Summary
Проиллюстрирована интенсивная подготовка интактных эндотелиальных «трубок» головного мозга мыши из церебральных паренхиматозных артериол для изучения регуляции мозгового кровотока. Кроме того, мы демонстрируем экспериментальные сильные стороны этой модели эндотелиального исследования для флуоресцентной визуализации и электрофизиологического измерения ключевых клеточных сигнальных путей, включая изменения внутриклеточного [Ca2+] и мембранного потенциала.
Abstract
Мозговой кровоток передается сосудистыми артериями сопротивления и ниже по течению паренхиматозными артериолами. Устойчивое сосудистое сопротивление кровотоку увеличивается с уменьшением диаметра от артерий до артериол, которые в конечном итоге питаются капиллярами. Из-за их меньшего размера и расположения в паренхиме артериолы были относительно недостаточно изучены и с меньшей воспроизводимостью в результатах, чем поверхностные пиальные артерии. Несмотря на это, структура и функция артериолярных эндотелиальных клеток, неотъемлемая часть физиологии и этиологии хронических дегенеративных заболеваний, требует обширного исследования. В частности, новые данные демонстрируют, что нарушенная функция эндотелия предшествует и усугубляет когнитивные нарушения и деменцию.
В паренхиматозной микроциркуляции функция эндотелиального канала K+ является наиболее надежным стимулом для тонкого контроля распространения вазодилатации, чтобы способствовать увеличению притока крови к областям нейрональной активности. Эта статья иллюстрирует усовершенствованный метод свежеизолирования интактных и электрически связанных эндотелиальных «трубок» (диаметр, ~25 мкм) из паренхиматозных артериол мозга мыши. Артериолярные эндотелиальные трубки обеспечиваются в физиологических условиях (37 °C, рН 7,4) для разрешения экспериментальных переменных, которые охватывают функцию канала K+ и их регуляцию, включая внутриклеточную динамику Ca2+ , изменения мембранного потенциала и мембранную липидную регуляцию. Явным техническим преимуществом по сравнению с артериальным эндотелием является улучшенное морфологическое разрешение размеров клеток и органелл (например, митохондрий), что расширяет полезность этого метода. Здоровая церебральная перфузия на протяжении всей жизни влечет за собой надежную функцию эндотелия в паренхиматозных артериолах, напрямую связывая кровоток с подпиткой нейронной и глиальной активности в точных анатомических областях мозга. Таким образом, ожидается, что этот метод значительно расширит общие знания сосудистой физиологии и неврологии относительно здорового и больного мозга.
Introduction
Паренхиматозные артериолы непосредственно доставляют необходимый кислород и питательные вещества по всему мозгу1. Взаимодействуя с капиллярами, высоковазоактивные артериолы реагируют на ретроградную передачу сигналов, инициированную капиллярными ионными каналами, которые воспринимают метаболические сигналы от определенных нейронныхобластей 2. Поскольку паренхима головного мозга исторически получила основную часть исследований, в настоящее время появилась роль эндотелиальной дисфункции для прояснения патологических механизмов, связанных с различными цереброваскулярными нарушениями, лежащими в основе деменции (например, ишемический инсульт, болезнь Альцгеймера)3,4,5,6 . Эндотелий является неотъемлемой частью перфузии мозга в соответствии с неоднородностью генетики, структуры и функции во всех сосудистых сегментах7. Пиальные артерии были широко изучены из-за их относительно большого размера, высокого сегментарного сосудистого сопротивления и роли в распределении кровотока к подлежащему церебру 8,9. Таким образом, лучшее понимание артериолярных эндотелиальных механизмов, вероятно, улучшит понимание регуляции мозгового кровотока в здоровье и болезнях в направлении разработки новых терапевтических схем.
Новые данные подчеркивают важность изучения паренхиматозных артериол в отношении различных сигнальных путей и заболеваний 8,10. Однако этот подход был ограничен использованием интактных артериол под давлением11 и/или препаратов12 капиллярно-паренхиматозной артериолы (CaPA). Свежеизолированные, нативные артериолярные эндотелиальные клетки головного мозга, лишенные других типов клеток и смешивающих факторов, не были исследованы, вероятно, из-за технических трудностей в их изоляции. В этой статье продвигается предыдущая методика, подчеркивающая выделение эндотелия пиальной артерии13, чтобы теперь надежно и воспроизводимо изолировать эндотелий паренхиматозных артериол головного мозга (ширина: ~ 25 мкм, длина: ~ 250 мкм). Этот метод помогает достичь оптимального разрешения электрически и химически связанных клеток в их индивидуальной ориентации и сотовых сетях.
Ключевые пути, представляющие интерес, включали взаимодействие внутриклеточной передачи сигналов Ca2+ ([Ca2+]i) и гиперполяризацию мембранного потенциала (Vm)14,15 — неотъемлемого элемента вазодилатации16 — чтобы позволить крови проникать в капилляры и доставлять кислород и питательные вещества в активную паренхиму17. Эти препараты позволяют проводить электрофизиологические записи ионных каналов в режиме реального времени, включая Ca2+-пермеантные, переходные рецепторные потенциалы (TRP) и K+ каналы и / или флуоресцентную визуализацию внутриклеточных органелл в эндотелиальных клеточных трубках в почти физиологических условиях. Это подходящий метод для исследователей, заинтересованных в физиологических клеточных механизмах, которые управляют эндотелиальным клеточным контролем мозгового кровотока до паренхимы мозга. В целом, этот метод поможет исследователям лучше понять фундаментальные эндотелиальные сигнальные пути и сетевую связь артериол, встроенных в паренхиму головного мозга, при решении вопросов, связанных с цереброваскулярной физиологией и патологией.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Экспериментаторы должны обеспечить, чтобы назначенное использование животных и связанные с ними протоколы были одобрены их Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) и выполнялись в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» Национального исследовательского совета (8-е издание, 2011 год) и руководящими принципами ARRIVE. IACUC Университета Лома Линда и Университета Аризоны одобрили все протоколы, используемые для этой рукописи для мышей C57BL/6N и 3xTg-AD (самцы и самки; возрастной диапазон: 2-30 месяцев). См. Рисунок 1 в качестве обзора выделения и исследования артериолярных эндотелиальных трубок, недавно выделенных из паренхиматозных артериол головного мозга мышей.
1. Материалы и оборудование
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для всех реагентов и материалов, необходимых для этого протокола. Кроме того, по мере необходимости можно обращаться к руководствам и веб-сайтам, связанным с соответствующими поставщиками. Иллюстрации станций вскрытия и экспериментальных аппаратов были ранее предоставлены13.
- Проточная камера
- Прикрепите камеру суперфузии со стеклянной крышкой к платформе, состоящей из анодированного алюминия. Закрепите платформу камерой на алюминиевой ступени микроскопа.
- Установите микроманипулятор, держащий закрепляющую пипетку на каждом конце платформы на сцене алюминиевого микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости используйте переносной ступенчатый аппарат с блоком проточной камеры для перемещения защищенной, изолированной эндотелиальной трубки из одного микроскопического аппарата в другой для экспериментов.
- Микроскопы
- Используйте стереомикроскопы (диапазон увеличения от 5x до 50x) и волоконно-оптические источники света для процедур рассечения.
- Для изоляции эндотелиальных трубок используйте инвертированный микроскоп, оснащенный фазовым контрастом или дифференциальным интерференционным контрастом (DIC)-совместимыми объективами (10x, 20x и 40x) и алюминиевой ступенью.
- Имейте контроллер насоса микрошрица рядом с аппаратом, предназначенным для изоляции эндотелиальных трубок от частично переваренных кровеносных сосудов.
- Настройте экспериментальный аппарат, расположив на столе виброизоляции перевернутый микроскоп (объективы: 4x, 10x, 20x, 40x и 60x) и ручную алюминиевую ступень.
- ВнутриклеточноеV-м записывающее оборудование
- Подключите электрометр к совместимой головной станции. Используйте аксессуары, такие как генератор функций и стимулятор, для протоколов, требующих впрыска тока.
- Подключите выходы усилителя к системе дигитайзера данных, осциллографу и звуковым базовым мониторам. Закрепите электрод опорной ванны (гранула Ag/AgCl) рядом с выходом из проточной камеры.
- Соберите фотометрическую систему со встроенными компонентами интерфейса флуоресцентной системы, дуговой лампой высокой интенсивности и источником питания, гиперпереключателем, фотоумножительной трубкой (или PMT) и камерой для измерения [Ca2+]i в эндотелиальных ячейках.
- Соберите регулятор температуры, оснащенный встроенным нагревателем для повышения и поддержания физиологической температуры (37 °C) на протяжении всего эксперимента.
- Смонтируйте многоканальную платформу, соединенную с контроллером клапана с поточным клапаном регулирования потока, для управления доставкой решений в эндотелиальные трубки, закрепленные в камере.
- Микропипетты и острые электроды
ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментатору понадобится электронный съемник стекла и микрокварка для приготовления тритурации и закрепления пипеток.- Чтобы отделить эндотелиальную трубку от частично переваренного артериолярного сегмента, готовят термополированные тритурационные пипетки (диаметр внутреннего наконечника: 30-50 мкм) из боросиликатных стеклянных капилляров.
- Для закрепления эндотелиальной трубки в камере суперфузии готовят термополированные пипетки с затупленным сферическим концом (наружный диаметр: 50-70 мкм), приготовленные из тонкостенных боросиликатных стеклянных капилляров.
- Чтобы записать Vm эндотелиальной ячейки, подготовьте острые электроды с сопротивлением наконечника ~150 ± 30 МОм из стеклянных капилляров, используя только стеклянный съемник.
2. Растворы и препараты
- Физиологический раствор соли (PSS)
- Приготовьте минимум 1 л PSS, используя 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этанесульфоновую кислоту (HEPES) и 10 мМ глюкозы.
- Готовят необходимые растворы без CaCl2 (ноль Ca2+ PSS) для рассечения артериол головного мозга и выделения эндотелиальной трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Готовят все растворы в сверхчистом деионизированномH2Oс последующей фильтрацией (0,22 мкм). Убедитесь, что конечный продукт содержит рН 7,4 с осмоляльностью от 290 до 300 мОсм.
- Сывороточный альбумин крупного рогатого скота (BSA, 10%)
- Растворить 1 г лиофилизированного порошка BSA в стакане объемом 10 мл с нулевым Ca2+ PSS. Накройте стакан крышкой и подождите не менее 2 ч при медленном перемешивании, чтобы BSA растворился.
- Фильтруйте раствор с помощью шприца 10 мл плюс фильтр 0,22 мкм и подготовьте 1 мл аликвоты для хранения при -20 °C.
- Раствор для рассечения
- Добавьте 500 мкл BSA (10%) до 49,5 мл нуля Ca2+ PSS для общего объема 50 мл.
- Переложите раствор на чашку Петри для артериолярных рассечений.
- Решение для диссоциации
- Добавьте 5 мкл раствораCaCl2 (1 M) и 500 мкл BSA (10%) до 49,5 мл нуля Ca2+ PSS для общего объема 50 мл. Инкубировать раствор при комнатной температуре не менее 1 ч.
- Ферментов
- Приготовьте 1 мл раствора для пищеварения со 100 мкг/мл папаина, 170 мкг/мл дитиоэритритола, 250 мкг/мл коллагеназы (смесь типа H) и 40 мкг/мл эластазы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Активность ферментов может варьироваться, хотя успешные протоколы, вероятно, потребуют следующей ферментативной активности: ≥ 10 единиц / мг для папаина, ≥ 1 единица / мг для коллагеназы и ≥ 5 единиц / мг для эластазы.
- Приготовьте 1 мл раствора для пищеварения со 100 мкг/мл папаина, 170 мкг/мл дитиоэритритола, 250 мкг/мл коллагеназы (смесь типа H) и 40 мкг/мл эластазы.
- Фура-2 и фармакологические средства
- Готовят Фуру-2 АМ в виде диметилсульфоксида (ДМСО; 1 мМ). Подготовьте 500 мкл рабочей концентрации (10 мкМ), добавив 5 мкл запаса к 495 мкл PSS для загрузки.
- Приготовьте не менее 50 мл рабочих концентраций фармакологических агентов в PSS или DMSO в зависимости от обстоятельств.
- Проводящее решение
- Получают 2 M KCl путем растворения KCl в деионизированномH2O(7,455 г KCl в 50 млH2O). Пропустите раствор через шприц с фильтром 0,22 мкм перед засыпкой острых электродов.
- Флуоресцентные органеллы и антитела
- Готовят плазматическую мембрану или органелларные (например, ядро, эндоплазматический ретикулум) трекеры в соответствующем физиологическом солевом растворе в соответствии с инструкциями производителя.
- Готовят первичные и вторичные антитела согласно инструкции производителя в соответствующем физиологическом растворе соли.
3. Рассечение и выделение артериол головного мозга мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: Стереомикроскопы и заточенные инструменты микродиссекции (например, щипцы с тонкими наконечниками, ножницы для рассечения в стиле Ваннас) должны использоваться для увеличения образца (до 50 раз) во всех этих процедурах рассечения.
- Изоляция мозга мыши
- Обезболить стандартную лабораторную мышь (например, C57BL/6, 3xTg-AD; 2-30 месяцев, самец или самка) с помощью ингаляции изофлурана (3% в течение 2-3 мин), с последующим немедленным обезглавливанием с использованием острых ножниц или гильотины по одобрению IACUC. Поместите голову мыши в чашку Петри (диаметр 10 см, глубина 1,5 см), содержащую холодный (4 °C) раствор для рассечения.
- Во время просмотра под стереомикроскопом удалите кожу и волосы над черепом и смойте излишки крови холодным рассеченным раствором. Используя кончики стандартных ножниц для рассечения (например, лезвия 24 мм), сделайте разрез, начиная с затылочной кости и простираясь вверх через носовую кость черепа. Используйте грубые щипцы, чтобы осторожно открыть череп вдоль разреза, и отделить соединительную ткань (менингеальную мембрану), чтобы изолировать мозг, содержащий неповрежденный круг Виллиса.
- Промыть изолированный мозг холодным раствором для рассечения в стакане или чашке Петри, чтобы удалить оставшуюся кровь с поверхности мозга. Поместите вентральную сторону мозга лицом вверх в камеру, содержащую холодный расслоительный раствор для выделения паренхиматозных артериол (рисунок 2А).
- Выделение паренхиматозных артериол
ПРИМЕЧАНИЕ: Артериолы, возникающие из средних мозговых артерий (MCAs) и встроенные в паренхиму головного мозга, выбраны для этого протокола. Артериолы выделяют, какописано ранее 11, с модификацией.- Используйте стальные штифты (диаметр: 0,2 мм, длина: от 11 до 12 мм) для закрепления изолированного мозга в холодном растворе для рассечения в чашке Петри, содержащей кремниевое полимерное покрытие, наполненное древесным углем (глубина ≥ 50 см).
- Используя острые и выровненные ножницы для рассечения, вырежьте прямоугольник мозговой ткани (длина: 5 мм, ширина: 3 мм) (рисунок 2B) вокруг MCA, убедившись, что верхняя часть сегмента ткани находится за пределами точки ветвления от Круга Уиллиса. Отрежьте еще один прямоугольник мозговой ткани из другого полушария мозга, чтобы получить доступ к большему количеству артериол, если это необходимо.
- Закрепите отделенный сегмент мозговой ткани в чашке с помощью MCA, обращенного вверх (дистально от Круга Уиллиса) с помощью стальных штифтов (диаметр: 0,1 мм, длина: от 13 до 14 мм). Осторожно сделайте неглубокий разрез возле штифтов, чтобы удалить пиа небольшими щипцами, аккуратно отслаиваясь от одного конца к другому (рисунок 2С). Удалите пиа из другого сегмента ткани, чтобы получить доступ к большему количеству артериол, если это необходимо. Тщательно закрепите изолированную пиа паренхиматозными артериолами, разветвленными от MCA, в блюде с помощью булавок и рассекните паренхиматозные артериолы (рисунок 2D), гарантируя, что артериолы не повреждены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если артериолы нелегко вытащить пиа из паренхимы, используйте тонкие щипцы и копайтесь в мозге, начиная с точки ветви MCA от Круга Виллиса. Найдите артериолу, осторожно разрыхлите ткань вокруг артериол (рисунок 2E) и осторожно вытащите артериолу из паренхимы, удерживая верхний конец артериолы (рисунок 2F). Множественные артериолы (длина: ~1,5-2 мм) могут быть выделены из одного прямоугольника мозговой ткани. - Убедитесь, что артериола чистая без прикрепленной к ней ткани, и отрежьте все оставшиеся дистальные ветви (рисунок 3A). Используйте этот чистый, неповрежденный артериол для ферментативного пищеварения. Альтернативно, нарежьте каждую артериолу на две части (длина: 0,75-1 мм) для ферментативного пищеварения для приготовления эндотелиальных трубок, если это необходимо.
4. Переваривание паренхиматозных артериол и подготовка эндотелиальных трубок
- Компоновка оборудования и пипеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Выделение артериальных эндотелиальных трубок из головного мозга было описано ранее13,18. Текущий протокол включает модификации для выделения эндотелия из паренхиматозных (внутримозговых) артериол. Несколько артериол и/или кусочков артериол могут быть использованы вместе для ферментативного пищеварения.- Смонтируйте устройство13 тритурации для подготовки эндотелиальных трубок с использованием алюминиевой ступени, поддерживающей камеру и микроманипуляторы. Соберите микроскоп, оснащенный объективами (5x-60x) и камерой, подключенной к монитору компьютера. Закрепите микрошприц с помощью контроллера насоса рядом со сценой и образцом.
- Закрепите тритурационную пипетку, заполненную минеральным маслом, поверх поршня микрошприца. Используйте микрошприц с контроллером насоса, чтобы вывести диссоциационный раствор в тритурационную пипетку (~ 130 нЛ) поверх минерального масла, следя за тем, чтобы избежать пузырьков воздуха в пипетке.
- Частичное переваривание артериолярных сегментов
- Поместите неповрежденные артериолярные сегменты в 1 мл диссоциационного раствора в стеклянной трубке объемом 10 мл, содержащей папаин 100 мкг/мл, 170 мкг/мл дитиоэритритрита, коллагеназу 250 мкг/мл и эластазу 40 мкг/мл. Инкубировать артериолярные сегменты при 34 °C в течение 10-12 мин.
- После переваривания заменить раствор фермента 3-4 мл свежего диссоциационного раствора при комнатной температуре.
- Выделение артериолярной эндотелиальной трубки
ПРИМЕЧАНИЕ: После переваривания и замены раствора фермента переносят один или несколько частично переваренных сегментов в диссоциационный раствор в суперфузионной камере, прикрепленной к подвижной платформе. При просмотре с увеличением от 100x до 200x выберите один частично переваренный, но неразрывный сегмент сосуда и сосредоточьтесь на нем под микроскопом.- Поместите тритурационную пипетку, прикрепленную к инжектору микрошрица, в диссоциационный раствор в камере и расположите ее близко к одному концу сегмента переваренного сосуда. Установите скорость в пределах 1-3 нл/с на контроллере насоса для мягкой тритурации.
- Сохраняя увеличение от 100x до 200x, выведите артериолярный сегмент в пипетку, а затем выбросьте для диссоциации адвентиции и гладкомышечных клеток (рисунок 3B). Тритурируйте сегмент сосуда до тех пор, пока все гладкомышечные клетки не будут диссоциированы, и только эндотелиальные клетки останутся в виде неповрежденной «трубки».
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости во время тритурации осторожно используйте мелкоконечные щипцы для удаления диссоциированных адвентиций и внутренней эластичной пластинки из эндотелиальной трубки. Как правило, только несколько циклов тритурации дают неповрежденную эндотелиальную трубку. - Используйте микроманипуляторы для закрепления каждого конца эндотелиальной трубки на стеклянной крышке в камере с помощью боросиликатных стеклянных пипеток (рисунок 3C,D).
- Закрепление артериолярной эндотелиальной трубки
- Замените диссоциационный раствор суперфузионным раствором (PSS, содержащим 2 мМ CaCl2), обеспечивая при этом, чтобы неэндотелиальный материал вымывался из камеры.
- Перенос защищенной эндотелиальной трубки в мобильной платформе на микроскопическую установку, предназначенную для непрерывного суперсмешения и внутриклеточных или флуоресцентных записей/визуализаций.
- Применяют непрерывную доставку ПСС во время эксперимента. Вручную устанавливайте скорость потока (5-7 мл/мин) на протяжении всего эксперимента с помощью поточного клапана регулирования потока, соответствующего ламинарному потоку, при этом сопоставляя подачу потока раствора с объемом вакуумного всасывания. Дайте ≥5 мин потока PSS в камеру для суперфузии эндотелиальной трубки перед получением фоновых данных и/или загрузкой красителя.
5. Использование артериолярных эндотелиальных трубок для исследования клеточной физиологии
ПРИМЕЧАНИЕ: Изолированные и защищенные артериолярные эндотелиальные трубки могут быть использованы для внутриклеточной записи динамики [Ca2+]i и Vm с использованием фотометрии и электрофизиологии острых электродов, соответственно, как показано ранее13 (фиг.4). [Около2+] i и Vm могут быть измерены как отдельные или комбинированные экспериментальные переменные по мере необходимости13 (рисунок 4). Однако артериолярные эндотелиальные трубки более деликатны, чем артериальный эндотелий, и время экспериментирования не должно превышать 1 ч.
- Измерение [Ca2+]i
- Включите оборудование и программное обеспечение для записи [Ca2+]i , сохраняя непрерывную суперфрезью при скорости потока 5-7 мл/мин.
- Загрузите эндотелиальную трубку красителем Ca2+ Fura-2 AM в течение 30 мин при комнатной температуре. Промыть клетки суперфузионным раствором еще 20-30 мин, постепенно повышая температуру ванны до 37 °C. Поддерживайте температуру на уровне 37 °C на протяжении всего эксперимента.
- Вручную отрегулируйте окно визуализации с помощью программного обеспечения фотометрии, чтобы сфокусироваться на ~ 20 эндотелиальных клетках (рисунок 4A). При отсутствии света включите PMT на флуоресцентном интерфейсе и начните получение [Ca2+]i , возбуждая Fura-2 попеременно (≥10 Гц) при 340 нм и 380 нм при сборе флуоресцентного излучения при 510 нм. Как только установлена стабильная базовая запись [Ca2+]i , применяют фармакологические агенты (например, агонисты пуринергических рецепторов) на экспериментальную цель (рисунок 4B).
- Измерение Вм
- Включите оборудование и программное обеспечение для записи Vm и установите скорость сбора данных (≥10 Гц) при сохранении непрерывного переливания при расходе 5-7 мл/мин. Постепенно поднимайте температуру ванны до 37 °C и поддерживайте ее до конца эксперимента.
- Потяните острый электрод с помощью боросиликатного стеклянного капилляра, засыпьте его 2 M KCl и закрепите его на серебряной проволоке, покрытой хлоридом, в держателе пипетки, прикрепленном к электрометру, который, в свою очередь, удерживается микроманипулятором.
- При просмотре через объектив 4x используйте микроманипулятор, чтобы аккуратно расположить острый кончик электрода прямо над ячейкой артериолярной эндотелиальной трубки в протекающем PSS в камере.
- Постепенно увеличивайте увеличение до 400x и перепозиционируйте наконечник электрода по мере необходимости.
- С помощью микроманипулятора аккуратно вставьте кончик острого электрода в одну из ячеек эндотелиальной трубки и начните запись Vm с помощью электрометра (рисунок 4А).
- Как только эндотелиальный остаток Vm стабилен (от −30 до −40 мВ), применяют желаемые фармакологические средства на экспериментальный объект (рисунок 4С).
6. Клеточная визуализация
ПРИМЕЧАНИЕ: Эндотелиальные трубки, закрепленные в камере мобильной платформы, также могут быть использованы для микроскопической визуализации как в живых, так и в фиксированных условиях19 с использованием стандартной флуоресценции или конфокальной микроскопии. Иммуногистохимия с различными антителами к рецепторам и ионным каналам также может быть применена, какописано ранее 20.
- Нагрузите эндотелиальную трубку флуоресцентным трекером плазматической мембраны или желаемой органеллы (например, ядра, эндоплазматического ретикулума) при 37 °C в течение 15-30 мин.
- Промыть клетки свежей суперфузией PSS и изобразить живые клетки под микроскопом на длине волны возбуждения соответствующих красителей (рисунок 4D,E).
ПРИМЕЧАНИЕ: Иммуногистохимия может быть выполнена на этой модели трубки с использованием интересующих антител.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Демонстрация протокола показана на фиг.1 с этапами рассечения артериолярных артерий и изоляции эндотелиальной трубки, как показано на фиг.2 и фиг.3 соответственно. Здесь эндотелиальную функцию оценивали путем измерения [Ca2+]i и Vm с использованием фотометрии Fura-2 и электрофизиологии острых электродов (рисунок 4A) в ответ на фармакологический агент [2-метилтиоаденозиндифосфат (MTA), мощный агонист пуринергического рецептора (P2YR)] при 37 °C. При применении МТА (1 мкМ) [Ca2+]i быстро увеличивается (рисунок 4B) с сопутствующей гиперполяризацией (рисунок 4C). Эти измерения являются отражением активации рецепторов, связанных с Gq-белком (P2YR), за которой следует активация мало- и промежуточной проводимости Ca2+-активированных K+ каналов (SKCa/IKCa), которые инициируют эндотелий-зависимый гиперполяризационный (EDH) вазодилататорный путь. Таким образом, эндотелий, выделенный из паренхиматозной артериолы, функционирует изолированно и может быть использован для изучения ключевых компонентов путей, которые включают мобилизацию [Ca2+]i и/или регуляцию Vm через каналы K+ .
Кроме того, интактный эндотелий инкубировали при 37 °C с флуоресцентными трекерами для визуализации для изучения клеточной морфологии. Визуализация живых эндотелиальных клеток показывает совместное окрашивание плазматической мембраны (зеленый) и ядер (красный) (рисунок 4D). На рисунке 4E плазматическую мембрану (зеленый) окрашивали вместе с эндоплазматическим ретикулумным (ER; красным) флуоресцентным пятном, в результате чего области видимого перекрытия ER в непосредственной близости от плазматической мембраны выглядят оранжевыми (рисунок 4E). Эти флуоресцентные изображения дополнительно раскрывают клеточную целостность артериолярного эндотелия и их возможное использование для изучения сигнальных микродоменов, расположенных в соединительных мембранных комплексах.
Рисунок 1: Исследование артериолярной эндотелиальной трубки, только что выделенной из паренхиматозной артериолы мыши. Как показано, мозг изолирован от мыши, и кусок прямоугольной мозговой ткани, содержащий MCA, был удален. Выделяют паренхиматозные артериолы, разветвляющиеся от МКА и поступающие в паренхиму головного мозга. Артериолы ферментативно перевариваются и тритурируются, образуя неповрежденную эндотелиальную трубку для исследования. Подготовленная эндотелиальная трубка позволяет измерять внутриклеточную динамику Ca2+ и Vm , а также позволяет проводить клеточную визуализацию для флуоресцентной визуализации и иммуногистохимии. Сокращения: MCA = средняя мозговая артерия; Vm = мембранный потенциал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Рассечение и выделение паренхиматозных артериол. (А) Изолированный мозг мыши с неповрежденным виллиевым кругом. (B) Рассеченный прямоугольный кусок мозговой ткани, содержащий MCA (белая стрелка). (С) Выделение пиа из верхней части ткани (артериола, синяя стрелка). (D) Артериолы (очерченные синими наконечниками стрел), соединенные со средними мозговыми артериями (желтые стрелки). (E) Идентифицирована артериола (синяя стрелка) в мозговой ткани. (F) Вытягивание артериолы (синяя стрелка) из разрыхленной ткани. Обратите внимание, что панели E и F указывают на альтернативный метод выделения артериолы (см. этап протокола 3.2.3). Шкала стержней = 2 мм (A,B,C), 0,2 мм (D) и 1 мм (E,F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Подготовка эндотелиальных трубок из паренхиматозных артериол. (А) Изолированная и чистая артериола (синяя стрелка). (B) Тритурация частично переваренной ферментами артериолы. (C) Неповрежденная эндотелиальная трубка (увеличение: 100x), подготовленная и закрепленная на стеклянной крышке с помощью закрепляющих пипеток. (D) Эндотелиальная трубка при 200-кратном увеличении. Шкала стержней = 0,2 мм (A), 0,1 мм (B, C) и 0,05 мм (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Применение эндотелиальной трубки для физиологического обследования путей, связанных с регуляцией кровотока. (А) Острый электрод (фиолетовая стрелка) расположен в ячейке эндотелиальной трубки, сфокусированной в окне сбора данных для фотометрии. (B) Репрезентативная запись внутриклеточного Ca2+ с использованием фотометрии Fura-2 в ответ на MTA (1 мкМ). (C) Репрезентативная запись Vm одновременно с внутриклеточным следом Ca2+ в панели B. (D) Репрезентативное изображение плазматической мембраны (зеленый) и ядер (красный) живых эндотелиальных клеток, окрашенных флуоресцентными красителями. (E) Репрезентативное изображение плазматической мембраны (зеленый) и эндоплазматического ретикулума (ER, красный) живых эндотелиальных клеток, окрашенных флуоресцентными красителями. Области близости для ER и плазматической мембраны обозначены оранжевым цветом. Изображения были получены с помощью монохромной камеры и были псевдоцветными. Шкала стержней = 20 мкм (D), 10 мкм (E). Сокращения: MTA = 2-метилтиоаденозиндифосфат; F340/F380 = сигнал о соотношении красителей Fura-2; Vm = мембранный потенциал; PM = плазматическая мембрана; ER = эндоплазматический ретикулум. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Растущие данные свидетельствуют о том, что цереброваскулярные заболевания (ССЗ), старение и болезнь Альцгеймера сильно коррелируют и являются актуальной темой исследований деменции 4,8,14,21. Таким образом, очевидно, что исследования цереброваскулярной сети будут иметь широкое влияние на здоровье, требуя продолжения обширных исследований в условиях заболевания. Как значимая точка сосудистого сопротивления для церебральной перфузии, общее значение паренхиматозных артериол в этиологии и развитии ССЗ было выделено на протяжении более 50 лет22.
Тем не менее, инструменты научного исследования не были должным образом разработаны для изучения интактных паренхиматозных артериол и их составных типов клеток до недавнего появления подходов ex vivo , таких как изолированные, под давлением паренхиматозные артериолы11 и CaPA12 препараты. Область цереброваскулярной физиологии также выиграет от дополнительных методов в моделях гомоклеточных исследований (гладкие мышцы, перициты и эндотелий), чтобы сосредоточиться на конкретных типах клеток и их генетических и фармакологических характеристиках, лежащих в основе регуляции мозгового кровотока и проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ).
Эндотелий является центральным регулирующим органом, который «питает» все другие органы по всему телу, включая мозг23. Хотя все сосудистые сегменты (артерии, артериолы, капилляры, венулы, вены) необходимы для перфузии головного мозга, эндотелий артериол требует специального исследования в качестве центрального компонента цереброваскулярной ауторегуляции и нейрососудистой связи24. Кроме того, сигнальная активность Ca2+ 25 и K+ канала 17,26, по-видимому, усиливаются во время регуляции миогенного тонуса в паренхиматозных артериолах относительно пиальных артерий. Таким образом, в настоящее время мы расширили ранее установленный метод для пиальных мозговых артерий (задних)13 до паренхиматозных артериол.
По сравнению с этими ранее проиллюстрированными подходами11,13 этот протокол был уточнен путем эмпирической корректировки различных этапов (например, ферментативного лечения, тритурации) для воспроизводимого получения интактных эндотелиальных трубок из паренхиматозных артериол. Кроме того, этот протокол демонстрирует использование этой модели исследования для оптимизации применения клеточной фотометрии, электрофизиологии и флуоресцентной визуализации (рисунок 4). Учитывая общие сильные стороны и ограничения фотометрии Fura-2 и электрофизиологии острых электродов, ранее подробно описанные13, экспериментатору рекомендуется попробовать массив других сигнальных и ионных каналов Ca2+ для проверки конкретных гипотез, представляющих интерес. Кроме того, развитие и генерация новых генетических моделей с эндотелиальными клеточными специфическими генетически закодированными показателями (например, [Ca2+]i27 и voltage28 indicators) может расширить полезность этого препарата.
Для исследовательского контекста эта изолированная эндотелиальная модель полезна для исследовательских вопросов, требующих изучения роли артериолярного эндотелия в регуляции сосудистой динамики, в результате чего измерения лица экспериментально невозможны из-за их небольшого размера. Эндотелиальная регуляция мозгового кровотока начинается с активации различных рецепторов, связанных с G-белком (например, пуринергических, мускариновых)18 и ионных каналов (TRPV329, TRPA15, NMDA рецепторов8). Активация рецепторов Gq-типа влечет за собой липолиз фосфатидилинозитола 4,5-бисфосфата (PIP2) с образованием инозитолтрисфосфата (IP3) и диацилглицерина для мобилизации [Ca2+]i, которая затем может опосредуть активацию канала K+ для изменений в Vm15. Активность канала K+ и, следовательно, только Vm также могут быть изучены непосредственно в физиологических условиях2 или с помощью выбранного фармакологического таргетинга30. Кроме того, артериолярная эндотелиальная трубка обеспечивает улучшенную флуоресцентную визуализацию ремоделирования выбранной плазматической мембраны (например, Filipin-III), внутриклеточных органелл (например, ER-трекер) и межклеточной связи (например, йодид пропидия)18,19. Таким образом, еще одна особенность исследуемой модели влечет за собой эффективное сопряжение клеточной морфологии и гистологии с параметрами функции, такими как Ca2+ и электрическая сигнализация, при старении и развитии хронических заболеваний.
Компонентами протокола, заслуживающими особого внимания, являются диссекция артериоляров, ферментативное пищеварение, тритурация и закрепление артериолярной эндотелиальной трубки для измерений. Во время рассечения из головного мозга следует любой ценой избегать повреждения паренхиматозной артериолы, чтобы обеспечить успешное пищеварение и тритурацию для выделения неповрежденного и функционального эндотелиального слоя. Кроме того, чрезмерное растяжение при закреплении эндотелиальной трубки в перфузионной камере также разрушит препарат, эффективно сводя на нет все предыдущие этапы протокола.
Тесты на жизнеспособность должны применяться для обеспечения того, чтобы артериолярные эндотелиальные трубки были функциональными по отношению к ключевымфизиологическим компонентам, таким как передача сигналов Ca2+ (приток и/или внутриклеточное высвобождение) после стимуляции рецепторов, связанных с G-белком, степень гиперполяризации V m и надежная межклеточная связь через щелевые соединения18,23. Примеры таких средств контроля включают обратимую пуринергическую стимуляцию с использованием MTA (1 мкМ; Δ[Ca2+]i ~ 300 нМ; гиперполяризации ≥10 мВ; Фиг.4В,С), обратимая активация SKCa/IKCa с использованием NS309 (1 мкМ; гиперполяризация ≥20 мВ) и/или соответствие между впрыском тока (например, ~-1 нА) в однуячейку и В-м реакциями (~-10 мВ) другой на расстоянии ≥250 мкм18,31. С практикой, осторожностью и экспериментальной строгостью весь протокол воспроизводим, если у ученика есть терпение и настойчивость.
Этот метод имеет ключевые ограничения, такие как недостаточное количество образцов (например, нуклеиновых кислот, белков и липидов) и относительная хрупкость для биохимических экспериментов и записей живых клеток, соответственно. Тем не менее, этого предостережения молекулярной биологии можно избежать, объединив несколько животных и / или разработав методы количественного определения более высокой чувствительности и пропускной способности. Если физиологическая температура должна поддерживаться на уровне 37 °C, потребуются короткие экспериментальные временные рамки (≤1 ч) только с целенаправленными фармакологическими вмешательствами. Кроме того, было бы чрезвычайно сложно выделить артериолярные эндотелиальные трубки у недоношенных или новорожденных (<1-месячного) животных, что потенциально исключает исследования развития сосудов головного мозга.
Другие соображения включают точный состав эндотелиальных трубок сосудов головного мозга, что потенциально требует выбора подходов иммунофлуоресценции и электрофизиологии. Например, базальная мембрана (состоящая в основном из коллагена IV, ламинина и фибронектина) проходит вдоль мозгового сосудистого дерева. Он известен своим вкладом в целостность ГЭБ, образованного капиллярными эндотелиальными клетками мозга32. Следует отметить, что данная модель исследования может не подходить для экспериментов по проницаемости ГЭБ, поскольку компоненты базальной мембраны являются субстратами ферментного коктейля, используемого для частичного переваривания артериолярных эндотелиальных трубок, в частности, смеси коллагеназы H. Кроме того, применение селективного ферментного коктейля, удаление внутренней эластичной пластинки и четкая идентификация эндотелиальных клеток по структуре (параллельное расположение против окружности для гладкомышечных клеток), морфология («каплевидная» форма эндотелиальных клеток против веретенообразных гладкомышечных клеток) и электрофизиология (например, гиперполяризация для стимуляции GPCR) устраняет физиологический вклад гладкомышечных клеток и перицитов. Наконец, экспериментатор должен принять к сведению гетерогенность эндотелиальных клеток (профиль экспрессии генов, структура, функция) для каждого типа органа (например, мозг, сердце, легкие33) в дополнение к области мозга (например, кора 9,34, гиппокамп10) и соответствующей сосудистой сегментации (например, артерии, артериолы и капилляры 9,34,35 ). Таким образом, комплексное изучение регуляции мозгового кровотока также потребует комплементарных ex vivo (например, миография внутрисосудистого давления, капиллярно-паренхиматозная подготовка артериол) и in vivo (например, внутримозговая лазерная допплерография) подходов к интактным сосудистым сегментам и сетям.
Таким образом, в этой статье представлена передовая техника, демонстрирующая, как подготовить неповрежденную эндотелиальную трубку, только что выделенную из паренхиматозных артериол мозга мыши. Мы ожидаем, что этот подход будет дополнять и/или строить на основе моделей исследования in vivo и интактных сосудов. Общая цель состоит в том, чтобы генерировать новую информацию для понимания механизмов, лежащих в основе мозгового кровотока на фундаментальном для физиологии уровне, и выбрать переходы к патологии для терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами Национальных институтов здравоохранения (R00AG047198 & R56AG062169 для EJB; R00HL140106 к PWP) и Ассоциации Альцгеймера (AZRGD-21-805835 к PWP). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения или Ассоциации Альцгеймера.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
| Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
| Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
| Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
| Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
| NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
| Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |
References
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Kelleher, R. J., Soiza, R. L. Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder. American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium. Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).
- Pires, P. W., Earley, S. Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke. elife. 7, 35316 (2018).
- Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease. Function. 2 (2), (2021).
- Zhao, L., et al. Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain. Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).
- Peters, E. C., et al. Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease. Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).
- Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).
- Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex. Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).
- Behringer, E. J., Hakim, M. A. Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).
- Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice. Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).
- Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).
- Attems, J., Jellinger, K. A. The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology. BMC Medicine. 12, 206 (2014).
- Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).
- Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Chen, Y. L., et al. Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice. Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).
- Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators. Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).
- Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).
- Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain. Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. elife. 9, 51413 (2020).
- Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).
- Chen, M. B., et al. Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues. Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).
