Analyse af hjertekontraktil dysfunktion og Ca²⁺ forbigående i gnavermyocytter

Summary

Et sæt protokoller præsenteres, der beskriver måling af kontraktil funktion via sarkomerlængdedetektion sammen med calcium (Ca²⁺) forbigående måling i isolerede rottemyocytter. Anvendelsen af denne tilgang til undersøgelser i dyremodeller af hjertesvigt er også inkluderet.

Abstract

Kontraktil dysfunktion og Ca²⁺ transienter analyseres ofte på celleniveau som en del af en omfattende vurdering af hjerteinduceret skade og / eller ombygning. En tilgang til vurdering af disse funktionelle ændringer anvender ubelastet forkortelse og Ca²⁺ forbigående analyser i primære voksne hjertemyocytter. Til denne fremgangsmåde isoleres voksne myocytter ved kollagenasefordøjelse, gøres Ca²⁺ tolerant og klæbes derefter til lamininbelagte dæksler efterfulgt af elektrisk tempo i serumfrie medier. Den generelle protokol anvender voksne rotte hjertemyocytter, men kan let justeres til primære myocytter fra andre arter. Funktionelle ændringer i myocytter fra skadede hjerter kan sammenlignes med falske myocytter og / eller med in vitro terapeutiske behandlinger. Metoden inkluderer de væsentlige elementer, der er nødvendige for myocyttempo, sammen med cellekammeret og platformkomponenterne. Den detaljerede protokol for denne tilgang inkorporerer trinene til måling af ubelastet forkortelse ved sarkomerlængdedetektion og cellulære Ca²⁺ transienter målt med den ratiometriske indikator Fura-2 AM samt til rådataanalyse.

Introduction

Analysen af hjertepumpefunktionen kræver ofte en række tilgange for at få tilstrækkelig indsigt, især for dyremodeller af hjertesvigt (HF). Ekkokardiografi eller hæmodynamiske målinger giver indsigt i in vivo hjertedysfunktion¹, mens in vitro-tilgange ofte anvendes til at identificere, om dysfunktion opstår som følge af ændringer i myofilamentet og / eller Ca²⁺ forbigående, der er ansvarlig for kobling af excitation eller handlingspotentialet med kontraktil funktion (f.eks. excitation-sammentrækning [E-C] kobling). In vitro-tilgange giver også mulighed for at screene det funktionelle respons på neurohormoner, vektorinducerede genetiske ændringer samt potentielle terapeutiske midler² , inden der forfølges dyre og / eller besværlige in vivo-behandlingsstrategier .

Der findes flere metoder til at undersøge in vitro kontraktil funktion, herunder kraftmålinger i intakt trabeculae³ eller permeabiliserede myocytter⁴, samt losset forkortelse og Ca²⁺ transienter i intakte myocytter i nærvær og fravær af HF ^5,6. Hver af disse tilgange fokuserer på hjertemyocytkontraktil funktion, som er direkte ansvarlig for hjertepumpefunktion ^2,7. Analysen af både sammentrækning og E-C-kobling udføres dog oftest ved at måle forkortelse af muskellængden og Ca 2+ transienter i isolerede, Ca²⁺ tolerante voksne myocytter. Laboratoriet bruger en detaljeret offentliggjort protokol til at isolere myocytter fra rottehjerter til dette trin⁸.

Både Ca²⁺ forbigående og myofilamenter bidrager til forkortelse og forlængelse i intakte myocytter og kan bidrage til kontraktil dysfunktion ^2,7. Således anbefales denne fremgangsmåde, når in vitro funktionel analyse kræver en intakt myocyt indeholdende Ca²⁺ cykelmaskiner plus myofilamenterne. For eksempel er intakte isolerede myocytter ønskelige til undersøgelse af kontraktil funktion efter ændring af myofilamentet eller Ca²⁺ cykelfunktionen via genoverførsel⁹. Derudover foreslås en intakt myocyttilgang til analyse af neurohormonernes funktionelle virkning, når man studerer virkningen af nedstrøms anden messenger-signalveje og / eller respons på terapeutiske midler². En alternativ måling af belastningsafhængig kraft i enkelte myocytter udføres oftest efter membranpermeabilisering (eller flåning) ved lave temperaturer (≤15 °C) for at fjerne Ca²⁺ forbigående bidrag og fokusere på myofilamentfunktion¹⁰. Måling af belastningsafhængig kraft plus Ca²⁺ transienter i intakte myocytter er sjælden på grund af den komplekse og tekniske udfordring ved tilgang¹¹, især når der er behov for højere gennemstrømning, såsom til måling af reaktioner på neurohormonsignalering eller som en skærm for terapeutiske midler. Analysen af hjertetrabeculae overvinder disse tekniske udfordringer, men kan også påvirkes af ikke-myocytter, fibrose og / eller ekstracellulær matrixombygning². Hver af de ovenfor beskrevne tilgange kræver et præparat indeholdende voksne myocytter, fordi neonatale myocytter og myocytter afledt af inducerbare pluripotente stamceller (iPSC'er) endnu ikke udtrykker det fulde komplement af voksne myofilamentproteiner og normalt mangler niveauet af myofilamentorganisation, der er til stede i den voksne stavformede myocyt². Til dato tyder beviser i iPSC'er på, at den fulde overgang til voksne isoformer overstiger mere end 134 dage i kultur¹².

I betragtning af denne samlings fokus på HF inkluderer protokollerne tilgange og analyse til at differentiere kontraktil funktion i svigtende versus ikke-svigtende intakte myocytter. Repræsentative eksempler er givet fra rottemyocytter undersøgt 18-20 uger efter en supra-renal coarctation, beskrevet tidligere ^5,13. Der foretages derefter sammenligninger med myocytter fra shambehandlede rotter.

Protokollen og billeddannelsesplatformen beskrevet her bruges til at analysere og overvåge ændringer i forkortelse og Ca²⁺ transienter i stavformede hjertemyocytter under udviklingen af HF. Til denne analyse belægges 2 x 10⁴ Ca 2+-tolerante, stavformede myocytter på²² mm² lamininbelagte glasdæksler (CS'er) og dyrkes natten over, som beskrevet tidligere⁸. De komponenter, der er samlet til denne billeddannelsesplatform, sammen med de medier og buffere, der bruges til optimal billeddannelse, findes i materialetabellen. En guide til dataanalyse ved hjælp af en software og de repræsentative resultater findes også her. Den overordnede protokol er opdelt i separate underafsnit, hvor de første tre sektioner fokuserer på isolerede rottemyocytter og dataanalyse efterfulgt af cellulære Ca²⁺ forbigående eksperimenter og dataanalyse i myocytter.

Protocol

Undersøgelser udført på gnavere fulgte Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals og blev godkendt af University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee. Til denne undersøgelse blev myocytter isoleret fra 3-34 måneder gamle Sprague-Dawley og F344BN rotter, der vejer ≥ 200 g⁵. Både mandlige og kvindelige satser blev brugt.

1. Myocyttempo til kontraktile funktionsundersøgelser

1. Lav friske M199-baserede medier til hvert sæt isolerede myocytter (materialetabel). 1 dag før pacing, plade 2 x 10⁴ Ca 2+-tolerante, stavformede myocytter på²² mm² lamininbelagte glasdæksler (CS'er), som beskrevet tidligere⁸.
2. For at forberede kamrene blødlægges hvert kammer i 10% blegemiddel i 1 time. Skyl derefter kamrene med rindende ledningsvand i 30-45 min, efterfulgt af destilleret vand udskiftet hvert 5. minut i 30 min, efterfulgt af deioniseret vand udskiftet hvert 5. minut i 30 minutter og en sidste skylning i deioniseret vand.
3. Tør kamrene på en ren overflade i 20-30 min (supplerende figur 1A-C). Derefter UV-behandler kamrene i et biosikkerhedsskab i 5 minutter i hver retning (i alt = 20 min). Dette trin er ikke nødvendigt for præsteriliserede kamre.
   FORSIGTIG: Forlad området for at minimere UV-eksponering.
4. Fjern dækslet fra kammeret, tilsæt 3 ml M199-baserede medier (se Materialetabel) til hver brønd (supplerende figur 1B), udskift dækslet, og forvarm kammeret i en 37 °C inkubator med 5% CO₂ og 20% O₂.
5. Steriliser tang i en varm perlesterilisator ved 250 ° C i 20-25 s. Overfør det forvarmede stimuleringskammer fra inkubatoren til et biosikkerhedsskab.
6. Overfør hver dækslip (CS) indeholdende hjertemyocytter til individuelle brønde i stimuleringskammeret ved hjælp af sterile tang. Overfør CS'er fire ad gangen efterfulgt af opvarmning i 10 minutter før overførslen af de resterende fire CS'er for at opretholde medietemperaturen.
7. Fastgør bananstik til stimuleringskammeret i den ene ende (supplerende figur 1C) og til stimulatoren i den anden ende (supplerende figur 1D).
8. Indstil stimulatorfrekvensen til 0,2 Hz og indstil spændingen (~ 12 V) for at opnå sammentrækning i ~ 10% -20% af alle de stavformede hjertemyocytter i en brønd. For at bestemme antallet af kontraherende myocytter skal du placere kammeret under et omvendt mikroskop med 4x til 10x forstørrelse.
9. Stimuleringskammeret anbringes i en inkubator ved 37 °C i 5 % CO₂ (supplerende figur 1E). Skift mediet hver 12. time ved hjælp af medier, der er forvarmet i en 37 °C, 5% CO₂ inkubator i 20-25 min. Fortsæt elektrisk stimulering i op til 3 dage med mediet skiftet hver 12. time.

2. Kontraktil funktionsanalyse af voksne rotte hjertemyocytter

1. Forvarm en gelpakke og et medie i en 37 °C inkubator i 30 minutter før forsøget.
2. Tænd for de kontraktile funktionsplatformskomponenter, der er anført i materialetabellen og vist i supplerende figur 2, med særlig opmærksomhed på nøglekomponenterne, som omfatter en vibrationsdæmpende tabel (supplerende figur 2A-1) med et omvendt mikroskop med et dybt rødt (590 nm) filter (supplerende figur 2A-2,3) og CCD-kamera (supplerende figur 2A-4) tilsluttet en CCD-controller (supplerende figur 2A-5 og Supplerende figur 2C-5) og integreret med en pc-computer (supplerende figur 2B-14).
3. Saml slanger i peristaltisk pumpe (supplerende figur 2A-8; Supplerende figur 2A-8), overfør den forvarmede gelpakke til rørholderen (supplerende figur 2A-9), og tænd for vakuumet (supplerende figur 2A-11) og strømmen til cellestimulatoren (supplerende figur 2B-13).
4. Placer et 50 ml rør med medier i den isolerede rørholder (supplerende figur 2A-9) og begynd perfusion ved ~ 0,5 ml / min gennem den peristaltiske pumpeslange (supplerende figur 2E-8).
5. Tilsæt en lille mængde forvarmede medier til en lille vejebåd (~ 2 ml). Overfør en CS indeholdende myocytter fra stimuleringskammeret til vejebåden. Stimuleringskammeret sættes tilbage til 37 °C i 5 % CO₂ -inkubatoren.
6. Fjern CS fra vejebåden, og tør forsigtigt undersiden af. Overfør CS til et nysmurt CS-kammer (supplerende figur 2A, F-10; sort pil) og tilsæt forsigtigt en dråbe medier (~ 200 μL) på CS.
7. Placer en platinelektrodemontering over CS (supplerende figur 2F; grå pil) og læg en ny CS over toppen ved hjælp af tang. Placer en topmontering (supplerende figur 2F; hvid pil) over CS-sandwichen, og installer derefter to eller fire #0 pan-head skruer for at afslutte samlingen af kammeret.
8. Når mediet er til stede i hele pumpeslangen, skal du fastgøre slangen til forvarmeren og derefter tilslutte forvarmeren til CS-kammeret, der er samlet i trin 2.7. Begynd perfusion ved 0,5 ml / min og læg en vævsserviet under kammeret for at sikre, at der ikke er lækager.
9. Placer CS-kammeret i sceneadapteren. Det perfunderede medie opsamles i den modsatte ende af kammeret med slanger forbundet til et vakuumsystem. Tænd for varmesystemet (supplerende figur 2A, D-7), og ligevægte kammeret, målet og forvarmeren i ~ 5-10 minutter for at opnå en konstant medietemperatur på 37 ° C. Visualiser myocytter med 40x vandnedsænkningsmålet på mikroskopet i løbet af denne ækvilibreringstid.
10. Aktiver tempostimulatoren (supplerende figur 2B-13) ved at indstille spændingen til 1,5x den indstilling, der er nødvendig for, at 80% af stavformede celler kan trække sig sammen, hvilket typisk er 35-40 V. Indstil stimuleringsfrekvensen til 0,2 Hz for at optimere kontraktil funktion og myocytoverlevelse.
11. Saml kontraktile forkortelses- og forlængelsesspor fra kontinuerligt perfunderede og tempofyldte myocytter. For at indsamle afkortningsmålinger skal du bruge et CCD-kamera (supplerende figur 2A-4), der er tilsluttet en CCD-controller (supplerende figur 2B-5, C) og en dedikeret computer med et I/O-controllerkort (supplerende figur 2B-14; se materialetabel). Platformen måler sarkomerforkortelse i rottemyocytter, selvom lignende resultater opnås fra myocytmålinger indsamlet fra myocyternes langsgående kanter (se Ecklerle et ^al.14).
12. Hvis du vil indsamle spor, der forkorter sarkomer, skal du åbne softwaren på computeren, vælge OK og derefter Filer > ny. Forbered en skærmskabelon ved at vælge Spor > Rediger brugergrænser > Sarcomerelængde og derefter angive maksimum- og minimumværdier, som typisk er mellem 2,0 μm og 1,5 μm. Kalibrer CCD-kameraet med en 0,01 mm graticule, inden der foretages målinger i myocytterne (figur 1D).
13. Hvis du vil registrere sporinger af sarkomerlængde, skal du vælge Filer > nye. Identificer en kontraherende myocyt, og placer myocytten langs kameraets længdeakse, så striationsmønsteret er lodret (figur 1B).
14. Brug computermusen til at placere feltet af interesse (ROI) (lyserød boks) over myocytten (figur 1C). Vælg Indsaml og start for at optage kontraktil funktion. Optag forkortelse for 60 s fra hver myocyt ved lave stimuleringsfrekvenser (≤0,5 Hz).
15. Optag sarkomerforkortelse fra 5-10 celler pr. CS. Udfør målinger ved 1 celle/CS, hvis undersøgelser omfatter behandling med agonister/antagonister. Forbered separate forvarmede medier og et andet, dedikeret stykke perfusionsrør fyldt i en flerkanals peristaltisk pumpe, og følg trin 2.9.-2.14. at måle virkningen af lægemiddel- eller neurohormonlevering på myocytkontraktil funktion.
16. For at måle forkortelse over en række frekvenser skal du pace myocytter ved hver frekvens for at opnå steady-state forkortelse før optagelse⁵. For disse undersøgelser skal du fordoble perfusionshastigheden og begynde at optage 15-20 s efter stimulering ved en ny frekvens for at opnå konsistente steady-state kontraktile responser for frekvenser i området 0,2 Hz og 2 Hz. Optag typisk ikke mere end 2 myocytter / CS til forkortelse på tværs af det givne spektrum af stimuleringsfrekvenser.
17. Optag mindst 7 sammentrækninger/celle for at opnå pålidelige signalgennemsnitsdata, når du analyserer optagelserne (se trin 3.).

3. Dataanalyse af kontraktil funktion i isolerede myocytter

1. For at begynde skal du vælge Filer, vælge en optaget sporing og derefter vælge Åbn. Vælg fane 1 (venstre side) af basissporingen, og indstil derefter det gule panel øverst på sporingen til Sarc-Length. Vælg Spor og den skærmskabelon, der er udarbejdet i trin 2.12.
2. Hvis du vil forberede en analyseskabelon, skal du vælge Operations, Monotonic Transient Analysis Options, TTL Event Mark i feltet Definition of t0 samt følgende indstillinger i menuen: Baseline (hvilende sarcomere længde), Afgangshastighed i forhold til t0 (dep v), Peak (peak height og%peak height/baseline eller bl%peak h), Return rate relative to tPeak (ret v), Tid til at toppe 50 % (TTP 50 %) ved hjælp af t0 og Tid til oprindelig plan 50 % (TTR_{50 %}) ved hjælp af tPeak. Gem disse analyseindstillinger ved at vælge Skabeloner > Gem analyseskabelon med et id. Indlæs denne analyseskabelon, før du analyserer hver sporing.
3. Hvis du vil starte dataanalysen, skal du vælge Mærker > Gate > Tilføj midlertidige > konvertere fra hændelsesmærke > analyseområde. Indstil nu tidsintervallet fra -0,01 s til 1,20 s for myocytter paced på 0,2 Hz (figur 2A, røde mærker på den nederste del af det rå spor). Vælg et kortere tidsinterval for myocytter stimuleret ved højere frekvenser.
4. Opret en signalgennemsnitlig sporing ved at vælge Handlinger > gennemsnitlige hændelser. En signalgennemsnitlig optagelse vises under det oprindelige basisspor.
5. Vælg fane 1 i sporingen af signalgennemsnittet (venstre side af skærmen), og vælg derefter Mærker i den øverste menu efterfulgt af Tilføj forbigående. Vælg Operationer i topmenuen og Monotonisk transient analyse for at få vist signalgennemsnitsværdierne for baseline sarkomerlængde, tophøjde, bl%peak h, dep v, ret v, TTP 50% og TTR_50% i signalgennemsnittet displaypanel.
6. Overfør hver sarcomere forbigående analyse til et regneark til sammensat analyse af flere myocytter ved at vælge Eksporter > monotonisk forbigående analyse > udklipsholderstrøm. Indsæt disse data i regnearket for hver sporing.
7. Hvis du vil kopiere sporingen med signalgennemsnit, skal du vælge Eksporter > aktuel sporing > Udklipsholder > indstillinger og angive decimalerne til 5, derefter vælge Afgrænser for faner og klikke på OK og OK. Indsæt de signalgennemsnitlige spor for hver myocytoptagelse i et andet regneark.

4. Optagelse af Ca²⁺ transienter i voksne hjertemyocytter hos rotter

1. Før måling af Ca 2+ transienter skal du tænde for platformskomponenterne beskrevet i trin 2.2. sammen med yderligere fluorescensbilleddannelseskomponenter (se yderligere komponenter til Ca²⁺ billedanalyse i materialetabellen; Supplerende figur 2A-5,6; 2B-12).
2. Der fremstilles Fura-2AM stamopløsning indeholdende 1 mM Fura-2AM plus 0,5 M probenecid i dimethylsulfoxid (DMSO). Probenecid minimerer Fura-2AM lækage¹⁵.
3. Stamopløsningen fortyndes til 5 μM Fura-2AM og 2,5 mM probenecid i 2,5 ml medier (se Materialetabel) i en brønd af en 6-brøndsplade. Tilsæt 2,5 ml medier alene (ingen Fura-2AM) til tre ekstra brønde i pladen, dæk pladen med aluminiumsfolie, og forvarm mediet til 37 ° C.
4. Overfør en CS indeholdende myocytter fra tempokammeret til brønden, der indeholder Fura-2AM, dæksel, og sæt pladen tilbage til 37 ° C inkubatoren med 5% CO₂ i 4 min. Monter slanger i perfusionspumpen og perfuse med medier under Fura-2AM-belastningsperioden, som beskrevet i trin 2.4.
5. Sluk eller minimer rumlys for at reducere fluorescensfotoblegning og for at optimere fluorescenssignalet. Fjern 6-brøndspladen fra inkubatoren, og vask derefter CS i 10 s i hver af de tre brønde, der indeholder medier alene. Overfør CS til en lille vejebåd, der indeholder forvarmede medier (ingen tilføjet Fura-2AM).
6. Monter CS til nysmurt CS-kammer efter forsigtigt at have tørret undersiden af CS. Tilsæt forsigtigt en dråbe medier til CS, og saml derefter elektrodebeslaget over CS efterfulgt af en anden CS og den øverste montering. Brug #0 pan-head skruer til at afslutte samlingen af cellekammeret, som beskrevet i trin 2.6.-2.7.
7. Tilslut pumpeslangen fyldt med medier til forvarmeren, tilslut forvarmeren til CS-kammeret, og anbring i en trinadapter som beskrevet i trin 2.8. Mediet opsamles med vakuumslangesystemet, og varmesystemet tændes (supplerende figur 2A,D-7) for at ækvilibrere kammeret til 37 °C som beskrevet i trin 2.8.-2.9.
8. Aktivér tempostimulatoren (supplerende figur 2B-13) indstillet til 35-40 V og 0,2 Hz, som beskrevet i trin 2.10.
9. Før du optager en Ca²⁺ transient, skal du tænde en lille lommelygte eller boglygte, der er monteret i nærheden af computertastaturet, for at hjælpe med at se tastaturet. Derudover skal du registrere fluorescensbaggrunden i et område uden hjertemyocytter. For at starte skal du vælge Filer > Start > nyt som beskrevet i trin 2.12.
10. Vælg et investeringsafkast, og angiv en fane (eller sporingslinje i venstre side) for rå tæller og en anden fane for rå nævner, defineret øverst i midten af hver fane. Optag baggrunden for 10-20 s. Højreklik med musen, og træk over et sporingspanelpanel for at få de rå signalgennemsnitlige tæller- og nævnerværdier. Angiv disse værdier ved at vælge Operationer > konstanter, og angiv råværdierne.
11. Forbered en ny skærmskabelon til at indsamle både forkortelse og Ca²⁺ transienter. For sarkomerlængde skal du vælge fane 1 og bruge den samme proces som beskrevet i trin 2.13. For Ca²⁺ -billeddannelse skal du vælge Faneblad 2 > Forhold (øverst i midten af fanen) > Sporer > Rediger brugergrænser for at indstille minimums- og maksimumniveauerne for forholdet, som typisk er angivet mellem 1 og 5. Brug den samme proces til at definere tæller- og nævnerintervallerne for fane 3 og 4 (venstre side).
12. Placer en ROI-boks over et myocytbillede som beskrevet i trin 2.14. Vælg Filer > nye > indsamle. Vælg nu Start for at indsamle forkortelses- og ratiometriske Ca²⁺ -data. Optag ≥7 sammentrækninger/celle til signalgennemsnitlig analyse.
13. Gentag den baggrundssporingsoptagelse, der er beskrevet i trin 4.10. efter optagelse af 2-4 myocytter. Optag typisk 4-5 myocytter / CS eller færre myocytter, hvis der er betydelige ændringer i baggrundslæsningen.

5. Dataanalyse af Ca²⁺ transienter i isolerede myocytter.

1. Åbn den ønskede fil til analyse, og vælg Skabeloner > skærmskabelon til forkortelse plus Ca²⁺ transienter. Vælg derefter fanerne 1 og 2 (venstre) for at vise henholdsvis sarkomerlængde og Ca²⁺ -forhold. Vælg Operationer > konstanter , og indtast tæller- og nævnerværdierne fra baggrundssporet Ca²⁺ .
2. Forbered analyseskabeloner til forkortelse plus Ca²⁺ forbigående data. Vælg fane 1 (venstre side), og brug den samme proces som beskrevet i trin 3.2. for at indstille skabelonen til analyse af sarkomerlængde.
3. Vælg fane 2 (venstre side), og vælg Operations, Monotonic Transient Analysis Options, TTL-hændelsesmærke i feltet Definition af t0 og følgende indstillinger i menuen: Baseline (basalforhold), Afgangshastighed i forhold til t0 (dep v), Peak (peak-højde og%peak height/baseline eller bl%peak h), Decay velocity relative to tPeak (ret v), Tid til at toppe 50 % (TTP 50 %) ved hjælp af t0 og Tid til oprindelig plan 50 % (TTR_{50 %}) ved hjælp af tPeak. Gem disse analyseindstillinger ved at vælge Skabeloner og Gem analyseskabelon ved hjælp af et nyt id-navn. Indlæs denne analyseskabelon, før du analyserer hver sporing.
4. Brug den samme proces som beskrevet i trin 3.3.-3.6. for at gennemsnit signalet og derefter analysere sarkomerlængden efterfulgt af de samme trin for Ca²⁺ transienter. Indstil separate mærker for sarkomerlængde og for Ca²⁺ forbigående forholdssporing.

Representative Results

Kontraktile funktionsundersøgelser udføres på rottemyocytter fra dagen efter isolering (dag 2) op til 4 dage efter isolation. Selvom myocytter kan registreres dagen efter isolering (dvs. dag 2), kræves der ofte længere kulturtider efter genoverførsel eller behandlinger for at ændre kontraktil funktion⁸. For myocytter, der dyrkes i mere end 18 timer efter isolering, hjælper pacingprotokollen beskrevet i punkt 1 med at opretholde t-tubuli og konsekvente afkortnings- og forlængelsesresultater.

En repræsentativ del af en CS indeholdende myocytter til forkortelse af undersøgelser er vist i figur 1A sammen med en passende placeret myocyt inden indstilling af ROI (figur 1B). Når et investeringsafkast er identificeret (figur 1C; lyserød boks), hjælper algoritmeoplysningerne vist under myocytten også med at optimere myocytpositionering inden optagelse. Specifikt er den lineære optiske tæthed (LOD; sort linje) en indikator for antallet og afstanden mellem sarkomerer, og et skarpt effektspektrum i det hurtige Fourier-transformationsspor (FFT, rød linje) hjælper med at opnå optimal justering til optagelse af forkortelse og forlængelse. Graticulemønsteret, der anvendes til kalibrering af sarkomerlængde (og kantdetektion), er vist i figur 1D. En typisk justeret registrering af afkortning af sarkomerlængden er vist i figur 2A (øverste panel) sammen med den signalgennemsnitlige analyse beskrevet i afsnit 3 (nederste panel).

Dysfunktion opdages ofte i myocytter, når der er in vivo dysfunktion i dyremodeller. For eksempel påvises systolisk dysfunktion observeret ved ekkokardiografi som reaktion på trykoverbelastning (PO)¹³ også i myocytforkortelsesstudier⁵. For at illustrere dataspor vises repræsentative rå (figur 2; øvre panel) og signalgennemsnit (figur 2; nederste panel) spor opnået ved 0,2 Hz for myocytter fra sham- (figur 2A) og PO-behandlede (figur 2B) rotter. For at teste, om myocytfunktionen kunne reddes efter PO, blev viral-medieret genoverførsel på tidspunktet for myocytisolering også brugt til at erstatte endogen hjertetroponin I (cTnI) med en phospho-mimetisk cTnI T144D-substitution (T144D) i sarcomere¹⁶. Den indledende analyse viser den PO-inducerede reduktion i kontraktil funktion (tabel 1, øvre panel) returneret mod falske niveauer i PO-myocytter 4 dage efter genoverførsel af cTnIT144D (tabel 1; nederste panel).

Denne platform kan også bruges til at måle Ca²⁺ transienter sammen med forkortelse i isolerede myocytter. Forkortelse og Ca 2+ blev ikke registreret efter PO, fordi PO reducerer adhærensen af rottemyocytter til laminin¹³, og en sammenlignelig model viste tidligere ændret Ca²⁺ håndtering udvikler sig på et lignende tidspunkt¹⁷. I stedet blev repræsentative eksperimenter udført i Fura-2AM-belastede myocytter isoleret fra 2-3 måneder gamle rotter. En repræsentativ registrering og signalgennemsnitlige spor er vist i figur 3 sammen med dataanalysen i tabel 2. Til dette sæt eksperimenter blev myocytter isoleret fra voksne rotter undersøgt 4 dage efter adenoviral-medieret genoverførsel (infektionsmultiplikation = 100) af cTnIT144D eller vildtype cTnI. Både sarkomerforkortelse og Ca 2⁺ transienter blev målt efter indlæsning af myocytter med Fura-2AM. Genoverførsel af cTnIT144D forbedrede topforkortelse og forhøjede diastoliske Ca²⁺ niveauer sammenlignet med cTnI i disse indledende undersøgelser (tabel 2). Mens der er behov for mere omfattende analyse, tyder de første resultater på, at in vivo-udskiftning med cTnIT144D kan producere en kompleks hjertefænotype på grund af ændringer i både kontraktil funktion og Ca²⁺ -håndtering over tid.

Figur 1: Voksne rotters hjertemyocytter anvendt til funktionelle undersøgelser. (A) Repræsentative isolerede hjertemyocytter fra en voksen rotte (skalabar = 50 μm). Pilen peger på en repræsentativ myocyt, der er afbildet til kontraktil funktionsanalyse. (B) Repræsentativ myocyt med en ROI (lyserød) placeret på siden (skala bar = 20 μm). (C) Repræsentativ myocyt med et ROI (øverste panel), sarkomermønsteret for denne myocyt (nederste panel, blå; skalabjælke = 20 μm) og den skarpe top af effektspektret (nederste panel, rød). (D) Skærmbillede af 0,01 mm graticule til kalibrering af afkortningsmålingerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Repræsentative optagelser fra rottemyocytter. En rå optagelse (øverste panel) og signalgennemsnit (nederste panel) spor registreret ved 0,2 Hz i myocytter fra (A) sham- og (B) trykoverbelastning (PO) behandlede rotter. Myocytter blev isoleret 18-20 uger efter operationen, med PO produceret ved supra-renal coarctation¹³. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Repræsentativ registrering og analyse af sarkomerlængde (SL) og Ca 2+ transienter fra Fura-2AM-belastede voksne hjertemyocytter. (A) Rå spor for SL, Ca 2+ forbigående forhold (forhold) og tæller- og nævnerspor, der bruges til at producere Ca²⁺ forbigående forhold. (B) Et eksempel på signalgennemsnitlige spor for SL (øvre spor) og Ca²⁺ transient ratio (nedre spor). (C) Spor analyseres for sarkomerlængde (SL) og Ca²⁺ forbigående forhold ved hjælp af den monotone sporingsalgoritme. Klik her for at se en større version af denne figur.

Rotte gruppe	Fup (n=30)	Indkøbsordre (n=32)
Hvilende sarcomere længde (mm; SL)	1.761 + 0.006	1.748 + 0.004
tophøjde (% af basislinjen)	9.003 + 0.409	6.680 + 0.552*
Maksimal amplitude (mm)	0.159 + 0.007	0.117 + 0.010*
Afkortningshastighed (mm/s)	-4.674 + 0.285	-4.143 + 0.335
Re-forlængelse hastighed (mm/s)	3.251 + 0.223	2.706 + 0.273
Tid til at toppe (ms; TTP)	60 + 2	59 + 3
Tid til 50% forlængelse (ms; TTR50%)	35 + 2	37 + 3
Rotte gruppe	Sham + cTnIT144D (n = 14)	PO + cTnIT144D (n=17)
Hvilende sarcomere længde (mm; SL)	1.768 + 0.009	1.776 + 0.004
tophøjde (% af basislinjen)	9.038 + 1.339	8.414 + 0.960
Maksimal amplitude (mm)	0.160 + 0.023	0.149 + 0.016
Afkortningshastighed (mm/s)	-5.972 + 0.711	-4.173 + 0.726
Re-forlængelse hastighed (mm/s)	3.925 + 0.577	3.055 + 0.403
Tid til at toppe (ms; TTP)	51 + 5	59 + 2
Tid til 50% forlængelse (ms; TTR50%)	31 + 3	32 + 2

Tabel 1: Sammenligning af kontraktil funktion i hjertemyocytter som reaktion på trykoverbelastning (PO) og genoverførsel. Myocytforkortelsesresultater er fra falske og PO-rottehjerter 18-20 uger efter operationen (øverste panel)^5,13 og myocytter fra falske og PO-rotter 4 dage efter cTnIT144D genoverførsel (nederste panel). Kontraktil funktion måles 4 dage efter myocytisolering/genoverførsel i alle grupper. Resultaterne udtrykkes som middel ± SEM (n = antal myocytter). Hvert sæt falske og PO-data sammenlignes af en studerendes t-test, hvor * p < 0,05 betragtes som statistisk signifikant. Peak amplitude resultater for sham og PO myocytter alene blev rapporteret tidligere i Ravichandran et ^al.5.

	Sarcomere længde analyse
Genoverførselsgruppe	cTnI (n=21)	cTnIT144D (n=16)
Hvilende sarcomere længde (mm; SL)	1.81 + 0.01	1.81 + 0.01
Maksimal amplitude (mm)	0.11 + 0.01	0.14 + 0.02*
Afkortningshastighed (mm/s)	-4.29 + 0.42	-4.67 + 0.77
Re-forlængelse hastighed (mm/s)	2.92 + 0.43	3.71 + 0.64
Tid til at toppe (ms; TTP)	50 + 4	84 + 28
Tid til 50% forlængelse (ms; TTR 50%)	37 + 4	35 + 6
	Ca2+ forbigående analyse
Genoverførselsgruppe	cTnI (n=21)	cTnIT144D (n=19)
Hvilende Ca2+ forhold	0.89 + 0.02	1.04 + 0.04*
Peak Ca2+ forhold	0.50 + 0.05	0.42 + 0.07
Ca2+ forbigående hastighed (D/sek.)	45.24 + 5.85	40.53 + 10.95
Ca2+ henfaldshastighed (D/s)	-4.91 + 0.99	-2.87 + 0.57
Tid til at toppe Ca2+ (ms; TTP)	34 + 2	41 + 3
Tid til 50% Ca2+ henfald (ms; TTD50%)	101 + 8	117 + 6

Tabel 2: Kontraktil funktion og Ca²⁺ transienter i voksne rottemyocytter 4 dage efter cTnIT144D genoverførsel. En analyse af kontraktil funktion (øvre panel) og Ca²⁺ transienter (nederste panel) er vist i myocytter efter genoverførsel af cTnIT144D sammenlignet med vildtype cTnI. Myocytter isoleres fra 2-3 måneder gamle voksne rotter, og data præsenteres som middel ± SEM (n = antal myocytter). Statistiske sammenligninger af kontraktil funktion (venstre) og Ca²⁺ transienter (højre) udføres ved hjælp af en uparret Student's t-test med signifikans indstillet til *p < 0,05.

Supplerende figur 1: Komponenter i pacingsystemet til myocytter belagt på lamininbelagte CS'er. (A) Brugerdefineret tempokammer indeholdende platinelektroder i hvert kammer. (B) Pacing kammer med de første fire kamre fyldt med medier. (C) Pacingkammer fastgjort til bananstikkabler, som er forbundet til kammeret og (D) stimulatoren. E) Forbindelsen mellem stimulatoren (til højre) og rugemaskinen på 37 °C (til venstre). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Komponenter, der er nødvendige for myocytkontraktil funktion og / eller Ca²⁺ forbigående målinger. (A) Den kontraktile funktionsplatform, der viser hver komponent, med de nummererede elementer forklaret mere detaljeret i materialetabellen. Komponenter i platformen inkluderer et antivibrationsbord , omvendt brightfieldmikroskop (# 2,3), CCD-kamera (# 2), CCD-controller og xenon-strømforsyning , dobbeltemissionslyskilde , temperaturregulator , peristaltisk pumpe , isoleret rørholder , dækslipmonteret perfusionskammer (# 10) og vakuumsystem (# 11). (B) Yderligere komponenter omfatter fluorescensgrænsefladen (#12), kammerstimulatoren (#13) og pc-computeren (#14), som forklares mere detaljeret i materialetabellen. Nærbilleder af nummererede elementer i panel A vises i C-F. (C) Visning af xenonstrømforsyningen (venstre) og CCD-controlleren (højre). (D) Temperaturregulator. (E) Peristaltisk pumpe. (F) Visning af basen til CS-perfusionskammeret (sort pil), platinelektrodebeslaget (grå pil) og det øverste beslag (hvid pil) med #0 pan-head skruer. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Den kroniske tempoprotokol, der er skitseret i trin 1, forlænger den nyttige tid til at studere isolerede myocytter og vurdere virkningen af længere behandlinger. I vores laboratorium blev der opnået konsistente resultater op til 4 dage efter isolering ved måling af kontraktil funktion ved hjælp af sarkomerlængde på kronisk pacede myocytter. Myocytkontraktil funktion forværres dog hurtigt, når du bruger medier, der er ældre end 1 uge til at pace myocytter.

For kontraktile funktionsundersøgelser indsamles dataene ved 37 °C, hvilket er tæt på kropstemperaturen for rotter. For at optimere myocyttens levedygtighed og opnå ensartede spor for hver myocyt udføres disse eksperimenter med en tempofrekvens, der er lavere end den fysiologiske puls på ~ 5 Hz hos rotter. Disse indstillinger producerer konsistente kontraktile funktionsdata, men kammertemperatur og / eller tempofrekvens kan justeres, hvis forkortelsessporene forbliver konsistente på tværs af flere CS'er, der indeholder den samme behandlingsgruppe af myocytter. Derudover opnås optimale resultater ved at vælge myocytter, der mangler blebs, overholdes fuldt ud til en CS og trækker sig sammen i begge ender af en stangformet celle. Celler, der kun er fastgjort i den ene ende, dem med flere blebs og / eller myocytter, der kun trækker sig sammen i den ene ende, er ikke ønskelige og er ofte vanskeligere at registrere på grund af baggrundsbevægelse. Til disse undersøgelser er ≥20 sarkomerer inkluderet i ROI for at opnå en skarp effektspektrumtop, reproducerbare hvilende sarkomerlængder og et optimalt signal / støjforhold for forkortelsessporet. En ROI med så få som syv sarkomerer kan bruges, hvis effektspektret peak forbliver skarpt. Den hvilende sarkomerlængde i isolerede rottemyocytter varierer normalt fra 2,00-1,80 μm. Hvis en hvilende sarkomerlængde er mindre end 1,5 μm, er en aktiv sammentrækning ikke realistisk baseret på vores forståelse af sarkomerarkitektur¹⁸ og er normalt resultatet af suboptimal myocytorientering.

Måling af kontraktil funktion med eller uden Ca²⁺ forbigående målinger i intakte myocytter er en tilgang med højere gennemstrømning, der kræver mindre investering i udvikling af den tekniske ekspertise, der er nødvendig for kraftmålinger i intakte enkeltceller¹¹. Intakte myocytundersøgelser fokuserer også udelukkende på myocytfunktion uden bidrag fra andre celletyper i flercellede præparater². Et nyt område på dette område er udviklingen af højere gennemstrømningsanalyse ved samtidig at måle forkortelse og / eller Ca²⁺ transienter i flere intakte myocytter for at fremskynde screeningen af terapeutiske midler på celleniveau forud for mere omfattende in vivo-analyse .

Kontraktil funktion og Ca²⁺ forbigående målinger er også mulige i intakte myocytter isoleret fra andre gnavermodeller såsom mus, selvom der er nogle vigtige overvejelser og forskelle sammenlignet med rottemyocytter. Musemyocytter er levedygtige i kultur i 24-36 timer, men levedygtigheden falder gradvist i myocytter dyrket i mere end 48 timer¹⁹. Dette afkortede kulturinterval bør overvejes, når der anvendes vektorbaseret genoverførsel, især for myofilamentproteiner, der har en halveringstid i dage snarere end timer²⁰. I modsætning til rottemyocytter afhænger den vellykkede isolering og dyrkning af musemyocytter også af tilsætning af myosin ATPase-hæmmere, såsom 2,3-butandionmonoxid eller blebbistatin, til kulturmedier¹⁹. Som følge heraf er kronisk tempo ikke en levedygtig mulighed i musemyocytkulturer. En længere ligevægtstid på 15-20 minutter er også nødvendig for at fjerne den funktionelle virkning af disse myosinhæmmere på isolerede musemyocytter. Endelig er musemyocytter optimalt pacet ved 0,5 Hz for at opnå reproducerbare afkortningsspor sammenlignet med de 0,2 Hz, der anvendes til rottemyocytter.

I undersøgelser af PO-behandlede rotter påvises kontraktil dysfunktion konsekvent med lavfrekvent tempo i rottemyocytter. En større frekvensafhængig reduktion i forkortelse påvises også i myocytter efter PO sammenlignet med falske rotter, når der er in vivo kontraktil dysfunktion ^5,13. Under en undersøgelse med en række frekvenser producerede en fordobling af pumpehastigheden for at tilvejebringe tilstrækkelige medier steady-state-forkortelse inden for 15-20 s efter ændring af stimuleringsfrekvensen mellem 0,2 og 2 Hz. Rottemyocytter reagerer også på kortvarig stimulering ved højere frekvenser op til 8 Hz, selvom cellelevedygtigheden hurtigt forringes ved disse højere frekvenser. Samlet set har myocytkontraktil funktion vist sig at være en reproducerbar tilgang til at bekræfte eller validere in vivo hjertedysfunktion i rottemodeller, såsom PO- sammenlignet med skambehandlede rotter (tabel 1; se Kim et al.13). Derudover kan denne platform teste, om en behandling rettet mod myocytter genopretter eller forringer kontraktil funktion, inden den forfølger dyrere og / eller besværlige in vivo-tilgange. Både akut fødsel og længere eksponering for terapeutiske midler og / eller efter genlevering under primær kultur er mulige ved hjælp af denne tilgang. For eksempel indikerer genoverførselseksperimenter til erstatning af endogen cTnI med cTnIT144D ingen signifikant ændring i forkortelse af amplitude i myocytter fra falske rotter. I modsætning hertil genopretter cTnIT144D maksimal forkortelsesamplitude mod skinværdier i myocytter fra PO-behandlede rotter (tabel 1). En iboende svaghed ved denne tilgang er fraværet af den typiske belastning, der er til stede i myocytter under in vivo-forhold. Som følge heraf kan responser afvige fra belastningsafhængige funktionelle reaktioner, og eksempeleksperimentet indikerer, at in vivo-tilgange er nødvendige for yderligere at undersøge, om cTnIT144D forbedrer hjerteydelsen under PO.

Måling af både forkortelse og Ca²⁺ transienter i samme myocyt er en fordel ved denne platform. For eksempel kan ændringsretningen variere for Ca²⁺ transienter sammenlignet med kontraktil funktion. Som vist i tabel 2 øges topforkortelsen signifikant efter genoverførsel af cTnIT144D til myocytter fra 2-3 måneder gamle rotter. Dette resultat adskiller sig fra data opnået i ældre, sham-behandlede myocytter (tabel 1) og kan være relateret til rottealder⁵. Der er dog behov for yderligere test for at bevise denne fortolkning. Dataene i tabel 2 viser også, at cTnIT144D ikke ændrer den maksimale Ca 2+ amplitude og i stedet har tendens til at bremse Ca 2+ henfaldshastigheden og hæve hvilende Ca ²⁺. Disse resultater tyder på, at cTnIT144D-ekspression forbedrer kontraktil funktion, mens Ca²⁺ cykelmaskiner kompenserer for at dæmpe denne effekt. Disse resultater fremhæver denne tilgangs evne til at skelne mellem ændringer i kontraktil funktion og Ca²⁺ cykling. Mens de specifikke resultater, der præsenteres her, endnu ikke er endelige, giver de en solid begrundelse for at udvikle en genetisk dyremodel til at udtrykke myokardie cTnIT144D og vurdere, om dens udtryk dæmper dysfunktion forårsaget af PO i fremtiden. En sidste observation fra Ca 2⁺ forbigående data er, at fluorescerende farvestoffer som Fura-2AM ændrer den kontraktile funktionskinetik i myocytter²¹. Selvom det relative respons produceret af en given behandlings- eller dyremodel er sammenlignelig inden for Fura-2-belastede myocytter, bør disse resultater ikke kombineres med forkortede målinger foretaget i fravær af Fura-2AM. For at optimere brugen af Fura-2AM til Ca 2+ forbigående analyse måler laboratoriet oftest forkortelse i fravær af Fura-2AM og udfører en delmængde af eksperimenter til måling af Ca²⁺ transienter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEDIA
Bovine serum albumin	Sigma (Roche)	3117057001	Final concentration = 0.2% (w/v)
Glutathione	Sigma	G-6529	Final concentration = 10 mM
HEPES	Sigma	H-7006	Final concentration = 15 mM
M199	Sigma	M-2520	1 bottle makes 1 L; pH 7.45
NaHCO3	Sigma	S-8875	Final concentration = 4 mM
Penicillin/streptomycin	Fisher	15140122	Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin
REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Fura-2AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	50 μg/vial;  Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;  Final Fura2-AM concentration in media is  5 μM
Probenicid	Invitrogen (Fisher)	P36400	Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM
MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING
#1 22  mm2 glass coverslips	Corning	2845-22
3 x 36 inch cables with banana jacks	Pomona Electronics	B-36-2	Supplemental Figure 1, panel C
37oC Incubator  with 95% O2:5% CO2	Forma	3110	Supplemental Figure 1, panel E.  Multiple models are appropriate
Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp	Forma	1286	Multiple models are appropriate
Forceps - Dumont #5 5/45	Fine Science Tools	11251-35
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	1800-45
Low magnification inverted microscope	Leica	DM-IL	Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes;  4X and 10X objectives recommended
Pacing chamber	Custom		Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22
Stimulator	Ionoptix	Myopacer	Supplemental Figure 1, panel D.
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS			ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options
Additional components for Ca2+ imaging analysis	Ionoptix	Essential system components: -- Photon counting system            --  Xenon power supply with dual excitation light source            --  Fluorescence interface	- The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera  (panel A #4).                                                                      - The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm  excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.                                                                                                                                 - The fluorescence interface between the computer and  light source is shown in panel B, #12.
CCD camera with image acquisition  hardware and software (240 frames/s)	Ionoptix	Myocam with CCD controller	Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4  and  panel A #5 & panel C #5 (right), respectively.  The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).
Chamber stimulator	Ionoptix	Myopacer	Panel B, #13; Alternative:  Grass model S48
Coverslip mounted perfusion chamber	Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws  (arrow, panel F)		Panel A #10 & panel F;   Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).  Commercial alternatives:  Ionoptix FHD or C-stim cell  chambers; Cell MicroControls culture stimulation system
Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients	Ionoptix	PC with Ionwizard PC board and software	Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric  Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. - A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.  The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).
Forceps - Dumont #5 TI	Fine Science Tools	11252-40	Panel F
Insulated tube holder for media	Custom		Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm
Inverted brightfield microscope	Nikon	TE-2000S	Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.   A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.
Isolator Table	TMC Vibration Control	30 x 36 inches	Panel A, #1; Desirable:  elevated shelving, Faraday shielding
Microscope eyepieces & objective	Nikon	10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective	Panel A #3; 40X objective:  n.a. 0.08; w.d. 2 mm.  A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).          NOTE:  water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls 3	Panel A #8 and panel E
small weigh boat	Fisher	08-732-112
Temperature controller	Cell MicroControls	TC2BIP	Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.    A preheater and objective heater are recommended for this platform.  A Cell MicroControls HPRE2 preheater and  HLS-1 objective heater are controlled  by the TC2BIP temperature controller for our studies.
Under cabinet LED light with motion sensor	Sylvania	#72423 LED light	Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..  Alternative:  A clip on flashlight/book light with flexible neck - multiple suppliers are available.
Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter	Fisher	Tygon tubing - E363;  polypropylene Ehrlenmeyer flask - 10-182-50B; Vacuum filter - 09-703-90	Panel A #11