Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Nitroreductase/Metronidazole-Mediert ablasjon og en MATLAB-plattform (RpEGEN) for å studere regenerering av Sebrafish Retinal Pigment Epithelium

Published: March 2, 2022 doi: 10.3791/63658
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Ophthalmology, Louis J. Fox Center for Vision Restoration, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Earth Research Institute, University of California, Santa Barbara, 3Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Denne protokollen beskriver metodikken for å genetisk fyre opp retinal pigment epitel (RPE) ved hjelp av en transgen sebrafiskmodell. Tilpasning av protokollen for å inkorporere signalveimodulering ved hjelp av farmakologiske forbindelser er omfattende detaljert. En MATLAB-plattform for kvantifisering av RPE-regenerering basert på pigmentering ble utviklet og presentert og diskutert.

Abstract

Retinal pigment epitel (RPE) ligger på baksiden av øyet og utfører funksjoner som er avgjørende for å opprettholde helsen og integriteten til tilstøtende retinal og vaskulært vev. For tiden har den begrensede reparative kapasiteten til pattedyr RPE, som er begrenset til små skader, hindret fremgang i å forstå in vivo RPE regenerative prosesser. Her er det gitt en detaljert metodikk for å lette studiet av in vivo RPE-reparasjon ved hjelp av sebrafisken, en virveldyrmodell som er i stand til robust vevregenerering. Denne protokollen beskriver en transgen nitroreductase/metronidazol (NTR/MTZ)-mediert skadeparadigme (rpe65a:nfsB-eGFP), som resulterer i ablasjon av de sentrale to tredjedeler av RPE etter 24 timers behandling med MTZ, med påfølgende vevsgjenvinning. Fokus er plassert på RPE-ablasjoner i larval sebrafisk og metoder for å teste effekten av farmakologiske forbindelser på RPE-regenerering er også skissert. Generering og validering av RpEGEN, et MATLAB-skript opprettet for å automatisere kvantifisering av RPE-regenerering basert på pigmentering, diskuteres også. Utover aktive RPE-reparasjonsmekanismer kan denne protokollen utvides til studier av RPE-degenerasjon og skaderesponser, samt effekten av RPE-skade på tilstøtende netthinne- og vaskulært vev, blant andre cellulære og molekylære prosesser. Dette sebrafisksystemet har et betydelig løfte om å identifisere gener, nettverk og prosesser som driver RPE-regenerering og RPE sykdomsrelaterte mekanismer, med det langsiktige målet om å anvende denne kunnskapen på pattedyrsystemer og til slutt mot terapeutisk utvikling.

Introduction

Metodikken beskrevet heri beskriver en protokoll for genetisk å fyre opp retinal pigment epitel (RPE) ved hjelp av larval sebrafisk. RPE strekker seg over baksiden av øyet og ligger mellom de stratifiserte lagene i nevral netthinnen og laget av vaskulatur som utgjør koroiden. Trofisk støtte, absorpsjon av fototoksisk lys og vedlikehold av visuelle syklusproteiner er bare noen av de kritiske funksjonene RPE utfører som er avgjørende for å opprettholde helsen og integriteten til disse tilstøtende vevene1. Skade på pattedyr RPE er reparerbar når lesjoner er små2; Imidlertid er skade forårsaket av større skader eller progressiv degenerativ sykdom irreversibel. Hos mennesker fører RPE degenerative sykdommer (f.eks. aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) og Stargardt sykdom) til permanent synstap og, med få behandlingsalternativer tilgjengelig, redusert pasientkvalitet på livet. Den begrensede evnen for pattedyr RPE til selvreparasjon har skapt et kunnskapsgap innen RPE regenerative prosesser. Gitt den robuste regenerative kapasiteten til sebrafisken på tvers av mange forskjellige vevstyper, ble denne protokollen utviklet for å etablere et in vivo vertebratsystem for å lette studier på iboende regenerering av RPE og avdekke mekanismer som driver den responsen. Ved hjelp av ablasjonsparadigmet som er skissert her, har den kanoniske Wnt-signalveien3, mTOR-bane4 og immunrelaterte responser5 blitt identifisert som kritiske formidlere av RPE-regenerering, sannsynligvis med overlappende funksjoner.

I dette genetiske ablasjonsparadigmet uttrykker Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 sebrafisk det bakterieavledede nitroreductase (NTR/nfsB) gen6 smeltet sammen til eGFP under kontroll av RPE-forsterkerelementet, rpe65a7. Ablasjon oppnås ved å legge til prodrug, metronidazol (MTZ), til systemvannhus sebrafisk. Intracellulær aktivering av MTZ ved nitroreductase resulterer i DNA-krysskobling og apoptose i NTR/nfsB-uttrykkende celler 8,9. Denne teknologien har blitt mye brukt i sebrafisk for å fyre opp celler i netthinnen 10,11,12,13 og andre vev 8. Sammen muliggjør disse elementene målrettet uttrykk (rpe65a) av en induserbar celleablasjonsmetodikk (NTR/MTZ)8,9 og en fluorescerende markør (eGFP) for visualisering.

Andre interessante in vivo-modeller eksisterer også som kan brukes til å studere det regenerative potensialet til RPE14. Disse er brede og inkluderer RPE-til-netthinne transdifferentiation post-retinectomy i amfibier, der RPE celler tapt til retinal gjenvekst erstattes 15,16; RPE restaurering etter skade i "super healing" MRL / MpJ mus17; og eksogen stimulering av RPE-spredning i en rottemodell av spontan RPE og retinal degenerasjon18, blant andre. In vitro-modeller, som voksne humane RPE stamceller (RPESCs)19, er også utviklet. Disse modellene er alle verdifulle verktøy som arbeider for å avdekke cellulære prosesser relatert til RPE-regenerering (f.eks. spredning, differensiering, etc.); Sebrafisken er imidlertid unik i sin kapasitet for egen RPE-reparasjon etter ablasjon.

Mens metodikken her er skrevet for å fokusere på å forstå mekanismene som driver RPE-regenerering, kan Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)- linjen og denne genetiske ablasjonsprotokollen brukes til å studere andre cellulære prosesser som RPE-apoptose, RPE-degenerasjon og effekten av RPE-skade på tilstøtende retinal og vaskulært vev. Ablasjonsprotokollen kan også endres for å inkludere farmakologisk manipulasjon, som er en praktisk foreløpig strategi for å screene signalveier av interesse. For eksempel har blokkering av den kanoniske Wnt-banen ved hjelp av Inhibitor of Wnt Response-1 (IWR-1)20 vist seg å svekke RPE-regenerering3. Dette ble gjentatt her for å veilede brukere gjennom et farmakologisk manipulasjonseksperiment og tjene som konseptgodkjenning for å validere et MATLAB-skript (RpEGEN) opprettet for å kvantifisere RPE-regenerering basert på utvinning av pigmentering. I likhet med den transgene linjen og ablasjonsprotokollen, kan RpEGEN-skriptene tilpasses og kan brukes til å kvantifisere andre markører / cellulære prosesser i RPE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder som er skissert her, er i samsvar med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Pittsburgh.

1. Tilberedning før sebrafisk embryosamling

  1. Sett embryoinkubatoren til 28,5 °C.
  2. Forbered en 25x lagerløsning av melanogenesehemmeren, N-fenylthiourea (PTU)21,22. Denne lagerløsningen er skalert fra en vanlig oppskrift22 og 1x er lik 0,003% vekt per volum (% m / v) (f.eks. 0,003 g PTU pulver i 100 ml flytende løsningsmiddel).
    1. For å lage en stor 25x PTU lagerløsning, tilsett 0,75 g PTU pulver til 1 L renset deionisert vann (heretter referert til som dH2O) og bland grundig ved romtemperatur (~ 25 °C) ved hjelp av en rørestang og røreplate. Oppbevars ved 4 °C i opptil 3 måneder beskyttet mot lys.
      MERK: Det er vanskelig å få PTU til å gå inn i vandig løsning, og utvidet omrøring over natten kan være nødvendig.
      FORSIKTIG: PTU er farlig, og det må utvises forsiktighet for å forhindre inntak, innånding og/eller kontakt med hud eller øyne. PTU pulver og alle PTU flytende derivater beskrevet her må kanskje kastes som kjemisk avfall avhengig av statlige og institusjonelle forskrifter. Bekreftelse av riktige PTU avfallshåndteringsmetoder, hvis noen, anbefales før bruk.
    2. For å lage en 1,5x PTU arbeidsløsning (heretter referert til som 1,5x PTU), tilsett 60 ml 25x PTU-lagerløsning til 940 ml sebrafiskanleggsvann (heretter kalt systemvann). Optimale vannkvalitetsparametere for sebrafisk er beskrevet23 og vannanlegg bør ha standard vannovervåkingsprosedyrer på plass. Oppbevar 1,5x PTU ved 28,5 °C i 1–2 uker beskyttet mot lys.
      MERK: Denne protokollen utføres rutinemessig ved hjelp av PTU-konsentrasjoner, løsemidler og lagringsparametere som er beskrevet i trinn 1.2. Som en forholdsregel bør embryoer/larver observeres hver 1-2 dag mens de er i PTU for å validere effekt og bekrefte vedvarende depigmentering. Oppløsnings- og/eller lagringsforhold bør optimaliseres hvis det mistenkes reduksjon i PTU-løselighet/effekt.
  3. Forbered en lagerløsning på 0,05% m / v metylenblå, en soppveksthemmer, ved å tilsette 0,05 g metylenblått pulver til 100 ml dH2O. Bland grundig med en rørestang og rør plate. Oppbevars ved 4 °C.
  4. Forbered pipetter for embryo/larvemanipulering (f.eks. bevegelige embryoer/larver mellom Petri-retter, separer larver under fluorescensscreening, samle euthanized larver i mikrocentrifugerør for fiksering, etc.) ved å kutte tilbake den koniske enden av et glass Pasteur pipette ved hjelp av en diamantspiss som beskriver pennen. Ets rundt pipettens omkrets med diamantpennen og trekk eller knips enden forsiktig av for å gjøre en ren pause.
    MERK: Pipettens munn skal være glatt og bred nok til å enkelt ta opp et embryo som fortsatt er inne i koret uten å skjære. Bruk en pære tegne overføring pipette som et alternativ. Forberedte pipetter kan også brukes til å fjerne væske under vannforandringer (i stedet for helling) for å minimere embryo/ larvetap.
  5. Forbered en 4% paraformaldehyd (PFA) oppløsning i 1x fosfatbufret saltvann (PBS) (f.eks. tilsett 10 ml 16% PFA til 4 ml 10x PBS og 26 ml dH2O). Oppbevars ved 4 °C i opptil 4 uker beskyttet mot lys.
    FORSIKTIG: Paraformaldehyd er et farlig kjemikalie og bør håndteres i en kjemisk avtrekkshette og kastes på riktig måte. Det må utvises forsiktighet, og personlig verneutstyr (PVU) bør brukes for å forhindre inntak, innånding og/eller kontakt med hud eller øyne.

2. Zebrafish embryo innsamling og vedlikehold før genetisk ablasjon (0-5 dager etter befruktning)

  1. Vedlikehold voksen sebrafisk som beskrevet tidligere 3,4,5. Ettermiddagen/kvelden før embryosamlingen, del voksen sebrafisk inn i avlstanker for gyting.
  2. Neste morgen (0 dager etter befruktning (dpf)), samle embryoer i 10 cm diameter Petri retter i systemvann og fjerne alle ikke-levedyktige eller unfertilized egg, som vil vises ugjennomsiktig og / eller vise uregelmessig cytoplasma og mislykket spalting24.
    MERK: Normale spaltings- og utviklingsoppsamlingshendelser vil være tydelige i friske embryoer som beskrevet25. Petri retter bør holdes tre fjerdedeler fulle (~ 30 ml for en 10 cm diameter tallerken) gjennom hele protokollen.
    1. Tilsett to dråper metylenblått på 0,05 % m/v til hver Petri-tallerken, bland forsiktig og oppbevar embryoer ved 28,5 °C for resten av protokollen.
  3. Rundt 6 h etter befruktning (hpf)4,5,26, erstatt systemvann i embryo Petri-retter med 1,5x PTU (arbeidsløsning laget i trinn 1.2.2) og etterfyll metylenblå.
    MERK: PTU må tilsettes embryoer før pigmentering (dvs. før 24 hkf)25, da allerede pigmentert vev ikke vil depigmentere ved tilsetning av PTU21. Det skal imidlertid bemerkes at redusert øyestørrelse, okulære og kraniofaciale underskudd, og forstyrrelse av noen signalveier (f.eks. skjoldbrusksignalering) er rapportert i PTU-behandlet sebrafisk 27,28,29. Utviklingstoksisiteten til PTU synes å være avhengig av konsentrasjon og tidspunkt for PTU tillegg27,29. Som nevnt ovenfor for validering av PTU-effekt (trinn 1.2), bør tegn på PTU-toksisitet også overvåkes nøye, og hvis det mistenkes, bør arbeidskonsentrasjonen og / eller tidspunktet for PTU-tillegg optimaliseres.
  4. På 2-3 dpf, dechorionate embryoer ved hjelp av nylaget pronase løsning.
    1. Løs opp pronase i 1,5x PTU i en konsentrasjon på 2 mg/ml ved virveling.
      FORSIKTIG: Pronase er pakket som et veldig fint pulver og er irriterende. Ta forholdsregler for å unngå innånding og/eller kontakt med hud, øyne osv.
    2. Skill klekkede embryoer fra ubeskyttede embryoer og pronase-behandle bare unhatched embryoer.
    3. Bytt ut 1,5x PTU med 2 mg/ml pronaseoppløsning laget i trinn 2.4.1 og la det ligge på ubemerkede embryoer i 4-5 min med skånsom agitasjon (f.eks. på en bordrotator/shaker eller ved manuell virveling).
    4. Hell av pronaseoppløsningen og skyll straks med frisk 1,5x PTU. Trianturer forsiktig 1,5x PTU skyll over embryoer med en pære-trekk overføring pipette.
    5. Gjenta en ekstra 1,5x PTU-skylling for å kaste alt chorion rusk, og etterfyll deretter 1,5x PTU for vedlikehold.
      MERK: Embryoer kan også dechorionated manuelt ved hjelp av finspissede tang. I dette tilfellet bør chorion rusk fjernes og 1,5x PTU etterfylles etter manuell dechorionation.
  5. Overvåk embryo/larvalhelse og fyll opp 1,5x PTU hver 1-2 dag. Embryoer/larver holdes i 1,5x PTU til ablasjon ved 5 dpf.
    MERK: Viktigheten av trinn 2.3 og 2.4 tas opp videre i diskusjonsdelen.

3. Screening sebrafisk larver for rpe65a:nfsB-eGFP og genetisk ablasjon av retinal pigment epitel (5-6 dager etter befruktning)

  1. Lag en frisk 10 mM metronidazol (MTZ) løsning på 5 dpf (dag for ablasjon). Denne prosessen tar 2 timer å fullføre.
    1. Tilsett MTZ-pulver i systemvann uten PTU og bland grundig ved kraftig risting (f.eks. 250 rotasjoner per min) i 1 time ved 37 °C.
    2. Avkjøl 10 mM MTZ-oppløsning for ytterligere 1 time ved romtemperatur på en bordplaterotator/shaker og sørg for fullstendig oppløsning før du legger til Petri-retter med larver.
      MERK: Fluorescensscreening og separasjon av eGFP+ -larver (trinn 3.2) kan utføres under inkubasjonene på 37 °C og romtemperatur.
      FORSIKTIG: MTZ er farlig, og det må utvises forsiktighet for å forhindre inntak, innånding og/eller kontakt med hud eller øyne. MTZ pulver og alle flytende derivater som er beskrevet her, må kanskje avhendes som kjemisk avfall avhengig av statlige og institusjonelle forskrifter. Bekreftelse av riktige MTZ avfallshåndteringsmetoder, hvis noen, anbefales før bruk.
  2. Skjerm sebrafisk larver for rpe65a:nfsB-eGFP transgene.
    1. Bedøv larver med 0,168 g/l trikain (MS-222) og separate transgene (eGFP+) larver (figur 1) fra ikke-transgene (eGFP-) larver ved hjelp av et fluorescenssterekroskop med en 488 nm eksitasjonslaser/filter.
      MERK: Trikain bør legges til 1,5x PTU og/eller farmakologiske sammensatte løsninger, da larver bør forbli nedsenket i behandlingen mens de screenes for eGFP. Inkuber larver i trikain bare i løpet av screeningen (f.eks. ≤10 min for en enkelt 10 cm Petri-tallerken som inneholder 50 larver).
    2. Våkn opp skjermede larver umiddelbart ved å pipetter direkte inn i en Petri-tallerken med frisk 1,5x PTU uten trikain.
    3. Når screeningen er fullført, må du videre skille eGFP+- larvene i to grupper petriske retter: en gruppe som skal få MTZ-behandling (ablated/MTZ+) og en gruppe som skal være den ikke-aablaterte (MTZ-) kontrollen.
  3. Ablate retinal pigment epitel.
    1. Fjern 1,5x PTU fra de uavsatte (MTZ-) kontrollrettene og tilsett ferskvann uten PTU.
    2. Fjern 1,5x PTU fra de ablerte (MTZ+) behandlingsrettene og tilsett den nylagde 10 mM MTZ-oppløsningen (trinn 3.1.).
    3. Fjern 10 mM MTZ-oppløsningen etter nøyaktig 24 timer (angitt 1 dag etter skade (dpi)) og tilsett ferskvann uten PTU. Bytt ut ferskvannsvannet uten PTU på MTZ-retten (e). Larver vil ikke bli utsatt for PTU igjen for resten av protokollen.
      MERK: Det kan være vanskelig å pipette eller helle av alle 1,5x PTU (trinn 3.3.1 og 3.3.2) eller 10 mM MTZ (trinn 3.3.3) mellom løsningsutvekslinger uten larvtap som dyr svømmer aktivt rundt. I dette tilfellet kan vask (er) av systemvann uten PTU tilsettes for å sikre vellykket løsningsutveksling.

4. Larval vedlikehold post-genetisk ablasjon (6+ dager etter befruktning)

  1. Kontroller larver og fyll opp systemvann uten PTU daglig til eutanasi (trinn 5.6) eller gå tilbake til sebrafiskboliger.
  2. Overvåk suksessen og omfanget av ablasjon in vivo på 2 dpi (7 dpf) ved hjelp av overført lysbelysning på et stereomikroskop (figur 2).

5. Inkorporere farmakologisk behandling i sebrafisk retinal pigment epitel ablasjonsprotokoll

MERK: Som utført tidligere3, er behandling med 15 μM IWR-1 eller volumtilpasset dimetylsulfoksid (DMSO) kjøretøykontroll fra 4 dpf skissert her som et eksempeleksperiment for å teste RpEGEN. Konsentrasjoner og tidslinjer kan variere med ulike farmakologiske forbindelser og anbefalinger for doseresponsvalidering, behandlingsvarighet, screening og andre aspekter ved eksperimentell design for farmakologiske manipuleringsstudier er adressert i diskusjonsdelen. Følg trinn 6 og 7 hvis bildeanalyse er nødvendig.

  1. Samle og vedlikehold embryoer som beskrevet i trinn 2. Dechorionate embryoer på 2 dpf.
  2. Screen eGFP + larver på 4 dpf som beskrevet i trinn 3.2. I stedet for Petri-retter, legg eGFP + larver i 6-brønnsplater med en tetthet på n ≤ 10 larver per 6-brønn for farmakologisk behandling. Angi separate 6-brønns plater for larver som vil være unablated (MTZ-) og larver som vil bli ablated (MTZ +).
    MERK: eGFP-signalet er synlig på 4 dpf, men vises svakere enn signalintensiteten på 5 dpf.
  3. Forbehandle 4 dpf eGFP+ larver med 15 μM IWR-1 eller volumtilpasset DMSO kjøretøykontroll i nøyaktig 24 timer før genetisk ablasjon med 10 mM MTZ-løsning.
    MERK: Ofte er det behov for svært lite forbindelse for farmakologiske behandlingseksperimenter. For å unngå å veie ut små mengder IWR-1 pulver, kjøpes denne farmakologiske forbindelsen allerede i DMSO-løsning, i en konsentrasjon på 25 mM, og alisiteres i mindre volumer ved ankomst for å unngå gjentatte fryse-tine sykluser.
    1. Bestem volumet av farmakologiske og kjøretøykontrollbehandlinger som trengs og aliquot 1,5x PTU i koniske rør tilsvarende. Et volum på 5 ml/brønn av en 6-brønns plate anbefales.
    2. Legg IWR-1 lager til 1,5x PTU for en endelig konsentrasjon på 15 μM IWR-1 (f.eks. 3 μL 25 mM IWR-1 per 5 ml 1,5x PTU). Legg til et samsvarende volum DMSO-lager til 1,5x PTU (f.eks. 3 μL ≥ 99,7 % DMSO per 5 ml 1,5x PTU). Her vil dette ende opp med å gi en endelig konsentrasjon på 0,06% volum / volum (% v / v) DMSO. Bland godt ved å virvelere og visuelt bekrefte oppløsning av forbindelser.
      FORSIKTIG: DMSO, IWR-1 og andre farmakologiske forbindelser og løsemidler må kanskje kastes som kjemisk avfall avhengig av statlige og institusjonelle forskrifter. Bekreftelse av farenivå og riktige avfallshåndteringsmetoder for disse forbindelsene, hvis noen, anbefales før bruk.
    3. Fjern 1,5x PTU fra eGFP+ larver i 6-brønnsplater og tilsett 5 ml / brønn nylagde 0,06% v / v DMSO eller 15 μM IWR-1 behandlinger fra trinn 5.3.2.
  4. På 5 dpf, fyre opp RPE. I tillegg til 24 timers forbehandling (trinn 5.3), vil larver forbli nedsenket i farmakologiske og kjøretøykontrollbehandlinger i løpet av 24 timers genetisk ablasjon med 10 mM MTZ og under post-ablasjon utvinning, til fiksering (f.eks. fra 4-9 dpf).
    1. Lag 10 mM MTZ-oppløsning 2 timer før du utfører genetisk ablasjon (trinn 3.1).
    2. Bestem volumet av farmakologiske og kjøretøykontrollbehandlinger som trengs for både unablated (MTZ-) og ablated (MTZ +) 6-brønnsplater og aliquot passende volumer av enten ferskvann uten PTU (MTZ-) eller 10 mM MTZ-løsning (MTZ +) i koniske rør. Dette vil gi fire behandlingstilstander: 1) 0,06% v / v DMSO, MTZ-; 2) 15 μM IWR-1, MTZ-; 3) 0.06% v / v DMSO, MTZ +; og 4) 15 μM IWR-1, MTZ+.
    3. Legg til IWR-1- og DMSO-lagerløsninger i respektive koniske rør som utført i trinn 5.3.2. Bland godt ved å virvelere og visuelt bekrefte oppløsning av forbindelser.
    4. Fjern 0,06% v/v DMSO og 15 μM IWR-1-behandlinger i 1,5x PTU (trinn 5.3.2) fra utpekte unablated (MTZ-) og ablated (MTZ+) 6-brønnsplater og etterfyll med passende behandlinger gjort i trinn 5.4.3.
    5. Fjern 0,06% v / v DMSO og 15 μM IWR-1 behandlinger i 10 mM MTZ-løsning etter nøyaktig 24 timer og fyll på med behandlinger i ferskvann uten PTU. Fyll på 0,06% v/v DMSO og 15 μM IWR-1 behandlinger i ferskvann uten PTU på de uavløste (MTZ-) 6-brønnsplaten(e).
  5. Følg larvalvedlikehold etter ablasjon som beskrevet i trinn 4 og fyll på 0,06% v / v DMSO eller 15 μM IWR-1 behandlinger daglig i systemvann uten PTU.
  6. Euthanize larver på 9 dpf (4 dpi for alderstilpassede MTZ-behandlede søsken) ved å nedsenke dyr i 0,3 g / L trikainoppløsning (dødelig overdose) kombinert med rask kjøling (f.eks . plasser Petri-retter på is) i minst 20 min30. Kontroller at larver ikke reagerer på å berøre og fikse i 4% PFA (trinn 1,5) i 3 timer ved romtemperatur eller ved 4 °C over natten.
  7. Behandle larvalvev etter fiksering for z-stack-bildeanskaffelse på et konfokalt mikroskop som beskrevet tidligere 5,31 og her i representative resultater-delen. Analyse i trinn 6 og 7 vil i det minste kreve oppkjøp av kjernefysiske markørbilder (f.eks. DAPI) og brightfield z-stack-bilder.

6. Confocal mikroskop z-stack bilde forhåndsbehandling i FIJI (ImageJ)

  1. Importer og formater konfiskeringsmikroskop z-stack-bilder ved hjelp av FIJI32.
    1. Åpne mikroskopbilder ved hjelp av importalternativene for bioformater som er satt til Visningsstakk med: Hyperstakk og Fargemodus: Gråtone.
    2. Generer en maksimal intensitetsprojeksjon av det importerte mikroskopbildet ved å velge Bilde | Stabler | Z-prosjekt. I ZProjection-vinduet angir du Start Slice og Stop Slice til å inkludere alle stykker for bildet. Sett for eksempel Start Slice: 1 og Stop Slice: 18 for en z-stack som har totalt 18 stykker. Velg Projeksjonstype: Maks intensitet og klikk på OK.
    3. Konverter den maksimale intensitetsprojeksjonsfilen til et 8-biters bilde (hvis ikke allerede) ved å velge Bilde | Skriv inn | 8-biters.
    4. Omorientere bildet slik at dorsalsiden er opp og distal (dvs. objektivet) er igjen ved å velge Bilde | Transformer | Vend vannrett (for den siste kommandoen velger du alternativet som passer best til retningen som trengs for bildet). For et flerkanalsbilde, klikk på Ja i prosessstakken? til å omorganisere alle kanaler.
      MERK: Dette trinnet er kritisk, men ikke nødvendig hvis bildet allerede er i dorsal opp, distal venstre retning. Se figur 3A-D og figur 4 for bilder med øyne i riktig retning for behandling.
    5. Lagre 8-biters maksimal intensitetsprojeksjon som en kodet bildefilformatfil (TIF) ved å velge Fil | Lagre som | Tiff....
  2. Generer RPE-interesseområde (ROI) ved hjelp av FIJI.
    1. Åpne et 8-biters TIF-bilde som er generert som beskrevet i trinn 6.1. Start ROI Manager ved å velge Analyser | Verktøy | ROI Manager.
    2. Bruk bilde | Zoom og veksle mellom DAPI- og brightfield-kanalene for å identifisere punktet(e) der den apikale siden av RPE ligger ved siden av spissen av den ytre begrensende membranen (OLM) (figur 3B, B", D', D"; blå pilspisser). Bruk dette anatomiske landemerket som roi-utgangspunkt.
    3. Opprett RPE ROI med mangekantmarkeringer-verktøyet (på FIJI-verktøylinjen) ved hjelp av både DAPI- og brightfield-bildekanaler og zoomfunksjon (Bilde | Zoom) for å identifisere apikale og basale RPE-grenser. Ta med dorsale og ventrale ender av avkastningen (dvs. der avkastningen går fra den apikale til basale siden av RPE) til et skarpt punkt i stedet for å stumpe eller avrunde (figur 3B', B", D', D"; magenta linjer).
      MERK: Oppretting av en spiss avkastningsende er et kritisk trinn for å optimalisere endepunktgjenkjenning ved hjelp av RpEGEN og behandles i diskusjonsdelen.
    4. Legg til avkastningen ved å klikke på Legg til i ROI Manager. Juster avkastningen etter behov og klikk på Oppdater i ROI Manager.
    5. Lagre ROI-filen ved å velge Mer>> | Lagre... i ROI Manager. Bruk identiske navn for samsvarende ROI- og TIF-bildefiler (for eksempel [filnavn].tif og [filnavn].roi).
  3. Kombiner 8-biters TIF- og ROI-filer for hver betingelse i én enkelt mappe. Mappen, DMSO_9dpf, vil for eksempel inneholde alle de samsvarende TIF- og ROI-filene for larvegruppen 9 dpf unablated (MTZ-) 0,06 % v/v DMSO-behandlet larvalgruppe.

7. Kvantifisering og visualisering av RPE-regenerering ved hjelp av RpEGEN-skript

  1. Installer og klargjør RpEGEN-skript.
    1. Last ned de nyeste RpEGEN-skriptene fra GitHub-repositoriet (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) ved å klikke på Kode | Last ned ZIP.
    2. Pakk ut mappen og plasser den på ønsket plassering for arbeidsområdet (f.eks. skrivebord).
    3. Åpne MATLAB.
    4. Naviger til RpEGEN-mappen i Gjeldende mappe-ruten (vanligvis på venstre side).
    5. Høyreklikk på RpEGEN-mappen og velg Legg til i bane | Merkede mapper og undermapper. Dette legger til mappen i MATLAB-banen slik at den automatisk kan finne og kjøre skript i mappen.
    6. Dobbeltklikk RpEGEN-mappen i gjeldende mapperute for å vise alle undermappene og M-filene.
    7. Dobbeltklikk filen RpEGEN.m for å åpne den i redigeringsruten .
    8. Under delen BRUKERDEFINERTE VARIABLER i filen RpEGEN.m angir du mappeplasseringene for mappene som inneholder ROI-filene (ROI), bildefiler (.tif) og hvor utdatafiler skal lagres. Skriv inn gruppenavnet for MA-filen som skal eksporteres (f.eks. DMSO_9dpf, DMSO_4dpi osv.) og plasseringen av brightfield-kanalen i TIF-bildestakken (f.eks. 3, hvis brightfield er den tredje kanalen i en bildestakk). Hvis bildefilen bare inneholder brightfield-bildet, bør dette være lik 1.
  2. Kjør RpEGEN.m-skriptet og valider resultatene.
    MERK: RpEGEN krever at verktøykassen for bildebehandling, verktøykassen for kurvetilpasning og verktøykassen for statistikk og maskinlæring aktiveres på bruker-MATLAB-lisensen for å kunne kjøres. I tillegg er den fritt tilgjengelige ReadImageJROI-verktøykassen33 nødvendig for å importere FIJI-ROIer til MATLAB; Den leveres imidlertid i RpEGEN-mappen sammen med andre M-filer for funksjoner som ikke krever aktivering.
    1. Kjør skriptet ved å klikke på Kjør-knappen i Redigering-menyen øverst på MATLAB.
      MERK: Når kommandovinduet er startet, vil det gi detaljerte utdata som indikerer fremdriften til skriptet. Etter å ha lagret MAT-filen som inneholder de utpakkede dataene, vises en figur med tre paneler og lagres som en PDF-fil i utdatakatalogen for hver bildekjøring. Dette er kvalitetskontrollfigurer (QC) for å sikre at alt har gått som det skal og inkluderer: 1) brightfield-bildet som er lagt over avkastningen (figur 4A); 2) avkastningen med midtlinje og tilhørende vinkelavstand (grader) (figur 4G); og 3) avkastningen med midtlinje medianintensitetsverdiene (0-255, 8-biters fargeskala) (figur 4H). Vent til QC PDF-filene er lagret i utdatamappen, og den siste figuren har forsvunnet før du går videre til neste trinn.
    2. Åpne de enkelte PDF-filene som eksporteres til utdatamappen i et PDF-visningsprogram, og kontroller at alle ROIer samsvarer med brightfield-bildene, at midtlinjeverdier er rimelige tilnærminger til midten av ROIene, og at medianintensitetsverdier fylles ut med data på riktig måte (dvs. ikke alle de samme verdiene på tvers av hele midtlinjen).
      MERK: En detaljert beskrivelse og struktur av hver variabel som er lagret i MAT-filen av RpEGEN.m, finner du i tabell 1.
  3. Kjør skriptet RpEGEN_PermPlot.m.
    MERK: RpEGEN_PermPlot.m-skriptet bruker utgangen av RpEGEN.m til å kjøre statistiske sammenligninger ved hjelp av en permutasjonssimulering av medianene til to grupper og gir også koden for å reprodusere plottene i dette papiret ved hjelp av den fritt tilgjengelige GRAMM-verktøykassen34, som også er inkludert i RpEGEN-mappen.
    1. Dobbeltklikk RpEGEN_PermPlot filen for å åpne den i en ny Redigering-fane .
    2. Under SECTION 1 - USER-DEFINED VARIABLES i RpEGEN_PermPlot.m-filen angir du katalogplasseringen for utdatamappen som inneholder MAT-filene fra å kjøre RpEGEN.m, og skriver inn hvert MAT-filnavn som skal lastes inn (f.eks. DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat).
    3. Kjør denne delen av skriptet ved å klikke Kjør inndeling-knappen i Redigering-menyen øverst på MATLAB.
    4. I avsnitt 2 skriver du inn navnene på de to gruppene for statistisk sammenligning i variablene data_A og data_B (dette er gruppene som medianer skal avledes fra ved hjelp av permutasjonssimuleringen). I variabelen bin_sz angir du hvor mange grader medianintensitetsverdiene for datasettene skal integreres over (standard er 1-graders intervaller).
      MERK: Repetisjonsvariabelen angir antall permutasjoner som skal brukes til å bygge en sannsynlighetsfordeling , og kan settes til et hvilket som helst tall (standardverdien er 20 000). Generelt vil et høyere antall repetisjoner være mer statistisk robuste, men vil øke behandlingstiden.
    5. Kjør denne delen av skriptet ved å klikke Kjør inndeling-knappen i Redigering-menyen øverst på MATLAB. Det kan ta litt tid å fullføre denne delen, avhengig av hvor mange repetisjoner som er angitt, men den gir en kontinuerlig statusoppdatering i kommandovinduet.
    6. Kjør heatmap figure - og grupperesultater og P-VERDIER uavhengig av hverandre ved hjelp av Kjør inndeling-knappen . Rediger datavariabler i alle seksjoner som er kommentert med "ENTER DATA HERE". PDF-filer av disse tallene lagres automatisk for hver og kan enkelt endres i enhver vektor programvare etter behandling.
      MERK: Plottene som genereres i RpEGEN_PermPlot.m-filen er ad hoc og vil sannsynligvis kreve endringer basert på hver brukers spesifikke data- og visualiseringsbehov. Tallene gir imidlertid et solid fundament som enkelt kan individualiseres ved hjelp av både MATLAB- og GRAMM-nettsteder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hemming av den kanoniske Wnt-signalveien er kjent for å betydelig svekke sebrafisk RPE-regenerering ved hjelp av det genetiske ablasjonsparadigmet (rpe65a:nfsB-eGFP) og farmakologisk manipulasjonsmetodikk (IWR-1) beskrevet i protokollen3. Dette eksperimentet ble gjentatt her for å validere en automatisert metode for kvantifisering av sebrafisk RPE-regenerering basert på pigmentering. Resultatene oppsummert nedenfor omfattet alle trinnene i protokollen, fra befruktningsdagen (0 dpf) til kvantifisering av RPE-regenerering ved hjelp av RpEGEN.

Implementering av RPE-ablasjonsprotokollen (med farmakologisk manipulering) i larval sebrafisk
Embryoer samlet inn fra tre separate foreldregrupper (N = 3) begynte behandling med 1,5x PTU rundt 6 hkf og fravær av pigmentering i RPE og overflatemelanocytter ble visuelt bekreftet på 1 dpf. Embryoer ble enzymatisk dekorionert på 2 dpf ved bruk av 2 mg/ml pronase (trinn 2.4). På 4 dpf ble larver bedøvet ved hjelp av trikain (MS-222) og screenet for eGFP ved hjelp av et fluorescenssterekroskop (trinn 3.2 og 5.2). eGFP+ larver ble flyttet inn i 6-brønnsplater (n = 10 larver / brønn) og ble behandlet med enten 0,06% v / v DMSO (kjøretøykontroll) eller 15 μM IWR-1 (trinn 5.3). Larvtettheten som ble rapportert her var i utgangspunktet basert på tilnærmingen til 1 larve / cm2 vekstområde og ble validert gjennom nøye helseovervåking (f.eks. svømmeblæreutvikling) over tid. Intensiteten av eGFP virket svak på 4 dpf, så larver ble vist på nytt på 5 dpf for å bekrefte lyse eGFP-uttrykk (figur 1). RPE65 (rpe65a i sebrafisk) er en markør for moden RPE7 , og i teleostfisk genereres netthinne- og RPE-celler kontinuerlig fra den ciliære marginalsonen (CMZ), en stamcellenisje på den distale spissen av netthinnen, ved siden av linsen35. I rpe65a:nfsB-eGFP-transgene linjen finnes dermed den mer umodne RPE i periferien og vises eGFP- (omtrent en tredjedel av det totale RPE-vevet) mens de modne, sentrale to tredjedeler av RPE uttrykker eGFP (figur 1B; hvite pilspisser). Transgene var også synlige i pinealkjertelen (figur 1A; gul pilspiss), som var forventet da rpe65a viser pinealuttrykk i sebrafisk36. Relativt svake eller eGFP-larver ble trukket fra 6-brønnsplater og euthanized på 5 dpf. Ved nøyaktig 24 timers etterbehandling med DMSO eller IWR-1 ble 5 dpf larver behandlet med 10 mM MTZ for å fyre opp RPE (trinn 3,1, 3,3 og 5,4). MTZ ble vasket ut etter nøyaktig 24 timer (dvs. på 6 dpf/ 1 dpi) for å tillate RPE-regenerering å finne sted.

Larver ble observert daglig på et stereomikroskop ved hjelp av overført lysbelysning fra 6 dpf / 1 dpi til eutanasitidspunktet på 9 dpf / 4 dpi. Suksessen med genetisk ablasjon ble bekreftet in vivo på 2 dpi ved fravær av pigment i de sentrale to tredjedeler av øyet i MTZ + larver (figur 2B; røde pilspisser) sammenlignet med 7 dpf MTZ-kontrollsøsken (figur 2A) (trinn 4.2). Som forventet virket området uten pigment på 2 dpi analogt med regionen rpe65a:nfsB-eGFP transgene uttrykk observert på 5 dpf (figur 1B). Vurdering ble utført på 2 dpi og ikke tidligere da RPE gjennomgår repigmentering etter fjerning av PTU, og avhengig av tidspunktet for observasjon in vivo, kan en markert forskjell mellom den ablerte sentrale RPE og spart (unablated) perifer RPE være vanskelig å skjelne hvis sistnevnte ikke har fullstendig repigmentert. Til tross for muligheten for makroskopisk tvetydighet, ble RPE-ablasjon ved 1 dpi tidligere vist seg å være lett synlig i seksjonert vev, og avslørte et tap av sentral RPE og ytre kjernefysisk lag (ONL; dvs. fotoreseptor) vevsintegritet sammen med bevis på celledød (pyknotisk nuklei) (figur 5)3. Mot vevstap ble robust spredning fastslått å være en nøkkeldriver under vevregenerering i rpe65a:nfsB-eGFP sebrafiskmodell3. Både den tidlige apoptotiske responsen, hvor RPE-ablasjon fører til degenerasjon av tilstøtende vev (f.eks. fotoreseptorer og Bruchs membran; Figur 6A-C), og den perifere til sentrale proliferative responsen som følger, som gir heterogen regenerering "soner" som beveger seg innover på skadestedet (figur 6D-F), har blitt omfattende karakterisert og diskutert tidligere3.

Vevsforberedelse, konfikal bildeanskaffelse og forhåndsbehandling av bilder for automatisert kvantifisering basert på RPE-pigmentering ved bruk av RpEGEN
På 9 dpf/4 dpi ble DMSO- og IWR-1-behandlede larver euthanized av trikainoverdose og festet i 4% PFA i 3 timer ved romtemperatur (trinn 5,6). Fire larver fra hver uavhengige foreldregruppe ble tilfeldig valgt for etterfølgende vevsbehandling (N = 3; n = 12 larver per behandling). Kryobeskyttelse, kryooseksjon (ved 12 μm tykkelse), kjernefysisk mottrekking med DAPI, og dekslerlipmontering ble utført som referert i trinn 5.7 5,31. En sentral seksjon, med synlig optisk nerve, fra hver larve ble avbildet på et konfokalt laserskanningsmikroskop ved hjelp av et 40x oljeinnlevelsesmål (numerisk blenderåpning = 1,30) for å skaffe 512 x 512-pikslers z-stack-bilder med et 1 μm z-trinns intervall. Hvert bilde inneholdt data fra tre kanaler: kanal 1 = 405 nm eksitasjon for DAPI, kanal 2 = 488 nm eksitasjon for eGFP, kanal 3 = overført lys for brightfield. Ettersom pikselintensiteten ble kvantifisert i brightfield-bilder, ble overførte lyslampespenningsinnstillinger holdt konstante og alle data samlet inn for statistiske sammenligninger ble avbildet samme dag.

Confocal mikroskop z-stack bilder ble forhåndsbehandlet for automatisert kvantifisering som beskrevet i trinn 6, ved hjelp av FIJI. Bilder ble utelukket fra forbehandling og kvantifisering hvis vevet ble kompromittert på en måte som ville gjøre avkastningen vanskelig (f.eks. fra å rive (Figur 7A; magenta pilspisser) eller hindring av landemerker (Figur 7B; magenta ovaler)) eller skråstille målinger av ROI-intensitet (f.eks. fra sammenleggbar (Figur 7C; magenta ovaler)). Til tross for å utelate noen larver med disse eksklusjonskriteriene, representerer alle datasett heri N = 3 med følgende antall biologiske replikeringer (larver): n = 11, DMSO MTZ-; n = 10, IWR-1 MTZ-; n = 11, DMSO MTZ+; n = 12, IWR-1 MTZ+. Ved hjelp av DAPI-kanalen ble RPE-ROIer initiert ved først å identifisere punktet der den dorsale apikale siden av RPE (netthinnevendt) var rett ved siden av dorsalspissen til OLM (Figur 3B',D'; blå pilspisser) (trinn 6.2.2). Ettersom distal RPE-forlengelse kan variere mellom seksjoner, ble OLM brukt som et anatomisk landemerke for å standardisere RPE ROI-endepunkter og normalisere vinkelavstandsmålinger i MATLAB (hvor 0° = dorsalt AVKASTNING-endepunkt og 180° = ventral avkastningsendepunkt). Ved utførelse av RPE-ablasjoner med farmakologisk manipulering eller i mutantbakgrunn, bør et anatomisk landemerke identifiseres og valideres før forbehandling og kvantifisering. Her var OLM tydelig i alle larver kvantifisert og ble ikke kompromittert ved å rive (som i Figur 7B) eller behandling med DMSO eller IWR-1. Etter å ha identifisert det dorsale utgangspunktet, ble ROIer generert etter at den apikale siden av RPE (dorsal-to-ventral) til punktet ved siden av spissen av ventral OLM ble nådd (Figur 3B",D"; blå pilspisser). Deretter ble det laget et ventralt ROI-endepunkt mellom de apikale og basale (korroidvendte) sidene av RPE som beskrevet i trinn 6.2.3 (Figur 3B",D"; magenta linje). Avkastningen ble videreført, etter basalsiden av RPE (ventral-til-dorsal) til den nådde basalsiden ved siden av utgangspunktet ved dorsal OLM. Avkastningen ble deretter omsluttet av å skape en spiss dorsal ende (Figur 3B',D'; magenta linje) som gjort ventrally. Genetisk ablasjon har vist seg å resultere i tap av sentrale eGFP-uttrykk som gjenvinnes som regenereringsproveny (oppsummert i Figur 6)3; Avhengig av omfanget av regenerering og intensiteten til eGFP på det tidspunktet av interesse, kan eGFP-kanalen bare være nyttig for AVKASTNINGSgenerering i MTZ- gruppe. Derfor, mens konfølende oppkjøp også inneholdt eGFP-kanalbilder, ble ROI-generasjonen fullført ved hjelp av DAPI- og brightfield-kanalene som nevnt i trinn 6.2.3. RPE ROI-generasjonen var enkel i DMSO- og IWR-1-behandlet MTZ- larvgrupper og omfattede regioner med synlig pigmentert apikal mikrovilli (Figur 3B; rød pilspiss) sammen med de fremtredende pigmenterte cellelegemene. De samme parameterne ble brukt på MTZ+ larvgrupper (Figur 3D; rød pilspiss); På grunn av restskadet vev på skadestedet var imidlertid apikale mikrovilli- og pigmenteringsgrenser vanskelige å avgrense i brightfield-kanalen alene i noen tilfeller. I disse områdene ble DAPI-kanalen også brukt til å identifisere cellulært rusk på RPE-skadestedet, som ble inkludert i avkastningen (Figur 3C,D; eksempler på skade sted-lokalisert cellulært rusk er indikert med cyan pilspisser). Immunstaining med markører av umoden/moden RPE (f.eks. Figur 6D,E)37 og/eller fotoreseptorer (f.eks.37,38 kan også brukes til å legge til rette for å skissere RPE ROIer i ablated larver.

Tidligere viste ablerte larver behandlet med IWR-1 fra 4 dpf til 4 dpi betydelig svekkelse av RPE-regenerering sammenlignet med DMSO-behandlede søskenkontroller (figur 8C)3. Dette ble rapportert som prosentandelen av sentral pigment utvinning, som krevde betydelig tidligere erfaring med modellen og manuelle målinger av vinkel avstand for å betegne regenerering grenser (Figur 8B; svarte pilspisser). RpEGEN ble opprettet for å automatisere kvantifisering av RPE-regenerering og redusere iboende skjevheter. Ikke bare det, RpEGEN aktiverte også generering av svært robuste datasett; For eksempel ble 10 datapunkter tidligere generert fra manuell kvantifisering av n = 10 DMSO-behandlede MTZ+ larver (figur 8C; % pigmentgjenvinning per seksjonsmålinger)3, mens 174 801 datapunkter ble generert fra n = 11 DMSO-behandlede MTZ+ larver/ROIer her ved hjelp av RpEGEN (figur 9C; pikselintensitetsmålinger).

RpEGEN ble utviklet for å gradvis vurdere regionale endringer i pigmentering over hele RPE ved å utlede en skeletonisert midtlinje (1-pikselbredde) fra den opprinnelige avkastningen generert ved hjelp av FIJI (figur 4A, B). For å inkludere alle bildepunkter i avkastningen for analyse (dvs. ikke bare midtlinjebildepunktene), ble det utført en euklidsk avstandstransformasjon på hvert bildepunkt fra midtlinjen for å opprette et kart over den nærmeste midtlinjeindeksen for hvert bildepunkt i ROI-masken. Dette kartet over indekser tillot at hver piksel utenfor midtlinjen ble tilskrevet en enkelt midtlinjepiksel, og skapte et omfattende datasett over hele RPE for hver larve (figur 4E). Den dorsale til ventrale lengden på RPE var representert av vinkelavstand (figur 4G; 0-180°) i motsetning til normalisert pikselavstand (figur 4F; 0-1 vilkårlige enheter), da dette var mer intuitivt basert på tidligere målinger av RPE-regenerering 3,4,5 og det faktum at vinkelavstanden ikke varierer med morfologiske forskjeller. Medianintensiteter avledet fra 5-graders hyller var målingen som ble valgt for å fremheve store trender og minimere høyfrekvent variasjon observert i 1-graders binned data (tabell 1, figur 10A). Permutasjonssimulering ble valgt for å teste nullhypotesen for å se om medianene til de to behandlingsgruppene (her DMSO MTZ+ og IWR-1 MTZ+ (begge 4 dpi), figur 10B) er lik39. Denne omsamplingsteknikken mangler strenge forutsetninger om fordelingen av dataene og kan brukes på en rekke teststatistikker (f.eks. gjennomsnitt, median osv.) for å generere robuste p-verdiestimater. En rekke av disse parameterne (f.eks. bin size av rå- og mediandata, permutasjonssimuleringsrepetisjoner, etc.) kan tilpasses og modifiseres for å passe til brukerens behov. For sistnevnte ble det valgt 20.000 repetisjoner for å generere en statistisk robust sammenligning, men det bør tas hensyn til å balansere beregningseffektivitet med statistisk robusthet, da for få repetisjoner kan gi feilaktige p-verdiestimater. Det anbefales at flere repetisjonsverdier kjøres (10 000, 20 000 osv.) for å sikre at p-verdifordelingen og verdiene er relativt stabile før tolkningene påbegynnes. Økende permutasjonsrepetisjoner vil øke statistisk kraft (men vil også ta lengre tid å kjøre), noe som kan være gunstig for noen datasett.

Konfiskeringsbildedatasett ble kvantifisert ved hjelp av RpEGEN som beskrevet i trinn 7. De kommenterte RpEGEN og støtteskriptene er tilgjengelige på GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) sammen med 8-biters TIF og tilsvarende ROI-filer for interesserte brukere å teste. Varmekart som viser rådata fra MTZ-larval-ROIer viste en samlet fordeling av mørkere pikselintensiteter (der 0 = svart og 255 = hvit, 8-biters fargeskala) som spenner over dorsal (0°) til ventral (180°) lengde på RPE, uavhengig av behandling med 0,06% v/v DMSO eller 15 μM IWR-1 (figur 9A,B). Plotting av median pikselintensiteter forenklet visualisering blant alle grupper og viste likheter mellom MTZ-gruppene på tvers av RPE (figur 10A; svarte og grå linjer). Disse dataene støttet tilstedeværelsen av et intakt pigmentert RPE-monolag (figur 9E,F) og ga baseline median pikselintensitetsverdier (dvs. under 150) for unablated RPE (figur 10A, svarte og grå linjer). Relativt sett viste rådata (figur 9C,D) og mediandata (figur 10A, blå og røde linjer) fra MTZ+ larval-ROIer en samlet fordeling av lettere pikselintensiteter i den sentrale RPE, igjen, uavhengig av behandlingstilstand. Ablated DMSO-behandlede larver viste sentralisert fordeling av lyspiksler ved ca. 100° (± 15°) (figur 9C; oransje-røde skuffer). Dette tilsvarte et synlig fravær av pigmentering på det sentrale RPE-skadestedet i/rundt synsnerven (figur 9G; blå pilspisser). Ablated IWR-1-behandlede larver viste også sentralisert fordeling av lyspiksler som ble utvidet både dorsalt (til rundt 50°) og ventrally (med ca. 5°) sammenlignet med MTZ + DMSO-behandlede søskenkontroller (figur 9D, oransje-røde skuffer). Tilstedeværelsen av et utvidet skadested var tydelig synlig i seksjonert vev (figur 9H; blå pilspisser). Med unntak av to 1-graders beholdere var den observerte forskjellen mellom MTZ+-gruppene statistisk signifikant i den sentrale RPE (figur 10B; lyseblått skyggelagt område mellom ~40-140°; p-verdi ≤ 0,05), noe som indikerer betydelig mindre sentral RPE-pigmentering i MTZ + IWR-1-behandlede larver sammenlignet med MTZ + DMSO-behandlede søskenkontroller. Tolkning av disse rådataene (figur 9C,D) og mediandata (figur 10A) med statistisk sammenligning (figur 10B) ved bruk av RpEGEN ble validert ikke bare ved å observere seksjonert vev (figur 9G,H), men støttet også tidligere funn fra manuell kvantifisering (figur 8)3.

Figure 1
Figur 1: rpe65a:nfsB-eGFP transgene expression on 5 days post-fertilization. (A-C) Wholemount bilder av en PTU-behandlet 5 dpf larve som viser dim transgene uttrykk i pinealkjertelen (A; gul pilspiss) og lyse transgene uttrykk i RPE (B, C) på tidspunktet for screening for genetisk ablasjon. (B) Transgene uttrykk er synlig lokalisert til de sentrale to tredjedeler av RPE, og hvite pilspisser fremhever grensen mellom perifer (umoden) og sentral (moden) RPE. Grønn = eGFP. Fremre er oppe. Skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Verifisering av vellykket genetisk ablasjon av RPE in vivo. Wholemount bilder av (A) tre unablated (MTZ-) 7 dpf larver som viser RPE pigmentering gjennom øyet og (B) tre ablated (MTZ +) 2 dpi larver som viser en ablasjonssone der det er fravær av pigment i de sentrale to tredjedeler av RPE (røde pilspisser). Fremre er oppe. Skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: RPE-interesseområder (ROIer) for automatisert kvantifisering ved hjelp av RpEGEN. Tverrgående kryoser av (A,B) en unablated (MTZ-) 9 dpf larve og (C,D) en ablated (MTZ +) 4 dpi larve med RPE ROIs uthevet i magenta. (B,D) Røde pilspisser fremhever regioner der synlig pigmentert apikal mikrovilli ble inkludert i avkastningen. (C,D) Cyan pilspisser peker på eksempelregioner av skade sted-lokalisert DAPI + rusk, som ble brukt til å inkludere RPE celle rusk i avkastningen. (B',B",D',D") Digitale zoomer av både dorsale og ventrale ROI-regioner (svarte stiplede bokser i B og D) viser foreslåtte AVKASTNING-startpunkter (blå pilspisser) og de spisse ROI-endene som er kritiske for endepunktgjenkjenning i MATLAB. Brightfield-bilder vises også i figur 9E,G. Hvit/grå = kjerner. Dorsal er oppe og distal er igjen. (A-D) Skalastolper = 40 μm. (B',B",D',D") Skalastenger = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Arbeidsflyt for RpEGEN-behandling. (A) Eksempel på et riktig orientert 8-biters lysfeltbilde og FIJI-generert avkastning (rød) importert til MATLAB. Dorsal er oppe og distal er igjen. Fargelinjen representerer 8-biters gråtoneintensitetsverdier der 0 = svart og 255 = hvit. (B) Innledende binær skjelettisering (hvit) av ROI-masken (rød) som viser tilstedeværelsen av feilaktige sporer og avgrensning av start- og sluttpunktene for geodesisk pikselavstandsavgrensning som vist i (C). Fargelinje i (C) representerer euklidsk pikselavstand. (D) Spurs fjernes ved hjelp av en forenklet minstekostnadsbane fra sluttpikselet tilbake til startpikselet, noe som resulterer i en kontinuerlig midtlinje uten sporer (rød). (E) Nærmeste lineære midtlinjeindekser basert på en avstandstransformasjon mellom alle bildepunktene i ROI-masken og midtlinjebildepunktene (hvite). Disse indeksverdiene gjør det mulig å tilordne hvert bildepiksel i ROI-masken til det nærmeste midtlinjepikselet for analyse. Fargelinjen representerer de lineære indeksverdiene for midtlinjepiksler. (F) Et eksempel på den normaliserte pikselavstanden langs midtlinjen, der 0 (blå, distal-mest dorsal piksel) er startpikselet og 1 (rød, distal-mest ventral piksel) er sluttpikselen. (G) Ligner på (F), men bruker vinkelavstanden, der 0 grader (blå) er startpikselet og 180 grader (rød) er sluttpikselen. (H) Eksempel på median pikselintensitetsverdier beregnet for hvert midtlinjepiksel. Fargelinje representerer median intensitetsverdi for gråtoner for alle AVKASTNING-bildepunkter som bidrar til hvert gitte midtlinjebildepunkt. Denne figuren viser bilder fra et testdatasett og ikke larver fra behandlingsgruppene 0,06% v/v DMSO eller 15 μM IWR-1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Tegn på RPE-ablasjon og fotoreseptordegenerering. (A) Tverrgående kryoser av en unablated 6 dpf larve. (A,A') Etter eksponering for PTU er transgene uttrykk begrenset til modne RPE-celler, med det lyseste uttrykket begrenset til de sentrale to tredjedeler av RPE. Pilspisser indikerer apikale mikrovilli. (A") Differensial interferenskontrastbilder (DIC) viser normal ytre kjernefysisk lag (ONL; dvs. fotoreseptor) arkitektur. (B,B') Tverrgående kryoser av en 1 dpi larve avslører betydelig forstyrrelse av eGFP + cellemorfologi og uorganisering i ONL-laminering. Piler indikerer delaminerte og pyknotiske kjerner. (B") DIC-bilder avslører videre den markerte forstyrrelsen av ONL-arkitektur. Grønn = eGFP, blå = kjerner, gul = ONL. Dorsal er oppe og distal er igjen. Skaleringslinjen i (A) representerer 40 μm og kan brukes på (B). Skalalinjen i (A) representerer 40 μm og kan brukes på (A", B', B"). Denne figuren og figurforklaringsteksten er endret fra Hanovice et al. 2019 (figur 1)3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Modell for RPE-regenerering i larvsebrafisk. (A) nfsB-eGFP uttrykkes i moden RPE i de sentrale to tredjedeler av øyet. (B) Påføring av MTZ fører til apoptose (TUNEL, rød) av RPE og fotoreseptorer. (C) RPE-ablasjon fører til degenerasjon av fotoreseptorer og Bruchs membran (prikket linje). (D) Unablated RPE i periferien begynner å spre seg og strekke seg inn i skadestedet (blå). (E) Når regenerert eGFP+ RPE vises i periferien, kan RPE deles inn i fire soner: ekstern RPE (pRPE), differensiert RPE (dRPE), overgangssone (TZ) og skadested (IS). (E, innsettet) Regenerert differensiert RPE (grønn) vises i periferien proksimal til den uavsatt perifere RPE, og inneholder proliferative celler ved siden av overgangssonen. Overgangssonen består av fortsatt differensierende RPE-celler (ZPR2, rød) og proliferative celler (blå). Skadestedet består av upigmenterte proliferative celler som ikke uttrykker noen RPE-differensieringsmarkører. (F) Regenerering av et funksjonelt RPE-lag og Bruchs membran er fullført med 14 dpi. Denne figuren og figurforklaringsteksten er endret fra Hanovice et al. 2019 (figur 14)3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Kompromitterte vevsseksjoner ekskludert fra bildeanalyse. (A-C) Tverrgående kryoser av larver fra datasettene 0,06 % v/v DMSO og 15 μM IWR-1 som oppfylte ekskluderingskriteriene. En larve viser dorsal RPE vev rive (A; magenta pilspisser) og to andre larver viser vev folding som enten hindrer et anatomisk landemerke (dorsal OLM) i DAPI-kanalen (B; magenta prikkete ovaler) eller kan forskyve RPE intensitetsmålinger fra brightfield kanalen (C; magenta prikkete ovaler). Hvit/grå = kjerner. Dorsal er oppe og distal er igjen. Skalastenger = 40 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Farmakologisk hemming ved bruk av IWR-1 svekker RPE-regenerering. Tverrgående kryoser av ablated (MTZ+) 4 dpi larver fra (A) 0,06% v / v DMSO og (B) 15 μM IWR-1 behandlingsgrupper. Brightfield-bilder (A,B) og kvantifisering av prosent RPE-gjenoppretting / seksjon (C) viser en betydelig forsinkelse i utvinningen av et pigmentert monolayer i IWR-1-behandlede larver (Studentens uparrede t-test, *** p < 0,0001). (B) Svarte pilspisser angir den sentrale kanten av den regenererende RPE. Dorsal er oppe og distal er igjen. Skalastangen i (B) representerer 40 μm og kan brukes på (A). Denne figuren og figurforklaringsteksten er endret fra Hanovice et al. 2019 (Figur 13)3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Rådatautgang fra automatisert kvantifisering av RPE-regenerering i RpEGEN. (A-D) Varmekart som viser lyse felt pikselintensitetsfordelinger kompilert fra hele RPE ROI-regionen, fra dorsal (x-akser; vinkelavstand = 0°) til ventral (x-akser, vinkelavstand = 180°), for alle larver i hvert datasett: (A) n = 11, DMSO MTZ-; (B) n = 10, IWR-1 MTZ-; (C) n = 11, DMSO MTZ+; (D) n = 12, IWR-1 MTZ+ (fra tre uavhengige overordnede grupper, N = 3). (A) viser for eksempel data fra 177 460 bildepunkter på tvers av 11 ROIer. På y-aksene vises pikselintensiteten basert på en 8-biters fargeskala der 0 = svart og 255 = hvit. Rådata vises i 5-graders (x-akse) med 5-8-biters intensitetsverdibeholdere (y-akse) der rød = maksimalt antall hyller og mørkeblå = minste hylleantall. (E-H) Tverrgående kryoser av representative (E,F) unablated (MTZ-) 9 dpf larver og (G, H) ablated (MTZ +) 4 dpi larve fra 0,06% v / v DMSO og 15 μM IWR-1 behandlingsgrupper. RPE ROIer er uthevet i magenta og vinkelavstand ekstremer er indikert (0° = dorsal, 180 ° = ventral). I stor grad viser disse dataene fordeling av mørkere bildepunkter (intensitetsverdier mellom 0-150) i (A,B,E,F) uavsette ROIer sammenlignet med (C,D,G,H) ablated ROIer, uavhengig av behandling. Data fra ablated ROIs viser (C,G) sentralisert (100° ± 15°) fordeling av lettere piksler (intensitetsverdier mellom 150-250) i DMSO-behandlingsgruppen som (D,H) utvider dorsalt (til ~ 50°) og litt ventrally (med ~ 5 °) i IWR-1-behandlede larver. (G,H) Disse sentrale ablasjonssonene fraværende pigment er fremhevet av blå pilspisser. Svarte piler indikerer plasseringen av synsnerven. Bilder fra DMSO-behandlede larver er også vist i figur 3. Skalastenger = 40 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 10
Figur 10: Grupperesultater og statistisk sammenligning avledet fra automatisert kvantifisering av RPE-regenerering i RpEGEN. (A) 5-graders binnerte medianverdier og 95 % konfidenskonvolutter avledet fra rådataene for hver gruppe. Plottet viser likhet mellom MTZ-gruppene (svarte og grå linjer) over dorsalen (0°) til ventral (180°) lengde på RPE med bemerkelsesverdige forskjeller mellom og blant MTZ + gruppene (blå og røde linjer) i det sentrale RPE (lyseblå skyggelagt område mellom ~ 40-140°). Spesielt virker median pikselintensitet lettere (0 = svart og 255 = hvit) i IWR-1 MTZ + 4 dpi sammenlignet med en hvilken som helst annen behandlingsgruppe, noe som tilsvarer redusert sentral RPE-pigmentering. (B) En statistisk sammenligning av medianverdiene avledet fra 1-graders intervaller over dorsal (0°) til ventral (180°) lengde på RPE for DMSO MTZ+ 4 dpi og IWR-1 MTZ + 4 dpi forsterker observasjonen i (A). p-verdier ble beregnet ved hjelp av en permutasjonssimulering med 20 000 repetisjoner og en tosidig test for hver 1-graders skuff. Under nullhypotesen om at de to gruppene har lignende medianverdier for en tilsvarende 1-graders intervall, indikerer en p-verdi ≤ 0,05 en statistisk signifikant forskjell mellom gruppens medianer (stiplet svart linje = 95 % konfidensintervall (CI)). Tilstedeværelsen av p-verdier ≤ 0,05 over det sentrale RPE (lyseblått skyggelagt område mellom ~ 40-140 °) indikerer betydelig mindre pigmentering i ablated (MTZ +) IWR-1-behandlede larver sammenlignet med ablated (MTZ +) DMSO-behandlede søskenkontroller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Variabelt navn Variabel type Variabel størrelse Beskrivelse av variabel
AVKASTNINGSNAVN Celle {N x 1} Navn på ROI-filene som behandles
ROIxy Celle {N x 1} ROI-toppunkt for hver ROI-fil som behandles
IMG-navn Celle {N x 1} Navn på TIF-bildefilene som er behandlet
IMG Celle {N x 1} 8-biters lysfeltbildedata for hver TIF-behandlet
ROIBW Celle {N x 1} Logisk (0 eller 1) ROI-maske med samme dimensjoner som IMG-bilder
Cline Celle m/tabeller {N x 1} (n x 16) Midtlinjedata for enkeltbilder, inkludert x, y, avstand, vinkel, indeks, antall punkt og statistikk
CIdx Celle {N x 1} Midtlinjeindeksdata relatert til ROI-maske peker til det nærmeste midtlinjepunktet for beregning av CLine
Faktisk vekt Celle {N x 1} Logisk (0 eller 1) matrise med samme dimensjoner som IMG-bilder som angir plasseringen av midtlinjen (=1)
RAW_data Bord N x 3 Tabell som kombinerer alle rådataene for hver piksel i ROIene på tvers av alle de forskjellige IMG-bildene
BIN_1_deg_all Bord N x 9 Tabell som inneholder 1-graders binned data og statistikk ved hjelp av dataene fra RAW_data
BIN_5_deg_all Bord N x 9 Tabell som inneholder 5-graders binned data og statistikk ved hjelp av dataene fra RAW_data
BIN_10_deg_all Bord N x 9 Tabell som inneholder 10-graders binned data og statistikk ved hjelp av dataene fra RAW_data

Tabell 1: Beskrivelse av variabler eksportert fra RpEGEN.m-skript til MAT-filen. Definisjoner er som følger: avkastning(er) = interesseområde(r). TIF = kodet bildefilformat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver metodikk for å genetisk fyre opp RPE og studiemekanismer for degenerasjon og regenerering i larve-alderen sebrafisk. Denne protokollen har også blitt utført i voksen sebrafisk3, men med mindre omfattende karakterisering, og derfor er larver fokus her. Kritiske aspekter ved denne delen av protokollen (trinn 1-4) inkluderer: 1) legge 1,5x PTU til embryoer før utbruddet av melanogenese, 2) dechorionating PTU-behandlede embryoer på 2-3 dpf, 3) forsiktig screening for eGFP, og 4) tidspunkt for vannforandringer under genetisk ablasjon med MTZ. PTU hemmer melaninsyntese21,22 og har blitt brukt i dette RPE-ablasjonsparadigmet for å lette screening for rpe65a:nfsB-eGFP transgene uttrykk og for å muliggjøre karakterisering av RPE degenerative og regenerative prosesser basert på henholdsvis fravær og etterfølgende retur av pigmentert vev3. Siden PTU vil hemme ytterligere pigmentering, men ikke depigment vev når melanogenese har begynt21, PTU må legges før utbruddet av pigmentering, som begynner rundt 24 HPF i sebrafisk25. Her, og i tidligere studier 4,5, PTU har blitt lagt til ca 6 HPF26 for å sikre hemming før melanin syntese begynner. Mens PTU muliggjør visualisering av viktige protokolltrinn, kan PTU-behandling påvirke noen aspekter av utviklingen (som diskutert i trinn 2.3) og svekke embryo klekking. Sistnevnte prosess, hvis forsinket for lenge, kan føre til morfologi og motilitet underskudd og påvirke levedyktighet40; Dermed er dechorionating (hatching) embryoer enten enzymatisk med pronase eller manuelt ved hjelp av tang på 2-3 dpf viktig for å opprettholde og standardisere larvalhelse før genetisk ablasjon. En annen viktig vurdering for å unngå problemer med eldre larvhelse og levedyktighet (ikke relatert til PTU-behandling), er at larver bør begynne standardiserte fôringsregimer hvis de forblir ute av et vannanleggssystem forbi 9 dpf / 4 dpi for eksperimenter41.

Som forklart driver rpe65a transgene uttrykk i moden RPE i de sentrale to tredjedeler av det bakre øyet. Uttrykk for eGFP i PTU-behandlede 5 dpf larver oppdages normalt lett og synlig intens (lys), som vist i figur 1. Larver som svakt uttrykker eGFP ved 5 dpf sammenlignet med søsken med lyst uttrykk, kan også observeres. Variasjon i uttrykksintensitetsforhold (dvs. lys vs. dim) mellom generasjoner kan også eksistere, med noen generasjoner som har mer svakt uttrykke larver enn andre. I alle fall representerer larver med svakt eGFP-uttrykk vanligvis et mindretall av dyrene i hver kobling. Selv om det er ukjent om svakt uttrykke larver viser mindre alvorlige RPE-skadefenotyper, har det blitt utført ablasjoner i den lyse eGFP + -kohorten fra hver kobling, og relativt svake søsken har blitt euthanized ved screening og utelukket fra analyse. På samme måte har omfattende karakterisering av sebrafisk RPE-ablasjons- og regenereringsfenotyper blitt utført i larver heterozygot for rpe65a:nfsB-eGFP-transgene, ved å outcrossing rpe65a:nfsB-eGFP heterozygote voksne til wildtype voksne3. Det er imidlertid usannsynlig, ikke kjent, om larver homozygote for rpe65a:nfsB-eGFP viser mer alvorlige ablasjonsfenotyper. Andre anstrengelser for å standardisere ablasjonsprotokollen inkluderer tilsetning av like, målte volumer (f.eks. 30 ml per 10 cm Petri-tallerken) til MTZ- og MTZ+-retter i løpet av den genetiske ablasjonsperioden på 24 timer. På samme måte har larver i farmakologiske behandlingsretter fått like, målte volumer (f.eks. 5 ml per 6-brønn) og rettidig etterfylling av friske forbindelser (f.eks. hver 24. time). Ved håndtering av retter med ulike MTZ- og/eller farmakologiske forbindelser, bør det treffes nøye tiltak for å forhindre søl og utilsiktet krysskontaminering under transport og vannforandringer.

Sebrafisken RPE ablasjonsprotokoll kan endres for å inkludere farmakologisk manipulasjon (trinn 5). Dette har tidligere blitt gjort for å identifisere immunrespons5, mTOR4 og Wnt3 signalveier som kritiske regulatorer for RPE-regenerering; sistnevnte har vist seg å være repeterbar her og ble brukt til å validere RpEGEN. I tillegg til å belyse kritiske RPE-regenereringsveier, har farmakologisk manipulasjon vært mye brukt til sebrafisk retinal regenereringsstudier 10,42,43,44,45,46,47. Før inkorporering i RPE-ablasjonsprotokollen bør farmakologiske midler evalueres grundig for toksisitet, effekt og behandlingsvarighet. Dette kan gjøres ved å: utføre doseresponseksperimenter for å vurdere toksisitet48; vurdere uttrykk for kjente målgener/-proteiner 4,5; og evaluere kjente funksjonelle konsekvenser av farmakologisk manipulasjon, for eksempel uttømming av leukocytter med PLX3397 behandling 48,49,50,51. Her ble DMSO (kjøretøykontroll) og IWR-1 lagt til 24 timer før genetisk ablasjon og larver ble screenet umiddelbart før farmakologisk forbehandling på 4 dpf. Mens eGFP + larver skiller seg fra eGFP-larver på 4 dpf, kan intensiteten av eGFP virke ganske svak, og derfor ble larver rescreened for eGFP-uttrykk på 5 dpf (Representative Results). Screening for eGFP før 4 dpf kan være vanskelig, da uttrykket kan være så lavt som å være uoppdagelig for øyet. Dermed kan forbehandling med farmakologiske midler før 4 dpf (dvs. på 2 dpf)4 legges til uskjermede larver som vil bli skilt på 5 dpf når eGFP er tydelig synlig. I ethvert scenario der larver må manipuleres (f.eks. under screening, innebygging for avbildning, etc.), bør farmakologiske behandlingstilstander opprettholdes, og uavhengig av screeningalder bør RPE ablated med MTZ på 5 dpf.

I tillegg til den genetiske ablasjonsprotokollen er trinnvise instruksjoner for forhåndsbehandling av konfokalt mikroskopbilde og automatisert kvantifisering av RPE-regenerering ved hjelp av RpEGEN skissert (trinn 6-7). RpEGEN ble opprettet for å standardisere RPE regenerering kvantifisering på tvers av brukere og øke robustheten av utgangsdatasettet, samtidig minimere iboende skjevheter som kan komme med kjedelig manuell kvantifisering gjort tidligere. Kritiske aspekter ved denne delen av protokollen utføres under ROI-generering (trinn 6). Først må bildet/øyet være i dorsal up, distal venstre retning (f.eks. figur 3A-D, figur 4) slik RpEGEN er optimalisert for denne retningen. Det er også kritisk at de dorsale og ventrale terminalendene på RPE ROIene taper til en spiss spiss som vist i figur 3B',B",D',D" (magenta linjer). Hvis disse endene i stedet er kvadrert eller avrundet, kan RpEGEN-skriptet ha problemer med å bestemme start- og sluttpikslene for midtlinjeskjelettet og kan generere sporer ved terminal-ROI-ender i stedet for en sentralisert linje (figur 4B). Spurs ved terminalen ROI-ender kan føre til forkorting av midtlinjen under avsporing (figur 4D) og/eller problemer med vinkelavstandsmålinger i den eksterne RPE (figur 4G). Identiske navnesystemer for TIF- og ROI-filene som tilsvarer hver enkelt larve er også et betydelig skritt og avgjørende for å parre 8-biters TIF-filen med riktig avkastning i RpEGEN. TIF- og ROI-filnavn som ikke samsvarer, vil føre til at arbeidsflyten for RpEGEN-behandling ikke genereres, som er beskrevet i delen Representative Results (figur 4), og til slutt forhindre RPE-autogenereringsnummerantifisering ved hjelp av dette skriptet.

Samlet gir denne protokollen instruksjoner for å lykkes med å fyre opp RPE i larval sebrafisk, for å manipulere signalveier som kan være av interesse pre-, under eller post-RPE skade, og å kvantifisere RPE regenerering på en standardisert måte med begrensede iboende fordommer. I sammenheng med tilgjengelige in vivo - og in vitro-modeller for å studere RPE's regenerative potensial, er sebrafisken unik i sin kapasitet for iboende RPE-regenerering14. Dette er imidlertid en akutt modell av RPE-skade, ikke kronisk som RPE degenerative sykdommer rettet mot terapeutisk utvikling (f.eks. AMD). Selv om dette er en begrensning av modellen, er det fortsatt en utmerket plattform for å studere mekanismene for RPE-regenerering, som i stor grad er ukjente, og kan være tilpasningsdyktige i fremtiden for å studere kronisk skade og sykdom. Verktøyene og metodikken som er beskrevet her, er allsidige og kan også brukes på studier av cellulære prosesser involvert i degenerativ respons og for å studere skjebnen til RPE-tilstøtende vev etter ablasjon. På samme måte kan RpEGEN-skriptet endres for å passe til brukernes datautdatabehov. for eksempel for å utføre romlige analyser av andre markører enn pigment (f.eks. in situ hybridiseringssonder , proteinuttrykk, etc.).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

L.L.L. er medoppfinneren på US Patent #9,458,428, som beskriver en fremskyndet metode for å utlede retinal pigment epitel fra humane pluripotente stamceller; Dette er ikke relatert til innholdet i dette dokumentet. J.M.G. og G.B.F. har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Arbeidet som er beskrevet her, ble støttet av National Institutes of Health (RO1-EY29410 til J.M.G, og NIH CORE Grant P30-EY08098 til Institutt for oftalmologi); UPMC immuntransplantasjons- og terapisenter (til L.L.L. og J.M.G.); og E. Ronald Salvitti-stolen i oftalmologiforskning (til J.M.G.). Ytterligere støtte ble mottatt fra Wiegand Fellowship i Oftalmologi (til L.L.L), Eye &Ear Foundation of Pittsburgh, og et ubegrenset stipend fra Research to Prevent Blindness, New York, NY. Forfattere ønsker også å takke Amanda Platt for teknisk assistanse og Dr. Hugh Hammer og vannpersonalet for utmerket dyrepleiestøtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) Millipore Sigma D9542
6-well plates Fisher Scientific 07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 05-539-13 Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing pen Fisher Scientific 50-254-51 Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % Fisher Scientific BP231 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large) Fisher Scientific 3720A
Embryo incubator (mini/tabletop) Labnet I5110A
Fluorescence stereo microscope Zeiss Axio Zoom.V16 Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-4 Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo Millipore Sigma 5.04462 Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder) Fisher Scientific BP117-100 Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ) Millipore Sigma M3761 Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU) Millipore Sigma P7629 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free Fisher Scientific AA433689M Chemical waste, proper disposal required
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 10 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets) Millipore Sigma P3813 Used to make 10 X PBS stock
Pronase Millipore Sigma PRON-RO
Shaking incubator Benchmark H2010 Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscope Leica S9i Or similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forceps Fine Science Tools 91150-20 Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shaker Scilogex SK-D1807-E
Transfer pipette Millipore Sigma Z135003 3.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Pentair TRS1, TRS2, TRS5 Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ) FIJI (Fiji is Just ImageJ) https://imagej.net/software/fiji/ Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tos MathWorks https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB support MathWorks https://www.mathworks.com/support.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
  3. Hanovice, N. J., et al. Regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium after widespread genetic ablation. PLoS Genetics. 15 (1), 1007939 (2019).
  4. Lu, F., Leach, L. L., Gross, J. M. mTOR activity is essential for retinal pigment epithelium regeneration in zebrafish. bioRxiv. , (2021).
  5. Leach, L. L., Hanovice, N. J., George, S. M., Gabriel, A. E., Gross, J. M. The immune response is a critical regulator of zebrafish retinal pigment epithelium regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (21), (2021).
  6. Zenno, S., Koike, H., Tanokura, M., Saigo, K. Gene cloning, purification, and characterization of nfsb, a minor oxygen-insensitive nitroreductase from escherichia coli, similar in biochemical properties to frase I, the major flavin reductase in vibrio fischeri. The Journal of Biochemistry. 120 (4), 736-744 (1996).
  7. Hamel, C. P., et al. Molecular cloning and expression of rpe65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post-transcriptionally regulated in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15751-15757 (1993).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
  10. White, D. T., et al. Immunomodulation-accelerated neuronal regeneration following selective rod photoreceptor cell ablation in the zebrafish retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 3719-3728 (2017).
  11. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
  12. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. The Journal of Comparative Neurology. 518 (6), 800-814 (2010).
  13. Hagerman, G. F., et al. Rapid recovery of visual function associated with blue cone ablation in zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0166932 (2016).
  14. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).
  15. Chiba, C., et al. Visual cycle protein rpe65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt. The Journal of Comparative Neurology. 495 (4), 391-407 (2006).
  16. Yoshii, C., Ueda, Y., Okamoto, M., Araki, M. Neural retinal regeneration in the anuran amphibian xenopus laevis post-metamorphosis: Transdifferentiation of retinal pigmented epithelium regenerates the neural retina. Developmental Biology. 303 (1), 45-56 (2007).
  17. Xia, H., Krebs, M. P., Kaushal, S., Scott, E. W. Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in mrl/mpj mice. Experimental Eye Research. 93 (6), 862-872 (2011).
  18. McGill, T. J., et al. Subretinal transplantation of human central nervous system stem cells stimulates controlled proliferation of endogenous retinal pigment epithelium. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 43 (2019).
  19. Salero, E., et al. Adult human rpe can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
  20. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature Chemical Biology. 5 (2), 100-107 (2009).
  21. Whittaker, J. R. An analysis of melanogenesis in differentiating pigment cells of ascidian embryos. Developmental Biology. 14 (1), 1-39 (1966).
  22. Westerfield, M. Zebrafish Book, 5th Edition; A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregon, USA. (2007).
  23. Hammer, H. S. Water quality for zebrafish culture in The Zebrafish in Biomedical Research. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. 321-335 (2020).
  24. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  25. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  26. Camp, E., Lardelli, M. Tyrosinase gene expression in zebrafish embryos. Development Genes and Evolution. 211 (3), 150-153 (2001).
  27. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  28. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PloS One. 7 (6), 40132 (2012).
  29. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and igf signaling. PLoS One. 6 (8), 22991 (2011).
  30. Leary, S., et al. Avma Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , American veterinary medical association. Schaumburg, Illinois, USA. (2020).
  31. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on cryosections from embryonic and adult zebrafish eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, 4779 (2007).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Muir, D. GitHub - ReadImageJROI. , Available from: https://github.com/DylanMuir/ReadImageJROI (2021).
  34. Morel, P. Gramm: Grammar of graphics plotting in matlab. Journal of Open Source Software. 3 (23), 568 (2018).
  35. Reinhardt, R., et al. Sox2, tlx, gli3, and her9 converge on rx2 to define retinal stem cells in vivo. The EMBO Journal. 34 (11), 1572-1588 (2015).
  36. Schonthaler, H. B., et al. Evidence for rpe65-independent vision in the cone-dominated zebrafish retina. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1940-1949 (2007).
  37. Yazulla, S., Studholme, K. M. Neurochemical anatomy of the zebrafish retina as determined by immunocytochemistry. Journal of Neurocytology. 30 (7), 551-592 (2001).
  38. Larison, K. D., Bremiller, R. Early onset of phenotype and cell patterning in the embryonic zebrafish retina. Development. 109 (3), 567-576 (1990).
  39. Dwass, M. Modified randomization tests for nonparametric hypotheses. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (1), 181-187 (1957).
  40. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: A refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  41. Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
  42. Meyers, J. R., et al. Β-catenin/wnt signaling controls progenitor fate in the developing and regenerating zebrafish retina. Neural Development. 7, 30 (2012).
  43. Tappeiner, C., et al. Inhibition of the tgfβ pathway enhances retinal regeneration in adult zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0167073 (2016).
  44. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, o-phospho-l-serine, suppresses müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Experimental Eye Research. 91 (5), 601-612 (2010).
  45. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (38), 15858-15863 (2011).
  46. Lemmens, K., et al. Matrix metalloproteinases as promising regulators of axonal regrowth in the injured adult zebrafish retinotectal system. The Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1472-1493 (2016).
  47. Elsaeidi, F., Bemben, M. A., Zhao, X. F., Goldman, D. Jak/stat signaling stimulates zebrafish optic nerve regeneration and overcomes the inhibitory actions of socs3 and sfpq. The Journal of Neuroscience. 34 (7), 2632-2644 (2014).
  48. Van Dyck, A., et al. Müller glia-myeloid cell crosstalk accelerates optic nerve regeneration in the adult zebrafish. Glia. 69 (6), 1444-1463 (2021).
  49. Conedera, F. M., Pousa, A. M. Q., Mercader, N., Tschopp, M., Enzmann, V. Retinal microglia signaling affects müller cell behavior in the zebrafish following laser injury induction. Glia. 67 (6), 1150-1166 (2019).
  50. Chen, S., Lathrop, K. L., Kuwajima, T., Gross, J. M. Retinal ganglion cell survival after severe optic nerve injury is modulated by crosstalk between jak/stat signaling and innate immune responses in the zebrafish retina. Development. 149 (8), (2022).
  51. de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Marro, J., Jaźwińska, A. Distinct effects of inflammation on preconditioning and regeneration of the adult zebrafish heart. Open Biology. 6 (7), 160102 (2016).

Tags

Biologi Utgave 181 sebrafisk retinal pigment epitel nitroreductase metronidazol genetisk ablasjon regenerering pigmentering farmakologiske forbindelser RpEGEN
Nitroreductase/Metronidazole-Mediert ablasjon og en MATLAB-plattform (RpEGEN) for å studere regenerering av Sebrafish Retinal Pigment Epithelium
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross,… More

Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross, J. M. Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (181), e63658, doi:10.3791/63658 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter