Summary
Intensiv forberedelse af intakte mus cerebrale endotelrør fra cerebrale parenkymale arterioler er illustreret til at studere cerebral blodgennemstrømningsregulering. Desuden demonstrerer vi de eksperimentelle styrker ved denne endotelundersøgelsesmodel til fluorescensbilleddannelse og elektrofysiologisk måling af vigtige cellulære signalveje, herunder ændringer i intracellulær [Ca2+] og membranpotentiale.
Abstract
Cerebral blodgennemstrømning formidles af vaskulære resistensarterier og nedstrøms parenkymale arterioler. Steady-state vaskulær resistens over for blodgennemstrømningen øges med faldende diameter fra arterier til arterioler, der i sidste ende føder ind i kapillærer. På grund af deres mindre størrelse og placering i parenchymen har arterioler været relativt underundersøgte og med mindre reproducerbarhed i fund end overfladepialarterier. Uanset hvad kræver arteriolær endotelcellestruktur og -funktion - integreret i fysiologien og ætiologien af kroniske degenerative sygdomme - omfattende undersøgelse. Især viser nye beviser, at kompromitteret endotelfunktion går forud for og forværrer kognitiv svækkelse og demens.
I parenkymal mikrocirkulation er endotel K + - kanalfunktion den mest robuste stimulus til fint at kontrollere spredningen af vasodilatation for at fremme stigninger i blodgennemstrømningen til områder med neuronal aktivitet. Dette papir illustrerer en raffineret metode til nyisolering af intakte og elektrisk koblede endotelrør (diameter, ~ 25 μm) fra musehjernens parenkymale arterioler. Arteriolære endotelrør sikres under fysiologiske forhold (37 ° C, pH 7,4) for at løse eksperimentelle variabler, der omfatter K + kanalfunktion og deres regulering, herunder intracellulær Ca2 + dynamik, ændringer i membranpotentiale og membranlipidregulering. En klar teknisk fordel i forhold til arterielt endotel er den forbedrede morfologiske opløsning af celle- og organelledimensioner (f.eks. Mitokondrier), hvilket udvider nytten af denne teknik. Sund cerebral perfusion gennem hele livet indebærer robust endotelfunktion i parenkymale arterioler, der direkte forbinder blodgennemstrømningen med brændstof til brændstof til neuronal og glial aktivitet gennem præcise anatomiske områder af hjernen. Det forventes således, at denne metode vil fremme den generelle viden om vaskulær fysiologi og neurovidenskab vedrørende den sunde og syge hjerne betydeligt.
Introduction
Parenkymale arterioler leverer direkte essentiel ilt og næringsstoffer i hele hjernen1. Mens de er i grænseflade med kapillærer, reagerer stærkt vasoaktive arterioler på retrograd signalering initieret af kapillærionkanaler, der registrerer metaboliske signaler fra specifikke neuronale regioner2. Da hjerneparenkym historisk har modtaget størstedelen af undersøgelsen, er der nu opstået en rolle for endoteldysfunktion til afklaring af patologiske mekanismer forbundet med forskellige cerebrovaskulære lidelser, der ligger til grund for demens (f.eks. Iskæmisk slagtilfælde, Alzheimers sygdom)3,4,5,6 . Endotelet er integreret i perfusion af hjernen i overensstemmelse med heterogeniteten af genetik, struktur og funktion i hele vaskulære segmenter7. Pialarterier er blevet grundigt undersøgt på grund af deres relativt store størrelse, høje segmentale vaskulære resistens og rolle i blodgennemstrømningsfordelingen til det underliggende cerebrum 8,9. Således vil en bedre forståelse af arteriolære endotelmekanismer sandsynligvis forbedre forståelsen af hjernens blodgennemstrømningsregulering i sundhed og sygdom mod udviklingen af nye terapeutiske regimer.
Nye beviser fremhæver vigtigheden af at studere parenkymale arterioler i forhold til forskellige signalveje og sygdomme 8,10. Denne fremgangsmåde har imidlertid været begrænset til anvendelse af intakte trykarteriole11 og/eller kapillær-parenkymal arteriole (CaPA) præparater12. Nyligt isolerede, indfødte cerebrale arteriolære endotelceller uden andre celletyper og forvirrende faktorer er ikke blevet undersøgt, sandsynligvis på grund af tekniske vanskeligheder i deres isolation. Dette papir fremmer en tidligere teknik, der fremhæver isoleringen af pial arterielt endotel13 til nu pålideligt og reproducerbart at isolere endotelet af hjernens parenkymale arterioler (bredde: ~ 25 μm, længde: ~ 250 μm). Denne teknik hjælper med at opnå optimal opløsning af elektrisk og kemisk koblede celler i deres individuelle orientering og cellulære netværk.
Nøgleveje af interesse har inkluderet interaktionen mellem intracellulær Ca2+ ([Ca2+]i) signalering og hyperpolarisering af membranpotentiale (Vm) 14,15 - integreret i vasodilatation16 - for at tillade blod at komme ind i kapillærerne og levere ilt og næringsstoffer til aktivt parenkym17. Disse præparater muliggør elektrofysiologiske optagelser i realtid af ionkanaler, herunder Ca2+-permenante, forbigående receptorpotentiale (TRP) og K+-kanaler og/eller fluorescerende billeddannelse af intracellulære organeller i endotelcellerør under næsten fysiologiske forhold. Dette er en passende teknik for forskere, der er interesseret i fysiologiske cellulære mekanismer, der styrer endotelcellekontrol af cerebral blodgennemstrømning til hjernens parenchyma. Alt i alt vil denne teknik hjælpe forskere med bedre at forstå grundlæggende endotelsignalveje og netværkskommunikation af arterioler indlejret i hjerneparenkym, samtidig med at de behandler spørgsmål relateret til cerebrovaskulær fysiologi og patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøgsdyr bør sikre, at udpeget anvendelse af dyr og tilhørende protokoller godkendes af deres Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og udføres i overensstemmelse med National Research Council's "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (8. udgave, 2011) og ARRIVE-retningslinjerne. IACUC fra Loma Linda University og University of Arizona har godkendt alle protokoller, der anvendes til dette manuskript til C57BL / 6N og 3xTg-AD mus (mænd og kvinder; aldersgruppe: 2-30 måneder). Se figur 1 som en oversigt over isolering og undersøgelse af arteriolære endotelrør, der er nyligt isoleret fra musens parenkymale arterioler i hjernen.
1. Materialer og udstyr
BEMÆRK: Se tabellen over materialer for alle reagenser og materialer, der kræves til denne protokol. Derudover kan manualer og hjemmesider, der er tilknyttet de respektive leverandører, også konsulteres efter behov. Illustrationer af dissektionsstationer og forsøgsapparater er tidligere blevet leveret13.
- Flowkammer
- Fastgør et superfusionskammer med et glasdæksellip på en platform sammensat af anodiseret aluminium. Fastgør platformen med kammeret på et aluminiumsmikroskoptrin.
- Indstil en mikromanipulator, der holder en fastgørelsespipette i hver ende af platformen på aluminiumsmikroskoptrinnet.
BEMÆRK: Brug om nødvendigt et overførbart trinapparat med en flowkammerenhed til at flytte et sikret, isoleret endotelrør fra et mikroskopapparat til et andet til eksperimentering.
- Mikroskoper
- Brug stereomikroskoper (5x til 50x forstørrelsesområde) og fiberoptiske lyskilder til dissektionsprocedurer.
- Til isolering af endotelrør skal du bruge en omvendt mikroskoprig udstyret med fasekontrast- eller differentiel interferenskontrast (DIC)-kompatible mål (10x, 20x og 40x) og et aluminiumstrin.
- Hav en mikrosyringepumperegulator klar ved siden af apparatet dedikeret til isolering af endotelrør fra delvist fordøjede blodkar.
- Opsæt forsøgsapparatet ved at arrangere et omvendt mikroskop (mål: 4x, 10x, 20x, 40x og 60x) og et manuelt aluminiumstrin på et vibrationsisoleringsbord.
- Intracellulært Vm kontrolapparat
- Tilslut elektrometeret til et kompatibelt hovedbillede. Brug tilbehør, såsom en funktionsgenerator og stimulator, til protokoller, der kræver strøminjektion.
- Tilslut forstærkerudgange til et datadigitalisatorsystem, oscilloskop og hørbare baseline-skærme. Fastgør referencebadelektroden (Ag/AgCl-pelleten) nær flowkammerets udgang.
- Saml et fotometrisk system med integrerede komponenter i en fluorescenssystemgrænseflade, højintensitetsbuelampe og strømforsyning, hyperswitch, fotomultiplikatorrør (eller PMT) og kamera for at måle [Ca2+]i i endotelceller.
- Saml en temperaturregulator udstyret med en indbygget varmelegeme for at hæve og opretholde en fysiologisk temperatur (37 °C) under hele eksperimentet.
- Saml en flerkanalsplatform, der er forbundet til en ventilregulator med en inline flowreguleringsventil for at kontrollere leveringen af løsninger til endotelrør, der er fastgjort i kammeret.
- Mikropipetter og skarpe elektroder
BEMÆRK: Eksperimentatoren skal bruge en elektronisk glastrækker og en mikrosmed til fremstilling af trituration og fastgørelse af pipetter.- For at adskille endotelrøret fra det delvist fordøjede arteriolære segment skal du forberede varmepolerede triturationspipetter (indvendig spidsdiameter: 30-50 μm) fra borosilikatglaskapillærer.
- For at sikre endotelrøret i superfusionskammeret skal du forberede varmepolerede fastgørelsespipetter med en stump, sfærisk ende (ydre diameter: 50-70 μm) fremstillet af tyndvæggede borosilikatglaskapillærer.
- For at optage Vm i en endotelcelle skal du forberede skarpe elektroder med en spidsmodstand på ~ 150 ± 30 MΩ fra glaskapillærer kun ved hjælp af glasaftrækkeren.
2. Løsninger og stoffer
- Fysiologisk saltopløsning (PSS)
- Der fremstilles mindst 1 liter PSS ved anvendelse af 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsyre (HEPES) og 10 mM glucose.
- Forbered nødvendige opløsninger, der mangler CaCl2 (nul Ca2+ PSS) til dissektion af cerebrale arterioler og isolering af endotelrøret.
BEMÆRK: Forbered alle opløsninger i ultrarent deioniseretH20efterfulgt af filtrering (0,22 μm). Sørg for, at slutproduktet indeholder en pH 7,4 med osmolalitet mellem 290 og 300 mOsm.
- Bovin serumalbumin (BSA, 10%)
- 1 g af det lyofiliserede BSA-pulver opløses i et bægerglas på 10 ml nul Ca2+ PSS. Bægerglasset dækkes, og lad det gå i opløsning mindst 2 timer under langsom omrøring.
- Opløsningen filtreres ved hjælp af en 10 ml sprøjte plus et filter på 0,22 μm, og der fremstilles 1 ml alikvoter, der skal opbevares ved -20 °C.
- Dissektion opløsning
- Tilsæt 500 μL BSA (10%) til 49,5 ml nul Ca2+ PSS for et samlet volumen på 50 ml.
- Overfør opløsningen til en petriskål til arteriolære dissektioner.
- Opløsning af dissociation
- Der tilsættes 5 μL CaCl2-opløsning (1 M) og 500 μL BSA (10 %) til 49,5 ml nul Ca2+ PSS for et samlet volumen på 50 ml. Inkuber opløsning ved stuetemperatur i mindst 1 time.
- Enzymer
- Der fremstilles 1 ml fordøjelsesopløsning med 100 μg/ml papain, 170 μg/ml dithioerythritol, 250 μg/ml kollagenase (type H-blanding) og 40 μg/ml elastase.
BEMÆRK: Enzymaktiviteter kan variere, selvom vellykkede protokoller sandsynligvis vil kræve følgende enzymatiske aktiviteter: ≥ 10 enheder / mg for papain, ≥ 1 enhed / mg for kollagenase og ≥ 5 enheder / mg for elastase.
- Der fremstilles 1 ml fordøjelsesopløsning med 100 μg/ml papain, 170 μg/ml dithioerythritol, 250 μg/ml kollagenase (type H-blanding) og 40 μg/ml elastase.
- Fura-2 og farmakologiske midler
- Forbered Fura-2 AM-lager i dimethylsulfoxid (DMSO; 1 mM). Der forberedes 500 μL arbejdskoncentration (10 μM) ved at tilsætte 5 μL af lageret til 495 μL PSS til lastning.
- Der forberedes mindst 50 ml arbejdskoncentrationer af farmakologiske agenser i PSS eller DMSO, alt efter hvad der er relevant.
- Gennemførelse af løsning
- 2 M KCl ved at opløse KCl i deioniseretH20(7,455 g KCl i 50 mlH20). Før opløsningen gennem en sprøjte med et 0,22 μm filter, inden de skarpe elektroder fyldes op igen.
- Fluorescerende organelle trackere og antistoffer
- Forbered plasmamembran eller organellar (f.eks. Kerne, endoplasmatisk retikulum) trackere i den passende fysiologiske saltopløsning i henhold til producentens anvisninger.
- Forbered primære og sekundære antistoffer i henhold til producentens anvisninger i den relevante fysiologiske saltopløsning.
3. Dissektion og isolering af mus cerebrale arterioler
BEMÆRK: Stereomikroskoper og skærpede mikrodissektionsværktøjer (f.eks. Fintippet tang, dissektionssaks i Vannas-stil) skal bruges til prøveforstørrelse (op til 50x) i alle disse dissektionsprocedurer.
- Isolering af musehjerne
- Bedøve en standard laboratoriemus (f.eks. C57BL / 6, 3xTg-AD; 2-30 måneder gammel, mand eller kvinde) ved hjælp af isofluranindånding (3% i 2-3 minutter) efterfulgt af øjeblikkelig halshugning ved hjælp af skarp saks eller guillotin pr. IACUC-godkendelse. Anbring musehovedet i en petriskål (diameter 10 cm, dybde 1,5 cm) indeholdende kold (4 °C) dissektionsopløsning.
- Mens du ser under et stereomikroskop, skal du fjerne hud og hår over kraniet og vaske overdreven blod væk med kold dissektionsopløsning. Brug spidserne af standard dissektionssaks (f.eks. 24 mm knive) til at lave et snit, der starter med den occipitale knogle og strækker sig op gennem næsebenet i kraniet. Brug grovspidsede tang til forsigtigt at åbne kraniet langs snittet og adskille bindevæv (meningeal membran) for at isolere hjernen, der indeholder en intakt cirkel af Willis.
- Vask den isolerede hjerne med kold dissektionsopløsning i et bægerglas eller en petriskål for at fjerne resterende blod fra hjernens overflade. Placer hjernens ventrale side vendt op i et kammer indeholdende kold dissektionsopløsning til isolering af parenkymale arterioler (figur 2A).
- Isolering af parenkymale arterioler
BEMÆRK: Arterioler, der stammer fra de midterste cerebrale arterier (MCA'er) og indlejret i hjerneparenkym, vælges til denne protokol. Arteriolerne isoleres som tidligere beskrevet11 med modifikation.- Brug stålstifter (diameter: 0,2 mm, længde: 11 til 12 mm) til at fastgøre den isolerede hjerne i kold dissektionsopløsning i en petriskål indeholdende en trækulinfunderet siliciumpolymerbelægning (dybde ≥ 50 cm).
- Brug en skarp og justeret dissektionssaks til at klippe et rektangel af hjernevæv (længde: 5 mm, bredde: 3 mm) (figur 2B) rundt om MCA'en, samtidig med at det sikres, at den øverste del af vævssegmentet er forbi forgreningspunktet fra Willis-cirklen. Skær et andet rektangel af hjernevæv fra den anden halvkugle af hjernen for at få adgang til flere arterioler, hvis det er nødvendigt.
- Fastgør det adskilte hjernevævssegment i fadet med MCA'en opad (distal fra Circle of Willis) ved hjælp af stålstifter (diameter: 0,1 mm, længde: 13 til 14 mm). Lav forsigtigt et lavt snit nær stifterne for at fjerne pia med små tang, forsigtigt skræl fra den ene ende mod den anden (figur 2C). Fjern pia fra det andet vævssegment for at få adgang til flere arterioler, hvis det er nødvendigt. Fastgør forsigtigt den isolerede pia med parenkymale arterioler forgrenet fra MCA i fadet med stifterne, og disseker de parenkymale arterioler (figur 2D), og sørg for, at arteriolerne ikke beskadiges.
BEMÆRK: Hvis arteriolerne ikke let trækkes ud med pia fra parenchymen, skal du bruge fine tang og grave ind i hjernen, startende ved MCA-grenpunktet fra Circle of Willis. Find arteriolen, løsn forsigtigt vævet omkring arterioler (figur 2E), og træk forsigtigt arteriolen ud af parenchymen og hold den øvre ende af arteriolen (figur 2F). Flere arterioler (længde: ~ 1,5-2 mm) kan isoleres fra et rektangel af hjernevæv. - Sørg for, at arteriolen er ren uden væv fastgjort til den, og afskær eventuelle resterende distale grene (figur 3A). Brug denne rene, intakte arteriole til enzymatisk fordøjelse. Alternativt skæres hver arteriole i to stykker (længde: 0,75-1 mm) til enzymatisk fordøjelse til fremstilling af endotelrør, hvis det ønskes.
4. Fordøjelse af parenkymale arterioler og fremstilling af endotelrør
- Arrangement af udstyr og pipetter
BEMÆRK: Isolering af arterielle endotelrør fra hjernen er tidligere beskrevet13,18. Den nuværende protokol indeholder ændringer til isolering af endotel fra parenkymale (intracerebrale) arterioler. Flere arterioler eller / og stykker af arterioler kan bruges sammen til enzymatisk fordøjelse.- Saml triturationsapparatet13 til fremstilling af endotelrør ved hjælp af et aluminiumstrin, der understøtter et kammer og mikromanipulatorer. Saml et mikroskop udstyret med mål (5x-60x) og et kamera tilsluttet en computerskærm. Fastgør en mikrosyringe med en pumperegulator ved siden af scenen og prøven.
- Fastgør en triturationspipette fyldt med mineralolie over mikrosyringstemplet. Brug mikroyringen med pumperegulatoren til at trække dissociationsopløsningen ud i triturationspipetten (~ 130 nL) oven på mineralolien, mens du sørger for at undgå luftbobler i pipetten.
- Delvis fordøjelse af arteriolære segmenter
- Intakte arteriolære segmenter anbringes i 1 ml dissociationsopløsning i et 10 ml glasrør indeholdende 100 μg/ml papain, 170 μg/ml dithioerythritol, 250 μg/ml kollagenase og 40 μg/ml elastase. Inkuber arteriolære segmenter ved 34 °C i 10-12 minutter.
- Efter fordøjelsen udskiftes enzymopløsningen med 3-4 ml frisk dissociationsopløsning ved stuetemperatur.
- Isolering af arteriolært endotelrør
BEMÆRK: Efter fordøjelsen og udskiftningen af enzymopløsningen overføres et eller flere delvist fordøjede segmenter til dissociationsopløsningen i et superfusionskammer, der er fastgjort til en mobil platform. Mens du ser ved 100x til 200x forstørrelse, skal du vælge et delvist fordøjet, men ubrudt fartøjssegment og fokusere på det under mikroskopet.- Anbring triturationspipetten, der er fastgjort med mikrosprøjteinjektoren, i dissociationsopløsningen i kammeret, og placer den tæt på den ene ende af det fordøjede beholdersegment. Indstil en hastighed inden for området 1-3 nL/s på pumpestyringen for skånsom triturering.
- Mens du opretholder 100x til 200x forstørrelse, skal du trække det arteriolære segment tilbage i pipetten og derefter skubbe ud for at dissociere adventitia og glatte muskelceller (figur 3B). Triturer karsegmentet, indtil alle glatte muskelceller er dissocieret, og kun endotelceller forbliver som et intakt "rør".
BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt under trituration, skal du forsigtigt bruge fintippet tang til at fjerne den dissocierede adventitia og den indre elastiske lamina fra endotelrøret. Typisk giver kun få cyklusser af trituration et intakt endotelrør. - Brug mikromanipulatorer til at fastgøre hver ende af endotelrøret på glasdækslerne i kammeret med borosilikatglaspindepipetter (figur 3C,D).
- Sikring af det arteriolære endotelrør
- Udskift dissociationsopløsningen med superfusionsopløsning (PSS indeholdende 2 mM CaCl2), samtidig med at det sikres, at ikke-endotelielt materiale vaskes ud af kammeret.
- Overfør sikret endotelrør i den mobile platform til mikroskopriggen designet til kontinuerlig superfusion og intracellulære eller fluorescerende optagelser / billeddannelse.
- Anvend kontinuerlig levering af PSS under eksperimentet. Indstil flowhastigheden manuelt (5-7 ml/min) under hele forsøget ved hjælp af den indbyggede flowreguleringsventil i overensstemmelse med det laminære flow, samtidig med at tilførslen af opløsningsflowet er i overensstemmelse med vakuumsugningen. Lad ≥5 minutters PSS-flow strømme til kammeret til superfusion af endotelrøret, før du henter baggrundsdata og/eller farvestofbelastning.
5. Anvendelse af arteriolære endotelrør til undersøgelse af cellulær fysiologi
BEMÆRK: Isolerede og sikrede arteriolære endotelrør kan anvendes til intracellulære optagelser af [Ca2+]i dynamik og Vm ved hjælp af henholdsvis fotometri og skarp elektrodeelektrofysiologi, som tidligere illustreret13 (figur 4). [Ca2+] i og Vm kan måles som separate eller kombinerede eksperimentelle variabler efter behov13 (figur 4). Arteriolære endotelrør er imidlertid mere sarte end arterielt endotel, og forsøgstiden bør ikke overstige 1 time.
- Måling af [Ca2+]i
- Tænd for udstyr og software til [Ca2+]i-optagelser , mens du opretholder kontinuerlig superfusion ved en strømningshastighed på 5-7 ml/min.
- Læg endotelrøret med Ca2+ farvestoffet Fura-2 AM i 30 minutter ved stuetemperatur. Vask cellerne med superfusionsopløsning i yderligere 20-30 minutter, mens badetemperaturen gradvist hæves til 37 °C. Hold temperaturen på 37 °C under hele forsøget.
- Juster billedvinduet manuelt ved hjælp af fotometrisoftware for at fokusere på ~ 20 endotelceller (figur 4A). I mangel af lys skal du tænde PMT på fluorescensgrænsefladen og begynde erhvervelsen af [Ca2+]i ved at spændende Fura-2 skiftevis (≥10 Hz) ved 340 nm og 380 nm, mens fluorescensemissionen opsamles ved 510 nm. Når en stabil baseline-registrering af [Ca2+]i er etableret, skal du anvende farmakologiske midler (f.eks. purinerge receptoragonister) pr. eksperimentelt mål (figur 4B).
- Måling af Vm
- Tænd for udstyr og software til Vm-optagelser , og indstil dataindsamlingshastigheden (≥10 Hz), mens du opretholder kontinuerlig superfusion med en strømningshastighed på 5-7 ml / min. Løft gradvist badetemperaturen til 37 °C og oprethold den indtil forsøgets afslutning.
- Træk en skarp elektrode ved hjælp af en borosilikatglaskapillær, udfyldning med 2 M KCl, og fastgør den over en sølvtråd belagt med chlorid i pipetteholderen, der er fastgjort til et elektrometer, der igen holdes af en mikromanipulator.
- Mens du ser gennem 4x-målet, skal du bruge en mikromanipulator til omhyggeligt at placere den skarpe elektrodespids lige over en celle i det arteriolære endotelrør ind i det flydende PSS i kammeret.
- Forøg gradvist forstørrelsen til 400x, og flyt elektrodespidsen efter behov.
- Brug mikromanipulatoren til forsigtigt at indsætte spidsen af en skarp elektrode i en af cellerne i endotelrøret og begynde at optage Vm ved hjælp af et elektrometer (figur 4A).
- Når endotelhvilet Vm er stabilt (-30 til -40 mV), påføres de ønskede farmakologiske midler pr. eksperimentelt mål (figur 4C).
6. Cellulær billeddannelse
BEMÆRK: Endotelrør, der er fastgjort i kammeret på den mobile platform, kan også bruges til mikroskopisk billeddannelse under både levende og faste forhold19 ved hjælp af standard fluorescens eller konfokal mikroskopi. Immunhistokemi med forskellige antistoffer for receptorer og ionkanaler kan også anvendes som tidligere beskrevet20.
- Læg endotelrøret med fluorescenstrackeren til plasmamembranen eller den ønskede organel (f.eks. kerne, endoplasmatisk retikulum) ved 37 °C i 15-30 minutter.
- Vask cellerne med frisk superfusion PSS og billede levende celler under mikroskopet ved excitationsbølgelængden af de respektive farvestoffer (figur 4D,E).
BEMÆRK: Immunohistokemi kan udføres på denne rørmodel ved hjælp af antistoffer af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En demonstration af protokollen er vist i figur 1 med arteriolær dissektion og endotelrørisoleringstrin som henholdsvis figur 2 og figur 3. Her blev endotelfunktionen vurderet ved at måle [Ca2+]i og Vm ved hjælp af Fura-2-fotometri og skarp elektrodeelektrofysiologi (figur 4A) som reaktion på et farmakologisk middel [2-methylthioadenosindiphosphat (MTA), en potent purinerg receptor (P2YR) agonist] ved 37 °C. Ved anvendelse af MTA (1 μM) øges [Ca2+]i hurtigt (figur 4B) med en samtidig hyperpolarisering (figur 4C). Disse målinger er en afspejling af aktiveringen af G q-proteinkoblede receptorer (P2YR'er) efterfulgt af aktivering af små- og mellemkonduktans Ca2+-aktiverede K+-kanaler (SKCa/IKCa), som initierer en endotelafhængig hyperpolariseringsvej (EDH) vasodilatorisk vej. Endotel isoleret fra en parenkymal arteriole er således funktionel isoleret og kan bruges til at studere nøglekomponenter i veje, der involverer mobilisering af [Ca2+]i og / eller regulering af Vm via K + -kanaler.
Desuden blev det intakte endotel inkuberet ved 37 ° C med fluorescerende trackere til visualisering for at undersøge cellulær morfologi. Levende endotelcellebilleddannelse viser co-farvning for plasmamembran (grøn) og kerner (rød) (figur 4D). I figur 4E blev plasmamembranen (grøn) farvet sammen med en endoplasmatisk retikulum (ER; rød) fluorescerende plet, hvorved områder med tilsyneladende overlapning af ER i nærheden af plasmamembranen fremstår orange (figur 4E). Disse fluorescerende billeder afslører yderligere den cellulære integritet af arteriolært endotel og deres mulige anvendelse til at studere signalmikrodomæner placeret ved forbindelsesmembrankomplekser.
Figur 1: Undersøgelse af arteriolært endotelrør, der er frisk isoleret fra musens parenkymale arteriole. Som afbildet er hjernen isoleret fra en mus, og et stykke rektangulært hjernevæv indeholdende MCA blev fjernet. Parenkymale arterioler, der forgrener sig fra MCA og kommer ind i hjernens parenchym, isoleres. Arterioler fordøjes enzymatisk og tritureres, hvilket producerer et intakt endotelrør til undersøgelse. Det forberedte endotelrør muliggør måling af intracellulær Ca2+ dynamik og Vm , samtidig med at det muliggør cellulær billeddannelse til fluorescensbilleddannelse og immunhistokemi. Forkortelser: MCA = midterste cerebrale arterie; Vm = membranpotentiale. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Dissektion og isolering af parenkymale arterioler. (A) Isoleret musehjerne med intakt cirkel af Willis. (B) Et dissekeret rektangulært stykke hjernevæv, der indeholder MCA (hvid pil). (C) Isolering af pia fra den øverste del af vævet (arteriole, blå pil). (D) Arterioler (skitseret med blå pilespidser) forbundet med midterste cerebrale arterier (gule pile). (E) Identificeret arteriole (blå pil) i hjernevævet. (F) Træk arteriolen (blå pil) ud af det løsnede væv. Bemærk, at panelerne E og F angiver en alternativ metode til isolering af arteriolen (se protokoltrin 3.2.3). Vægtstænger = 2 mm (A,B,C), 0,2 mm (D) og 1 mm (E,F). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Fremstilling af endotelrør fra parenkymale arterioler. (A) Isoleret og ren arteriole (blå pil). (B) Trituration af delvist enzymfordøjet arteriole. (C) Intakt endotelrør (forstørrelse: 100x), der er forberedt og fastgjort på glasdæksedlen ved hjælp af fastgørelsespipetter. (D) Endotelrør ved 200x forstørrelse. Vægtstænger = 0,2 mm (A), 0,1 mm (B, C) og 0,05 mm (D). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Anvendelse af endotelrør til fysiologisk undersøgelse af veje relateret til regulering af blodgennemstrømningen. (A) En skarp elektrode (lilla pil) er placeret i en celle i et endotelrør med fokus i dataindsamlingsvinduet til fotometri. (B) Repræsentativ registrering af intracellulær Ca2+ ved hjælp af Fura-2-fotometri som reaktion på MTA (1 μM). C) Repræsentativ registrering af Vm samtidig med intracellulær Ca2+ spor i panel B. (D) Repræsentativt billede af plasmamembran (grøn) og kerner (rød) af levende endotelceller farvet med fluorescerende farvestoffer. (E) Repræsentativt billede af plasmamembran (grøn) og endoplasmatisk retikulum (ER, rød) af levende endotelceller farvet med fluorescerende farvestoffer. Nærhedsområder for ER og plasmamembran er angivet med orange. Billeder blev erhvervet ved hjælp af et monokromt kamera og var pseudofarvede. Skalastænger = 20 μm (D), 10 μm (E). Forkortelser: MTA = 2-methylthioadenosindiphosphat; F340/F380 = Fura-2 farvestofforholdssignal; Vm = membranpotentiale; PM = plasmamembran; ER = endoplasmatisk retikulum. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voksende beviser tyder på, at cerebrovaskulær sygdom (CVD), aldring og Alzheimers sygdom er stærkt korrelerede og er et aktuelt emne for demensforskning 4,8,14,21. Det er således indlysende, at undersøgelser af det cerebrovaskulære netværk vil have en bred indvirkning på sundheden, samtidig med at de kræver fortsat omfattende undersøgelse under sygdomsforhold. Som et væsentligt punkt for vaskulær resistens for cerebral perfusion er den generelle betydning af parenkymale arterioler i ætiologien og udviklingen af CVD blevet fremhævet i over 50 år22.
Imidlertid er videnskabelige undersøgelsesværktøjer ikke blevet tilstrækkeligt udviklet til at studere intakte parenkymale arterioler og deres sammensatte celletyper, før den nylige begyndelse af ex vivo-tilgange såsom de isolerede, tryksatte parenkymale arteriole11 og CaPA12 præparater. Det cerebrovaskulære fysiologifelt ville også drage fordel af komplementære teknikker i homocellulære undersøgelsesmodeller (glat muskel, pericytter og endotel) for at fokusere på specifikke celletyper og deres genetiske og farmakologiske egenskaber, der ligger til grund for cerebral blodgennemstrømningsregulering og blod-hjernebarriere (BBB) permeabilitet.
Endotelet er et centralt regulerende organ, der "fodrer" alle andre organer i hele kroppen, herunder hjernen23. Selvom alle vaskulære segmenter (arterier, arterioler, kapillærer, venuler, vener) er afgørende for cerebral perfusion, kræver endotelet af arterioler dedikeret undersøgelse som en central komponent til cerebrovaskulær autoregulering og neurovaskulær kobling24. Endvidere synes Ca2+ signalering25 og K + kanalaktivitet17,26 at være forbedret under reguleringen af myogen tone i parenkymale arterioler i forhold til pialarterier. Således har vi nu udvidet den tidligere etablerede metode til pial cerebral arterier (posterior)13 til parenkymale arterioler.
I forhold til disse tidligere illustrerede tilgange 11,13 blev denne protokol raffineret ved empirisk at justere forskellige trin (f.eks. Enzymatisk behandling, trituration) for reproducerbart at give intakte endotelrør fra parenkymale arterioler. Derudover demonstrerer denne protokol brugen af denne undersøgelsesmodel til at optimere anvendelsen af cellulær fotometri, elektrofysiologi og fluorescerende billeddannelse (figur 4). Med generelle styrker og begrænsninger af Fura-2 fotometri og skarp elektrode elektrofysiologi, der tidligere er beskrevet detaljeret13, opfordres eksperimentatoren til at prøve en række andre Ca2+ signal- og ionkanalassays for at teste specifikke hypoteser af interesse. Endvidere kan fremskridt og generering af nye genetiske modeller med endotelcellespecifikke genetisk kodede indikatorer (f.eks. [Ca2+]i27 og spænding28 indikatorer) øge nytten af dette præparat.
Til undersøgelseskontekst er denne isolerede endotelmodel nyttig til forskningsspørgsmål, der kræver undersøgelse af det arteriolære endotels rolle i reguleringen af vaskulær dynamik, hvorved en ansigtsmålinger ikke er eksperimentelt gennemførlige på grund af deres lille størrelse. Endotelregulering af cerebral blodgennemstrømning begynder med aktiveringen af forskellige G-proteinkoblede receptorer (f.eks. Purinergisk, muscarinisk)18 og ionkanaler (TRPV329, TRPA15, NMDA-receptorer8). Aktivering af Gq-type receptorer indebærer phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP2) lipolyse til at generere inositoltrisphosphat (IP3) og diacylglycerol til [Ca2+]i mobilisering, som derefter kan formidle K + kanalaktivering for ændringer i Vm15. K+ kanalaktivitet, og dermed Vm alene, kan også undersøges direkte under fysiologiske forhold2 eller via udvalgt farmakologisk målretning30. Desuden muliggør det arteriolære endotelrør forbedret fluorescerende visualisering af udvalgte plasmamembranombygninger (f.eks. Filipin-III), intracellulære organeller (f.eks. ER-tracker) og celle-til-celle-kobling (f.eks. Propidiumiodid)18,19. Et andet træk ved undersøgelsesmodellen indebærer således effektiv parring af cellulær morfologi og histologi med funktionsparametre, såsom Ca2+ og elektrisk signalering, i aldring og udvikling af kroniske sygdomme.
Komponenterne i protokollen, der fortjener særlig opmærksomhed, er arteriolær dissektion, enzymatisk fordøjelse, trituration og sikring af det arteriolære endotelrør til målinger. Under dissektion fra hjernen bør skader på parenkymal arteriole undgås for enhver pris for at sikre en vellykket fordøjelse og trituration til isolering af et intakt og funktionelt endotellag. Endvidere vil overdreven strækning under sikring af endotelrøret i perfusionskammeret også ødelægge præparatet og effektivt negere alle tidligere protokoltrin.
Levedygtighedstest bør anvendes for at sikre, at arteriolære endotelrør er funktionelle med hensyn til vigtige fysiologiske komponenter såsom Ca2+ signalering (tilstrømning og / eller intracellulær frigivelse) efter stimulering af G-proteinkoblede receptorer, omfanget af Vm hyperpolarisering og robust intercellulær kobling gennem mellemrumskryds18,23. Eksempler på sådanne kontroller omfatter reversibel purinergisk stimulering ved anvendelse af MTA (1 μM; Δ[Ca2+]i ~ 300 nM; ≥10 mV hyperpolarisering; Figur 4B,C), reversibel SKCa/IKCa-aktivering ved hjælp af NS309 (1 μM; ≥20 mV hyperpolarisering) og/eller korrespondance mellem strøminjektion (f.eks. ~-1 nA) i en celle og Vm-respons (~-10 mV) i en anden i en afstand af ≥250 μm18,31. Med praksis, omhu og eksperimentel stringens er hele protokollen reproducerbar, hvis eleven har tålmodighed og udholdenhed.
Denne metode har vigtige begrænsninger at tage fat på, såsom den utilstrækkelige overflod af prøver (f.eks. Nukleinsyrer, proteiner og lipider) og relativ skrøbelighed til henholdsvis biokemiske eksperimenter og levende celleoptagelser. Denne molekylærbiologiske advarsel kan dog undgås ved at samle fra flere dyr og / eller udtænke kvantationsmetoder med højere følsomhed og gennemstrømning. Hvis den fysiologiske temperatur skal holdes på 37 °C, kræves der kun korte eksperimentelle tidsrammer (≤1 time) med fokuserede farmakologiske indgreb. Derudover ville det være yderst udfordrende at isolere arteriolære endotelrør fra kortvarige eller nyfødte (<1 måned gamle) dyr, hvilket potentielt forhindrer undersøgelser af cerebral vaskulær udvikling.
Andre overvejelser omfatter den præcise sammensætning af cerebrale vaskulære endotelrør, der potentielt kræver udvalgte tilgange til immunofluorescens og elektrofysiologi. For eksempel løber kældermembranen (der primært består af kollagen IV, laminin og fibronectin) langs det cerebrale vaskulære træ. Det er kendt for sit bidrag til integriteten af BBB dannet af hjernekapillære endotelceller32. Det skal bemærkes, at denne undersøgelsesmodel muligvis ikke er egnet til BBB-permeabilitetsforsøg, da kældermembrankomponenter er substrater af enzymcocktailen, der anvendes til delvis fordøjelse af arteriolære endotelrør, især collagenase H-blandingen. Endvidere eliminerer anvendelse af en selektiv enzymcocktail, fjernelse af den indre elastiske lamina og klar identifikation af endotelceller pr. Struktur (parallelt arrangement vs. omkreds for glatte muskelceller), morfologi ("dråbe" -form af endotelceller vs. spindelformede glatte muskelceller) og elektrofysiologi (f.eks. Hyperpolarisering til GPCR-stimulering) fysiologiske bidrag fra glatte muskelceller og pericytter. Endelig skal eksperimentatoren notere sig endotelcelleheterogenitet (genekspressionsprofil, struktur, funktion) pr. organtype (f.eks. Hjerne, hjerte, lunge33) ud over hjerneområdet (f.eks. Cortex 9,34, hippocampus10) og respektive vaskulær segmentering (f.eks. Arterier, arterioler og kapillærer 9,34,35 ). Således vil en omfattende undersøgelse af cerebral blodgennemstrømningsregulering også kræve komplementære ex vivo (f.eks. Intravaskulær tryk myografi, kapillær-parenkymal arteriole forberedelse) og in vivo (f.eks. Intracerebral Laser Doppler) tilgange af intakte vaskulære segmenter og netværk.
Sammenfattende præsenterer dette papir en avanceret teknik, der viser, hvordan man forbereder et intakt endotelrør, der er frisk isoleret fra musehjernens parenkymale arterioler. Vi forventer, at denne tilgang vil supplere og/eller bygge på in vivo og intakte vaskulære undersøgelsesmodeller. Det overordnede mål er at generere ny information til forståelse af mekanismer, der understøtter cerebral blodgennemstrømning på det grundlæggende niveau for fysiologi og vælge overgange til patologi til terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskning er blevet støttet af bevillinger fra National Institutes of Health (R00AG047198 & R56AG062169 til EJB; R00HL140106 til PWP) og Alzheimers Association (AZRGD-21-805835 til PWP). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health eller Alzheimers Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
| Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
| Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
| Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
| Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
| NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
| Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |
References
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Kelleher, R. J., Soiza, R. L. Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder. American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium. Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).
- Pires, P. W., Earley, S. Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke. elife. 7, 35316 (2018).
- Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease. Function. 2 (2), (2021).
- Zhao, L., et al. Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain. Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).
- Peters, E. C., et al. Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease. Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).
- Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).
- Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex. Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).
- Behringer, E. J., Hakim, M. A. Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).
- Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice. Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).
- Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).
- Attems, J., Jellinger, K. A. The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology. BMC Medicine. 12, 206 (2014).
- Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).
- Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Chen, Y. L., et al. Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice. Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).
- Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators. Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).
- Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).
- Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain. Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. elife. 9, 51413 (2020).
- Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).
- Chen, M. B., et al. Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues. Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).
