os pinos, e disseque as artérias parenchímicas (Figura 2D), garantindo que as artérias não sejam danificadas.
NOTA: Se as artérias não forem facilmente retiradas com a pia do parenchyma, use fórceps finos e cavem no cérebro, começando no ponto de ramificação da MCA do Círculo de Willis. Localize a arteriola, solte cuidadosamente o tecido ao redor das artérias (Figura 2E), e puxe suavemente a arteriola para fora do parenchyma, segurando a extremidade superior da artéria (Figura 2F). Múltiplas artérias (comprimento: ~1,5-2 mm) podem ser isoladas de um retângulo de tecido cerebral. - Certifique-se de que a arteriola está limpa sem tecido preso a ela e corte todos os ramos distais restantes (Figura 3A). Use esta arteriola limpa e intacta para digestão enzimática. Alternativamente, corte cada arteriola em dois pedaços (comprimento: 0,75-1 mm) para digestão enzimática para a preparação de tubos endoteliais, se desejar.
4. Digestão de artérias parenchímicas e preparação de tubos endoteliais
- Arranjo de equipamentos e pipetas
NOTA: O isolamento dos tubos endoteliais arterials do cérebro foi descrito anteriormente 13,18. O protocolo atual incorpora modificações para o isolamento do endotélio das artérias parenchymal (intracerebral). Múltiplas artérias ou/e pedaços de arteriolas podem ser usados juntos para digestão enzimática.- Monte o aparelho de trituração13 para preparar tubos endoteliais usando um estágio de alumínio que suporta uma câmara e micromanipuladores. Monte um microscópio equipado com objetivos (5x-60x) e uma câmera conectada a um monitor de computador. Fixar uma microsiringe com um controlador de bomba ao lado do estágio e espécime.
- Fixar uma pipeta de trituração com óleo mineral sobre o pistão de microsiringe. Use o microsinge com o controlador da bomba para retirar a solução de dissociação na pipeta de trituração (~130 nL) em cima do óleo mineral, enquanto toma cuidado para evitar bolhas de ar na pipeta.
- Digestão parcial dos segmentos arteriolares
- Coloque segmentos arteriolares intactos em 1 mL de solução de dissociação em um tubo de vidro de 10 mL contendo 100 μg/mL papain, 170 μg/mL dithioerythritol, 250 μg/mL collagenase e 40 μg/mL elastase. Incubar segmentos arteriolares a 34 °C por 10-12 min.
- Após a digestão, substitua a solução enzimática por 3-4 mL de solução de dissociação fresca à temperatura ambiente.
- Isolamento do tubo endotelial arteriolar
NOTA: Após a digestão e substituição da solução enzimática, transfira um ou múltiplos segmentos parcialmente digeridos para a solução de dissociação em uma câmara de superfusão anexada a uma plataforma móvel. Enquanto estiver visualizando a ampliação de 100x a 200x, selecione um segmento de vaso parcialmente digerido, mas ininterrupto, e concentre-se nele sob o microscópio.- Coloque a pipeta de trituração presa com o injetor de microsinge na solução de dissociação na câmara e posicione-a perto de uma extremidade do segmento de vaso digerido. Defina uma taxa dentro da faixa de 1-3 nL/s no controlador da bomba para trituração suave.
- Mantendo a ampliação de 100x a 200x, retire o segmento arteriolar na pipeta e, em seguida, ejete para dissociar a adventitia e as células musculares lisas (Figura 3B). Triturar o segmento do vaso até que todas as células musculares lisas sejam dissociadas, e apenas as células endoteliais permanecem como um "tubo" intacto.
NOTA: Se necessário durante a trituração, utilize cuidadosamente fórceps finos para remover a adventitia dissociada e a lâmina elástica interna do tubo endotelial. Normalmente, apenas alguns ciclos de trituração produzem um tubo endotelial intacto. - Use micromanipuladores para fixar cada extremidade do tubo endotelial na tampa de vidro na câmara com pipetas de fixação de vidro borossilicato (Figura 3C,D).
- Protegendo o tubo endotelial arteriolar
- Substitua a solução de dissociação por solução de superfusão (PSS contendo 2 mM CaCl2) ao mesmo tempo em que garante que o material não tertelial seja lavado da câmara.
- Transfira o tubo endotelial seguro na plataforma móvel para a plataforma de microscópio projetada para superfusão contínua e gravações/imagens intracelulares ou fluorescentes.
- Aplique a entrega contínua de PSS durante o experimento. Defina manualmente a taxa de fluxo (5-7 mL/min) durante todo o experimento usando a válvula de controle de fluxo inline, consistente com o fluxo laminar, ao mesmo tempo em que corresponde ao fluxo da solução à extensão da sucção do vácuo. Permita ≥5 minutos de fluxo de PSS para a câmara para superfusão do tubo endotelial antes de adquirir dados de fundo e/ou carregamento de corante.
5. Utilização de tubos endoteliais arteriolares para o exame da fisiologia celular
NOTA: Tubos endoteliais arteriolares isolados e fixados podem ser usados para gravações intracelulares de [Ca2+]i dynamics e Vm utilizando fotometria e eletrofisiologia de eletrodos afiados, respectivamente, como ilustrado anteriormente13 (Figura 4). [Ca2+] i e Vm podem ser medidos como variáveis experimentais separadas ou combinadas conforme necessário13 (Figura 4). No entanto, os tubos endoteliais arteriolares são mais delicados que o endotélio arterial, e o tempo de experimentação não deve exceder 1h.
- Medição de [Ca2+]i
- Ligue o equipamento e o software para gravações [Ca2+]i enquanto mantém a superfusão contínua a uma taxa de fluxo de 5-7 mL/min.
- Carregue o tubo endotelial com o corante Ca2+ Fura-2 AM por 30 min a temperatura ambiente. Lave as células com solução de superfusão por mais 20-30 minutos enquanto aumenta gradualmente a temperatura do banho para 37 °C. Mantenha a temperatura a 37 °C durante todo o experimento.
- Ajuste manualmente a janela de imagem usando o software de fotometria para se concentrar em ~20 células endoteliais (Figura 4A). Na ausência de luz, gire o PMT na interface da fluorescência e comece a aquisição de [Ca2+]i por excitar Fura-2 alternadamente (≥10 Hz) a 340 nm e 380 nm enquanto coleta emissão de fluorescência a 510 nm. Uma vez estabelecida uma gravação de linha de base estável de [Ca2+]i , aplique agentes farmacológicos (por exemplo, agonistas receptores purinérgicos) por objetivo experimental (Figura 4B).
- Medição de Vm
- Ligue o equipamento e o software para gravaçõesV m e defina a taxa de aquisição de dados (≥10 Hz) mantendo a superfusão contínua a uma taxa de fluxo de 5-7 mL/min. Aumente gradualmente a temperatura do banho para 37 °C e mantenha-a até o final do experimento.
- Puxe um eletrodo afiado usando um capilar de vidro borossilicato, enchimento traseiro com 2 M KCl, e fixe-o sobre um fio de prata revestido com cloreto no porta-pipetas preso a um eletrometro, que por sua vez, é mantido por um micromanipulador.
- Ao visualizar através do objetivo 4x, use um micromanipulador para posicionar cuidadosamente a ponta de eletrodo afiado logo acima de uma célula do tubo endotelial arteriolar no PSS fluindo na câmara.
- Aumente gradualmente a ampliação para 400x e reposicione a ponta do eletrodo conforme necessário.
- Usando o micromanipulador, insira suavemente a ponta de um eletrodo afiado em uma das células do tubo endotelial e comece a gravar Vm usando um eletrometro (Figura 4A).
- Uma vez que o repouso endotelial Vm esteja estável (-30 a −40 mV), aplique os agentes farmacológicos desejados por objetivo experimental (Figura 4C).
6. Imagem celular
NOTA: Tubos endoteliais fixados na câmara da plataforma móvel também podem ser usados para imagens microscópicas em condições vivas e fixas19 usando fluorescência padrão ou microscopia confocal. A imunohistoquímica com diferentes anticorpos para receptores e canais de íons também pode ser aplicada como descrito anteriormente20.
- Carregue o tubo endotelial com o rastreador de fluorescência para a membrana plasmática ou organela desejada (por exemplo, núcleo, ritúlume endoplasmático) a 37 °C por 15-30 min.
- Lave as células com PSS de superfusão fresca e células vivas de imagem sob o microscópio no comprimento de onda de excitação de seus respectivos corantes (Figura 4D,E).
NOTA: A imunohistoquímica pode ser realizada neste modelo de tubo usando anticorpos de interesse.
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Representative Results
Uma demonstração do protocolo é mostrada na Figura 1 com dissecção arteriolar e etapas de isolamento do tubo endotelial como Figura 2 e Figura 3, respectivamente. Aqui, a função endotelial foi avaliada pela medição [Ca2+]i e Vm utilizando fotometria Fura-2 e eletrofisiologia eletrodo afiada (Figura 4A) em resposta a um agente farmacológico [2-metilthioadenosine diphosphate (MTA), um potente receptor purinérgico (P2YR) agonista] a 37 °C. Após a aplicação de MTA (1 μM), [Ca2+]i aumenta rapidamente (Figura 4B) com uma hiperpolarização concomitante (Figura 4C). Essas medidas são um reflexo da ativação de receptores acoplados àproteína G q (P2YRs), seguidos da ativação de canais K+ de pequena e intermediáriacondução (SK Ca/IKCa), que iniciam uma via vasodilatética dependente de endotélio (EDH). Assim, o endotélio isolado de uma arteriola parenchímal é funcional isoladamente e pode ser usado para estudar componentes-chave de vias que envolvem mobilização de [Ca2+]i e/ou regulação de Vm via canais K+.
Além disso, o endotélio intacto foi incubado a 37 °C com rastreadores fluorescentes para visualização para examinar a morfologia celular. Imagens de células endoteliais ao vivo mostram co-coloração para membrana plasmática (verde) e núcleos (vermelho) (Figura 4D). Na Figura 4E, a membrana plasmática (verde) foi manchada juntamente com uma mancha fluorescente de ânticulo endoplasmático (ER; vermelho), pelo qual áreas de aparente sobreposição de ER nas proximidades da membrana plasmática aparecem laranja (Figura 4E). Essas imagens fluorescentes revelam ainda a integridade celular do endotélio arteriolar e seu possível uso para estudar microdomínios de sinalização localizados em complexos de membranas juncionais.
Figura 1: Exame do tubo endotelial arteriolar recém-isolado da arteriola parenchímal do rato. Como descrito, o cérebro é isolado de um rato, e um pedaço de tecido cerebral retangular contendo o MCA foi removido. Arteriolas parenchymal ramificando-se da ANM e entrando no cérebro parenchyma são isoladas. As artérias são enzimáticamente digeridas e trituradas, produzindo um tubo endotelial intacto para estudo. O tubo endotelial preparado permite a medição da dinâmica intracelular ca2+ eV m , ao mesmo tempo em que permite imagens celulares para imagens de fluorescência e imunohistoquímica. Abreviaturas: MCA = artéria cerebral média; Vm = potencial de membrana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Dissecção e isolamento de artérias parenchímicas. (A) Cérebro de rato isolado com círculo intacto de Willis. (B) Um pedaço retangular dissecado do tecido cerebral contendo o MCA (seta branca). (C) Isolamento da pia da parte superior do tecido (arteriole, seta azul). (D) Arterioles (delineados com pontas de flecha azul) conectados a artérias cerebrais médias (setas amarelas). (E) Arteriole identificada (seta azul) no tecido cerebral. (F) Retirar a artéria (seta azul) do tecido solto. Observe que os painéis E e F indicam um método alternativo para o isolamento da artéria (ver protocolo passo 3.2.3). Barras de escala = 2 mm (A,B,C), 0,2 mm (D) e 1 mm (E,F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Preparação de tubos endoteliais a partir de artérias parenchímicas. (A) Arteriole isolada e limpa (seta azul). (B) Trituração da artéria parcialmente enzimada. (C) Tubo endotelial intacto (ampliação: 100x) preparado e fixado na tampa de vidro usando pipetas de fixação. (D) Tubo endotelial a 200x de ampliação. Barras de escala = 0,2 mm (A), 0,1 mm (B, C) e 0,05 mm (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Aplicação de tubo endotelial para exame fisiológico de vias relacionadas à regulação do fluxo sanguíneo. (A) Um eletrodo afiado (seta roxa) está posicionado em uma célula de um tubo endotelial focado na janela de aquisição de dados para fotometria. (B) Registro representativo de Ca2+ intracelular usando fotometria Fura-2 em resposta a MTA (1 μM). (C) Gravação representativa de Vm simultâneo com traço intracelular Ca2+ no painel B. (D) Imagem representativa da membrana plasmática (verde) e núcleos (vermelho) de células endoteliais vivas manchadas com corantes fluorescentes. (E) Imagem representativa da membrana plasmática (verde) e reticúlumo endoplasmático (ER, vermelho) de células endoteliais vivas manchadas com corantes fluorescentes. Áreas de proximidade para ER e membrana plasmática são indicadas em laranja. As imagens foram adquiridas usando uma câmera monocromática e foram pseudocoloridas. Barras de escala = 20 μm (D), 10 μm (E). Abreviaturas: MTA = 2 difosfato de metilthioadenosina; F340/F380 = Sinal de relação de corante Fura-2; Vm = potencial de membrana; PM = membrana plasmática; ER = órticulum endoplasmático. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Evidências crescentes sugerem que a doença cerebrovascular (DCV), o envelhecimento e a doença de Alzheimer estão fortemente correlacionados e são um tópico atual de pesquisa de demência 4,8,14,21. Assim, é óbvio que estudos da rede cerebrovascular teriam um amplo impacto na saúde, ao mesmo tempo em que requerem uma investigação extensiva contínua durante as condições da doença. Como ponto significativo de resistência vascular para perfusão cerebral, destaca-se a importância geral das artérias parenchímicas na etiologia e desenvolvimento da DCV há mais de 50anos.
No entanto, as ferramentas de exame científico não foram adequadamente desenvolvidas para estudar arteriolos parenchímals intactos e seus tipos de células compostas até o recente início de abordagens ex vivo , como as preparações isoladas e pressurizadas de arteriola parenchymal11 e CaPA12 . O campo de fisiologia cerebrovascular também se beneficiaria de técnicas complementares em modelos de estudo homocelular (músculo liso, pericílitos e endotélio) para se concentrar em tipos de células específicas e suas características genéticas e farmacológicas subjacentes à regulação do fluxo sanguíneo cerebral e permeabilidade da barreira hematoencefálica (BBB).
O endotélio é um órgão regulador central que "alimenta" todos os outros órgãos em todo o corpo, incluindo o cérebro23. Embora todos os segmentos vasculares (artérias, arterioles, capilares, venules, veias) sejam essenciais para a perfusão cerebral, o endotélio das artérias requer uma investigação dedicada como componente central para a autoregulação cerebrovascular e o acoplamento neurovascular24. Além disso, a sinalização Ca2+ 25 e k+ de atividadedo canal 17,26 parecem ter sido aprimoradas durante a regulação do tom miogênico em artérias parenchymal em relação às artérias pial. Assim, estendemos agora o método previamente estabelecido para as artérias cerebrais pial (posterior)13 para arteriolas parenchímicas.
Em relação a essas abordagens previamente ilustradas11,13, este protocolo foi refinado ajustando empiricamente várias etapas (por exemplo, tratamento enzimático, trituração) para reproduzir tubos endoteliais intactos de artérias parenchímicas. Além disso, este protocolo demonstra o uso deste modelo de estudo para otimizar a aplicação de fotometria celular, eletrofisiologia e imagem fluorescente (Figura 4). Com pontos fortes gerais e limitações da fotometria Fura-2 e eletrofisiologia de eletrodos afiados descritas anteriormente no detalhe13, o experimentador é encorajado a tentar uma matriz de outros ensaios de sinalização e canal de íons Ca2+ para testar hipóteses específicas de interesse. Além disso, o avanço e a geração de novos modelos genéticos com indicadores geneticamente codificados por células endoteliais (por exemplo, [Ca2+]i27 e tensão28 indicadores) podem expandir a utilidade dessa preparação.
Para o contexto investigativo, este modelo endotelial isolado é útil para questões de pesquisa que requerem o estudo do papel do endotélio arteriolar na regulação da dinâmica vascular, pelo qual as medidas em face não são experimentalmente viáveis devido ao seu pequeno tamanho. A regulação endotelial do fluxo sanguíneo cerebral começa com a ativação de vários receptores acoplados de proteína G (por exemplo, canais purinérgicos, muscarínicos)18 e íons (TRPV329, TRPA15, receptores NMDA8). A ativação de receptores do tipoG q implica fosfatialinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) lipólise para gerar trisfosfato inositol (IP3) e diacitilglicerol para [Ca2+]i mobilização que pode então mediar a ativação do canal K+ para alterações em Vm15. A atividade do canal K+ e, portanto, Vm sozinho, também pode ser estudada diretamente sob condições fisiológicas2 ou através de um alvo farmacológico seleto30. Além disso, o tubo endotelial arteriolar permite uma visualização fluorescente aprimorada da remodelação da membrana plasmática selecionada (por exemplo, Filipin-III), organelas intracelulares (por exemplo, rastreador ER) e acoplamento celular-célula (por exemplo, iodecida propidium)18,19. Assim, outra característica do modelo de estudo implica o emparelhamento efetivo da morfologia celular e histologia com parâmetros de função, como o Ca2+ e a sinalização elétrica, no envelhecimento e no desenvolvimento de doenças crônicas.
Os componentes do protocolo que merecem atenção especial são dissecção arteriolar, digestão enzimática, trituração e fixação do tubo endotelial arteriolar para medições. Durante a dissecção do cérebro, os danos à artéria parenchymal devem ser evitados a todo custo para garantir a digestão e trituração bem sucedidas para isolar uma camada endotelial intacta e funcional. Além disso, o alongamento excessivo ao fixar o tubo endotelial na câmara de perfusão também destruirá a preparação, negando efetivamente todas as etapas anteriores do protocolo.
Testes de viabilidade devem ser aplicados para garantir que os tubos endoteliais arteriolares estejam funcionais em relação aos principais componentes fisiológicos, como a sinalização Ca2+ (influxo e/ou liberação intracelular) após a estimulação de receptores acoplados de proteína G, a extensão da hiperpolarização Vm e o acoplamento intercelular robusto através de junções de lacunas18,23. Exemplos desses controles incluem estimulação purinérgica reversível usando MTA (1 μM; Δ[Ca2+]i ~ 300 nM; ≥10 mV hiperpolarização; Figura 4B,C), ativação reversível skca/IKca usando NS309 (1 μM; ≥20 mV hiperpolarização) e/ou correspondência entre injeção atual (por exemplo, ~-1 nA) em uma célula e respostasV m (~-10 mV) de outra a uma distância de ≥250 μm18,31. Com prática, cuidado e rigor experimental, todo o protocolo é reprodutível se o aluno tiver paciência e perseverança.
Este método tem limitações fundamentais para abordar, como a abundância insuficiente de amostras (por exemplo, ácidos nucleicos, proteínas e lipídios) e relativa fragilidade para experimentos bioquímicos e gravações de células vivas, respectivamente. No entanto, esta ressalva de biologia molecular pode ser evitada através da junção de vários animais e/ou elaborando métodos de quantitação de maior sensibilidade e throughput. Se a temperatura fisiológica for mantida a 37 °C, serão exigidos prazos experimentais curtos (≤1 h) apenas com intervenções farmacológicas focadas. Além disso, seria extremamente desafiador isolar tubos endoteliais arteriolares de animais de curto prazo ou recém-nascidos (<1 meses de idade), potencialmente impedindo estudos de desenvolvimento vascular cerebral.
Outras considerações abrangem a composição precisa dos tubos endoteliais vasculares cerebrais, potencialmente exigindo abordagens selecionadas de imunofluorescência e eletrofisiologia. Por exemplo, a membrana do porão (composta principalmente de colágeno IV, laminina e fibronectina) corre ao longo da árvore vascular cerebral. É conhecida por sua contribuição para a integridade do BBB formado pelas células endoteliais capilares cerebrais32. Deve-se notar que este modelo de estudo pode não ser apropriado para experimentos de permeabilidade BBB, pois os componentes da membrana do porão são substratos do coquetel enzimante utilizado para digestão parcial de tubos endoteliais arteriolares, em particular, a mistura de colagenase H. Além disso, a aplicação de um coquetel seletivo de enzimas, remoção da lâmina elástica interna, e identificação clara de células endoteliais por estrutura (arranjo paralelo vs. circunferencial para células musculares lisas), morfologia (forma "teardrop" de células endoteliais vs. células musculares lisas em forma de fuso) e eletrofísiologia (por exemplo, hiperpolarização para estimulação GPCR), elimina contribuições fisiológicas de células musculares lisas e pericítes. Por fim, o experimentador deve tomar nota da heterogeneidade celular endotelial (perfil de expressão genética, estrutura, função) por tipo de órgão (por exemplo, cérebro, coração, pulmão33) além da região cerebral (por exemplo, córtex 9,34, hipocampo10) e respectiva segmentação vascular (por exemplo, artérias, artérias e capilares 9,34,35 ). Assim, um estudo abrangente da regulação do fluxo sanguíneo cerebral também exigirá abordagens complementares ex vivo (por exemplo, mografia de pressão intravascular, preparação arteriola capilar-parenchymal) e in vivo (por exemplo, Doppler Laser Intracerebral) de segmentos e redes vasculares intactas.
Em resumo, este artigo apresenta uma técnica avançada demonstrando como preparar um tubo endotelial intacto recém-isolado das artérias pareremínmicas cerebrais do camundongo. Prevemos que essa abordagem irá complementar e/ou construir a partir de modelos de estudo vascular in vivo e intactos. O objetivo geral é gerar novas informações para a compreensão de mecanismos que sustentam o fluxo sanguíneo cerebral no nível fundamental da fisiologia e selecionar transições para a patologia para a terapia.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (R00AG047198 & R56AG062169 para o EJB; R00HL140106 para PWP) e a Associação de Alzheimer (AZRGD-21-805835 para PWP). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde ou da Associação de Alzheimer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
| Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
| Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
| Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
| Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
| NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
| Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |
References
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