Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

नाइट्रोरिडक्टेस / मेट्रोनिडाज़ोल-मध्यस्थता एब्लेशन और ज़ेब्राफ़िश रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम के पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए एक MATLAB प्लेटफ़ॉर्म (RpEGEN)

Published: March 2, 2022 doi: 10.3791/63658
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Ophthalmology, Louis J. Fox Center for Vision Restoration, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Earth Research Institute, University of California, Santa Barbara, 3Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल एक ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफ़िश मॉडल का उपयोग करके रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) को आनुवंशिक रूप से कम करने की पद्धति का वर्णन करता है। औषधीय यौगिकों का उपयोग करके सिग्नलिंग पाथवे मॉडुलन को शामिल करने के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित करना व्यापक रूप से विस्तृत है। रंजकता के आधार पर आरपीई पुनर्जनन को परिमाणित करने के लिए एक MATLAB मंच विकसित किया गया था और प्रस्तुत और चर्चा की गई है।

Abstract

रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) आंख के पीछे रहता है और आसन्न रेटिना और संवहनी ऊतकों के स्वास्थ्य और अखंडता को बनाए रखने के लिए आवश्यक कार्य करता है। वर्तमान में, स्तनधारी आरपीई की सीमित पुनरावृत्ति क्षमता, जो छोटी चोटों तक सीमित है, ने विवो आरपीई पुनर्योजी प्रक्रियाओं में समझने के लिए प्रगति को बाधित किया है। यहां, जेब्राफ़िश का उपयोग करके विवो आरपीई मरम्मत के अध्ययन को सुविधाजनक बनाने के लिए एक विस्तृत पद्धति प्रदान की जाती है, जो मजबूत ऊतक पुनर्जनन में सक्षम एक कशेरुक मॉडल है। यह प्रोटोकॉल एक ट्रांसजेनिक नाइट्रोरिडक्टेस / मेट्रोनिडाज़ोल (एनटीआर / एमटीजेड) - मध्यस्थता चोट प्रतिमान (rpe65a: nfsB-eGFP) का वर्णन करता है, जिसके परिणामस्वरूप एमटीजेड के साथ 24 घंटे के उपचार के बाद आरपीई के केंद्रीय दो-तिहाई का एब्लेशन होता है, बाद में ऊतक वसूली के साथ। लार्वा ज़ेबराफ़िश में आरपीई एब्लेशन पर ध्यान केंद्रित किया जाता है और आरपीई पुनर्जनन पर औषधीय यौगिकों के प्रभावों का परीक्षण करने के तरीकों को भी रेखांकित किया जाता है। RpEGEN की पीढ़ी और सत्यापन, एक MATLAB स्क्रिप्ट रंजकता के आधार पर आरपीई पुनर्जनन के परिमाणीकरण को स्वचालित करने के लिए बनाया गया है, पर भी चर्चा की जाती है। सक्रिय आरपीई मरम्मत तंत्र से परे, इस प्रोटोकॉल को आरपीई अध: पतन और चोट प्रतिक्रियाओं के अध्ययन के साथ-साथ अन्य सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं के बीच आसन्न रेटिना और संवहनी ऊतकों पर आरपीई क्षति के प्रभावों के अध्ययन के लिए विस्तारित किया जा सकता है। यह ज़ेब्राफ़िश सिस्टम जीन, नेटवर्क और प्रक्रियाओं की पहचान करने में महत्वपूर्ण वादा करता है जो आरपीई पुनर्जनन और आरपीई रोग से संबंधित तंत्र को चलाते हैं, स्तनधारी प्रणालियों के लिए इस ज्ञान को लागू करने के दीर्घकालिक लक्ष्य के साथ और अंततः, चिकित्सीय विकास की ओर।

Introduction

यहां वर्णित पद्धति लार्वा ज़ेबराफ़िश का उपयोग करके रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) को आनुवंशिक रूप से समाप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल का विवरण देती है। आरपीई आंख के पीछे तक फैला हुआ है और तंत्रिका रेटिना की स्तरीकृत परतों और कोरॉइड का गठन करने वाले वास्कुलचर की परत के बीच रहता है। ट्रॉफिक समर्थन, फोटोटॉक्सिक प्रकाश का अवशोषण, और दृश्य चक्र प्रोटीन का रखरखाव केवल कुछ महत्वपूर्ण कार्य हैं जो आरपीई प्रदर्शन करता है जो इनआसन्न ऊतकों के स्वास्थ्य और अखंडता को बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं। स्तनधारी आरपीई को नुकसान तब पुन: क्षतिदायक होता है जब घाव छोटे होते हैं2; हालांकि, बड़ी चोटों या प्रगतिशील अपक्षयी बीमारी से होने वाली क्षति अपरिवर्तनीय है। मनुष्यों में, आरपीई अपक्षयी रोग (उदाहरण के लिए, उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी) और स्टारगार्ड रोग) स्थायी दृष्टि हानि का कारण बनते हैं और, उपलब्ध कुछ उपचार विकल्पों के साथ, जीवन की रोगी की गुणवत्ता में कमी आई है। स्तनधारी आरपीई के लिए आत्म-मरम्मत की सीमित क्षमता ने आरपीई पुनर्योजी प्रक्रियाओं के क्षेत्र में एक ज्ञान अंतर पैदा किया है। कई अलग-अलग ऊतक प्रकारों में ज़ेब्राफ़िश की मजबूत पुनर्योजी क्षमता को देखते हुए, इस प्रोटोकॉल को आंतरिक रूप से पुन: उत्पन्न करने वाले आरपीई पर अध्ययन की सुविधा के लिए एक इन विवो कशेरुक प्रणाली स्थापित करने और उस प्रतिक्रिया को चलाने वाले तंत्र को उजागर करने के लिए विकसित किया गया था। यहां उल्लिखित एब्लेशन प्रतिमान का उपयोग करते हुए, विहित WNT सिग्नलिंग मार्ग3, एमटीओआर मार्ग4, और प्रतिरक्षा से संबंधित प्रतिक्रियाओं5 को आरपीई पुनर्जनन के महत्वपूर्ण मध्यस्थों के रूप में पहचाना गया है, संभवतः अतिव्यापी कार्यों के साथ।

इस आनुवांशिक एब्लेशन प्रतिमान में, Tg (rpe65a: nfsB-eGFP)3 zebrafish बैक्टीरियल-व्युत्पन्न नाइट्रोरिडक्टेस (NTR / nfsB) जीन6 को व्यक्त करता है जो आरपीई बढ़ाने वाले तत्व के नियंत्रण में ईजीएफपी से जुड़ा हुआ है, rpe65a7। एब्लेशन प्रोड्रग, मेट्रोनिडाज़ोल (एमटीजेड) को सिस्टम वाटर हाउसिंग ज़ेब्राफ़िश में जोड़कर प्राप्त किया जाता है। नाइट्रोरिडक्टेस द्वारा एमटीजेड के इंट्रासेल्युलर सक्रियण के परिणामस्वरूप एनटीआर / एनएफएसबी-व्यक्त कोशिकाओं में डीएनए क्रॉसलिंकिंग और एपोप्टोसिसहोता है। इस तकनीक का व्यापक रूप से ज़ेब्राफ़िश में उपयोग किया गया है ताकि रेटिना10,11,12,13 और अन्य ऊतकों की कोशिकाओं को कम कियाजा सके। साथ में, ये तत्व एक इनड्यूसिबल सेल एब्लेशन पद्धति (NTR / MTZ) 8,9 और विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक फ्लोरोसेंट मार्कर (eGFP) की लक्षित अभिव्यक्ति (rpe65a) को सक्षम करते हैं।

वीवो मॉडल में अन्य दिलचस्प भी मौजूद हैं जिनका उपयोग आरपीई14 की पुनर्योजी क्षमता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। ये व्यापक हैं और उभयचरों में आरपीई-टू-रेटिना ट्रांसडिफरेंशिएशन पोस्ट-रेटिनेक्टोमी शामिल हैं, जिसमें रेटिना रीग्रोथ से खोई आरपीई कोशिकाओं को15,16 को बदल दिया जाता है; "सुपर हीलिंग" MRL / MpJ माउस17 में आरपीई बहाली पोस्ट-चोट; और सहज आरपीई और रेटिना अध: पतन18 के एक चूहे मॉडल में आरपीई प्रसार के बहिर्जात उत्तेजना, दूसरों के बीच में। इन विट्रो मॉडल, जैसे कि वयस्क मानव आरपीई स्टेम सेल (RPESCs) 19 भी विकसित किए गए हैं। ये मॉडल आरपीई पुनर्जनन से संबंधित सेलुलर प्रक्रियाओं को उजागर करने के लिए काम करने वाले सभी मूल्यवान उपकरण हैं (उदाहरण के लिए, प्रसार, भेदभाव, आदि); हालांकि, ज़ेब्राफ़िश आंतरिक आरपीई मरम्मत पोस्ट-एब्लेशन के लिए अपनी क्षमता में अद्वितीय है।

जबकि यहां पद्धति को आरपीई पुनर्जनन चलाने वाले तंत्र को समझने पर ध्यान केंद्रित करने के लिए लिखा गया है, टीजी (आरपीई 65 ए: एनएफएसबी-ईजीएफपी) लाइन और इस आनुवंशिक एब्लेशन प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं जैसे आरपीई एपोप्टोसिस, आरपीई अध: पतन और आसन्न रेटिना और संवहनी ऊतकों पर आरपीई चोट के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। एब्लेशन प्रोटोकॉल को औषधीय हेरफेर को शामिल करने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है, जो ब्याज के सिग्नलिंग मार्गों को स्क्रीन करने के लिए एक सुविधाजनक प्रारंभिक रणनीति है। उदाहरण के लिए, WNT Response-1 (IWR-1)20 के अवरोधक का उपयोग करके विहित WNT मार्ग को अवरुद्ध करना, RPE पुनर्जनन3 को खराब करने के लिए दिखाया गया है। यह एक औषधीय हेरफेर प्रयोग के माध्यम से उपयोगकर्ताओं का मार्गदर्शन करने के लिए यहां दोहराया गया था और रंजकता की वसूली के आधार पर आरपीई उत्थान को मापने के लिए बनाई गई MATLAB स्क्रिप्ट (RpEGEN) को मान्य करने के लिए सबूत-की-अवधारणा के रूप में कार्य करता है। ट्रांसजेनिक लाइन और एब्लेशन प्रोटोकॉल की तरह, RpEGEN स्क्रिप्ट अनुकूलनीय हैं और आरपीई के भीतर अन्य मार्करों / सेलुलर प्रक्रियाओं को मापने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

यहां उल्लिखित सभी तरीके पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) के अनुरूप हैं।

1. ज़ेबराफ़िश भ्रूण संग्रह से पहले तैयारी

  1. 28.5 डिग्री सेल्सियस के लिए भ्रूण इनक्यूबेटर सेट करें।
  2. मेलानोजेनेसिस अवरोधक, एन-फेनिलथियोरिया (पीटीयू) 21,22 का एक 25x स्टॉक समाधान तैयार करें। इस स्टॉक समाधान को एक सामान्य नुस्खा22 से स्केल किया जाता है और 1x प्रति मात्रा 0.003% वजन (% w / v) के बराबर होता है (उदाहरण के लिए, 0.003 ग्राम पीटीयू पाउडर को 100 मिलीलीटर तरल विलायक में)।
    1. एक बड़ा 25x PTU स्टॉक समाधान बनाने के लिए, शुद्ध विआयनीकृत पानी के 1 L में 0.75 ग्राम PTU पाउडर जोड़ें (इसके बाद dH2O के रूप में संदर्भित) और कमरे के तापमान (~ 25 °C) पर एक हलचल बार और हलचल प्लेट का उपयोग करके अच्छी तरह से मिलाएं। प्रकाश से संरक्षित 3 महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: जलीय घोल में जाने के लिए पीटीयू प्राप्त करना मुश्किल है और रात भर विस्तारित सरगर्मी आवश्यक हो सकती है।
      सावधानी: पीटीयू खतरनाक है, और त्वचा या आंखों के साथ अंतर्ग्रहण, साँस लेना और / या संपर्क को रोकने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। पीटीयू पाउडर और यहां वर्णित सभी पीटीयू तरल डेरिवेटिव को राज्य और संस्थागत नियमों के आधार पर रासायनिक अपशिष्ट के रूप में निपटाने की आवश्यकता हो सकती है। उचित पीटीयू अपशिष्ट निपटान विधियों की पुष्टि, यदि कोई हो, तो उपयोग करने से पहले अनुशंसित है।
    2. एक 1.5x PTU काम समाधान बनाने के लिए (इसके बाद 1.5x PTU के रूप में संदर्भित), 940 मिलीलीटर ज़ेब्राफ़िश आवास सुविधा पानी (इसके बाद सिस्टम पानी के रूप में जाना जाता है) के लिए 25x PTU स्टॉक समाधान के 60 mL जोड़ें। ज़ेब्राफ़िश के लिए इष्टतम जल गुणवत्ता मापदंडों का वर्णन किया गया है23 और एक्वाटिक्स सुविधाओं में मानक जल निगरानी प्रक्रियाएं होनी चाहिए। प्रकाश से संरक्षित 1-2 सप्ताह के लिए 28.5 डिग्री सेल्सियस पर 1.5x पीटीयू स्टोर करें।
      नोट:: यह प्रोटोकॉल नियमित रूप से PTU सांद्रता, सॉल्वैंट्स, और चरण 1.2 में वर्णित संग्रहण पैरामीटर का उपयोग कर किया जाता है। एक एहतियात के रूप में, भ्रूण / लार्वा को पीटीयू में हर 1-2 दिनों में मनाया जाना चाहिए ताकि प्रभावकारिता को मान्य किया जा सके और निरंतर डिपिग्मेंटेशन की पुष्टि की जा सके। विघटन और / या भंडारण की स्थिति को अनुकूलित किया जाना चाहिए यदि पीटीयू घुलनशीलता / प्रभावकारिता में कमी का संदेह है।
  3. 0.05% w / v मेथिलीन ब्लू, एक कवक विकास अवरोधक का एक स्टॉक समाधान तैयार करें, जिसमें 100 मिलीलीटर dH2O के लिए 0.05 ग्राम मेथिलीन ब्लू पाउडर जोड़कर एक हलचल बार और हलचल प्लेट का उपयोग करके अच्छी तरह से मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. भ्रूण / लार्वा हेरफेर के लिए पिपेट्स तैयार करें (उदाहरण के लिए, पेट्री व्यंजनों के बीच भ्रूण / लार्वा को स्थानांतरित करना, प्रतिदीप्ति स्क्रीनिंग के दौरान लार्वा को अलग करना, निर्धारण के लिए माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में यूथेनाइज्ड लार्वा एकत्र करना, आदि) एक हीरे की नोक स्क्राइबिंग पेन का उपयोग करके कांच पाश्चर पिपेट के पतले छोर को वापस काटकर। हीरे की कलम के साथ पिपेट की परिधि के चारों ओर एच और धीरे से खींच या एक साफ ब्रेक बनाने के लिए अंत बंद स्नैप.
    नोट: पिपेट का मुंह चिकनी और चौड़ा होना चाहिए ताकि आसानी से कर्तन के बिना चोरियन के अंदर अभी भी भ्रूण लिया जा सके। एक विकल्प के रूप में एक बल्ब ड्रा स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें। तैयार पिपेट्स का उपयोग भ्रूण / लार्वा हानि को कम करने के लिए पानी के परिवर्तन (डालने के बजाय) के दौरान तरल को हटाने के लिए भी किया जा सकता है।
  5. 1x फॉस्फेट बफ़र्ड खारा (PBS) में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (PFA) समाधान तैयार करें (उदाहरण के लिए, 10x PBS के 4 mL औरdH 2O के 26 mL में 16% PFA के 10 mL जोड़ें)। प्रकाश से संरक्षित 4 सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    सावधानी: पैराफॉर्मेल्डिहाइड एक खतरनाक रसायन है और इसे रासायनिक धुएं के हुड में संभाला जाना चाहिए और ठीक से निपटाया जाना चाहिए। देखभाल की जानी चाहिए, और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहने जाने चाहिए, ताकि अंतर्ग्रहण, साँस लेना और / या त्वचा या आंखों के संपर्क को रोका जा सके।

2. ज़ेबराफ़िश भ्रूण संग्रह और रखरखाव आनुवंशिक एब्लेशन से पहले (0-5 दिन निषेचन के बाद)

  1. वयस्क ज़ेबराफ़िश बनाए रखें जैसा कि पहले 3,4,5 वर्णित है। भ्रूण संग्रह से पहले दोपहर / शाम, स्पॉनिंग के लिए प्रजनन टैंक में वयस्क ज़ेब्राफ़िश को अलग करें।
  2. अगली सुबह (0 दिन बाद निषेचन (डीपीएफ)), सिस्टम के पानी में 10 सेमी व्यास पेट्री व्यंजनों में भ्रूण एकत्र करें और सभी गैर-व्यवहार्य या अनफर्टिलाइज्ड अंडे को हटा दें, जो अपारदर्शी दिखाई देंगे और / या अनियमित साइटोप्लाज्म और असफल दरार24 दिखाएंगे।
    नोट: सामान्य दरार और विकासात्मक स्टेजिंग घटनाएं स्वस्थ भ्रूण में स्पष्ट होंगी जैसा कि25 वर्णित है। पेट्री व्यंजन ों को प्रोटोकॉल के दौरान तीन-चौथाई पूर्ण (~ 10 सेमी व्यास वाले पकवान के लिए ~ 30 मिलीलीटर) रखा जाना चाहिए।
    1. प्रत्येक पेट्री डिश में 0.05% डब्ल्यू / वी मेथिलीन नीले रंग की दो बूँदें जोड़ें, धीरे से मिलाएं, और प्रोटोकॉल के शेष के लिए भ्रूण को 28.5 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. लगभग 6 एच पोस्ट-निषेचन (एचपीएफ) 4,5,26, भ्रूण पेट्री व्यंजनों में सिस्टम के पानी को 1.5x पीटीयू (चरण 1.2.2 में बनाए गए काम करने वाले समाधान) के साथ बदलें और मेथिलीन नीले रंग को फिर से भरें।
    नोट: पीटीयू को रंजकता की शुरुआत से पहले भ्रूण में जोड़ा जाना चाहिए (यानी, 24 एचपीएफ से पहले)25 के रूप में पहले से ही पिगमेंटेड ऊतक पीटीयू21 के अतिरिक्त पर डिपिगमेंट नहीं करेंगे। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि आंखों के आकार, ओकुलर और क्रैनियोफेशियल घाटे को कम करना, और कुछ सिग्नलिंग मार्गों (जैसे, थायरॉयड सिग्नलिंग) के विघटन को पीटीयू-उपचारित ज़ेबराफ़िश 27,28,29 में सूचित किया गया है। पीटीयू की विकासात्मक विषाक्तता पीटीयू के अतिरिक्त27,29 की एकाग्रता और समय पर निर्भर प्रतीत होती है। जैसा कि पीटीयू प्रभावकारिता (चरण 1.2) को मान्य करने के लिए ऊपर उल्लेख किया गया है, पीटीयू विषाक्तता के संकेतों की भी सावधानीपूर्वक निगरानी की जानी चाहिए और, यदि संदेह है, तो काम करने की एकाग्रता और / या पीटीयू अतिरिक्त के समय को अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  4. 2-3 डीपीएफ पर, ताजा निर्मित प्रोनेस समाधान का उपयोग करके डिकोरियोनेट भ्रूण।
    1. भंवर द्वारा 2 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर 1.5x पीटीयू में प्रोनेस को भंग करें।
      सावधानी: प्रोनेस को एक बहुत ही महीन पाउडर के रूप में पैक किया जाता है और यह एक अड़चन है। साँस लेने और / या त्वचा, आंखों आदि के संपर्क से बचने के लिए उपाय करें।
    2. unhatched भ्रूण से अलग हैच्ड भ्रूण और pronase-उपचार केवल unhatched भ्रूण.
    3. चरण 2.4.1 में किए गए 2 मिलीग्राम / एमएल प्रोनेस समाधान के साथ 1.5x पीटीयू को बदलें और कोमल आंदोलन के साथ 4-5 मिनट के लिए अनहैच्ड भ्रूण पर छोड़ दें (उदाहरण के लिए, टेबलटॉप रोटेटर / शेकर पर या मैन्युअल घूमते हुए)।
    4. Pronase समाधान बंद डालो और तुरंत ताजा 1.5x PTU के साथ कुल्ला. धीरे triturate 1.5x PTU एक बल्ब के साथ भ्रूण पर कुल्ला-ड्रा स्थानांतरण पिपेट.
    5. सभी चोरियन मलबे को त्यागने के लिए एक दूसरा 1.5x PTU कुल्ला दोहराएं, और फिर रखरखाव के लिए 1.5x PTU को फिर से भरें।
      नोट: भ्रूण को ठीक-ठीक इत्तला वाले संदंश का उपयोग करके मैन्युअल रूप से डिकोरियोनेटेड भी किया जा सकता है। इस मामले में, कोरियोन मलबे को हटा दिया जाना चाहिए और मैन्युअल डिकोरियोनेशन के बाद 1.5x पीटीयू को फिर से भर दिया जाना चाहिए।
  5. भ्रूण / लार्वा स्वास्थ्य की निगरानी करें और हर 1-2 दिनों में 1.5x PTU को फिर से भरें। भ्रूण / लार्वा को 1.5x PTU में रखा जाता है जब तक कि 5 dpf पर एब्लेशन न हो जाए।
    नोट:: चरण 2.3 और 2.4 के महत्व को चर्चा अनुभाग में आगे संबोधित किया गया है।

3. rpe65a के लिए zebrafish लार्वा स्क्रीनिंग: nfsB-eGFP और रेटिना वर्णक उपकला के आनुवंशिक एब्लेशन (5-6 दिन के बाद निषेचन)

  1. 5 डीपीएफ (एब्लेशन के दिन) पर एक ताजा 10 एमएम मेट्रोनिडाज़ोल (एमटीजेड) समाधान बनाएं। इस प्रक्रिया को पूरा करने में 2 घंटे लगते हैं।
    1. PTU के बिना सिस्टम पानी में MTZ पाउडर जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए जोरदार मिलाते हुए (उदाहरण के लिए, 250 रोटेशन प्रति मिनट) द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
    2. एक टेबलटॉप रोटेटर / शेकर पर कमरे के तापमान पर एक अतिरिक्त 1 घंटे के लिए 10 एमएम एमटीजेड समाधान को ठंडा करें और लार्वा के साथ पेट्री व्यंजनों में जोड़ने से पहले पूर्ण विघटन सुनिश्चित करें।
      नोट: प्रतिदीप्ति स्क्रीनिंग और eGFP + लार्वा (चरण 3.2) के अलगाव 37 डिग्री सेल्सियस और कमरे के तापमान ऊष्मायन के दौरान किया जा सकता है।
      सावधानी: एमटीजेड खतरनाक है, और त्वचा या आंखों के साथ अंतर्ग्रहण, साँस लेना और / या संपर्क को रोकने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। एमटीजेड पाउडर और यहां वर्णित सभी तरल डेरिवेटिव को राज्य और संस्थागत नियमों के आधार पर रासायनिक अपशिष्ट के रूप में निपटाने की आवश्यकता हो सकती है। उचित एमटीजेड अपशिष्ट निपटान विधियों की पुष्टि, यदि कोई हो, तो उपयोग करने से पहले अनुशंसित है।
  2. rpe65a के लिए स्क्रीन zebrafish लार्वा: nfsB-eGFP ट्रांसजीन.
    1. ट्राइकेन (एमएस -222) के 0.168 ग्राम / एल के साथ एनेस्थेटिक लार्वा और गैर-ट्रांसजेनिक (ईजीएफपी -) लार्वा (चित्रा 1) से 488 एनएम उत्तेजना लेजर / फिल्टर के साथ एक प्रतिदीप्ति स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अलग ट्रांसजेनिक (ईजीएफपी +) लार्वा (चित्रा 1)।
      नोट: ट्राइकेन को 1.5x पीटीयू और / या औषधीय यौगिक समाधानों में जोड़ा जाना चाहिए क्योंकि लार्वा को ईजीएफपी के लिए जांच करते समय उपचार में विसर्जित रहना चाहिए। केवल स्क्रीनिंग की अवधि के लिए ट्राइकेन में लार्वा इनक्यूबेट करें (उदाहरण के लिए, 50 लार्वा युक्त एकल 10 सेमी पेट्री डिश के लिए ≤10 मिनट)।
    2. जागो तुरंत लार्वा ऊपर की जांच की एक पेट्री डिश में सीधे tricaine के बिना ताजा 1.5x PTU के साथ pipetting द्वारा.
    3. स्क्रीनिंग के पूरा होने पर, ईजीएफपी + लार्वा को पेट्री व्यंजनों के दो समूहों में अलग करें: एमटीजेड उपचार प्राप्त करने के लिए एक समूह (एब्लेटेड / एमटीजेड +) और एक समूह को अबाधित (एमटीजेड-) नियंत्रण होना चाहिए।
  3. रेटिना वर्णक उपकला को एब्लेट करें।
    1. Unablated (MTZ-) नियंत्रण व्यंजन से 1.5x PTU निकालें और PTU के बिना ताजा सिस्टम पानी जोड़ें।
    2. ablated (MTZ +) उपचार व्यंजनों से 1.5x PTU निकालें और ताजा बनाया 10 mM MTZ समाधान (चरण 3.1.) जोड़ें।
    3. ठीक 24 घंटे के बाद 10 mM MTZ समाधान निकालें (नामित 1 दिन पोस्ट-चोट (dpi)) और PTU के बिना ताजा सिस्टम पानी जोड़ें। MTZ- डिश (es) पर PTU के बिना ताजा सिस्टम पानी को बदलें। लार्वा प्रोटोकॉल के शेष के लिए फिर से पीटीयू के संपर्क में नहीं आएगा।
      नोट: लार्वा हानि के बिना समाधान एक्सचेंजों के बीच सभी 1.5x PTU (चरण 3.3.1 और 3.3.2) या 10 mM MTZ (चरण 3.3.3) को पिपेट करना या डालना मुश्किल हो सकता है क्योंकि जानवर सक्रिय रूप से चारों ओर तैर रहे हैं। इस घटना में, सफल समाधान विनिमय सुनिश्चित करने के लिए पीटीयू के बिना सिस्टम पानी के धोने (es) को जोड़ा जा सकता है।

4. लार्वा रखरखाव के बाद आनुवंशिक एब्लेशन (6 + दिन के बाद निषेचन)

  1. लार्वा की जांच करें और पीटीयू के बिना सिस्टम के पानी को फिर से भरें जब तक कि इच्छामृत्यु (चरण 5.6) या ज़ेब्राफ़िश आवास सुविधा पर वापस न आ जाए।
  2. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप (चित्रा 2) पर संचरित प्रकाश रोशनी का उपयोग करके 2 डीपीआई (7 डीपीएफ) पर विवो में एब्लेशन की सफलता और सीमा की निगरानी करें।

5. जेब्राफ़िश रेटिना वर्णक उपकला एब्लेशन प्रोटोकॉल में औषधीय उपचार को शामिल करना

नोट: जैसा कि पहले3 किया गया था, 15 μM IWR-1 या वॉल्यूम-मिलान डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (DMSO) वाहन नियंत्रण के साथ उपचार 4 dpf पर शुरू होता है, यहां RpEGEN का परीक्षण करने के लिए एक उदाहरण प्रयोग के रूप में उल्लिखित है। सांद्रता और समयरेखा विभिन्न औषधीय यौगिकों के साथ भिन्न हो सकती है और खुराक-प्रतिक्रिया सत्यापन, उपचार की अवधि, स्क्रीनिंग, और औषधीय हेरफेर अध्ययनों के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन के अन्य पहलुओं के लिए सिफारिशों को चर्चा अनुभाग में संबोधित किया जाता है। यदि छवि विश्लेषण आवश्यक है, तो चरण 6 और 7 का पालन करें।

  1. चरण 2 में वर्णित के रूप में भ्रूण एकत्र करें और बनाए रखें। 2 dpf पर dechorionate भ्रूण.
  2. स्क्रीन eGFP + लार्वा 4 dpf पर के रूप में चरण 3.2 में वर्णित है. पेट्री व्यंजनों के बजाय, ईजीएफपी + लार्वा को 6-वेल प्लेटों में एन ≤ 10 लार्वा प्रति 6-वेल के घनत्व पर औषधीय उपचार के लिए रखें। लार्वा के लिए अलग-अलग 6-अच्छी तरह से प्लेटों को नामित करें जो कि अनियंत्रित (एमटीजेड-) और लार्वा होंगे जो एब्लेटेड (एमटीजेड +) होंगे।
    नोट:: eGFP संकेत 4 dpf पर दिखाई देता है, लेकिन 5 dpf पर संकेत तीव्रता से dimmer प्रकट होता है।
  3. 15 μM IWR-1 या वॉल्यूम-मिलान वाले DMSO वाहन नियंत्रण के साथ 4 dpf eGFP + लार्वा को 10 mM MTZ समाधान के साथ आनुवंशिक एब्लेशन से पहले ठीक 24 घंटे के लिए प्रीट्रीट करें।
    नोट: अक्सर, औषधीय उपचार प्रयोगों के लिए बहुत कम यौगिक की आवश्यकता होती है। आईडब्ल्यूआर -1 पाउडर की छोटी मात्रा का वजन करने से बचने के लिए, इस औषधीय यौगिक को पहले से ही डीएमएसओ समाधान में 25 एमएम की एकाग्रता पर खरीदा जाता है, और बार-बार फ्रीज-पिघलने वाले चक्रों से बचने के लिए आगमन पर छोटी मात्रा में एलीकोट किया जाता है।
    1. आवश्यक औषधीय और वाहन नियंत्रण उपचार की मात्रा निर्धारित करें और तदनुसार शंक्वाकार ट्यूबों में 1.5x PTU को एलीकोट करें। 6-वेल प्लेट के 5 एमएल / कुएं की मात्रा की सिफारिश की जाती है।
    2. 15 μM IWR-1 की अंतिम सांद्रता के लिए 1.5x PTU में IWR-1 स्टॉक जोड़ें (उदाहरण के लिए, 25 mM IWR-1 के 3 μL प्रति 5 mL 1.5x PTU)। 1.5x PTU के लिए DMSO स्टॉक की एक मिलान मात्रा जोड़ें (उदाहरण के लिए, 3 μL ≥ 99.7% DMSO प्रति 5 mL 1.5x PTU)। यहां, यह 0.06% मात्रा / मात्रा (% v / v) DMSO की अंतिम एकाग्रता उत्पन्न करेगा। भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण और नेत्रहीन यौगिकों के विघटन की पुष्टि.
      सावधानी: डीएमएसओ, आईडब्ल्यूआर -1, और अन्य औषधीय यौगिकों और सॉल्वैंट्स को राज्य और संस्थागत नियमों के आधार पर रासायनिक अपशिष्ट के रूप में निपटाने की आवश्यकता हो सकती है। इन यौगिकों के लिए खतरे के स्तर और उचित अपशिष्ट निपटान विधियों की पुष्टि, यदि कोई हो, तो उपयोग करने से पहले अनुशंसित है।
    3. 6-अच्छी तरह से प्लेटों में eGFP + लार्वा से 1.5x PTU निकालें और चरण 5.3.2 से 0.06% v / v DMSO या 15 μM IWR-1 उपचार के 5 mL / well जोड़ें।
  4. 5 dpf पर, RPE ablate. 24 ज pretreatment (चरण 5.3) के अलावा, लार्वा 10 mM MTZ के साथ आनुवंशिक एब्लेशन के 24 ज के दौरान औषधीय और वाहन नियंत्रण उपचार में डूबे रहेंगे और पोस्ट-एब्लेशन वसूली के दौरान, निर्धारण तक (उदाहरण के लिए, 4-9 dpf से)।
    1. आनुवांशिक एब्लेशन (चरण 3.1) करने से पहले 10 mM MTZ समाधान 2 घंटे बनाएं।
    2. दोनों unablated (MTZ-) और ablated (MTZ+) 6-अच्छी तरह से प्लेटों और या तो PTU (MTZ-) या 10 mM MTZ समाधान (MTZ +) के बिना ताजा प्रणाली पानी के उचित मात्रा के लिए आवश्यक औषधीय और वाहन नियंत्रण उपचार की मात्रा निर्धारित करें शंक्वाकार ट्यूबों में। यह चार उपचार की स्थिति पैदा करेगा: 1) 0.06% v / v DMSO, MTZ-; 2) 15 μM IWR-1, MTZ-; 3) 0.06% v/ v DMSO, MTZ + और 4) 15 μM IWR-1, MTZ +
    3. IWR-1 और DMSO स्टॉक समाधान संबंधित शंक्वाकार ट्यूबों के लिए जोड़ें जैसा कि चरण 5.3.2 में किया गया है। भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण और नेत्रहीन यौगिकों के विघटन की पुष्टि.
    4. 0.06% v / v DMSO और 15 μM IWR-1 उपचार 1.5x PTU (चरण 5.3.2) में निर्दिष्ट unablated (MTZ-) और ablated (MTZ +) 6-अच्छी तरह से प्लेटों से निकालें और चरण 5.4.3 में किए गए उचित उपचारों के साथ फिर से भरें।
    5. ठीक 24 घंटे के बाद 10 mM MTZ समाधान में 0.06% v / v DMSO और 15 μM IWR-1 उपचार निकालें और PTU के बिना ताजा सिस्टम पानी में उपचार के साथ फिर से भरें। 0.06% v / v DMSO और 15 μM IWR-1 उपचार को बिना PTU के ताजे सिस्टम के पानी में पुनः भरें (MTZ-) 6-well प्लेट (s)।
  5. चरण 4 में उल्लिखित लार्वा रखरखाव पोस्ट-एब्लेशन का पालन करें और पीटीयू के बिना सिस्टम पानी में दैनिक रूप से 0.06% v / v DMSO या 15 μM IWR-1 उपचारों को फिर से भरें।
  6. 9 डीपीएफ (उम्र से मेल खाने वाले एमटीजेड-उपचारित भाई-बहनों के लिए 4 डीपीआई) पर लार्वा को कम से कम 20मिनट 30 के लिए तेजी से ठंडा करने (जैसे, बर्फ पर पेट्री व्यंजन रखें) के साथ मिलकर 0.3 ग्राम / एल ट्राइकेन समाधान (घातक ओवरडोज) में जानवरों को विसर्जित करके। यह सुनिश्चित करने के लिए जांचें कि लार्वा कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए या रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए (चरण 1.5) में स्पर्श करने और ठीक करने के लिए अनुत्तरदायी हैं।
  7. एक confocal माइक्रोस्कोप पर z-स्टैक छवि अधिग्रहण के लिए पोस्ट-फिक्सेशन लार्वा ऊतक की प्रक्रिया के रूप में पहले 5,31 और यहां प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में वर्णित है। चरण 6 और 7 में विश्लेषण के लिए, कम से कम, परमाणु मार्कर (जैसे, DAPI) और ब्राइटफील्ड z-स्टैक छवियों के अधिग्रहण की आवश्यकता होगी।

6. Confocal माइक्रोस्कोप z-स्टैक छवि फिजी में preprocessing (ImageJ)

  1. आयात और स्वरूप confocal माइक्रोस्कोप z-स्टैक छवियों FIJI32 का उपयोग कर.
    1. के साथ स्टैक देखने के लिए सेट बायो-स्वरूप आयात विकल्प का उपयोग कर माइक्रोस्कोप छवियों को खोलें: हाइपरस्टैक और रंग मोड: ग्रेस्केल।
    2. छवि | का चयन करके आयातित माइक्रोस्कोप छवि का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण उत्पन्न करें स्टैक्स | जेड परियोजना। ZProjection विंडो में, उस छवि के लिए सभी स्लाइस शामिल करने के लिए स्लाइस प्रारंभ करें और स्लाइस रोकें सेट करें। उदाहरण के लिए, स्लाइस प्रारंभ करें: 1 और स्लाइस रोकें: 18 सेट करें एक z-स्टैक के लिए जिसमें कुल 18 स्लाइस हैं। प्रोजेक्शन प्रकार चुनें: अधिकतम तीव्रता और ठीक पर क्लिक करें।
    3. छवि | का चयन करके अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण फ़ाइल को 8-बिट छवि (यदि पहले से ही नहीं) में कनवर्ट करें टाइप | 8-बिट.
    4. छवि को फिर से उन्मुख करें ताकि पृष्ठीय पक्ष ऊपर हो और डिस्टल (यानी, लेंस) को छवि | का चयन करके छोड़ दिया जाए | रूपांतरित करें क्षैतिज रूप से फ्लिप करें (अंतिम कमांड के लिए, उस विकल्प का चयन करें जो उस छवि के लिए आवश्यक दिशात्मकता के लिए सबसे अच्छा सूट करता है)। एक बहु-चैनल छवि के लिए, प्रक्रिया स्टैक में हाँ पर क्लिक करें? विंडो सभी चैनलों को reorient करने के लिए।
      नोट:: यह चरण महत्वपूर्ण है, लेकिन यदि छवि पहले से ही पृष्ठीय ऊपर, डिस्टल बाएँ ओरिएंटेशन में है, तो आवश्यक नहीं है। प्रसंस्करण के लिए सही दिशात्मकता में आंखों वाली छवियों के लिए चित्रा 3ए-डी और चित्रा 4 देखें।
    5. फ़ाइल | का चयन करके टैग की गई छवि फ़ाइल स्वरूप (TIF) फ़ाइल के रूप में 8-बिट अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण सहेजें | के रूप में सहेजें टिफ...।
  2. फिजी का उपयोग करके ब्याज के आरपीई क्षेत्र (आरओआई) उत्पन्न करें।
    1. चरण 6.1 में वर्णित के रूप में जनरेट की गई एक 8-बिट TIF छवि खोलें। विश्लेषण | का चयन करके ROI प्रबंधक प्रारंभ करें उपकरण | ROI प्रबंधक.
    2. छवि | का उपयोग करें ज़ूम और DAPI और brightfield चैनलों के बीच टॉगल करने के लिए बिंदु (ओं) की पहचान करने के लिए जिस पर RPE के एपिकल पक्ष बाहरी सीमित झिल्ली (OLM) की नोक से सटे हुए है (चित्रा 3B', B", D', D"; नीले arrowheads). ROI प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस शारीरिक मील का पत्थर का उपयोग करें।
    3. दोनों DAPI और brightfield छवि चैनलों और ज़ूम फ़ंक्शन (छवि | का उपयोग कर बहुभुज चयन उपकरण (FIJI उपकरण पट्टी में) के साथ RPE ROI बनाएँ ज़ूम) एपिकल और बेसल आरपीई सीमाओं की पहचान करने के लिए। ROI के पृष्ठीय और वेंट्रल सिरों को लाएं (यानी, जहां ROI एपिकल से आरपीई के बेसल पक्ष में संक्रमण करता है) को कुंद करने या गोल करने के बजाय एक तेज बिंदु पर ले जाएं (चित्रा 3 B', B", D', D"; मैजेंटा लाइनें)।
      नोट:: एक इंगित ROI अंत बनाना RpEGEN का उपयोग कर समापन बिंदु का पता लगाने को अनुकूलित करने के लिए एक महत्वपूर्ण चरण है और चर्चा अनुभाग में संबोधित किया गया है।
    4. ROI प्रबंधक में जोड़ें पर क्लिक करके ROI जोड़ें। आवश्यकतानुसार ROI समायोजित करें और ROI प्रबंधक में अद्यतन पर क्लिक करें।
    5. अधिक का चयन करके ROI फ़ाइल सहेजें >> | रक्षा कर।।। ROI प्रबंधक के भीतर। मिलान ROI और TIF छवि फ़ाइलों के लिए समान नामों का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, [फ़ाइल नाम].tif और [फ़ाइल नाम].roi).
  3. एक एकल फ़ोल्डर में प्रत्येक स्थिति के लिए 8-बिट TIF और ROI फ़ाइलों को संयोजित करें। उदाहरण के लिए, फ़ोल्डर, DMSO_9dpf, सभी मिलान TIF और ROI फ़ाइलें 9 dpf unablated (MTZ-) 0.06% v/v DMSO-उपचारित लार्वा समूह के लिए शामिल होंगे।

7. परिमाणीकरण और RpEGEN लिपियों का उपयोग कर आरपीई पुनर्जनन के दृश्य

  1. स्थापित करें और RpEGEN स्क्रिप्ट तैयार करें।
    1. कोड | पर क्लिक करके GitHub रिपॉजिटरी (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) से नवीनतम RpEGEN स्क्रिप्ट डाउनलोड करें डाउनलोड ज़िप.
    2. फ़ोल्डर को अनज़िप करें और इसे इच्छित कार्यस्थान स्थान (जैसे, डेस्कटॉप) में रखें.
    3. MATLAB खोलें.
    4. वर्तमान फ़ोल्डर फलक में RpEGEN फ़ोल्डर पर नेविगेट करें (आमतौर पर बाईं ओर).
    5. RpEGEN फ़ोल्डर पर राइट क्लिक करें और पथ | में जोड़ें चुनें चयनित फ़ोल्डर और सबफ़ोल्डर. यह फ़ोल्डर को MATLAB पथ पर जोड़ता है ताकि यह स्वचालित रूप से फ़ोल्डर में किसी भी स्क्रिप्ट को ढूँढ और चला सके.
    6. सभी सबफ़ोल्डर और M फ़ाइलें दिखाने के लिए वर्तमान फ़ोल्डर फलक में RpEGEN फ़ोल्डर पर डबल क्लिक करें।
    7. संपादक फलक में खोलने के लिए RpEGEN.m फ़ाइल पर डबल क्लिक करें।
    8. RpEGEN.m फ़ाइल के USER-DEFINED VARIABLES अनुभाग के अंतर्गत, ROI फ़ाइलों (.roi), छवि फ़ाइलों (.tif) वाले फ़ोल्डरों के लिए निर्देशिका स्थान दर्ज करें, और जहाँ आउटपुट फ़ाइलें सहेजी जानी चाहिए. निर्यात की जाने वाली .mat फ़ाइल के लिए समूह नाम दर्ज करें (उदाहरण के लिए, DMSO_9dpf, DMSO_4dpi, आदि) और TIF छवि स्टैक में ब्राइटफ़ील्ड चैनल का स्थान (उदाहरण के लिए, 3, यदि ब्राइटफ़ील्ड छवि स्टैक में तीसरा चैनल है). यदि छवि फ़ाइल में केवल ब्राइटफील्ड छवि है, तो यह 1 के बराबर होना चाहिए।
  2. RpEGEN.m स्क्रिप्ट चलाएँ और परिणामों को सत्यापित करें।
    नोट:: RpEGEN छवि संसाधन टूलबॉक्स, वक्र फिटिंग टूलबॉक्स, और आँकड़े और मशीन लर्निंग टूलबॉक्स को चलाने के लिए उपयोगकर्ता MATLAB लायसेंस पर सक्रिय करने के लिए की आवश्यकता है। इसके अलावा, स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ReadImageJROI टूलबॉक्स33 को फिजी आरओआई को MATLAB में आयात करने की आवश्यकता है; हालांकि, यह किसी भी सक्रियण की आवश्यकता नहीं है कि अन्य फ़ंक्शन M फ़ाइलों के साथ RpEGEN फ़ोल्डर में प्रदान की जाती है।
    1. MATLAB के शीर्ष पर संपादक मेनू में चलाएँ बटन पर क्लिक करके स्क्रिप्ट चलाएँ।
      नोट:: एक बार शुरू करने के बाद, आदेश विंडो स्क्रिप्ट की प्रगति को इंगित वर्बोज़ आउटपुट प्रदान करेगा। निकाले गए डेटा वाले मैट फ़ाइल को सहेजने के बाद, एक तीन-पैनल आंकड़ा दिखाई देगा और प्रत्येक छवि चलाने के लिए आउटपुट निर्देशिका में पीडीएफ के रूप में सहेजा जाएगा। ये गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) आंकड़े हैं जो यह सुनिश्चित करने के लिए हैं कि सब कुछ ठीक से चला गया है और इसमें शामिल हैं: 1) आरओआई (चित्रा 4 ए) द्वारा ओवरलेड ब्राइटफील्ड छवि; 2) सेंटरलाइन और संबंधित कोणीय दूरी (डिग्री) (चित्रा 4 जी) के साथ आरओआई; और 3) centerline औसत तीव्रता मान (0-255, 8-बिट रंग पैमाने) (चित्रा 4H) के साथ ROI. QC PDF आउटपुट फ़ोल्डर में सहेजे जाने तक प्रतीक्षा करें और अगले चरण पर जाने से पहले अंतिम आकृति गायब हो गई है.
    2. किसी भी पीडीएफ व्यूअर में आउटपुट फ़ोल्डर में निर्यात किए गए व्यक्तिगत पीडीएफ को खोलें और सत्यापित करें कि सभी आरओआई ब्राइटफील्ड छवियों से मेल खाते हैं, कि सेंटरलाइन मान आरओआई के केंद्र के उचित सन्निकटन हैं, और यह कि माध्यिका तीव्रता मान उचित रूप से डेटा के साथ पॉपुलेटेड हैं (यानी, पूरे सेंटरलाइन में सभी समान मूल्य नहीं)।
      नोट:: एक विस्तृत विवरण और RpEGEN.m द्वारा MAT फ़ाइल में सहेजे गए प्रत्येक चर की संरचना तालिका 1 में पाया जा सकता है।
  3. RpEGEN_PermPlot.m स्क्रिप्ट चलाएँ।
    नोट: RpEGEN_PermPlot.m स्क्रिप्ट दो समूहों के माध्यिकाओं के क्रमपरिवर्तन सिमुलेशन का उपयोग करके सांख्यिकीय तुलना चलाने के लिए RpEGEN.m के आउटपुट का उपयोग करता है और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध GRAMM टूलबॉक्स34 का उपयोग करके इस पेपर में भूखंडों को पुन: उत्पन्न करने के लिए कोड भी प्रदान करता है, जिसे RpEGEN फ़ोल्डर में भी शामिल किया गया है।
    1. एक नए संपादक टैब में खोलने के लिए RpEGEN_PermPlot.m फ़ाइल पर डबल क्लिक करें।
    2. अनुभाग 1 - उपयोगकर्ता-परिभाषित चर RpEGEN_PermPlot फ़ाइल में के तहत, RpEGEN.m चलाने से MAT फ़ाइलों वाले आउटपुट फ़ोल्डर के लिए निर्देशिका स्थान दर्ज करें और लोड होने के लिए प्रत्येक MAT फ़ाइल नाम दर्ज करें (उदाहरण के लिए, DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat)।
    3. MATLAB के शीर्ष पर संपादक मेनू में चलाएँ अनुभाग बटन पर क्लिक करके स्क्रिप्ट के इस अनुभाग को चलाएँ।
    4. अनुभाग 2 में, data_A में सांख्यिकीय तुलना के लिए दो समूहों के नाम दर्ज करें और चर data_B करें (ये वे समूह हैं जिनसे क्रमपरिवर्तन सिमुलेशन का उपयोग करके माध्यिकाओं को व्युत्पन्न किया जाएगा)। bin_sz चर में, डेटासेट के लिए माध्य तीव्रता मानों को एकीकृत करने के लिए डिग्री की संख्या दर्ज करें (डिफ़ॉल्ट 1-डिग्री डिब्बे है)।
      नोट:: प्रतिनिधि चर एक प्रायिकता वितरण बनाने के लिए उपयोग करने के लिए क्रमपरिवर्तन की संख्या को इंगित करता है और किसी भी संख्या (डिफ़ॉल्ट मान 20,000 है) पर सेट किया जा सकता है। सामान्य तौर पर, पुनरावृत्ति की एक उच्च संख्या अधिक सांख्यिकीय रूप से मजबूत होगी लेकिन प्रसंस्करण समय में वृद्धि होगी।
    5. MATLAB के शीर्ष पर संपादक मेनू में चलाएँ अनुभाग बटन पर क्लिक करके स्क्रिप्ट के इस अनुभाग को चलाएँ। इस अनुभाग को निर्दिष्ट पुनरावृत्तियों की संख्या के आधार पर पूरा करने में कुछ समय लग सकता है, लेकिन आदेश विंडो में एक निरंतर स्थिति अद्यतन प्रदान करता है।
    6. चलाएँ अनुभाग बटन का उपयोग कर हीटमैप आकृति और समूह परिणाम और P-मान अनुभाग स्वतंत्र रूप से चलाएँ । "यहाँ डेटा दर्ज करें" के साथ टिप्पणी की गई किसी भी अनुभाग में डेटा चर संपादित करें. इन आंकड़ों के पीडीएफ स्वचालित रूप से प्रत्येक के लिए सहेजे जाते हैं और किसी भी वेक्टर सॉफ़्टवेयर पोस्ट प्रोसेसिंग में आसानी से संशोधित किए जा सकते हैं।
      नोट:: RpEGEN_PermPlot.m फ़ाइल में जनरेट किए गए प्लॉट तदर्थ हैं और संभवतः प्रत्येक उपयोगकर्ता के विशिष्ट डेटा और विज़ुअलाइज़ेशन आवश्यकताओं के आधार पर संशोधनों की आवश्यकता होगी। हालांकि, आंकड़े एक ठोस नींव प्रदान करते हैं जिसे MATLAB और GRAMM वेबसाइटों दोनों का उपयोग करके आसानी से व्यक्तिगत किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

विहित WNT सिग्नलिंग मार्ग को बाधित करने के लिए आनुवंशिक एब्लेशन प्रतिमान (rpe65a: nfsB-eGFP) और औषधीय हेरफेर पद्धति (IWR-1) प्रोटोकॉल3 में वर्णित का उपयोग करके ज़ेबराफ़िश आरपीई पुनर्जनन को काफी खराब करने के लिए जाना जाता है। इस प्रयोग को रंजकता के आधार पर ज़ेबराफ़िश आरपीई पुनर्जनन को मापने के लिए एक स्वचालित विधि को मान्य करने के लिए यहां दोहराया गया था। नीचे संक्षेप में दिए गए परिणामों में प्रोटोकॉल के सभी चरणों को शामिल किया गया है, निषेचन (0 डीपीएफ) के दिन से आरपीईजेन का उपयोग करके आरपीई पुनर्जनन के परिमाणीकरण तक।

लार्वा ज़ेब्राफ़िश में आरपीई एब्लेशन प्रोटोकॉल (औषधीय हेरफेर के साथ) को लागू करना
तीन अलग-अलग माता-पिता समूहों (एन = 3) से एकत्र किए गए भ्रूण ने 6 एचपीएफ के आसपास 1.5x पीटीयू के साथ उपचार शुरू किया और आरपीई और सतह मेलानोसाइट्स में रंजकता की अनुपस्थिति की नेत्रहीन रूप से 1 डीपीएफ पर पुष्टि की गई थी। भ्रूण को एंजाइमेटिक रूप से 2 डीपीएफ पर 2 मिलीग्राम / एमएल प्रोनेस (चरण 2.4) का उपयोग करके डिकोरियनेटेड किया गया था। 4 डीपीएफ पर, लार्वा को ट्राइकेन (एमएस -222) का उपयोग करके एनेस्थेटिक किया गया था और एक प्रतिदीप्ति स्टीरियो माइक्रोस्कोप (चरण 3.2 और 5.2) का उपयोग करके ईजीएफपी के लिए स्क्रीन किया गया था। ईजीएफपी + लार्वा को 6-अच्छी तरह से प्लेटों (एन = 10 लार्वा / अच्छी तरह से) में ले जाया गया था और या तो 0.06% वी / वी डीएमएसओ (वाहन नियंत्रण) या 15 μM IWR-1 (चरण 5.3) के साथ इलाज किया गया था। यहां रिपोर्ट किया गया लार्वा घनत्व शुरू में 1 लार्वा / सेमी2 विकास क्षेत्र के सन्निकटन पर आधारित था और समय के साथ सावधानीपूर्वक स्वास्थ्य निगरानी (जैसे, मूत्राशय के विकास को तैरना) के माध्यम से मान्य किया गया था। ईजीएफपी की तीव्रता 4 डीपीएफ पर मंद दिखाई दी, इसलिए लार्वा को उज्ज्वल ईजीएफपी अभिव्यक्ति (चित्रा 1) की पुष्टि करने के लिए 5 डीपीएफ पर फिर से जांच की गई। RPE65 (zebrafish में rpe65a) परिपक्वRPE 7 का एक मार्कर है और, teleost मछली में, रेटिना और RPE कोशिकाओं को लगातार सिलियरी सीमांत क्षेत्र (CMZ) से उत्पन्न किया जाता है, रेटिना के डिस्टल टिप पर एक स्टेम सेल आला, लेंस35 से सटे। इस प्रकार, rpe65a: nfsB-eGFP ट्रांसजेनिक लाइन में, अधिक अपरिपक्व आरपीई परिधि पर मौजूद है और eGFP- (कुल आरपीई ऊतक का लगभग एक तिहाई) दिखाई देता है, जबकि परिपक्व, केंद्रीय दो-तिहाई आरपीई ईजीएफपी (चित्रा 1 बी; सफेद एरोहेड्स) व्यक्त करता है। ट्रांसजीन पीनियल ग्रंथि (चित्रा 1 ए; पीले एरोहेड) में भी दिखाई दे रहा था, जिसकी उम्मीद की गई थी क्योंकि आरपीई 65 ए ज़ेबराफ़िश36 में पीनियल अभिव्यक्ति दिखाता है। तुलनात्मक रूप से मंद या ईजीएफपी- लार्वा को 6-अच्छी तरह से प्लेटों से खींचा गया था और 5 डीपीएफ पर euthanized किया गया था। डीएमएसओ या आईडब्ल्यूआर -1 के साथ ठीक 24 घंटे के बाद के उपचार में, 5 डीपीएफ लार्वा को आरपीई (चरण 3.1, 3.3, और 5.4) को कम करने के लिए 10 एमएम एमटीजेड के साथ इलाज किया गया था। एमटीजेड को ठीक 24 घंटे (यानी, 6 डीपीएफ / 1 डीपीआई पर) के बाद धोया गया था ताकि आरपीई पुनर्जनन की अनुमति मिल सके।

लार्वा को एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप पर दैनिक रूप से देखा गया था, जिसमें 6 डीपीएफ / 1 डीपीआई से 9 डीपीएफ / 4 डीपीआई पर इच्छामृत्यु के समय तक संचारित प्रकाश रोशनी का उपयोग किया गया था। आनुवांशिक एब्लेशन की सफलता की पुष्टि 2 डीपीआई पर विवो में एमटीजेड + लार्वा (चित्रा 2 बी; लाल एरोहेड्स) में आंख के केंद्रीय दो-तिहाई में वर्णक की अनुपस्थिति से की गई थी, 7 डीपीएफ एमटीजेड- नियंत्रण भाई-बहनों (चित्रा 2 ए) (चरण 4.2) की तुलना में। जैसा कि प्रत्याशित है, 2 डीपीआई पर वर्णक से रहित क्षेत्र rpe65a के क्षेत्र के अनुरूप दिखाई दिया: nfsB-eGFP ट्रांसजीन अभिव्यक्ति 5 dpf (चित्रा 1B) पर मनाया गया। मूल्यांकन 2 डीपीआई पर किया गया था और पहले नहीं क्योंकि आरपीई पीटीयू को हटाने के बाद और विवो में अवलोकन के समय के आधार पर रिपिगमेंटेशन से गुजरता है, एब्लेटेड केंद्रीय आरपीई और बख्शा गया (अनियंत्रित) परिधीय आरपीई के बीच एक उल्लेखनीय अंतर यह समझना मुश्किल हो सकता है कि उत्तरार्द्ध ने पूरी तरह से repigmented नहीं किया है या नहीं। मैक्रोस्कोपिक अस्पष्टता की संभावना के बावजूद, 1 डीपीआई पर आरपीई एब्लेशन को पहले विभाजित ऊतक में आसानी से स्पष्ट दिखाया गया था, जो केंद्रीय आरपीई और बाहरी परमाणु परत (ओएनएल; यानी, फोटोरिसेप्टर) ऊतक अखंडता के नुकसान का खुलासा करता है, साथ ही सेल मृत्यु (पाइकनोटिक नाभिक) (चित्रा 5) 3 के सबूत के साथ। ऊतक हानि के लिए काउंटर, मजबूत प्रसार rpe65a में ऊतक पुनर्जनन के दौरान एक प्रमुख चालक होने के लिए निर्धारित किया गया था: nfsB-eGFP zebrafish मॉडल3. दोनों शुरुआती एपोप्टोटिक प्रतिक्रिया, जहां आरपीई एब्लेशन आसन्न ऊतकों के अध: पतन की ओर जाता है (उदाहरण के लिए, फोटोरिसेप्टर और ब्रूच की झिल्ली; चित्रा 6ए-सी), और परिधीय-से-केंद्रीय प्रोलिफेरेटिव प्रतिक्रिया जो इस प्रकार है, जो चोट साइट (चित्रा 6 डी-एफ) में अंदर की ओर बढ़ने वाले विषम उत्थान "ज़ोन" उत्पन्न करती है, को बड़े पैमाने पर विशेषता दी गई है और पहले3 पर चर्चा की गई है।

ऊतक की तैयारी, confocal छवि अधिग्रहण, और RpEGEN का उपयोग कर RPE रंजकता के आधार पर स्वचालित परिमाणीकरण के लिए छवि preprocessing
9 डीपीएफ / 4 डीपीआई पर, डीएमएसओ- और आईडब्ल्यूआर -1-उपचारित लार्वा को ट्राइकेन ओवरडोज द्वारा euthanized किया गया था और कमरे के तापमान (चरण 5.6) पर 3 घंटे के लिए 4% पीएफए में तय किया गया था। प्रत्येक स्वतंत्र माता-पिता समूह के चार लार्वा को बाद के ऊतक प्रसंस्करण के लिए यादृच्छिक रूप से चुना गया था (एन = 3; एन = 12 लार्वा प्रति उपचार)। क्रायोप्रोटेक्शन, क्रायोसेक्शनिंग (12 μm मोटाई पर), DAPI के साथ परमाणु काउंटरस्टेनिंग, और कवरस्लिप माउंटिंग चरण5.7 5,31 में संदर्भित के रूप में किया गया था। एक केंद्रीय अनुभाग, दृश्यमान ऑप्टिक तंत्रिका के साथ, प्रत्येक लार्वा से एक confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर एक 40x तेल विसर्जन उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर = 1.30) का उपयोग करके 512 x 512-पिक्सेल z-स्टैक छवियों को प्राप्त करने के लिए 1 μm z-step अंतराल के साथ चित्रित किया गया था। प्रत्येक छवि में तीन चैनलों से डेटा होता है: चैनल 1 = डीएपीआई के लिए 405 एनएम उत्तेजना, चैनल 2 = 488 एनएम उत्तेजना ईजीएफपी के लिए, चैनल 3 = ब्राइटफील्ड के लिए संचारित प्रकाश। जैसा कि पिक्सेल तीव्रता को ब्राइटफील्ड छवियों में परिमाणित किया गया था, संचारित प्रकाश लैंप वोल्टेज सेटिंग्स को स्थिर रखा गया था और सांख्यिकीय तुलना के लिए एकत्र किए गए सभी डेटा को उसी दिन चित्रित किया गया था।

Confocal माइक्रोस्कोप z-स्टैक छवियों को स्वचालित परिमाणीकरण के लिए पूर्वसंसाधित किया गया था जैसा कि फिजी का उपयोग करके चरण 6 में वर्णित है। छवियों को प्रीप्रोसेसिंग और परिमाणीकरण से बाहर रखा गया था यदि ऊतक को इस तरह से समझौता किया गया था जो आरओआई पीढ़ी को मुश्किल बना देगा (उदाहरण के लिए, फाड़ने से (चित्र 7A; मैजेंटा एरोहेड्स) या मील का पत्थर बाधा (चित्र 7B; मैजेंटा अंडाकार)) या तिरछा आरओआई तीव्रता माप (उदाहरण के लिए, तह से )चित्र 7C; मैजेंटा अंडाकार))। इन बहिष्करण मानदंडों के साथ कुछ लार्वा को छोड़ने के बावजूद, यहां सभी डेटासेट जैविक प्रतिकृतियों (लार्वा) की निम्नलिखित संख्या के साथ एन = 3 का प्रतिनिधित्व करते हैं: एन = 11, डीएमएसओ एमटीजेड-; n = 10, IWR-1 MTZ-; n = 11, DMSO MTZ+; n = 12, IWR-1 MTZ+. DAPI चैनल का उपयोग करते हुए, RPE ROIs को पहले उस बिंदु की पहचान करके शुरू किया गया था जिस पर RPE (रेटिना-फेसिंग) का पृष्ठीय एपिकल पक्ष सीधे OLM के पृष्ठीय सिरे से सटे हुए थे (चित्र 3B',D'; नीले एरोहेड्स) (चरण 6.2.2)। चूंकि डिस्टल आरपीई एक्सटेंशन वर्गों के बीच भिन्न हो सकता है, इसलिए ओएलएम का उपयोग आरपीई आरओआई समापन बिंदुओं को मानकीकृत करने और MATLAB में कोणीय दूरी माप को सामान्य करने के लिए एक शारीरिक मील का पत्थर के रूप में किया गया था (जहां 0 ° = पृष्ठीय ROI समापन बिंदु और 180 ° = वेंट्रल ROI समापन बिंदु)। औषधीय हेरफेर के साथ या उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में आरपीई एब्लेशन करते समय, एक शारीरिक मील का पत्थर की पहचान की जानी चाहिए और प्रीप्रोसेसिंग और परिमाणीकरण से पहले मान्य किया जाना चाहिए। यहां, ओएलएम सभी लार्वा परिमाणित में स्पष्ट था और फाड़ने से समझौता नहीं किया गया था (जैसा कि चित्र 7B) या डीएमएसओ या आईडब्ल्यूआर -1 के साथ उपचार। पृष्ठीय प्रारंभिक बिंदु की पहचान करने के बाद, आरओआई को आरपीई (पृष्ठीय-से-वेंट्रल) के एपिकल पक्ष के बाद उत्पन्न किया गया था जब तक कि वेंट्रल ओएलएम की नोक से सटे बिंदु तक नहीं पहुंच गया था (चित्र 3B",D"; नीले एरोहेड्स)। फिर, एक वेंट्रल आरओआई समापन बिंदु आरपीई के एपिकल और बेसल (कोरॉइड-फेसिंग) पक्षों के बीच बनाया गया था जैसा कि चरण 6.2.3 में चर्चा की गई थी (चित्र 3B",D"; मैजेंटा लाइन)। आरओआई को आरपीई (वेंट्रल-टू-पृष्ठीय) के बेसल पक्ष के बाद जारी रखा गया था, जब तक कि पृष्ठीय ओएलएम पर शुरुआती बिंदु से सटे बेसल पक्ष तक नहीं पहुंच जाता। आरओआई को तब एक नुकीले पृष्ठीय अंत (नुकीले पृष्ठीय अंत) बनाकर संलग्न किया गया था।चित्र 3B',D'; मैजेंटा लाइन) के रूप में ventrally किया. आनुवांशिक एब्लेशन को केंद्रीय ईजीएफपी अभिव्यक्ति के नुकसान के परिणामस्वरूप दिखाया गया है जिसे पुनर्जनन आय के रूप में पुनर्प्राप्त किया जाता है (संक्षेप में चित्र 6)3; इस प्रकार, पुनर्जनन की सीमा और ब्याज के समय बिंदु पर ईजीएफपी की तीव्रता के आधार पर, ईजीएफपी चैनल केवल एमटीजेड में आरओआई पीढ़ी के लिए उपयोगी हो सकता है- समूह। इसलिए, जबकि confocal अधिग्रहण में eGFP चैनल छवियां भी शामिल थीं, ROI पीढ़ी को DAPI और brightfield चैनलों का उपयोग करके पूरा किया गया था जैसा कि चरण 6.2.3 में उल्लेख किया गया है। RPE ROI पीढ़ी DMSO में सीधा था- और IWR-1-इलाज MTZ- लार्वा समूहों और स्पष्ट रूप से pigmented एपिकल microvilli के साथ शामिल क्षेत्रों (चित्र 3B; लाल एरोहेड) प्रमुखता से पिगमेंटेड सेल निकायों के साथ। एक ही पैरामीटर MTZ करने के लिए लागू किए गए थे+ लार्वा समूहों (चित्रा 3D; लाल एरोहेड); हालांकि, चोट साइट के भीतर अवशिष्ट क्षतिग्रस्त ऊतक के कारण, एपिकल माइक्रोविली और रंजकता सीमाओं को कुछ मामलों में अकेले ब्राइटफील्ड चैनल में चित्रित करना मुश्किल था। इन क्षेत्रों में, डीएपीआई चैनल का उपयोग आरपीई चोट साइट के भीतर सेलुलर मलबे की पहचान करने के लिए भी किया गया था, जिसे आरओआई में शामिल किया गया था ।चित्र 3C,D; चोट साइट-स्थानीयकृत सेलुलर मलबे के उदाहरण सियान एरोहेड्स के साथ इंगित किए गए हैं)। अपरिपक्व / परिपक्व आरपीई (जैसे, ZPR2) के मार्करों के साथ immunostaining; चित्रा 6D, E)37 और / या फोटोरिसेप्टर (उदाहरण के लिए, ZPR1)37,38 एब्लेटेड लार्वा में आरपीई आरओआई को रेखांकित करने की सुविधा के लिए भी नियोजित किया जा सकता है।

इससे पहले, 4 डीपीएफ से 4 डीपीआई तक आईडब्ल्यूआर -1 के साथ इलाज किए गए एब्लेटेड लार्वा ने डीएमएसओ-उपचारित भाई नियंत्रण (चित्रा 8 सी) 3 की तुलना में आरपीई पुनर्जनन की महत्वपूर्ण हानि दिखाई। यह केंद्रीय वर्णक वसूली के प्रतिशत के रूप में रिपोर्ट किया गया था, जिसके लिए पुनर्जनन सीमाओं (चित्रा 8 बी; ब्लैक एरोहेड्स) को नामित करने के लिए कोणीय दूरी के मॉडल और मैनुअल माप के साथ पर्याप्त पूर्व अनुभव की आवश्यकता थी। RpEGEN को RPE पुनर्जनन के परिमाणीकरण को स्वचालित करने और आंतरिक पूर्वाग्रहों को कम करने के लिए बनाया गया था। इतना ही नहीं, RpEGEN ने अत्यधिक मजबूत डेटासेट की पीढ़ी को भी सक्षम किया; उदाहरण के लिए, 10 डेटा बिंदु पहले n = 10 DMSO-उपचारित MTZ + लार्वा (चित्रा 8C; % वर्णक वसूली प्रति अनुभाग माप) 3 के मैनुअल परिमाणीकरण से उत्पन्न किए गए थे, जबकि 174,801 डेटा बिंदुओं को n = 11 DMSO-उपचारित MTZ + लार्वा / ROIs से उत्पन्न किया गया था, यहां RpEGEN (चित्रा 9C; पिक्सेल तीव्रता माप) का उपयोग करके।

RpEGEN को आरपीई की संपूर्णता पर रंजकता में क्षेत्रीय परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए विकसित किया गया था, जो फिजी (चित्रा 4 ए, बी) का उपयोग करके उत्पन्न मूल आरओआई से एक कंकालीकृत सेंटरलाइन (1-पिक्सेल चौड़ाई) प्राप्त करता है। विश्लेषण के लिए ROI के भीतर सभी पिक्सेल को शामिल करने के लिए (यानी, न केवल सेंटरलाइन पिक्सेल), ROI मास्क में प्रत्येक पिक्सेल के लिए निकटतम सेंटरलाइन इंडेक्स का एक नक्शा बनाने के लिए सेंटरलाइन से प्रत्येक पिक्सेल पर एक यूक्लिडियन दूरी रूपांतरण किया गया था। सूचकांकों के इस मानचित्र ने सेंटरलाइन के बाहर प्रत्येक पिक्सेल को एकल सेंटरलाइन पिक्सेल के लिए जिम्मेदार ठहराया, जिससे प्रत्येक लार्वा (चित्रा 4 ई) के लिए पूरे आरपीई में एक व्यापक डेटासेट बनाया जा सकता है। आरपीई की पृष्ठीय-से-वेंट्रल लंबाई को कोणीय दूरी (चित्रा 4 जी; 0-180 डिग्री) द्वारा सामान्यीकृत पिक्सेल दूरी (चित्रा 4 एफ; 0-1 मनमाने ढंग से इकाइयों) के विपरीत दर्शाया गया था, क्योंकि यह आरपीई पुनर्जनन 3,4,5 के पिछलेमापों के आधार पर अधिक सहज था और तथ्य यह है कि कोणीय दूरी रूपात्मक अंतर के साथ भिन्न नहीं होती है। 5-डिग्री डिब्बे से व्युत्पन्न माध्यिका तीव्रता बड़े पैमाने पर रुझानों को उजागर करने और 1-डिग्री बिन्ड डेटा (तालिका 1, चित्रा 10 ए) में देखी गई उच्च आवृत्ति परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए चुने गए मीट्रिक थे। क्रमपरिवर्तन सिमुलेशन को यह देखने के लिए शून्य परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए चुना गया था कि क्या दो उपचार समूहों (यहां, DMSO MTZ + और IWR-1 MTZ + (दोनों 4 dpi), चित्रा 10B) के माध्यिकाएं समान हैं39। इस resampling तकनीक डेटा के वितरण के बारे में सख्त मान्यताओं का अभाव है और परीक्षण आंकड़ों की एक श्रृंखला पर इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, मतलब, माध्यिका, आदि) मजबूत पी-मूल्य अनुमान उत्पन्न करने के लिए। इन मापदंडों की एक संख्या (उदाहरण के लिए, कच्चे और माध्य डेटा के बिन आकार, क्रमपरिवर्तन सिमुलेशन repetitions, आदि) को अनुकूलित किया जा सकता है और उपयोगकर्ता की जरूरतों को फिट करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध के लिए, 20,000 पुनरावृत्तियों को सांख्यिकीय रूप से मजबूत तुलना उत्पन्न करने के लिए चुना गया था, हालांकि, सांख्यिकीय मजबूती के साथ कम्प्यूटेशनल दक्षता को संतुलित करने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए क्योंकि बहुत कम पुनरावृत्ति गलत पी-मूल्य अनुमानों का उत्पादन कर सकती है। यह अनुशंसा की जाती है कि कई पुनरावृत्ति मानों को चलाया जाए (10,000, 20,000, आदि) यह सुनिश्चित करने के लिए कि पी-मूल्य वितरण और मान व्याख्याशुरू करने से पहले अपेक्षाकृत स्थिर हैं। क्रमपरिवर्तन पुनरावृत्ति बढ़ने से सांख्यिकीय शक्ति में वृद्धि होगी (लेकिन इसे चलाने में भी अधिक समय लगेगा), जो कुछ डेटासेट के लिए फायदेमंद हो सकता है।

Confocal छवि डेटासेट को चरण 7 में वर्णित के रूप में RpEGEN का उपयोग करके परिमाणित किया गया था। एनोटेटेड RpEGEN और समर्थन स्क्रिप्ट GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) पर 8-बिट TIF और इच्छुक उपयोगकर्ताओं के लिए इसी ROI फ़ाइलों के साथ परीक्षण करने के लिए उपलब्ध हैं। एमटीजेड- लार्वा आरओआई से कच्चे डेटा को प्रदर्शित करने वाले हीटमैप्स ने गहरे पिक्सेल तीव्रता (जहां 0 = काला और 255 = सफेद, 8-बिट रंग पैमाने) का समग्र वितरण दिखाया, जो पृष्ठीय (0 डिग्री) से आरपीई की वेंट्रल (180 डिग्री) लंबाई तक फैला हुआ है, 0.06% वी / वी डीएमएसओ या 15 μM IWR-1 (चित्रा 9 ए, बी) के साथ उपचार की परवाह किए बिना। माध्यिका पिक्सेल तीव्रता की साजिश ने सभी समूहों के बीच विज़ुअलाइज़ेशन की सुविधा प्रदान की और आरपीई (चित्रा 10ए; काली और ग्रे लाइनों) में एमटीजेड-समूहों के बीच समानताएं दिखाईं। इन आंकड़ों ने एक अक्षुण्ण पिगमेंटेड आरपीई मोनोलेयर (चित्रा 9ई, एफ) की उपस्थिति का समर्थन किया और बेसलाइन माध्यिका पिक्सेल तीव्रता मान (यानी, 150 से नीचे) प्रदान किए, जो कि अबाधित आरपीई (चित्रा 10 ए; काली और ग्रे लाइनें) के लिए थे। तुलनात्मक रूप से, कच्चे (चित्रा 9 सी, डी) और औसत (चित्रा 10 ए; नीली और लाल रेखाएं) एमटीजेड + लार्वा आरओआई से डेटा ने केंद्रीय आरपीई में हल्के पिक्सेल तीव्रता का समग्र वितरण दिखाया, फिर से, उपचार की स्थिति की परवाह किए बिना। एब्लेटेड डीएमएसओ-उपचारित लार्वा ने लगभग 100 डिग्री (± 15 डिग्री) (चित्रा 9 सी; नारंगी-लाल डिब्बे) पर प्रकाश पिक्सेल का केंद्रीकृत वितरण दिखाया। यह ऑप्टिक तंत्रिका (चित्रा 9 जी; नीले एरोहेड्स) में / उसके आसपास केंद्रीय आरपीई चोट साइट में रंजकता की एक दृश्य अनुपस्थिति के अनुरूप था। Ablated IWR-1-उपचारित लार्वा ने प्रकाश पिक्सेल के केंद्रीकृत वितरण को भी दिखाया जो MTZ + DMSO-उपचारित भाई नियंत्रण (चित्रा 9 D; नारंगी-लाल डिब्बे) की तुलना में पृष्ठीय रूप से (लगभग 50 ° तक) और वेंट्रल रूप से (लगभग 5 ° तक) दोनों का विस्तार किया गया था। एक विस्तारित चोट साइट की उपस्थिति अनुभागित ऊतक (चित्रा 9 एच; नीले एरोहेड्स) में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रही थी। दो 1-डिग्री डिब्बे को छोड़कर, एमटीजेड + समूहों के बीच मनाया गया अंतर केंद्रीय आरपीई में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था (चित्रा 10 बी; ~ 40-140 डिग्री के बीच हल्के नीले छायांकित क्षेत्र; पी-मान ≤ 0.05), एमटीजेड + आईडब्ल्यूआर -1-उपचारित लार्वा में काफी कम केंद्रीय आरपीई रंजकता को दर्शाता है जब एमटीजेड + डीएमएसओ-उपचारित भाई-बहन नियंत्रण की तुलना में। RpEGEN का उपयोग करके सांख्यिकीय तुलना (चित्रा 10B) के साथ इन कच्चे (चित्रा 9C, D) और माध्यिका (चित्रा 10A) डेटा की व्याख्या न केवल अनुभागित ऊतक (चित्रा 9 G, H) को देखकर मान्य की गई थी, बल्कि मैनुअल परिमाणीकरण (चित्रा 8) 3 से पिछले निष्कर्षों का भी समर्थन किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: rpe65a: nfsB-eGFP ट्रांसजीन अभिव्यक्ति 5 दिनों के बाद निषेचन पर। (A-C) पीटीयू-उपचारित 5 डीपीएफ लार्वा की होलमाउंट छवियां पीनियल ग्रंथि (ए; पीले एरोहेड) में मंद ट्रांसजीन अभिव्यक्ति और आनुवंशिक एब्लेशन के लिए स्क्रीनिंग के समय आरपीई (बी, सी) में उज्ज्वल ट्रांसजीन अभिव्यक्ति दिखाती हैं। (बी) ट्रांसजीन अभिव्यक्ति स्पष्ट रूप से आरपीई के केंद्रीय दो-तिहाई के लिए स्थानीयकृत है, और सफेद एरोहेड परिधीय (अपरिपक्व) और केंद्रीय (परिपक्व) आरपीई के बीच की सीमा को उजागर करते हैं। हरा = eGFP. पूर्वकाल ऊपर है। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: विवो में आरपीई के सफल आनुवंशिक एब्लेशन का सत्यापन। (ए) तीन unablated (MTZ-) 7 dpf लार्वा की होलमाउंट छवियां आंखों में आरपीई पिगमेंटेशन दिखाती हैं और (बी) तीन एब्लेटेड (एमटीजेड +) 2 डीपीआई लार्वा एक एब्लेशन ज़ोन दिखाते हैं जहां आरपीई (लाल एरोहेड्स) के केंद्रीय दो-तिहाई में वर्णक की अनुपस्थिति होती है। पूर्वकाल ऊपर है। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: RpEGEN का उपयोग करके स्वचालित परिमाणीकरण के लिए ब्याज के आरपीई क्षेत्रों (आरओआई)। (ए, बी) के अनुप्रस्थ क्रायोसेक्शन एक अबाधित (एमटीजेड-) 9 डीपीएफ लार्वा और (सी, डी) एक एब्लेटेड (एमटीजेड +) 4 डीपीआई लार्वा के साथ आरपीई आरओआई मैजेंटा में हाइलाइट किया गया है। (B,D) लाल एरोहेड्स उन क्षेत्रों को उजागर करते हैं जहां स्पष्ट रूप से पिगमेंटेड एपिकल माइक्रोविली को आरओआई में शामिल किया गया था। (C,D) सियान एरोहेड्स चोट साइट-स्थानीयकृत डीएपीआई + मलबे के उदाहरण क्षेत्रों को इंगित करते हैं, जिसका उपयोग आरओआई में आरपीई सेल मलबे को शामिल करने के लिए किया गया था। (B', B", D', D") दोनों पृष्ठीय और ventral ROI क्षेत्रों (बी और डी में काले बिंदीदार बक्से) के डिजिटल ज़ूम से पता चलता है कि ROI शुरुआती अंक (नीले एरोहेड्स) और नुकीले ROI सिरों कि MATLAB में समापन बिंदु का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण हैं सुझाव दिया. ब्राइटफील्ड छवियों को चित्र 9E, G में भी दिखाया गया है। सफेद / ग्रे = नाभिक। पृष्ठीय ऊपर है और डिस्टल छोड़ दिया गया है। (A-D) स्केल बार = 40 μm. (B', B",D',D") स्केल बार = 10 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: RpEGEN प्रसंस्करण वर्कफ़्लो. (ए) एक ठीक से उन्मुख 8-बिट ब्राइटफील्ड छवि और फिजी-जनित ROI (लाल) MATLAB में आयातित का उदाहरण। पृष्ठीय ऊपर है और डिस्टल छोड़ दिया गया है। रंग पट्टी 8-बिट ग्रेस्केल तीव्रता मानों का प्रतिनिधित्व करती है जहां 0 = काला और 255 = सफेद। (बी) आरओआई मास्क (लाल) का प्रारंभिक बाइनरी कंकालीकरण (सफेद) गलत स्पर्स की उपस्थिति और जियोडेसिक पिक्सेल दूरी के चित्रण के लिए शुरुआत और अंत बिंदुओं का चित्रण दिखाता है जैसा कि (सी) में दिखाया गया है। (C) में रंग पट्टी यूक्लिडियन पिक्सेल दूरी का प्रतिनिधित्व करती है। (डी) स्पर्स को अंत पिक्सेल से शुरू पिक्सेल तक एक सरलीकृत कम लागत वाले मार्ग का उपयोग करके हटा दिया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप स्पर्स (लाल) से रहित एक निरंतर केंद्र रेखा होती है। (ई) आरओआई मास्क और सेंटरलाइन पिक्सेल (सफेद) में सभी पिक्सेल के बीच की दूरी के आधार पर निकटतम रैखिक सेंटरलाइन सूचकांक। ये अनुक्रमणिका मान ROI मास्क के भीतर प्रत्येक छवि पिक्सेल को विश्लेषण के लिए निकटतम centerline पिक्सेल को असाइन करने की अनुमति देते हैं. रंग पट्टी रैखिक centerline पिक्सेल अनुक्रमणिका मानों का प्रतिनिधित्व करता है। (एफ) सेंटरलाइन के साथ सामान्यीकृत पिक्सेल दूरी का एक उदाहरण, जहां 0 (नीला, डिस्टल-सबसे पृष्ठीय पिक्सेल) स्टार्ट पिक्सेल है और 1 (लाल, डिस्टल-सबसे वेंट्रल पिक्सेल) अंतिम पिक्सेल है। (जी) (एफ) के समान लेकिन कोणीय दूरी का उपयोग करके, जहां 0 डिग्री (नीला) शुरुआती पिक्सेल है और 180 डिग्री (लाल) अंतिम पिक्सेल है। (H) प्रत्येक centerline पिक्सेल के लिए परिकलित माध्यिका पिक्सेल तीव्रता मानों का उदाहरण. रंग पट्टी प्रत्येक दिए गए सेंटरलाइन पिक्सेल में योगदान करने वाले सभी ROI पिक्सेल के माध्य ग्रेस्केल तीव्रता मान का प्रतिनिधित्व करती है। यह आंकड़ा एक परीक्षण डेटासेट से इमेजरी दिखाता है और 0.06% v / v DMSO या 15 μM IWR-1 उपचार समूहों से लार्वा नहीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: आरपीई एब्लेशन और फोटोरिसेप्टर अध: पतन के सबूत। (ए) एक अबाधित 6 डीपीएफ लार्वा के अनुप्रस्थ क्रायोसेक्शन। (A,A') PTU के संपर्क में आने के बाद, ट्रांसजीन अभिव्यक्ति परिपक्व आरपीई कोशिकाओं तक सीमित है, जिसमें सबसे उज्ज्वल अभिव्यक्ति आरपीई के केंद्रीय दो-तिहाई तक सीमित है। एरोहेड्स एपिकल माइक्रोविली को इंगित करते हैं। (A") विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) छवियां सामान्य बाहरी परमाणु परत (ओएनएल; यानी, फोटोरिसेप्टर) वास्तुकला को प्रकट करती हैं। (B, B') एक 1 डीपीआई लार्वा के अनुप्रस्थ क्रायोसेक्शन ईजीएफपी + सेल आकृति विज्ञान के महत्वपूर्ण व्यवधान और ओएनएल लेमिनेशन में अव्यवस्था को प्रकट करते हैं। तीर delaminated और pyknotic नाभिक का संकेत देते हैं। (B") डीआईसी छवियां आगे ओएनएल आर्किटेक्चर के चिह्नित व्यवधान को प्रकट करती हैं। हरा = eGFP, नीला = नाभिक, पीला = ONL. पृष्ठीय ऊपर है और डिस्टल छोड़ दिया गया है। (ए) में स्केल बार 40 μm का प्रतिनिधित्व करता है और (बी) पर लागू किया जा सकता है। (A') में स्केल बार 40 μm का प्रतिनिधित्व करता है और (A", B', B") पर लागू किया जा सकता है। इस आंकड़े और आंकड़ा किंवदंती पाठ Hanovice et al. 2019 (चित्रा 1)3 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: लार्वा ज़ेबराफ़िश में आरपीई पुनर्जनन का मॉडल(A) nfsB-eGFP को आंख के केंद्रीय दो-तिहाई हिस्से में परिपक्व आरपीई में व्यक्त किया जाता है। (बी) एमटीजेड के आवेदन से आरपीई और फोटोरिसेप्टर के एपोप्टोसिस (ट्यूनेल, लाल) की ओर जाता है। (सी) आरपीई एब्लेशन फोटोरिसेप्टर और ब्रूच की झिल्ली (बिंदीदार रेखा) के अध: पतन की ओर जाता है। (डी) परिधि में बिना लपेटे वाले आरपीई को फैलना शुरू कर देता है और चोट स्थल (नीले रंग) में विस्तारित होता है। (ई) जैसा कि पुनर्जीवित ईजीएफपी + आरपीई परिधि में दिखाई देते हैं, आरपीई को चार क्षेत्रों में विभाजित किया जा सकता है: परिधीय आरपीई (पीआरपीई), विभेदित आरपीई (डीआरपीई), संक्रमण क्षेत्र (टीजेड), और चोट साइट (आईएस)। (ई, इनसेट) Regenerated विभेदित RPE (हरा) परिधि में unablated परिधीय RPE के समीपस्थ में प्रकट होता है, और संक्रमण क्षेत्र से सटे proliferative कोशिकाओं होते हैं। संक्रमण क्षेत्र में अभी भी-अलग आरपीई कोशिकाएं (ZPR2, लाल) और प्रोलिफेरेटिव कोशिकाएं (नीली) होती हैं। चोट साइट में अनपिगमेंटेड प्रोलिफेरेटिव कोशिकाएं शामिल हैं जो किसी भी आरपीई भेदभाव मार्करों को व्यक्त नहीं करती हैं। (एफ) एक कार्यात्मक आरपीई परत और ब्रुच की झिल्ली का पुनर्जनन 14 डीपीआई द्वारा पूरा होता है। इस आंकड़े और आंकड़ा किंवदंती पाठ Hanovice et al. 2019 (चित्रा 14)3 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: छवि विश्लेषण से बाहर रखे गए समझौता ऊतक वर्गों. (A-C) 0.06% v/v DMSO और 15 μM IWR-1 डेटासेट से लार्वा के अनुप्रस्थ क्रायोसेक्शन जो बहिष्करण मानदंडों को पूरा करते हैं। एक लार्वा पृष्ठीय आरपीई ऊतक फाड़ (ए; मैजेंटा एरोहेड्स) और दो अन्य लार्वा ऊतक तह दिखाते हैं जो या तो डीएपीआई चैनल (बी; मैजेंटा बिंदीदार अंडाकार) में एक शारीरिक मील का पत्थर (पृष्ठीय ओएलएम) को बाधित करता है या ब्राइटफील्ड चैनल (सी; मैजेंटा बिंदीदार अंडाकार) से आरपीई तीव्रता माप को तिरछा कर सकता है। सफेद / ग्रे = नाभिक। पृष्ठीय ऊपर है और डिस्टल छोड़ दिया गया है। स्केल बार = 40 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: IWR-1 का उपयोग करके औषधीय निषेध आरपीई पुनर्जनन को बाधित करता है। (ए) 0.06% v / v DMSO और (बी) 15 μM IWR-1 उपचार समूहों से ablated (MTZ +) 4 डीपीआई लार्वा के अनुप्रस्थ क्रायोसेक्शन। Brightfield छवियों (ए, बी) और प्रतिशत आरपीई वसूली / अनुभाग (सी) का परिमाणीकरण आईडब्ल्यूआर -1 उपचारित लार्वा (छात्र के अनपेयर टी-टेस्ट, *** पी < 0.0001) में एक पिगमेंटेड मोनोलेयर की वसूली में महत्वपूर्ण देरी दिखाता है। (बी) काले एरोहेड्स पुनरुत्पादक आरपीई के केंद्रीय-सबसे किनारे को इंगित करते हैं। पृष्ठीय ऊपर है और डिस्टल छोड़ दिया गया है। (बी) में स्केल बार 40 μm का प्रतिनिधित्व करता है और (ए) पर लागू किया जा सकता है। इस आंकड़े और आंकड़ा किंवदंती पाठ Hanovice एट अल से संशोधित किया गया है. 2019 (चित्र13)3. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: RpEGEN में RPE पुनर्जनन के स्वचालित परिमाणीकरण से कच्चे डेटा आउटपुट. (A-D) Heatmaps पूरे RPE ROI क्षेत्र से संकलित ब्राइटफील्ड पिक्सेल तीव्रता वितरण दिखा रहा है, पृष्ठीय (x-अक्षों; कोणीय दूरी = 0°) से वेंट्रल (x-अक्षों; कोणीय दूरी = 180°) तक, प्रत्येक डेटासेट में सभी लार्वा के लिए: (A) n = 11, DMSO MTZ-; (बी) एन = 10, आईडब्ल्यूआर -1 एमटीजेड-; (C) n = 11, DMSO MTZ+; (D) n = 12, IWR-1 MTZ+ (तीन स्वतंत्र माता-पिता समूहों से, N = 3)। उदाहरण के लिए, (A) 11 ROIs में 177,460 पिक्सेल से डेटा प्रदर्शित करता है. y-अक्षों पर, पिक्सेल तीव्रता को 8-बिट रंग पैमाने के आधार पर दिखाया गया है जहां 0 = काला और 255 = सफेद है। कच्चा डेटा 5-डिग्री (x-अक्ष) में 5-8-बिट तीव्रता मान (y-अक्ष) डिब्बे द्वारा प्रदर्शित किया जाता है जहां लाल = अधिकतम बिन गिनती और गहरा नीला = न्यूनतम बिन गिनती। (E-H) प्रतिनिधि (ई, एफ) unablated (MTZ-) 9 dpf लार्वा और (G, H) ablated (MTZ+) 0.06% v / v DMSO और 15 μM IWR-1 उपचार समूहों से 4 dpi लार्वा के अनुप्रस्थ cryosections। आरपीई आरओआई को मैजेंटा में हाइलाइट किया गया है और कोणीय दूरी चरम सीमाओं को इंगित किया गया है (0° = पृष्ठीय, 180° = वेंट्रल)। मोटे तौर पर, ये डेटा (ए, बी, ई, एफ) में गहरे पिक्सेल (0-150 के बीच तीव्रता मान) के वितरण को दिखाते हैं, जब (सी, डी, जी, एच) की तुलना में (सी, डी, जी, एच) की तुलना में अस्पष्ट आरओआई, उपचार की परवाह किए बिना। Ablated ROIs से डेटा (C,G) डीएमएसओ उपचार समूह में हल्के पिक्सेल (150-250 के बीच तीव्रता मान) के केंद्रीकृत (100° ± 15°) वितरण से पता चलता है कि (D,H) पृष्ठीय रूप से (~ 50°) और IWR-1-उपचारित लार्वा में थोड़ा वेंट्रलली (~ 5°) फैलता है। (G,H) इन केंद्रीय एब्लेशन क्षेत्रों अनुपस्थित वर्णक नीले एरोहेड्स द्वारा हाइलाइट किए जाते हैं। काले तीर ऑप्टिक तंत्रिका के स्थान को इंगित करते हैं। डीएमएसओ-उपचारित लार्वा से छवियां भी चित्र 3 में दिखाई गई हैं। स्केल बार = 40 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 10
चित्रा 10: समूह परिणाम और सांख्यिकीय तुलना RpEGEN में RPE पुनर्जनन के स्वचालित परिमाणीकरण से व्युत्पन्न. (A) प्रत्येक समूह के लिए कच्चे डेटा से व्युत्पन्न 5-डिग्री बिनन्ड माध्यिका मान और 95% आत्मविश्वास लिफाफे। प्लॉट MTZ- समूहों (काली और ग्रे रेखाओं) के बीच समानता दिखाता है पृष्ठीय (0 °) से वेंट्रल (180 °) आरपीई की लंबाई के बीच और केंद्रीय आरपीई (~ 40-140 डिग्री के बीच हल्के नीले छायांकित क्षेत्र) में एमटीजेड + समूहों (नीली और लाल रेखाओं) के बीच उल्लेखनीय अंतर के साथ। विशेष रूप से, किसी भी अन्य उपचार समूह की तुलना में आईडब्ल्यूआर -1 एमटीजेड + 4 डीपीआई में औसत पिक्सेल तीव्रता हल्की (0 = काली और 255 = सफेद) दिखाई देती है, जो केंद्रीय आरपीई रंजकता में कमी से मेल खाती है। (बी) DMSO MTZ + 4 dpi और IWR-1 MTZ + 4 dpi के लिए RPE के पृष्ठीय (0 °) से वेंट्रल (180 °) लंबाई के पार 1-डिग्री डिब्बे से व्युत्पन्न माध्यिका मानों की एक सांख्यिकीय तुलना (A) में अवलोकन को मजबूत करती है। पी-मानों की गणना 20,000 पुनरावृत्तियों के साथ एक क्रमपरिवर्तन सिमुलेशन और प्रत्येक 1-डिग्री बिन के लिए दो-तरफा परीक्षण का उपयोग करके की गई थी। शून्य परिकल्पना के तहत कि दोनों समूहों में किसी भी संबंधित 1-डिग्री बिन के लिए समान माध्यिका मान हैं, 0.05 ≤ एक पी-मान समूह माध्यिकाओं (धराशायी काली रेखा = 95% आत्मविश्वास अंतराल (सीआई)) के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करता है। केंद्रीय आरपीई (~ 40-140 डिग्री के बीच हल्के नीले छायांकित क्षेत्र) में पी-मानों ≤ 0.05 की उपस्थिति एब्लेटेड (एमटीजेड +) आईडब्ल्यूआर -1-उपचारित लार्वा में काफी कम रंजकता को इंगित करती है जब एब्लेटेड (एमटीजेड +) डीएमएसओ-उपचारित भाई नियंत्रण की तुलना में। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चर नाम चर प्रकार चर आकार चर विवरण
ROIname कोशिका {N x 1} संसाधित ROI फ़ाइलों के नाम
ROIxy कोशिका {N x 1} संसाधित प्रत्येक ROI फ़ाइल के लिए ROI शीर्ष
IMGname कोशिका {N x 1} संसाधित TIF छवि फ़ाइलों के नाम
IMG कोशिका {N x 1} संसाधित प्रत्येक TIF के लिए 8-बिट ब्राइटफील्ड छवि डेटा
ROIBW कोशिका {N x 1} तार्किक (0 या 1) IMG छवियों के रूप में एक ही आयाम के साथ ROI मुखौटा
CLine कक्ष w/ तालिकाएँ {N x 1} (n x 16) x, y, दूरी, कोण, अनुक्रमणिका, बिंदुओं के # और आँकड़ों सहित अलग-अलग छवियों के लिए Centerline डेटा
CIdx कोशिका {N x 1} ROI मास्क से संबंधित सेंटरलाइन सूचकांक डेटा CLine की गणना के लिए निकटतम centerline बिंदु को इंगित करता है
CLineBW कोशिका {N x 1} तार्किक (0 या 1) मैट्रिक्स IMG छवियों के रूप में एक ही आयाम के साथ centerline (= 1) के स्थान को इंगित करता है
RAW_data मेज़ N x 3 सभी अलग-अलग आईएमजी छवियों में आरओआई में प्रत्येक पिक्सेल के लिए सभी कच्चे डेटा का संयोजन तालिका
BIN_1_deg_all मेज़ N x 9 तालिका जिसमें 1-डिग्री बिनन्ड डेटा और आँकड़े शामिल हैं, जो RAW_data से डेटा का उपयोग करते हैं
BIN_5_deg_all मेज़ N x 9 तालिका से डेटा का उपयोग कर 5-डिग्री binned डेटा और आँकड़े युक्त RAW_data
BIN_10_deg_all मेज़ N x 9 तालिका से डेटा का उपयोग कर 10-डिग्री binned डेटा और आँकड़े युक्त RAW_data

तालिका 1: MAT फ़ाइल के लिए RpEGEN.m स्क्रिप्ट से निर्यात चर का विवरण। परिभाषाएं इस प्रकार हैं: ROI (s) = ब्याज के क्षेत्र (ओं); TIF = टैग की गई छवि फ़ाइल प्रारूप.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से आरपीई को कम करने और लार्वा-आयु वर्ग के ज़ेब्राफ़िश में अध: पतन और उत्थान के तंत्र का अध्ययन करने के लिए पद्धति का वर्णन करता है। यह प्रोटोकॉल वयस्क ज़ेब्राफ़िश3 में भी सफलतापूर्वक किया गया है, लेकिन कम व्यापक लक्षण वर्णन के साथ, यही कारण है कि लार्वा यहां ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। प्रोटोकॉल के इस भाग के महत्वपूर्ण पहलुओं (चरण 1-4) में शामिल हैं: 1) मेलानोजेनेसिस की शुरुआत से पहले भ्रूण में 1.5x पीटीयू जोड़ना, 2) 2-3 डीपीएफ पर पीटीयू-उपचारित भ्रूण को डिकोरियोनेट करना, 3) ईजीएफपी के लिए सावधानीपूर्वक स्क्रीनिंग, और 4) एमटीजेड के साथ आनुवंशिक एब्लेशन के दौरान पानी के परिवर्तन का समय। PTU मेलेनिन संश्लेषण21,22 को रोकता है और इस RPE एब्लेशन प्रतिमान में rpe65a के लिए स्क्रीनिंग की सुविधा के लिए उपयोग किया गया है: nfsB-eGFP ट्रांसजीन अभिव्यक्ति और आरपीई अपक्षयी और पुनर्योजी प्रक्रियाओं के लक्षण वर्णन को सक्षम करने के लिए क्रमशः अनुपस्थिति और बाद की वापसी के आधार पर,पिगमेंटेड ऊतक 3। जैसा कि पीटीयू आगे रंजकता को बाधित करेगा, लेकिन एक बार मेलानोजेनेसिस21 शुरू होने के बाद डिपिगमेंट ऊतकों को नहीं, पीटीयू को रंजकता की शुरुआत से पहले जोड़ा जाना चाहिए, जो ज़ेबराफ़िश25 में लगभग 24 एचपीएफ शुरू होता है। यहां, और पूर्वअध्ययनों में 4,5, मेलेनिन संश्लेषण शुरू होने से पहले निषेध सुनिश्चित करने के लिए पीटीयू को लगभग 6 एचपीएफ26 पर जोड़ा गया है। जबकि पीटीयू प्रमुख प्रोटोकॉल चरणों के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है, पीटीयू उपचार विकास के कुछ पहलुओं को प्रभावित कर सकता है (जैसा कि चरण 2.3 में चर्चा की गई है) और भ्रूण हैचिंग को खराब कर सकता है। उत्तरार्द्ध प्रक्रिया, यदि बहुत लंबे समय तक देरी होती है, तो आकृति विज्ञान और गतिशीलता घाटे को जन्म दे सकती है और व्यवहार्यता40 को प्रभावित कर सकती है; इस प्रकार, dechorionating (हैचिंग) भ्रूण या तो pronase के साथ enzymatically या मैन्युअल रूप से 2-3 dpf पर संदंश का उपयोग आनुवंशिक एब्लेशन से पहले लार्वा स्वास्थ्य को बनाए रखने और मानकीकृत करने के लिए महत्वपूर्ण है। पुराने लार्वा स्वास्थ्य और व्यवहार्यता (पीटीयू-उपचार से असंबंधित) के साथ मुद्दों से बचने के लिए एक और महत्वपूर्ण विचार यह है कि लार्वा को मानकीकृत फीडिंग रेजिमेंस शुरू करना चाहिए यदि प्रयोगों के लिए 9 डीपीएफ / 4 डीपीआई पिछले जलीय सुविधा प्रणाली से बाहर रहनाचाहिए।

जैसा कि समझाया गया है, rpe65a पीछे की आंख के केंद्रीय दो-तिहाई में परिपक्व आरपीई में ट्रांसजीन अभिव्यक्ति को चलाता है। पीटीयू-उपचारित 5 डीपीएफ लार्वा में ईजीएफपी की अभिव्यक्ति आमतौर पर आसानी से पता लगाई जाती है और स्पष्ट रूप से तीव्र (उज्ज्वल) होती है, जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है। लार्वा जो उज्ज्वल अभिव्यक्ति वाले भाई-बहनों की तुलना में 5 डीपीएफ पर ईजीएफपी को मंद रूप से व्यक्त करते हैं, उन्हें भी देखा जा सकता है। पीढ़ियों के बीच अभिव्यक्ति तीव्रता अनुपात (यानी, उज्ज्वल बनाम मंद) में भिन्नता भी मौजूद हो सकती है, कुछ पीढ़ियों में दूसरों की तुलना में लार्वा को अधिक मंद रूप से व्यक्त किया जाता है। किसी भी मामले में, मंद ईजीएफपी अभिव्यक्ति के साथ लार्वा आमतौर पर प्रत्येक क्लच में जानवरों के अल्पसंख्यक का प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि यह अज्ञात है कि क्या लार्वा को कम गंभीर आरपीई चोट फेनोटाइप दिखाते हैं, प्रत्येक क्लच से उज्ज्वल ईजीएफपी + कोहोर्ट में एब्लेशन किया गया है और तुलनात्मक रूप से मंद भाई-बहनों को स्क्रीनिंग में euthanized किया गया है और विश्लेषण से बाहर रखा गया है। इसी तरह, ज़ेब्राफ़िश आरपीई एब्लेशन और पुनर्जनन फेनोटाइप्स के व्यापक लक्षण वर्णन को लार्वा विषमयुग्मजी में rpe65a के लिए किया गया है: nfsB-eGFP ट्रांसजीन, rpe65a: nfsB-eGFP विषमयुग्मजी वयस्कों को वाइल्डटाइप वयस्कों के लिएआउटक्रॉसिंग करके। हालांकि, यह संभावना नहीं है, यह ज्ञात नहीं है, कि क्या rpe65a के लिए लार्वा होमोजीगस: nfsB-eGFP अधिक गंभीर एब्लेशन फेनोटाइप दिखाते हैं। एब्लेशन प्रोटोकॉल को मानकीकृत करने के अन्य प्रयासों में 24 घंटे की आनुवंशिक एब्लेशन अवधि के दौरान एमटीजेड- और एमटीजेड + व्यंजनों के लिए समान, मापा मात्रा (उदाहरण के लिए, 30 एमएल प्रति 10 सेमी पेट्री डिश) को जोड़ना शामिल है। इसी तरह, औषधीय उपचार व्यंजनों में लार्वा को समान, मापा मात्रा (उदाहरण के लिए, 5 एमएल प्रति 6-अच्छी तरह से) और ताजा यौगिकों (जैसे, हर 24 घंटे) की समय पर पुनःपूर्ति प्राप्त हुई है। विभिन्न एमटीजेड और / या औषधीय यौगिक उपचारों के साथ व्यंजनों को संभालते समय, परिवहन और पानी के परिवर्तनों के दौरान फैलते और अनजाने में क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए सावधानीपूर्वक उपाय किए जाने चाहिए।

ज़ेब्राफ़िश आरपीई एब्लेशन प्रोटोकॉल को औषधीय हेरफेर (चरण 5) को शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। यह पहले आरपीई पुनर्जनन के महत्वपूर्ण नियामकों के रूप में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया5, एमटीओआर4, और डब्ल्यूएनटी3 सिग्नलिंग मार्गों की पहचान करने के लिए किया गया है; उत्तरार्द्ध को यहां दोहराए जाने योग्य दिखाया गया है और इसका उपयोग RpEGEN को मान्य करने के लिए किया गया था। महत्वपूर्ण आरपीई पुनर्जनन मार्गों को रोशन करने के अलावा, फार्माकोलॉजिकल हेरफेर को व्यापक रूप से ज़ेब्राफ़िश रेटिना पुनर्जनन अध्ययन 10,42,43,44,45,46,47 के लिए नियोजित किया गया है। आरपीई एब्लेशन प्रोटोकॉल में शामिल होने से पहले, औषधीय एजेंटों को विषाक्तता, प्रभावकारिता और उपचार की अवधि के लिए कड़ाई से मूल्यांकन किया जाना चाहिए। यह द्वारा किया जा सकता है: विषाक्तता48 का आकलन करने के लिए खुराक प्रतिक्रिया प्रयोगों का प्रदर्शन; ज्ञात लक्ष्य जीन / प्रोटीन 4,5 की अभिव्यक्ति का आकलन; और औषधीय हेरफेर के ज्ञात कार्यात्मक परिणामों का मूल्यांकन करते हुए, उदाहरण के लिए, PLX3397 उपचार 48,49,50,51 के साथ ल्यूकोसाइट्स की कमी। यहां, डीएमएसओ (वाहन नियंत्रण) और आईडब्ल्यूआर -1 को आनुवंशिक एब्लेशन से पहले 24 घंटे जोड़ा गया था और लार्वा को 4 डीपीएफ पर औषधीय pretreatment से तुरंत पहले जांच की गई थी। जबकि ईजीएफपी + लार्वा 4 डीपीएफ पर ईजीएफपी- लार्वा से अलग हैं, ईजीएफपी की तीव्रता काफी मंद दिखाई दे सकती है, यही कारण है कि लार्वा को 5 डीपीएफ (प्रतिनिधि परिणाम) पर ईजीएफपी अभिव्यक्ति के लिए फिर से जांचा गया था। 4 डीपीएफ से पहले ईजीएफपी के लिए स्क्रीनिंग मुश्किल हो सकती है क्योंकि अभिव्यक्ति इतनी कम हो सकती है कि आंखों का पता नहीं लगाया जा सके। इस प्रकार, 4 dpf (यानी, 2 dpf पर) 4 से पहले औषधीय एजेंटों के साथ pretreatment को unscreened लार्वा में जोड़ा जा सकता है जो eGFP के स्पष्ट रूप से दिखाई देने पर 5 dpf पर अलग किया जाएगा। किसी भी परिदृश्य में जहां लार्वा को हेरफेर करने की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, स्क्रीनिंग के दौरान, इमेजिंग के लिए एम्बेडिंग, आदि), औषधीय उपचार की स्थिति को बनाए रखा जाना चाहिए और स्क्रीनिंग उम्र की परवाह किए बिना, आरपीई को 5 डीपीएफ पर एमटीजेड के साथ एब्लेटेड किया जाना चाहिए।

आनुवांशिक एब्लेशन प्रोटोकॉल के अलावा, RpEGEN का उपयोग करके आरपीई पुनर्जनन के कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप छवि प्रीप्रोसेसिंग और स्वचालित परिमाणीकरण के लिए चरण-दर-चरण निर्देशों को रेखांकित किया गया है (चरण 6-7)। RpEGEN को उपयोगकर्ताओं में आरपीई पुनर्जनन परिमाणीकरण को मानकीकृत करने और आउटपुट डेटासेट की मजबूती बढ़ाने के लिए बनाया गया था, जबकि आंतरिक पूर्वाग्रहों को कम किया गया था जो पहले किए गए थकाऊ मैनुअल परिमाणीकरण के साथ आ सकते हैं। प्रोटोकॉल के इस हिस्से के महत्वपूर्ण पहलुओं को ROI पीढ़ी (चरण 6) के दौरान किया जाता है। सबसे पहले, छवि / आंख को पृष्ठीय ऊपर, डिस्टल बाएं अभिविन्यास (उदाहरण के लिए, चित्रा 3 ए-डी, चित्रा 4) में होना चाहिए क्योंकि RpEGEN को इस दिशात्मकता के लिए अनुकूलित किया गया है। यह भी महत्वपूर्ण है कि आरपीई आरओआई के पृष्ठीय और वेंट्रल टर्मिनल सिरों को एक नुकीली टिप पर टेपर किया जाता है जैसा कि चित्र 3 बी', बी ", डी', डी" (मैजेंटा लाइनों) में दिखाया गया है। यदि इन सिरों को इसके बजाय वर्गीकृत या गोल किया जाता है, तो RpEGEN स्क्रिप्ट को सेंटरलाइन कंकाल प्रारंभ और अंत पिक्सेल का निर्धारण करने में कठिनाई हो सकती है और एक केंद्रीकृत रेखा (चित्रा 4 B) के बजाय टर्मिनल ROI सिरों पर स्पर्स उत्पन्न कर सकती है। टर्मिनल ROI सिरों पर स्पर्स डी-स्परिंग (चित्रा 4 डी) और / या परिधीय आरपीई (चित्रा 4 जी) में कोणीय दूरी माप के साथ मुद्दों के दौरान सेंटरलाइन को छोटा करने का कारण बन सकता है। प्रत्येक व्यक्तिगत लार्वा के अनुरूप TIF और ROI फ़ाइलों के लिए समान नामकरण प्रणाली भी एक महत्वपूर्ण कदम है और RpEGEN में सही ROI के साथ 8-बिट TIF फ़ाइल को जोड़ने के लिए अनिवार्य है। बेमेल TIF और ROI फ़ाइल नाम प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग (चित्रा 4) में उल्लिखित RpEGEN संसाधन वर्कफ़्लो जनरेट करने में विफलता के परिणामस्वरूप होगा और, अंततः, इस स्क्रिप्ट का उपयोग करके RPE पुनर्जनन परिमाणीकरण को रोकें।

सामूहिक रूप से, यह प्रोटोकॉल लार्वा ज़ेब्राफ़िश में आरपीई को सफलतापूर्वक कम करने के लिए निर्देश प्रदान करता है, सिग्नलिंग मार्गों में हेरफेर करने के लिए जो पूर्व-, दौरान, या बाद में आरपीई चोट के ब्याज के हो सकते हैं, और सीमित अंतर्निहित पूर्वाग्रहों के साथ एक मानकीकृत तरीके से आरपीई पुनर्जनन को मापने के लिए। विवो और इन विट्रो मॉडल में उपलब्ध के संदर्भ में जिसमें आरपीई की पुनर्योजी क्षमता का अध्ययन करने के लिए, ज़ेबराफ़िश आंतरिक आरपीई पुनर्जनन14 के लिए अपनी क्षमता में अद्वितीय है। हालांकि, यह आरपीई चोट का एक तीव्र मॉडल है, जो पुरानी नहीं है क्योंकि चिकित्सीय विकास (जैसे, एएमडी) के लिए लक्षित आरपीई अपक्षयी रोग हैं। हालांकि यह मॉडल की एक सीमा है, यह एक उत्कृष्ट मंच बना हुआ है जिसमें आरपीई पुनर्जनन के तंत्र का अध्ययन करना है, जो काफी हद तक अज्ञात हैं, और भविष्य में पुरानी चोट और बीमारी का अध्ययन करने के लिए अनुकूलनीय हो सकते हैं। यहां वर्णित उपकरण और पद्धति बहुमुखी हैं और अपक्षयी प्रतिक्रिया में शामिल सेलुलर प्रक्रियाओं के अध्ययन और आरपीई-आसन्न ऊतकों के भाग्य का अध्ययन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है। इसी तरह, RpEGEN स्क्रिप्ट को उपयोगकर्ता डेटा आउटपुट की जरूरतों को फिट करने के लिए संशोधित किया जा सकता है; उदाहरण के लिए, वर्णक के अलावा अन्य मार्करों के स्थानिक विश्लेषण करने के लिए (उदाहरण के लिए, सीटू संकरण जांच, प्रोटीन अभिव्यक्ति, आदि में)।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

एल.एल.एल. यूएस पेटेंट # 9,458,428 पर सह-आविष्कारक है, जो मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम प्राप्त करने के लिए एक त्वरित विधि का वर्णन करता है; यह यहाँ की सामग्री से असंबंधित है. जे.एम.जी. और जी.बी.एफ. के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यहां वर्णित कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था (RO1-EY29410 J.M.G के लिए, और NIH CORE अनुदान P30-EY08098 नेत्र विज्ञान विभाग के लिए); UPMC Immune Transplant & Therapy Center (L.L.L. और J.M.G. के लिए); और नेत्र विज्ञान अनुसंधान में ई रोनाल्ड सालविटी चेयर (जे.एम.जी. के लिए)। नेत्र विज्ञान में विगैंड फैलोशिप (एलएलएल के लिए), पिट्सबर्ग के आई एंड ईयर फाउंडेशन, और अंधापन, न्यूयॉर्क, एनवाई को रोकने के लिए अनुसंधान से एक अप्रतिबंधित अनुदान से अतिरिक्त समर्थन प्राप्त हुआ था। लेखक भी तकनीकी सहायता के लिए अमांडा प्लैट और उत्कृष्ट पशु देखभाल समर्थन के लिए डॉ ह्यूग हैमर और एक्वाटिक्स स्टाफ को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) Millipore Sigma D9542
6-well plates Fisher Scientific 07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 05-539-13 Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing pen Fisher Scientific 50-254-51 Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % Fisher Scientific BP231 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large) Fisher Scientific 3720A
Embryo incubator (mini/tabletop) Labnet I5110A
Fluorescence stereo microscope Zeiss Axio Zoom.V16 Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-4 Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo Millipore Sigma 5.04462 Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder) Fisher Scientific BP117-100 Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ) Millipore Sigma M3761 Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU) Millipore Sigma P7629 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free Fisher Scientific AA433689M Chemical waste, proper disposal required
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 10 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets) Millipore Sigma P3813 Used to make 10 X PBS stock
Pronase Millipore Sigma PRON-RO
Shaking incubator Benchmark H2010 Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscope Leica S9i Or similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forceps Fine Science Tools 91150-20 Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shaker Scilogex SK-D1807-E
Transfer pipette Millipore Sigma Z135003 3.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Pentair TRS1, TRS2, TRS5 Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ) FIJI (Fiji is Just ImageJ) https://imagej.net/software/fiji/ Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tos MathWorks https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB support MathWorks https://www.mathworks.com/support.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
  3. Hanovice, N. J., et al. Regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium after widespread genetic ablation. PLoS Genetics. 15 (1), 1007939 (2019).
  4. Lu, F., Leach, L. L., Gross, J. M. mTOR activity is essential for retinal pigment epithelium regeneration in zebrafish. bioRxiv. , (2021).
  5. Leach, L. L., Hanovice, N. J., George, S. M., Gabriel, A. E., Gross, J. M. The immune response is a critical regulator of zebrafish retinal pigment epithelium regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (21), (2021).
  6. Zenno, S., Koike, H., Tanokura, M., Saigo, K. Gene cloning, purification, and characterization of nfsb, a minor oxygen-insensitive nitroreductase from escherichia coli, similar in biochemical properties to frase I, the major flavin reductase in vibrio fischeri. The Journal of Biochemistry. 120 (4), 736-744 (1996).
  7. Hamel, C. P., et al. Molecular cloning and expression of rpe65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post-transcriptionally regulated in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15751-15757 (1993).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
  10. White, D. T., et al. Immunomodulation-accelerated neuronal regeneration following selective rod photoreceptor cell ablation in the zebrafish retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 3719-3728 (2017).
  11. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
  12. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. The Journal of Comparative Neurology. 518 (6), 800-814 (2010).
  13. Hagerman, G. F., et al. Rapid recovery of visual function associated with blue cone ablation in zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0166932 (2016).
  14. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).
  15. Chiba, C., et al. Visual cycle protein rpe65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt. The Journal of Comparative Neurology. 495 (4), 391-407 (2006).
  16. Yoshii, C., Ueda, Y., Okamoto, M., Araki, M. Neural retinal regeneration in the anuran amphibian xenopus laevis post-metamorphosis: Transdifferentiation of retinal pigmented epithelium regenerates the neural retina. Developmental Biology. 303 (1), 45-56 (2007).
  17. Xia, H., Krebs, M. P., Kaushal, S., Scott, E. W. Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in mrl/mpj mice. Experimental Eye Research. 93 (6), 862-872 (2011).
  18. McGill, T. J., et al. Subretinal transplantation of human central nervous system stem cells stimulates controlled proliferation of endogenous retinal pigment epithelium. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 43 (2019).
  19. Salero, E., et al. Adult human rpe can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
  20. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature Chemical Biology. 5 (2), 100-107 (2009).
  21. Whittaker, J. R. An analysis of melanogenesis in differentiating pigment cells of ascidian embryos. Developmental Biology. 14 (1), 1-39 (1966).
  22. Westerfield, M. Zebrafish Book, 5th Edition; A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregon, USA. (2007).
  23. Hammer, H. S. Water quality for zebrafish culture in The Zebrafish in Biomedical Research. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. 321-335 (2020).
  24. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  25. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  26. Camp, E., Lardelli, M. Tyrosinase gene expression in zebrafish embryos. Development Genes and Evolution. 211 (3), 150-153 (2001).
  27. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  28. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PloS One. 7 (6), 40132 (2012).
  29. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and igf signaling. PLoS One. 6 (8), 22991 (2011).
  30. Leary, S., et al. Avma Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , American veterinary medical association. Schaumburg, Illinois, USA. (2020).
  31. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on cryosections from embryonic and adult zebrafish eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, 4779 (2007).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Muir, D. GitHub - ReadImageJROI. , Available from: https://github.com/DylanMuir/ReadImageJROI (2021).
  34. Morel, P. Gramm: Grammar of graphics plotting in matlab. Journal of Open Source Software. 3 (23), 568 (2018).
  35. Reinhardt, R., et al. Sox2, tlx, gli3, and her9 converge on rx2 to define retinal stem cells in vivo. The EMBO Journal. 34 (11), 1572-1588 (2015).
  36. Schonthaler, H. B., et al. Evidence for rpe65-independent vision in the cone-dominated zebrafish retina. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1940-1949 (2007).
  37. Yazulla, S., Studholme, K. M. Neurochemical anatomy of the zebrafish retina as determined by immunocytochemistry. Journal of Neurocytology. 30 (7), 551-592 (2001).
  38. Larison, K. D., Bremiller, R. Early onset of phenotype and cell patterning in the embryonic zebrafish retina. Development. 109 (3), 567-576 (1990).
  39. Dwass, M. Modified randomization tests for nonparametric hypotheses. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (1), 181-187 (1957).
  40. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: A refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  41. Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
  42. Meyers, J. R., et al. Β-catenin/wnt signaling controls progenitor fate in the developing and regenerating zebrafish retina. Neural Development. 7, 30 (2012).
  43. Tappeiner, C., et al. Inhibition of the tgfβ pathway enhances retinal regeneration in adult zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0167073 (2016).
  44. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, o-phospho-l-serine, suppresses müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Experimental Eye Research. 91 (5), 601-612 (2010).
  45. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (38), 15858-15863 (2011).
  46. Lemmens, K., et al. Matrix metalloproteinases as promising regulators of axonal regrowth in the injured adult zebrafish retinotectal system. The Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1472-1493 (2016).
  47. Elsaeidi, F., Bemben, M. A., Zhao, X. F., Goldman, D. Jak/stat signaling stimulates zebrafish optic nerve regeneration and overcomes the inhibitory actions of socs3 and sfpq. The Journal of Neuroscience. 34 (7), 2632-2644 (2014).
  48. Van Dyck, A., et al. Müller glia-myeloid cell crosstalk accelerates optic nerve regeneration in the adult zebrafish. Glia. 69 (6), 1444-1463 (2021).
  49. Conedera, F. M., Pousa, A. M. Q., Mercader, N., Tschopp, M., Enzmann, V. Retinal microglia signaling affects müller cell behavior in the zebrafish following laser injury induction. Glia. 67 (6), 1150-1166 (2019).
  50. Chen, S., Lathrop, K. L., Kuwajima, T., Gross, J. M. Retinal ganglion cell survival after severe optic nerve injury is modulated by crosstalk between jak/stat signaling and innate immune responses in the zebrafish retina. Development. 149 (8), (2022).
  51. de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Marro, J., Jaźwińska, A. Distinct effects of inflammation on preconditioning and regeneration of the adult zebrafish heart. Open Biology. 6 (7), 160102 (2016).

Tags

जीव विज्ञान अंक 181 ज़ेब्राफ़िश रेटिना वर्णक उपकला नाइट्रोरिडक्टेस मेट्रोनिडाज़ोल आनुवंशिक एब्लेशन पुनर्जनन रंजकता औषधीय यौगिकों RpEGEN
नाइट्रोरिडक्टेस / मेट्रोनिडाज़ोल-मध्यस्थता एब्लेशन और ज़ेब्राफ़िश रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम के पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए एक MATLAB प्लेटफ़ॉर्म (RpEGEN)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross,… More

Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross, J. M. Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (181), e63658, doi:10.3791/63658 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter