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Biology

माउस मस्तिष्क पैरेन्काइमा के धमनीविस्फार एंडोथेलियम का अलगाव और कार्यात्मक विश्लेषण

Published: March 11, 2022 doi: 10.3791/63463
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Basic Sciences, Loma Linda University, 2Departments of Physiology, Surgery and Neurosurgery and Sarver Heart Center, University of Arizona College of Medicine Tucson

Summary

सेरेब्रल पैरेन्काइमल आर्टेरियोल्स से बरकरार माउस सेरेब्रल एंडोथेलियल "ट्यूब" की गहन तैयारी को सेरेब्रल रक्त प्रवाह विनियमन का अध्ययन करने के लिए सचित्र किया गया है। इसके अलावा, हम प्रतिदीप्ति इमेजिंग और प्रमुख सेलुलर सिग्नलिंग मार्गों के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी माप के लिए इस एंडोथेलियल अध्ययन मॉडल की प्रयोगात्मक शक्तियों का प्रदर्शन करते हैं, जिसमें इंट्रासेल्युलर [सीए2+] और झिल्ली क्षमता में परिवर्तन शामिल हैं।

Abstract

सेरेब्रल रक्त प्रवाह संवहनी प्रतिरोध धमनियों और डाउनस्ट्रीम पैरेन्काइमल धमनियों द्वारा व्यक्त किया जाता है। रक्त प्रवाह के लिए स्थिर-राज्य संवहनी प्रतिरोध धमनियों से धमनियों तक घटते व्यास के साथ बढ़ता है जो अंततः केशिकाओं में फ़ीड करते हैं। पैरेन्काइमा में उनके छोटे आकार और स्थान के कारण, धमनियों को अपेक्षाकृत कम अध्ययन किया गया है और सतह की पायल धमनियों की तुलना में निष्कर्षों में कम पुनरुत्पादन के साथ। भले ही, धमनीविस्फार एंडोथेलियल सेल संरचना और कार्य-पुरानी अपक्षयी बीमारियों के शरीर विज्ञान और एटियलजि के अभिन्न अंग-व्यापक जांच की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से, उभरते हुए सबूत दर्शाते हैं कि समझौता किए गए एंडोथेलियल फ़ंक्शन संज्ञानात्मक हानि और मनोभ्रंश से पहले और बढ़ाता है।

पैरेन्काइमल माइक्रोसर्कुलेशन में, एंडोथेलियल के + चैनल फ़ंक्शन न्यूरोनल गतिविधि के क्षेत्रों में रक्त प्रवाह में वृद्धि को बढ़ावा देने के लिए वासोडिलेशन के प्रसार को बारीकी से नियंत्रित करने के लिए सबसे मजबूत उत्तेजना है। यह पेपर माउस मस्तिष्क पैरेन्काइमल धमनियों से बरकरार और विद्युत रूप से युग्मित एंडोथेलियल "ट्यूब" (व्यास, ~ 25 μm) को ताजा अलग करने के लिए एक परिष्कृत विधि दिखाता है। धमनीविस्फार एंडोथेलियल ट्यूबों को शारीरिक स्थितियों (37 डिग्री सेल्सियस, पीएच 7.4) के दौरान सुरक्षित किया जाता है ताकि प्रयोगात्मक चर को हल किया जा सके जो के + चैनल फ़ंक्शन और उनके विनियमन को शामिल करते हैं, जिसमें इंट्रासेल्युलर सीए2 + गतिशीलता, झिल्ली क्षमता में परिवर्तन और झिल्ली लिपिड विनियमन शामिल हैं। धमनी एंडोथेलियम बनाम एक अलग तकनीकी लाभ सेल और ऑर्गेनेल (जैसे, माइटोकॉन्ड्रिया) आयामों का बढ़ाया रूपात्मक संकल्प है, जो इस तकनीक की उपयोगिता का विस्तार करता है। पूरे जीवन में स्वस्थ सेरेब्रल परफ्यूजन पैरेन्काइमल आर्टेरियोल्स में मजबूत एंडोथेलियल फ़ंक्शन पर जोर देता है, जो मस्तिष्क के सटीक शारीरिक क्षेत्रों में न्यूरोनल और ग्लियाल गतिविधि के ईंधन के लिए सीधे रक्त प्रवाह को जोड़ता है। इस प्रकार, यह उम्मीद की जाती है कि यह विधि स्वस्थ और रोगग्रस्त मस्तिष्क से संबंधित संवहनी शरीर विज्ञान और तंत्रिका विज्ञान के सामान्य ज्ञान को काफी आगे बढ़ाएगी।

Introduction

पैरेन्काइमल धमनियां सीधे मस्तिष्क में आवश्यक ऑक्सीजन और पोषक तत्व प्रदान करतीहैं 1। केशिकाओं के साथ इंटरफेसिंग करते समय, अत्यधिक वासोएक्टिव धमनियां केशिका आयन चैनलों द्वारा शुरू किए गए प्रतिगामी सिग्नलिंग का जवाब देती हैं जो विशिष्ट न्यूरोनल क्षेत्रों से चयापचय संकेतों को समझतीहैं। मस्तिष्क पैरेन्काइमा के साथ ऐतिहासिक रूप से जांच का थोक प्राप्त करने के साथ, एंडोथेलियल डिसफंक्शन के लिए एक भूमिका अब विभिन्न सेरेब्रोवास्कुलर विकारों से जुड़े पैथोलॉजिकल तंत्र को स्पष्ट करने के लिए उभरी है जो मनोभ्रंश (जैसे, इस्केमिक स्ट्रोक, अल्जाइमर रोग) को रेखांकित करती है 3,4,5,6 . एंडोथेलियम पूरे संवहनी खंडों में आनुवांशिकी, संरचना और कार्य की विषमता के अनुरूप मस्तिष्क के परफ्यूजन के लिए अभिन्नअंग है। पायल धमनियों को उनके अपेक्षाकृत बड़े आकार, उच्च खंडीय संवहनी प्रतिरोध, और अंतर्निहित सेरेब्रम 8,9 में रक्त प्रवाह वितरण में भूमिका के कारण बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। इस प्रकार, धमनीविस्फार एंडोथेलियल तंत्र की बेहतर समझ संभवतः उपन्यास चिकित्सीय आहार के विकास की दिशा में स्वास्थ्य और बीमारी में मस्तिष्क रक्त प्रवाह विनियमन की समझ को बढ़ाएगी।

उभरते हुए साक्ष्य विभिन्न सिग्नलिंग मार्गों और बीमारियों के संबंध में पैरेन्काइमल धमनियों के अध्ययन के महत्व पर प्रकाश डालतेहैं 8,10। हालांकि, इस दृष्टिकोण को बरकरार दबाव वाले आर्टेरियोल11 और / या केशिका-पैरेन्काइमल आर्टेरियोल (सीएपीए) तैयारी12 का उपयोग करने तक सीमित कर दिया गया है। ताजा अलग-थलग, देशी सेरेब्रल आर्टेरिओलर एंडोथेलियल कोशिकाएं अन्य सेल प्रकारों और भ्रमित कारकों से रहित हैं, उनकी जांच नहीं की गई है, संभवतः उनके अलगाव में तकनीकी कठिनाइयों के कारण। यह पेपर एक पिछली तकनीक को आगे बढ़ाता है जो पियाल धमनी एंडोथेलियम13 के अलगाव को उजागर करता है, अब मज़बूती से और मस्तिष्क पैरेन्काइमल धमनियों के एंडोथेलियम को अलग करता है (चौड़ाई: ~ 25 μm, लंबाई: ~ 250 μm)। यह तकनीक उनके व्यक्तिगत अभिविन्यास और सेलुलर नेटवर्क में विद्युत और रासायनिक रूप से युग्मित कोशिकाओं के इष्टतम संकल्प को प्राप्त करने में मदद करती है।

ब्याज के प्रमुख मार्गों में इंट्रासेल्युलर सीए2 + ([सीए2 +] i) की बातचीत शामिल है झिल्ली क्षमता (वीएम) 14,15 के सिग्नलिंग और हाइपरपोलराइजेशन - वासोडिलेशन16 के लिए अभिन्न - रक्त को केशिकाओं में प्रवेश करने और सक्रिय पैरेन्काइमा17 को ऑक्सीजन और पोषक तत्वों को वितरित करने की अनुमति देने के लिए। ये तैयारी आयन चैनलों की वास्तविक समय की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देती हैं, जिसमें Ca2 + - permeant, क्षणिक रिसेप्टर क्षमता (टीआरपी) और K + चैनल और / या एंडोथेलियल सेल ट्यूबों के भीतर इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल की फ्लोरोसेंट इमेजिंग शामिल हैं। यह शारीरिक सेलुलर तंत्र में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए एक उपयुक्त तकनीक है जो मस्तिष्क पैरेन्काइमा में सेरेब्रल रक्त प्रवाह वितरण के एंडोथेलियल सेल नियंत्रण को नियंत्रित करती है। कुल मिलाकर, यह तकनीक शोधकर्ताओं को सेरेब्रोवास्कुलर फिजियोलॉजी और पैथोलॉजी से संबंधित प्रश्नों को संबोधित करते हुए मस्तिष्क पैरेन्काइमा में एम्बेडेड धमनियों के मौलिक एंडोथेलियल सिग्नलिंग मार्गों और नेटवर्क संचार को बेहतर ढंग से समझने में मदद करेगी।

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Protocol

प्रयोगकर्ताओं को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि जानवरों और संबंधित प्रोटोकॉल के नामित उपयोग को उनके संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया जाता है और राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद के "प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड" (8वें संस्करण, 2011) और आगमन दिशानिर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया जाता है। लोमा लिंडा विश्वविद्यालय और एरिजोना विश्वविद्यालय के आईएसीयूसी ने C57BL / 6N और 3xTg-AD चूहों (पुरुषों और महिलाओं; आयु सीमा: 2-30 महीने) के लिए इस पांडुलिपि के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी है। मस्तिष्क के माउस पैरेन्काइमल धमनियों से ताजा अलग धमनीविस्फार एंडोथेलियल ट्यूबों के अलगाव और परीक्षा के अवलोकन के रूप में चित्रा 1 देखें।

1. सामग्री और उपकरण

नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक सभी अभिकर्मकों और सामग्रियों के लिए सामग्री की तालिका देखें। इसके अलावा संबंधित वेंडर्स से जुड़े मैनुअल और वेबसाइट्स से भी जरूरत के मुताबिक सलाह ली जा सकती है। विच्छेदन स्टेशनों और प्रयोगात्मक उपकरणों के चित्र पहले प्रदान किए गए हैं।

  1. प्रवाह कक्ष
    1. anodized एल्यूमीनियम से बने एक मंच पर एक ग्लास coverslip के साथ एक superfusion कक्ष जकड़ना. एक एल्यूमीनियम माइक्रोस्कोप चरण पर कक्ष के साथ मंच को सुरक्षित करें।
    2. एल्यूमीनियम माइक्रोस्कोप चरण पर मंच के प्रत्येक छोर पर एक पिनिंग पिपेट पकड़े हुए एक माइक्रोमैनिपुलेटर सेट करें।
      नोट: यदि आवश्यक हो, तो प्रयोग के लिए एक माइक्रोस्कोप उपकरण से दूसरे में एक सुरक्षित, अलग एंडोथेलियल ट्यूब को स्थानांतरित करने के लिए एक प्रवाह कक्ष इकाई के साथ एक हस्तांतरणीय चरण उपकरण का उपयोग करें।
  2. सूक्ष्मदर्शी
    1. विच्छेदन प्रक्रियाओं के लिए स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (5x से 50x आवर्धन रेंज) और फाइबर ऑप्टिक प्रकाश स्रोतों का उपयोग करें।
    2. एंडोथेलियल ट्यूबों के अलगाव के लिए, चरण कंट्रास्ट- या विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) -संगत उद्देश्यों (10x, 20x, और 40x) और एक एल्यूमीनियम चरण से लैस एक उल्टे माइक्रोस्कोप रिग का उपयोग करें।
    3. आंशिक रूप से पचने वाले रक्त वाहिकाओं से एंडोथेलियल ट्यूबों को अलग करने के लिए समर्पित उपकरण के बगल में एक माइक्रोसिरिंज पंप नियंत्रक तैयार है।
    4. एक उल्टे माइक्रोस्कोप (उद्देश्यों: 4x, 10x, 20x, 40x, और 60x) और एक कंपन अलगाव तालिका पर एक मैनुअल एल्यूमीनियम चरण की व्यवस्था करके प्रयोगात्मक उपकरण स्थापित करें।
  3. इंट्रासेल्युलर वीएम रिकॉर्डिंग उपकरण
    1. इलेक्ट्रोमीटर को एक संगत हेडस्टेज से कनेक्ट करें। वर्तमान इंजेक्शन की आवश्यकता वाले प्रोटोकॉल के लिए सहायक उपकरण, जैसे फ़ंक्शन जनरेटर और उत्तेजक का उपयोग करें।
    2. एम्पलीफायर आउटपुट को डेटा डिजिटाइज़र सिस्टम, ऑसिलोस्कोप और श्रव्य बेसलाइन मॉनिटर से कनेक्ट करें। प्रवाह कक्ष से बाहर निकलने के पास संदर्भ स्नान इलेक्ट्रोड (Ag / AgCl गोली) को सुरक्षित करें।
    3. एक प्रतिदीप्ति प्रणाली इंटरफ़ेस, उच्च तीव्रता चाप लैंप और बिजली की आपूर्ति, hyperswitch, फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब (या PMT) के एकीकृत घटकों के साथ एक फोटोमेट्रिक प्रणाली को इकट्ठा, और कैमरा को मापने के लिए [Ca2+] मैं एंडोथेलियल कोशिकाओं में।
    4. प्रयोग के दौरान एक शारीरिक तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) को बढ़ाने और बनाए रखने के लिए एक इनलाइन हीटर से सुसज्जित एक तापमान नियंत्रक को इकट्ठा करें।
    5. कक्ष में सुरक्षित एंडोथेलियल ट्यूबों के समाधान के वितरण को नियंत्रित करने के लिए एक इनलाइन प्रवाह नियंत्रण वाल्व के साथ एक वाल्व नियंत्रक से जुड़े एक मल्टीचैनल प्लेटफ़ॉर्म को इकट्ठा करें।
  4. Micropipettes और तेज इलेक्ट्रोड
    नोट: प्रयोगकर्ता को एक इलेक्ट्रॉनिक ग्लास पुलर और एक माइक्रोफोर्ज की आवश्यकता होगी जो ट्राइटुरेशन और पिनिंग पिपेट्स तैयार करने के लिए होगी।
    1. एंडोथेलियल ट्यूब को आंशिक रूप से पचाए गए आर्टेरियोलर सेगमेंट से अलग करने के लिए, बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं से गर्मी-पॉलिश ट्राइटुरेशन पिपेट्स (आंतरिक टिप व्यास: 30-50 μm) तैयार करें।
    2. सुपरफ्यूजन चैंबर में एंडोथेलियल ट्यूब को सुरक्षित करने के लिए, पतली दीवार बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं से तैयार एक कुंद, गोलाकार अंत (बाहरी व्यास: 50-70 μm) के साथ गर्मी-पॉलिश पिनिंग पिपेट्स तैयार करें।
    3. एक एंडोथेलियल सेल के वीएम को रिकॉर्ड करने के लिए, केवल ग्लास पुलर का उपयोग करके ग्लास केशिकाओं से ~ 150 ± 30 एमΩ के टिप प्रतिरोध के साथ तेज इलेक्ट्रोड तैयार करें।

2. समाधान और दवाओं

  1. शारीरिक नमक समाधान (पीएसएस)
    1. 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 10 mM MgCl2, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES), और 10 mM ग्लूकोज का उपयोग करके पीएसएस का न्यूनतम 1 एल तैयार करें।
    2. सेरेब्रल आर्टेरियोल्स के विच्छेदन और एंडोथेलियल ट्यूब के अलगाव के लिए CaCl2 (शून्य Ca2 + PSS) की कमी वाले आवश्यक समाधान तैयार करें।
      नोट: ultrapure deionized H2O में सभी समाधान तैयार करें, निस्पंदन (0.22 μm) के बाद। सुनिश्चित करें कि अंतिम उत्पाद में 290 और 300 mOsm के बीच osmolality के साथ एक पीएच 7.4 है।
  2. गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए, 10%)
    1. शून्य Ca2 + PSS के 10 mL के एक बीकर में lyophilized बीएसए पाउडर के 1 ग्राम भंग। बीकर को कवर करें और बीएसए को भंग करने के लिए धीमी गति से सरगर्मी के साथ कम से कम 2 घंटे की अनुमति दें।
    2. एक 10 mL सिरिंज प्लस एक 0.22 μm फिल्टर का उपयोग कर समाधान फ़िल्टर करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने के लिए 1 mL ऐलीकोट तैयार करें।
  3. विच्छेदन समाधान
    1. 50 mL की कुल मात्रा के लिए शून्य Ca2 + PSS के 49.5 mL करने के लिए BSA (10%) के 500 μL जोड़ें।
    2. धमनीविस्फार विच्छेदन के लिए एक पेट्री डिश में स्थानांतरण समाधान।
  4. पृथक्करण समाधान
    1. 50 mL की कुल मात्रा के लिए CaCl2 समाधान (1 M) के 5 μL और BSA के 500 μL (10%) को शून्य Ca2+ PSS के 49.5 mL जोड़ें। कम से कम 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर समाधान इनक्यूबेट करें।
  5. एंजाइमों
    1. 100 μg / mL papain, 170 μg / mL dithioerythritol, 250 μg / mL कोलेजनेस (प्रकार एच मिश्रण), और 40 μg / mL इलास्टेज के साथ 1 mL पाचन समाधान तैयार करें।
      नोट: एंजाइम गतिविधियां अलग-अलग हो सकती हैं, हालांकि सफल प्रोटोकॉल के लिए निम्नलिखित एंजाइमेटिक गतिविधियों की आवश्यकता होगी: ≥ पपेन के लिए 10 इकाइयां / मिलीग्राम, कोलेजेनेस के लिए ≥ 1 इकाई / मिलीग्राम, और इलास्टेज के लिए 5 इकाइयों / मिलीग्राम ≥।
  6. Fura-2 और औषधीय एजेंट
    1. डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ; 1 एमएम) में फुरा -2 एएम स्टॉक तैयार करें। लोड िंग के लिए PSS के 495 μL करने के लिए स्टॉक के 5 μL जोड़कर काम एकाग्रता (10 μM) के 500 μL तैयार करें।
    2. पीएसएस या डीएमएसओ में फार्माकोलॉजिकल एजेंटों की काम करने वाली सांद्रता के कम से कम 50 मिलीलीटर को उपयुक्त के रूप में तैयार करें।
  7. संवाहक समाधान
    1. विआयनीकृत H 2 O में KCl को भंग करके2M KCl तैयार करें (H2O के 50 mL में KCl का 7.455 g)। तेज इलेक्ट्रोड backfilling करने से पहले एक 0.22 μm फिल्टर के साथ एक सिरिंज के माध्यम से समाधान पारित करें।
  8. फ्लोरोसेंट ऑर्गेनेल ट्रैकर्स और एंटीबॉडी
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार उचित शारीरिक खारा समाधान में प्लाज्मा झिल्ली या ऑर्गेनेलर (जैसे, नाभिक, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम) ट्रैकर तैयार करें।
    2. उपयुक्त शारीरिक नमक समाधान में निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी तैयार करें।

3. विच्छेदन और माउस सेरेब्रल धमनियों के अलगाव

नोट: स्टीरियोमाइक्रोस्कोप और तेज माइक्रोडिसेक्शन टूल (उदाहरण के लिए, ठीक-इत्तला दी गई संदंश, वैनास-शैली विच्छेदन कैंची) का उपयोग इन सभी विच्छेदन प्रक्रियाओं में नमूना आवर्धन (50x तक) के लिए किया जाना चाहिए।

  1. माउस मस्तिष्क का अलगाव
    1. एक मानक प्रयोगशाला माउस (उदाहरण के लिए, C57BL / 6, 3xTg-AD; 2-30 महीने की उम्र, पुरुष या महिला) का उपयोग करके आइसोफ्लुरेन साँस लेना (2-3 मिनट के लिए 3%), इसके बाद IACUC अनुमोदन के प्रति तेज कैंची या गिलोटिन का उपयोग करके तत्काल विच्छेदन किया जाता है। माउस सिर को एक पेट्री डिश (व्यास 10 सेमी, गहराई 1.5 सेमी) में रखें जिसमें ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) विच्छेदन समाधान होता है।
    2. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत देखते समय, खोपड़ी पर त्वचा और बालों को हटा दें और ठंडे विच्छेदन समाधान के साथ अत्यधिक रक्त को धो लें। मानक विच्छेदन कैंची (जैसे, 24 मिमी ब्लेड) की युक्तियों का उपयोग करते हुए, ओसीसीपटल हड्डी के साथ शुरू होने और खोपड़ी की नाक की हड्डी के माध्यम से विस्तारित होने वाला एक चीरा बनाएं। चीरा के साथ खोपड़ी को सावधानीपूर्वक खोलने के लिए मोटे-टिप्ड संदंश का उपयोग करें, और विलिस के एक बरकरार सर्कल वाले मस्तिष्क को अलग करने के लिए अलग संयोजी ऊतक (मेनिंगल झिल्ली) को अलग करें।
    3. मस्तिष्क की सतह से शेष रक्त को हटाने के लिए बीकर या पेट्री डिश में ठंडे विच्छेदन समाधान के साथ पृथक मस्तिष्क को धोएं। पैरेन्काइमल धमनियों के अलगाव के लिए ठंडे विच्छेदन समाधान वाले एक कक्ष में मस्तिष्क वेंट्रल साइड का सामना करना पड़ रहा है (चित्रा 2 ए)।
  2. पैरेन्काइमल धमनियों का अलगाव
    नोट: मध्य सेरेब्रल धमनियों (एमसीए) से उत्पन्न होने वाले धमनियों और मस्तिष्क पैरेन्काइमा में एम्बेडेड को इस प्रोटोकॉल के लिए चुना जाता है। धमनियों को अलग किया जाता है जैसा कि पहले वर्णित11, संशोधन के साथ किया गया था।
    1. स्टील पिन (व्यास: 0.2 मिमी, लंबाई: 11 से 12 मिमी) का उपयोग करें एक पेट्री डिश में ठंडे विच्छेदन समाधान में अलग-थलग मस्तिष्क को सुरक्षित करने के लिए जिसमें एक चारकोल-संक्रमित सिलिकॉन बहुलक कोटिंग (गहराई ≥ 50 सेमी) होता है।
    2. तेज और संरेखित विच्छेदन कैंची का उपयोग करते हुए, एमसीए के चारों ओर मस्तिष्क ऊतक (लंबाई: 5 मिमी, चौड़ाई: 3 मिमी) (चित्रा 2 बी) के एक आयत को काटें, जबकि यह सुनिश्चित करते हुए कि ऊतक खंड का ऊपरी हिस्सा विलिस के सर्कल से ब्रांचिंग बिंदु से पहले है। यदि आवश्यक हो तो अधिक धमनियों तक पहुंचने के लिए मस्तिष्क के दूसरे गोलार्ध से मस्तिष्क के ऊतकों का एक और आयत काटें।
    3. स्टील पिन (व्यास: 0.1 मिमी, लंबाई: 13 से 14 मिमी) का उपयोग करके एमसीए ऊपर की ओर (विलिस के सर्कल से दूरस्थ) का सामना करने के साथ डिश में अलग मस्तिष्क ऊतक खंड को सुरक्षित करें। छोटे संदंश के साथ पिया को हटाने के लिए पिन के पास एक उथला चीरा सावधानीपूर्वक बनाएं, धीरे से एक छोर से दूसरे छोर की ओर छीलना (चित्रा 2 सी)। यदि आवश्यक हो तो अधिक धमनियों तक पहुंचने के लिए अन्य ऊतक खंड से पिया को हटा दें। पिन के साथ पकवान में एमसीए से शाखित पैरेन्काइमल धमनियों के साथ अलग-थलग पिया को सावधानीपूर्वक सुरक्षित करें, और पैरेन्काइमल आर्टेरियोल्स (चित्रा 2 डी) को विच्छेदन करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि धमनियों को नुकसान नहीं पहुंचा है।
      नोट: यदि धमनियों को पैरेन्काइमा से पिया के साथ आसानी से बाहर नहीं निकाला जाता है, तो ठीक संदंश का उपयोग करें और मस्तिष्क में खुदाई करें, जो विलिस के सर्कल से एमसीए शाखा बिंदु पर शुरू होता है। आर्टेरियोल का पता लगाएं, धमनियों के चारों ओर ऊतक को सावधानीपूर्वक ढीला करें (चित्रा 2 ई), और धीरे से आर्टेरियोल को पैरेन्काइमा से बाहर निकालें, आर्टेरियोल के ऊपरी छोर को पकड़ते हुए (चित्रा 2 एफ)। एकाधिक धमनियों (लंबाई: ~ 1.5-2 मिमी) को मस्तिष्क के ऊतकों के एक आयत से अलग किया जा सकता है।
    4. सुनिश्चित करें कि आर्टेरियोल साफ है, जिसमें कोई ऊतक नहीं जुड़ा हुआ है, और किसी भी शेष डिस्टल शाखाओं को काट दिया गया है (चित्रा 3 ए)। एंजाइमेटिक पाचन के लिए इस साफ, बरकरार धमनी का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, यदि वांछित हो तो एंडोथेलियल ट्यूबों की तैयारी के लिए एंजाइमेटिक पाचन के लिए प्रत्येक आर्टेरियोल को दो टुकड़ों (लंबाई: 0.75-1 मिमी) में काट लें।

4. पैरेन्काइमल धमनियों का पाचन और एंडोथेलियल ट्यूबों की तैयारी

  1. उपकरणों और पिपेट्स की व्यवस्था
    नोट: मस्तिष्क से धमनी एंडोथेलियल ट्यूबों के अलगाव को पहले13,18 वर्णित किया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल में पैरेन्काइमल (इंट्रासेरेब्रल) धमनियों से एंडोथेलियम के अलगाव के लिए संशोधन शामिल हैं। एकाधिक धमनियों या / और धमनियों के टुकड़ों को एंजाइमेटिक पाचन के लिए एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है।
    1. एक कक्ष और micromanipulators का समर्थन एक एल्यूमीनियम चरण का उपयोग कर एंडोथेलियल ट्यूबों को तैयार करने के लिए trituration उपकरण13 इकट्ठा. उद्देश्यों (5x-60x) और एक कंप्यूटर मॉनिटर से जुड़े कैमरे से लैस एक माइक्रोस्कोप को इकट्ठा करें। मंच और नमूने के बगल में एक पंप नियंत्रक के साथ एक माइक्रोसिरिंज सुरक्षित करें।
    2. माइक्रोसिरिंज पिस्टन पर खनिज तेल के साथ backfilled एक trituration पिपेट सुरक्षित. पंप नियंत्रक के साथ microsyringe का उपयोग करने के लिए खनिज तेल के शीर्ष पर trituration पिपेट (~ 130 nL) में पृथक्करण समाधान वापस लेने के लिए, जबकि पिपेट में हवा के बुलबुले से बचने के लिए देखभाल ले रही है।
  2. धमनीविस्फोटिका खंडों का आंशिक पाचन
    1. 100 μg / mL papain, 170 μg / mL dithioerythritol, 250 μg / mL कोलेजनेस, और 40 μg / mL elastase युक्त एक 10 mL ग्लास ट्यूब में पृथक्करण समाधान के 1 mL में बरकरार धमनीविस्फार खंडों को रखें। 10-12 मिनट के लिए 34 डिग्री सेल्सियस पर धमनीविस्फार खंडों को इनक्यूबेट करें।
    2. पाचन के बाद, एंजाइम समाधान को कमरे के तापमान पर 3-4 मिलीलीटर ताजा पृथक्करण समाधान के साथ बदलें।
  3. धमनीविस्फार एंडोथेलियल ट्यूब का पृथक्करण
    नोट: पाचन और एंजाइम समाधान के प्रतिस्थापन के बाद, एक मोबाइल प्लेटफ़ॉर्म से जुड़े एक सुपरफ्यूजन कक्ष में पृथक्करण समाधान में एक या कई आंशिक रूप से पचे हुए खंडों को स्थानांतरित करें। 100x से 200x आवर्धन पर देखते समय, आंशिक रूप से पचे हुए लेकिन अखंड पोत खंड का चयन करें और माइक्रोस्कोप के तहत उस पर ध्यान केंद्रित करें।
    1. कक्ष में पृथक्करण समाधान में माइक्रोसिरिंज इंजेक्टर के साथ जुड़े ट्राइटुरेशन पिपेट को रखें और इसे पचाए गए पोत खंड के एक छोर के करीब रखें। कोमल trituration के लिए पंप नियंत्रक पर 1-3 nL / s की सीमा के भीतर एक दर सेट करें।
    2. 100x से 200x आवर्धन को बनाए रखते हुए, पिपेट में धमनीविस्फोट को वापस ले लें और फिर एडवेंटिया और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (चित्रा 3 बी) को अलग करने के लिए बाहर निकालें। पोत खंड को तब तक ट्राइट्यूरेट करें जब तक कि सभी चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं अलग न हो जाएं, और केवल एंडोथेलियल कोशिकाएं एक बरकरार "ट्यूब" के रूप में बनी रहती हैं।
      नोट: यदि trituration के दौरान आवश्यक हो, तो एंडोथेलियल ट्यूब से विघटित adventitia और आंतरिक लोचदार लामिना को हटाने के लिए ध्यान से ठीक-इत्तला संदंश का उपयोग करें। आमतौर पर, ट्राइटुरेशन के केवल कुछ चक्र एक बरकरार एंडोथेलियल ट्यूब उत्पन्न करते हैं।
    3. बोरोसिलिकेट ग्लास पिनिंग पिपेट्स (चित्रा 3 सी, डी) के साथ कक्ष में ग्लास कवरस्लिप पर एंडोथेलियल ट्यूब के प्रत्येक छोर को सुरक्षित करने के लिए माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करें।
  4. धमनीविस्फारीय एंडोथेलियल ट्यूब को सुरक्षित करना
    1. पृथक्करण समाधान को सुपरफ्यूजन समाधान (पीएसएस युक्त 2 mM CaCl2) के साथ बदलें, जबकि यह सुनिश्चित करते हुए कि गैर-एंडोथेलियल सामग्री को कक्ष से धोया जाता है।
    2. मोबाइल प्लेटफ़ॉर्म में सुरक्षित एंडोथेलियल ट्यूब को माइक्रोस्कोप रिग में स्थानांतरित करें जो निरंतर सुपरफ्यूजन और इंट्रासेल्युलर या फ्लोरोसेंट रिकॉर्डिंग / इमेजिंग के लिए डिज़ाइन किया गया है।
    3. प्रयोग के दौरान पीएसएस की निरंतर डिलीवरी लागू करें। मैन्युअल रूप से इनलाइन प्रवाह नियंत्रण वाल्व का उपयोग करके प्रयोग के दौरान प्रवाह दर (5-7 एमएल / मिनट) सेट करें, जो लैमिनर प्रवाह के अनुरूप है, जबकि वैक्यूम सक्शन की सीमा तक समाधान प्रवाह के फ़ीड का मिलान करता है। पृष्ठभूमि डेटा और / या डाई लोडिंग प्राप्त करने से पहले एंडोथेलियल ट्यूब के सुपरफ्यूजन के लिए कक्ष में पीएसएस प्रवाह के ≥5 मिनट की अनुमति दें।

5. सेलुलर शरीर विज्ञान की परीक्षा के लिए धमनीविस्फार एंडोथेलियल ट्यूबों का उपयोग

नोट: पृथक और सुरक्षित धमनीविस्फार एंडोथेलियल ट्यूबों का उपयोग इंट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग के लिए किया जा सकता है [Ca2+]i गतिशीलता और Vm क्रमशः फोटोमेट्री और तेज इलेक्ट्रोड इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग करके, जैसा कि पहले सचित्र13 (चित्रा 4)। [Ca2+] i और Vm को अलग-अलग या संयुक्त प्रयोगात्मक चर के रूप में मापा जा सकता है जैसा कि आवश्यक13 (चित्रा 4) है। हालांकि, धमनीअर्थानुचिकित्सा नलिकाएं धमनी एंडोथेलियम की तुलना में अधिक नाजुक होती हैं, और प्रयोग का समय 1 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए।

  1. [Ca2+]i का मापन
    1. [Ca2+] के लिए उपकरण और सॉफ़्टवेयर चालू करें, जबकि 5-7 mL / मिनट की प्रवाह दर पर निरंतर सुपरफ्यूजन बनाए रखते हुए i रिकॉर्डिंग करता हूं।
    2. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए Ca2 + डाई Fura-2 AM के साथ एंडोथेलियल ट्यूब लोड करें। एक और 20-30 मिनट के लिए सुपरफ्यूजन समाधान के साथ कोशिकाओं को धोएं, जबकि धीरे-धीरे स्नान के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाएं। पूरे प्रयोग के दौरान तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
    3. ~ 20 एंडोथेलियल कोशिकाओं (चित्रा 4 ए) पर ध्यान केंद्रित करने के लिए फोटोमेट्री सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके इमेजिंग विंडो को मैन्युअल रूप से समायोजित करें। प्रकाश की अनुपस्थिति में, प्रतिदीप्ति इंटरफ़ेस पर PMT को चालू करें और 510 एनएम पर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन एकत्र करते हुए 340 एनएम और 380 एनएम पर वैकल्पिक रूप से (≥10 हर्ट्ज) को रोमांचक फुरा -2 द्वारा [Ca2+] i का अधिग्रहण शुरू करें। एक बार [Ca2+] i की एक स्थिर आधार रेखा रिकॉर्डिंग स्थापित होने के बाद, प्रयोगात्मक उद्देश्य (चित्रा 4 B) प्रति औषधीय एजेंट (जैसे, प्यूरिनर्जिक रिसेप्टर एगोनिस्ट) लागू करें।
  2. Vm का मापन
    1. वीएम रिकॉर्डिंग के लिए उपकरण और सॉफ़्टवेयर को चालू करें और 5-7 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर निरंतर सुपरफ्यूजन बनाए रखते हुए डेटा अधिग्रहण दर (≥10 हर्ट्ज) सेट करें। धीरे-धीरे स्नान के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाएं और प्रयोग के अंत तक इसे बनाए रखें।
    2. एक बोरोसिलिकेट ग्लास केशिका का उपयोग करके एक तेज इलेक्ट्रोड खींचें, 2 एम केसीएल के साथ बैकफिल, और इसे एक इलेक्ट्रोमीटर से जुड़े पिपेट धारक में क्लोराइड के साथ लेपित चांदी के तार पर सुरक्षित करें, जो बदले में, एक माइक्रोमैनिपुलेटर द्वारा आयोजित किया जाता है।
    3. 4x उद्देश्य के माध्यम से देखते समय, कक्ष में बहने वाले पीएसएस में धमनीविस्फोटक एंडोथेलियल ट्यूब की एक कोशिका पर तेज इलेक्ट्रोड टिप को सावधानीपूर्वक रखने के लिए एक माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करें।
    4. धीरे-धीरे आवर्धन को 400x तक बढ़ाएं और आवश्यकतानुसार इलेक्ट्रोड टिप को पुनर्स्थापित करें।
    5. माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करते हुए, एंडोथेलियल ट्यूब की कोशिकाओं में से एक में धीरे से एक तेज इलेक्ट्रोड की नोक डालें और एक इलेक्ट्रोमीटर (चित्रा 4 ए) का उपयोग करके वीएम रिकॉर्ड करना शुरू करें।
    6. एक बार एंडोथेलियल रेस्टिंग वीएम स्थिर हो जाता है (-30 से -40 एमवी), प्रति प्रयोगात्मक उद्देश्य (चित्रा 4 सी) के लिए वांछित औषधीय एजेंटों को लागू करें।

6. सेलुलर इमेजिंग

नोट: मोबाइल प्लेटफ़ॉर्म के कक्ष में सुरक्षित एंडोथेलियल ट्यूबों का उपयोग मानक प्रतिदीप्ति या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपीका उपयोग करके लाइव और फिक्स्ड दोनों स्थितियों में माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग के लिए भी किया जा सकता है। रिसेप्टर्स और आयन चैनलों के लिए विभिन्न एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री को भी पहले वर्णित20 के रूप में लागू किया जा सकता है।

  1. प्लाज्मा झिल्ली या वांछित ऑर्गेनेल (जैसे, नाभिक, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम) के लिए प्रतिदीप्ति ट्रैकर के साथ एंडोथेलियल ट्यूब को 15-30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर लोड करें।
  2. संबंधित रंजक (चित्रा 4 डी, ई) की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर माइक्रोस्कोप के तहत ताजा सुपरफ्यूजन पीएसएस और छवि लाइव कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं को धोएं।
    नोट: इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री को ब्याज के एंटीबॉडी का उपयोग करके इस ट्यूब मॉडल पर किया जा सकता है।

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Representative Results

प्रोटोकॉल का एक प्रदर्शन चित्र 1 में धमनीविस्फेक्शन और एंडोथेलियल ट्यूब अलगाव चरणों के साथ क्रमशः चित्रा 2 और चित्रा 3 के रूप में दिखाया गया है। यहां, एंडोथेलियल फ़ंक्शन का मूल्यांकन [Ca2+] i और Vm को मापकर किया गया था, जिसमें फुरा -2 फोटोमेट्री और तेज इलेक्ट्रोड इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी (चित्रा 4 ए) का उपयोग करके एक औषधीय एजेंट [2-मिथाइलथियोएडेनोसिन डाइफॉस्फेट (एमटीए), एक शक्तिशाली प्यूरिनर्जिक रिसेप्टर (पी 2 वाईआर) एगोनिस्ट] के जवाब में 37 डिग्री सेल्सियस पर। एमटीए (1 μM) के आवेदन पर, [Ca2+] i तेजी से बढ़ता है (चित्रा 4B) एक सहवर्ती hyperpolarization (चित्रा 4C) के साथ। ये माप जी क्यू-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (पी 2 वाईआर) के सक्रियण का प्रतिबिंब हैं, जिसके बाद छोटे और मध्यवर्ती-चालकता Ca2 + - सक्रिय K + चैनलों (SKCa / IKCa) के सक्रियण के बाद, जो एंडोथेलियम-निर्भर हाइपरपोलराइजेशन (ईडीएच) वासोडिलेटरी मार्ग शुरू करते हैं। इस प्रकार, एक पैरेन्काइमल आर्टेरियोल से अलग एंडोथेलियम अलगाव में कार्यात्मक है और इसका उपयोग मार्गों के प्रमुख घटकों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जिसमें [Ca2+] i और / या K + चैनलों के माध्यम से Vm का विनियमन शामिल है।

इसके अलावा, बरकरार एंडोथेलियम को सेलुलर आकृति विज्ञान की जांच करने के लिए विज़ुअलाइज़ेशन के लिए फ्लोरोसेंट ट्रैकर्स के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था। लाइव एंडोथेलियल सेल इमेजिंग प्लाज्मा झिल्ली (हरे) और नाभिक (लाल) (चित्रा 4 डी) के लिए सह-धुंधला दिखाता है। चित्रा 4ई में, प्लाज्मा झिल्ली (हरे) को एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर; लाल) फ्लोरोसेंट दाग के साथ एक साथ दाग दिया गया था, जिससे प्लाज्मा झिल्ली की निकटता के भीतर ईआर के स्पष्ट ओवरलैप के क्षेत्र नारंगी दिखाई देते हैं (चित्रा 4 ई)। ये फ्लोरोसेंट छवियां आगे धमनीविस्फार एंडोथेलियम की सेलुलर अखंडता और जंक्शनल झिल्ली परिसरों में स्थित सिग्नलिंग माइक्रोडोमेन का अध्ययन करने के लिए उनके संभावित उपयोग को प्रकट करती हैं।

Figure 1
चित्रा 1: माउस पैरेन्काइमल आर्टेरियोल से ताजा अलग धमनीविस्फार एंडोथेलियल ट्यूब की परीक्षा। जैसा कि चित्रित किया गया है, मस्तिष्क को माउस से अलग किया गया है, और एमसीए युक्त आयताकार मस्तिष्क ऊतक का एक टुकड़ा हटा दिया गया था। एमसीए से ब्रांचिंग और मस्तिष्क पैरेन्काइमा में प्रवेश करने वाले पैरेन्काइमल आर्टेरियोल्स को अलग किया जाता है। धमनियों को एंजाइमेटिक रूप से पचाया जाता है और ट्राइट्यूरेटेड किया जाता है, जो अध्ययन के लिए एक बरकरार एंडोथेलियल ट्यूब का उत्पादन करता है। तैयार एंडोथेलियल ट्यूब इंट्रासेल्युलर सीए2 + गतिशीलता और वीएम के माप को सक्षम बनाता है, जबकि प्रतिदीप्ति इमेजिंग और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए सेलुलर इमेजिंग को भी सक्षम करता है। संक्षेप: एमसीए = मध्य सेरेब्रल धमनी; Vm = झिल्ली विभव। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: विच्छेदन और पैरेन्काइमल धमनियों का अलगाव( ए) विलिस के बरकरार सर्कल के साथ अलग माउस मस्तिष्क। (बी) मस्तिष्क ऊतक का एक विच्छेदित आयताकार टुकड़ा जिसमें एमसीए (सफेद तीर) होता है। (सी) ऊतक के ऊपरी हिस्से से पिया का अलगाव (धमनी, नीला तीर)। (डी) धमनियों (नीले एरोहेड्स के साथ उल्लिखित) मध्य सेरेब्रल धमनियों (पीले तीर) से जुड़ा हुआ है। (ई) मस्तिष्क के ऊतकों में पहचाने गए धमनी (नीले तीर)। (च) ढीले ऊतक से धमनी (नीले तीर) को बाहर निकालना। ध्यान दें कि पैनल ई और एफ आर्टेरियोल के अलगाव के लिए एक वैकल्पिक विधि का संकेत देते हैं (प्रोटोकॉल चरण 3.2.3 देखें)। स्केल बार = 2 मिमी (ए, बी, सी), 0.2 मिमी (डी), और 1 मिमी (ई, एफ)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: पैरेन्काइमल धमनियों से एंडोथेलियल ट्यूबों की तैयारी। (ए) अलग और साफ धमनी (नीला तीर)। (बी) आंशिक रूप से एंजाइम-पचाए गए धमनीओल का ट्रिचुरेशन। (सी) बरकरार एंडोथेलियल ट्यूब (आवर्धन: 100x) तैयार और पिनिंग पिपेट्स का उपयोग करके ग्लास कवरस्लिप पर सुरक्षित। (डी) 200x आवर्धन पर एंडोथेलियल ट्यूब। स्केल बार = 0.2 मिमी (ए), 0.1 मिमी (बी, सी), और 0.05 मिमी (डी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: रक्त प्रवाह विनियमन से संबंधित मार्गों की शारीरिक परीक्षा के लिए एंडोथेलियल ट्यूब का अनुप्रयोग। (A) एक तेज इलेक्ट्रोड (बैंगनी तीर) फोटोमेट्री के लिए डेटा अधिग्रहण विंडो में केंद्रित एंडोथेलियल ट्यूब के सेल में स्थित है। (बी) एमटीए (1 μM) के जवाब में Fura-2 फोटोमेट्री का उपयोग करके इंट्रासेल्युलर Ca 2+ की प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग। (सी) पैनल बी में इंट्रासेल्युलर सीए2 + ट्रेस के साथ एक साथ वीएम की प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग। (डी) प्लाज्मा झिल्ली (हरे) और नाभिक (लाल) की प्रतिनिधि छवि फ्लोरोसेंट रंजक के साथ दाग वाले जीवित एंडोथेलियल कोशिकाओं की। (ई) प्लाज्मा झिल्ली (हरे) और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर, लाल) की प्रतिनिधि छवि फ्लोरोसेंट रंजक के साथ दाग वाले जीवित एंडोथेलियल कोशिकाओं की। ईआर और प्लाज्मा झिल्ली के लिए निकटता के क्षेत्रों को नारंगी में इंगित किया जाता है। छवियों को मोनोक्रोम कैमरे का उपयोग करके अधिग्रहित किया गया था और छद्म रंग के थे। स्केल सलाखों = 20 μm (डी), 10 μm (E). संक्षेप: MTA = 2-methylthioadenosine diphosphate; F340/F380 = Fura-2 डाई अनुपात संकेत; Vm = झिल्ली विभव; पीएम = प्लाज्मा झिल्ली; ईआर = एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

बढ़ते सबूत बताते हैं कि सेरेब्रोवास्कुलर रोग (सीवीडी), उम्र बढ़ने और अल्जाइमर रोग दृढ़ता से सहसंबद्ध हैं और मनोभ्रंश अनुसंधान 4,8,14,21 का एक वर्तमान विषय हैं। इस प्रकार, यह स्पष्ट है कि सेरेब्रोवास्कुलर नेटवर्क के अध्ययन का स्वास्थ्य पर व्यापक प्रभाव पड़ेगा, जबकि बीमारी की स्थितियों के दौरान निरंतर व्यापक जांच की आवश्यकता होगी। सेरेब्रल परफ्यूजन के लिए संवहनी प्रतिरोध के एक महत्वपूर्ण बिंदु के रूप में, सीवीडी के एटियलजि और विकास में पैरेन्काइमल धमनियों के सामान्य महत्व को 50से अधिक वर्षों के लिए उजागर किया गया है।

हालांकि, वैज्ञानिक परीक्षा उपकरण ों को बरकरार पैरेन्काइमल धमनियों और उनके समग्र सेल प्रकारों का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त रूप से विकसित नहीं किया गया है, जब तक कि हाल ही में पूर्व विवो दृष्टिकोणों की शुरुआत नहीं हुई, जैसे कि अलग-थलग, दबाव वाले पैरेन्काइमल आर्टेरियोल11 और सीएपीए12 तैयारी। सेरेब्रोवास्कुलर फिजियोलॉजी क्षेत्र को विशिष्ट सेल प्रकारों और सेरेब्रल रक्त प्रवाह विनियमन और रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) पारगम्यता के अंतर्निहित उनकी आनुवंशिक और औषधीय विशेषताओं पर ध्यान केंद्रित करने के लिए होमोसेलुलर अध्ययन मॉडल (चिकनी मांसपेशी, पेरिसाइट्स और एंडोथेलियम) में पूरक तकनीकों से भी लाभ होगा।

एंडोथेलियम एक केंद्रीय नियामक अंग है जो मस्तिष्क23 सहित पूरे शरीर में अन्य सभी अंगों को "खिलाता" है। यद्यपि सभी संवहनी खंडों (धमनियों, धमनियों, केशिकाओं, वेन्यूल्स, नसों) सेरेब्रल परफ्यूजन के लिए आवश्यक हैं, धमनियों के एंडोथेलियम को सेरेब्रोवास्कुलर ऑटोरेगुलेशन और न्यूरोवैस्कुलर युग्मन24 के लिए एक केंद्रीय घटक के रूप में समर्पित जांच की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, सीए2 + सिग्नलिंग25 और के + चैनल गतिविधि17,26 को पायल धमनियों के सापेक्ष पैरेन्काइमल धमनियों में मायोजेनिक टोन के विनियमन के दौरान बढ़ाया गया प्रतीत होता है। इस प्रकार, अब हमने पायल सेरेब्रल धमनियों (पीछे) 13 के लिए पहले से स्थापित विधि को पैरेन्काइमल धमनियों तक बढ़ा दिया है।

इन पहले सचित्र दृष्टिकोण11,13 के सापेक्ष, इस प्रोटोकॉल को विभिन्न चरणों (जैसे, एंजाइमेटिक उपचार, ट्राइचरेशन) को आनुभविक रूप से समायोजित करके परिष्कृत किया गया था ताकि पैरेन्काइमल आर्टेरियोल्स से बरकरार एंडोथेलियल ट्यूबों को पुन: उत्पन्न किया जा सके। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल सेलुलर फोटोमेट्री, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और फ्लोरोसेंट इमेजिंग (चित्रा 4) के आवेदन को अनुकूलित करने के लिए इस अध्ययन मॉडल के उपयोग को दर्शाता है। Fura-2 फोटोमेट्री और तेज इलेक्ट्रोड इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की सामान्य शक्तियों और सीमाओं के साथ पहले विस्तारसे 13 में वर्णित किया गया था, प्रयोगकर्ता को ब्याज की विशिष्ट परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए अन्य सीए2 + सिग्नलिंग और आयन चैनल एसेस की एक सरणी की कोशिश करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है। इसके अलावा, एंडोथेलियल सेल-विशिष्ट आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड संकेतकों (जैसे [Ca2+] i27 और वोल्टेज28 संकेतकों) के साथ उपन्यास आनुवंशिक मॉडल की प्रगति और पीढ़ी इस तैयारी की उपयोगिता का विस्तार कर सकती है।

खोजी संदर्भ के लिए, यह पृथक एंडोथेलियल मॉडल अनुसंधान प्रश्नों के लिए उपयोगी है जिनके लिए संवहनी गतिशीलता के विनियमन में धमनीविस्फोटक एंडोथेलियम की भूमिका का अध्ययन करने की आवश्यकता होती है, जिससे एन फेस माप उनके छोटे आकार के कारण प्रयोगात्मक रूप से संभव नहीं होते हैं। सेरेब्रल रक्त प्रवाह का एंडोथेलियल विनियमन विभिन्न जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (जैसे, प्यूरिनर्जिक, मस्कारिनिक) 18 और आयन चैनलों (टीआरपीवी 329, टीआरपीए 15, एनएमडीए रिसेप्टर्स8) के सक्रियण के साथ शुरू होता है। जीक्यू-प्रकार रिसेप्टर्स के सक्रियण में फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल 4,5-बिस्फॉस्फेट (पीआईपी2) लिपोलिसिस को इनोसिटोल ट्राइसफॉस्फेट (आईपी3) और डायसिलग्लिसरॉल उत्पन्न करने के लिए शामिल किया गया है [सीए2 +] मैं जुटाव के लिए जो तब वीएम15 में परिवर्तन के लिए के + चैनल सक्रियण की मध्यस्थता कर सकता है। K + चैनल गतिविधि, और इस प्रकार अकेले वीएम, भी शारीरिकपरिस्थितियों में सीधे अध्ययन किया जा सकता है 2 या चयनित औषधीय लक्ष्यीकरण30 के माध्यम से। इसके अलावा, आर्टेरिओलर एंडोथेलियल ट्यूब चयनित प्लाज्मा झिल्ली रीमॉडलिंग (जैसे, फिलिपिन-III), इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल (जैसे, ईआर ट्रैकर), और सेल-टू-सेल युग्मन (जैसे, प्रोपिडियम आयोडाइड) 18,19 के बढ़े हुए फ्लोरोसेंट विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है। इस प्रकार, अध्ययन मॉडल की एक और विशेषता सेलुलर आकृति विज्ञान और हिस्टोलॉजी की प्रभावी जोड़ी को कार्य के मापदंडों के साथ शामिल करती है, जैसे कि सीए2 + और इलेक्ट्रिकल सिग्नलिंग, उम्र बढ़ने और पुरानी बीमारियों के विकास में।

प्रोटोकॉल के घटक जो विशेष ध्यान देने योग्य हैं, वे धमनीविस्फार विच्छेदन, एंजाइमेटिक पाचन, ट्रिचरेशन और माप के लिए आर्टेरिओलर एंडोथेलियल ट्यूब की सुरक्षा हैं। मस्तिष्क से विच्छेदन के दौरान, पैरेन्काइमल आर्टेरियोल को नुकसान से हर कीमत पर बचा जाना चाहिए ताकि एक बरकरार और कार्यात्मक एंडोथेलियल परत को अलग करने के लिए सफल पाचन और ट्राइटुरेशन सुनिश्चित किया जा सके। इसके अलावा, परफ्यूजन कक्ष में एंडोथेलियल ट्यूब को सुरक्षित करते समय अत्यधिक खिंचाव भी तैयारी को नष्ट कर देगा, प्रभावी रूप से सभी पूर्व प्रोटोकॉल चरणों को अस्वीकार कर देगा।

व्यवहार्यता परीक्षणों को यह सुनिश्चित करने के लिए लागू किया जाना चाहिए कि धमनीविस्फोटीय एंडोथेलियल ट्यूब जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स की उत्तेजना के बाद सीए2 + सिग्नलिंग (प्रवाह और / या इंट्रासेल्युलर रिलीज) जैसे प्रमुख शारीरिक घटकों के संबंध में कार्यात्मक हैं, वीएम हाइपरपोलराइजेशन की सीमा, और गैपजंक्शनों के माध्यम से मजबूत अंतरकोशिकीय युग्मन 18,23। इस तरह के नियंत्रणों के उदाहरणों में एमटीए (1 μM) का उपयोग करके प्रतिवर्ती प्यूरिनर्जिक उत्तेजना शामिल है; Π [Ca2+]i ~ 300 nM; ≥10 mV हाइपरपोलराइजेशन; चित्रा 4B, C), प्रतिवर्ती SKCa/IKCa सक्रियण NS309 (1 μM; ≥20 mV hyperpolarization) का उपयोग करके, और / या वर्तमान इंजेक्शन (जैसे, ~-1 nA) के बीच एक सेल में पत्राचार और ≥250 μm18,31 की दूरी पर दूसरे के Vm प्रतिक्रियाएं (~-10 mV)। अभ्यास, देखभाल और प्रयोगात्मक कठोरता के साथ, पूरा प्रोटोकॉल पुन: प्रस्तुत करने योग्य है यदि शिक्षार्थी में धैर्य और दृढ़ता है।

इस विधि में संबोधित करने के लिए महत्वपूर्ण सीमाएं हैं, जैसे कि नमूनों की अपर्याप्त बहुतायत (जैसे, न्यूक्लिक एसिड, प्रोटीन और लिपिड) और जैव रासायनिक प्रयोगों और लाइव-सेल रिकॉर्डिंग के लिए सापेक्ष नाजुकता, क्रमशः। हालांकि, इस आणविक जीव विज्ञान चेतावनी को कई जानवरों से पूल करके और / या उच्च संवेदनशीलता और थ्रूपुट की मात्रा विधियों को तैयार करके टाला जा सकता है। यदि शारीरिक तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखना है, तो कम प्रयोगात्मक समय सीमा (≤1 ज) केवल केंद्रित औषधीय हस्तक्षेपों के साथ आवश्यक होगी। इसके अलावा, निकट-अवधि या नवजात शिशु (<1 महीने के) जानवरों से धमनीविस्फोटक एंडोथेलियल ट्यूबों को अलग करना बेहद चुनौतीपूर्ण होगा, संभावित रूप से सेरेब्रल संवहनी विकास के पूर्ववर्ती अध्ययन।

अन्य विचारों में सेरेब्रल वैस्कुलर एंडोथेलियल ट्यूबों की सटीक संरचना शामिल है, संभावित रूप से इम्यूनोफ्लोरेसेंस और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के चुनिंदा दृष्टिकोणों की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, तहखाने की झिल्ली (मुख्य रूप से कोलेजन IV, लैमिनिन और फाइब्रोनेक्टिन से बना) सेरेब्रल संवहनी पेड़ के साथ चलती है। यह मस्तिष्क केशिका एंडोथेलियल कोशिकाओं32 द्वारा गठित बीबीबी की अखंडता में अपने योगदान के लिए जाना जाता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह अध्ययन मॉडल बीबीबी पारगम्यता प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है क्योंकि तहखाने झिल्ली घटक धमनीविस्फोटीय एंडोथेलियल ट्यूबों के आंशिक पाचन के लिए उपयोग किए जाने वाले एंजाइम कॉकटेल के सब्सट्रेट हैं, विशेष रूप से, कोलेजेनेस एच मिश्रण। इसके अलावा, एक चयनात्मक एंजाइम कॉकटेल का अनुप्रयोग, आंतरिक लोचदार लामिना को हटाने, और प्रति संरचना एंडोथेलियल कोशिकाओं की स्पष्ट पहचान (चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के लिए समानांतर व्यवस्था बनाम परिधीय), आकृति विज्ञान (एंडोथेलियल कोशिकाओं बनाम स्पिंडल के आकार की चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं का "टियरड्रॉप" आकार), और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी (उदाहरण के लिए, जीपीसीआर उत्तेजना के लिए हाइपरपोलराइजेशन), चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और पेरिसाइट के शारीरिक योगदान को समाप्त करता है। अंत में, प्रयोगकर्ता को मस्तिष्क क्षेत्र (जैसे, कॉर्टेक्स 9,34, हिप्पोकैम्पस10) और संबंधित संवहनी विभाजन (जैसे, धमनियों, धमनियों, धमनियों और केशिकाओं 9,34,35) के अलावा प्रति अंग प्रकार (जैसे, मस्तिष्क, हृदय, फेफड़े 33) के अलावा एंडोथेलियल सेल विषमता (जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल, संरचना, कार्य) पर ध्यान देना चाहिए। ). इस प्रकार, सेरेब्रल रक्त प्रवाह विनियमन के एक व्यापक अध्ययन के लिए पूरक पूर्व विवो (उदाहरण के लिए, इंट्रावैस्कुलर प्रेशर मायोग्राफी, केशिका-पैरेन्काइमल आर्टेरियोल तैयारी) और विवो (जैसे, इंट्रासेरेब्रल लेजर डॉपलर) में बरकरार संवहनी खंडों और नेटवर्क के दृष्टिकोण की भी आवश्यकता होगी।

संक्षेप में, यह पेपर एक उन्नत तकनीक प्रस्तुत करता है जो यह दर्शाता है कि माउस मस्तिष्क पैरेन्काइमल धमनियों से अलग एक बरकरार एंडोथेलियल ट्यूब को ताजा कैसे तैयार किया जाए। हम उम्मीद करते हैं कि यह दृष्टिकोण विवो और बरकरार संवहनी अध्ययन मॉडल में पूरक और / या निर्माण करेगा। समग्र लक्ष्य शरीर विज्ञान के लिए मौलिक स्तर पर सेरेब्रल रक्त प्रवाह को रेखांकित करने वाले तंत्र को समझने के लिए नई जानकारी उत्पन्न करना है और चिकित्सा के लिए पैथोलॉजी की ओर संक्रमण का चयन करना है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (R00AG047198 और R56AG062169 से EJB को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है; R00HL140106 PWP के लिए) और अल्जाइमर एसोसिएशन (AZRGD-21-805835 PWP के लिए)। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान या अल्जाइमर एसोसिएशन के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifiers Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Audible baseline monitors Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA  BM-A-TM
Bath Chiller (Isotemp 500LCU) ThermoFisher Scientific 13874647
Borosilicate glass capillaries (Pinning) Warner Instruments G150T-6
Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) Warner Instruments GC100F-10
Borosilicate glass capillaries (Trituration) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA 1B100-4
BSA: Bovine Serum Albumin Sigma A7906
CaCl2: Calcium Chloride Sigma 223506
Collagenase (Type H Blend) Sigma C8051
Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) ThermoFisher Scientific 12-548-5M
Data Acquision Digitizer Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Digidata 1550A
Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA DD-90-S-BLK
Dithioerythritol Sigma D8255
DMSO: Dimethyl Sulfoxide Sigma D8418
Elastase (porcine pancreas) Sigma E7885
Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) ThermoFisher Scientific E34250
Fiber optic light sources  Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss Fostec 8375
Flow Control Valve Warner Instruments  FR-50
Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA IonOptix Systems
Forceps (Fine-tipped, sharpened) FST Dumont #5 & Dumont #55
Function Generator EZ Digital, Seoul, South Korea FG-8002
Fura-2 AM dye Invitrogen, Carlsbad, CA, USA F14185
Glucose Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) G7021
HCl: Hydrochloric Acid ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) A466250
Headstages Molecular Devices HS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) Sigma H4034
Inline Solution Heater Warner Instruments SH-27B
KCl: Potassium Chloride Sigma P9541
MgCl2: Magnesium Chloride Sigma M2670
Microforge Narishige, East Meadow, NY, USA  MF-900
Micromanipulator Siskiyou  MX10
Micropipette puller (digital) Sutter Instruments, Novato, CA, USA P-97 or P-1000
Microscope (Nikon-inverted) Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA Ts2
Microscope (Nikon-inverted) Nikon Instruments Inc Eclipse TS100
Microscope objectives Nikon Instruments Inc 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor)
Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) Warner Instruments PM6 or PH6
Microscope Stage (Aluminum) Siskiyou, Grants Pass, OR, USA 8090P
Microsyringe Pump Controller World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA SYS-MICRO4
MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt Tocris 1624
NaCl: Sodium Chloride Sigma S7653
NaOH: Sodium Hydroxide Sigma S8045
Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) ThermoFisher Scientific R37605
Oscilloscope Tektronix, Beaverton, Oregon, USA  TDS 2024B
Papain Sigma P4762
Phase contrast objectives Nikon Instruments Inc  (Ph1 DL; 10X & 20X)
Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) ThermoFisher Scientific C10046
Plexiglas superfusion chamber Warner Instruments, Camden, CT, USA RC-27
Scissors (3 mm & 7 mm blades) Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA Moria MC52 & 15000-00
Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) World Precision Instruments 555640S, 14364
Stereomicroscopes Zeiss, NY, USA Stemi 2000 & 2000-C
Syringe filter (0.22 µm) ThermoFisher Scientific 722-2520
Temperature Controller (Dual Channel) Warner Instruments TC-344B or C
Valve Control System Warner Instruments VC-6
Vibration Isolation Table Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA  Micro-g

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References

  1. Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
  2. Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
  3. Kelleher, R. J., Soiza, R. L. Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder. American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).
  4. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium. Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).
  5. Pires, P. W., Earley, S. Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke. elife. 7, 35316 (2018).
  6. Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease. Function. 2 (2), (2021).
  7. Zhao, L., et al. Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain. Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).
  8. Peters, E. C., et al. Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).
  9. De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
  10. Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease. Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).
  11. Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).
  12. Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).
  13. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).
  14. Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex. Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).
  15. Behringer, E. J., Hakim, M. A. Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).
  16. Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).
  17. Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
  18. Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).
  19. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice. Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).
  20. Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).
  21. Attems, J., Jellinger, K. A. The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology. BMC Medicine. 12, 206 (2014).
  22. Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).
  23. Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
  24. Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).
  25. Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
  26. Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
  27. Chen, Y. L., et al. Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice. Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).
  28. Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators. Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).
  29. Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).
  30. Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).
  31. Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).
  32. Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain. Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).
  33. Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. elife. 9, 51413 (2020).
  34. Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).
  35. Chen, M. B., et al. Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues. Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).

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जीव विज्ञान अंक 181 मस्तिष्क microcirculation एंडोथेलियल hyperpolarization Ca2 + सिग्नलिंग कश्मीर + चैनल सेलुलर इमेजिंग इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी
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Hakim, M. A., Pires, P. W., Behringer, E. J. Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma. J. Vis. Exp. (181), e63463, doi:10.3791/63463 (2022).

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