Et sæt protokoller præsenteres, der beskriver måling af kontraktil funktion via sarkomerlængdedetektion sammen med calcium (Ca2+) forbigående måling i isolerede rottemyocytter. Anvendelsen af denne tilgang til undersøgelser i dyremodeller af hjertesvigt er også inkluderet.
Kontraktil dysfunktion og Ca2+ transienter analyseres ofte på celleniveau som en del af en omfattende vurdering af hjerteinduceret skade og / eller ombygning. En tilgang til vurdering af disse funktionelle ændringer anvender ubelastet forkortelse og Ca2+ forbigående analyser i primære voksne hjertemyocytter. Til denne fremgangsmåde isoleres voksne myocytter ved kollagenasefordøjelse, gøres Ca2+ tolerant og klæbes derefter til lamininbelagte dæksler efterfulgt af elektrisk tempo i serumfrie medier. Den generelle protokol anvender voksne rotte hjertemyocytter, men kan let justeres til primære myocytter fra andre arter. Funktionelle ændringer i myocytter fra skadede hjerter kan sammenlignes med falske myocytter og / eller med in vitro terapeutiske behandlinger. Metoden inkluderer de væsentlige elementer, der er nødvendige for myocyttempo, sammen med cellekammeret og platformkomponenterne. Den detaljerede protokol for denne tilgang inkorporerer trinene til måling af ubelastet forkortelse ved sarkomerlængdedetektion og cellulære Ca2+ transienter målt med den ratiometriske indikator Fura-2 AM samt til rådataanalyse.
Analysen af hjertepumpefunktionen kræver ofte en række tilgange for at få tilstrækkelig indsigt, især for dyremodeller af hjertesvigt (HF). Ekkokardiografi eller hæmodynamiske målinger giver indsigt i in vivo hjertedysfunktion1, mens in vitro-tilgange ofte anvendes til at identificere, om dysfunktion opstår som følge af ændringer i myofilamentet og / eller Ca2+ forbigående, der er ansvarlig for kobling af excitation eller handlingspotentialet med kontraktil funktion (f.eks. excitation-sammentrækning [E-C] kobling). In vitro-tilgange giver også mulighed for at screene det funktionelle respons på neurohormoner, vektorinducerede genetiske ændringer samt potentielle terapeutiske midler2 , inden der forfølges dyre og / eller besværlige in vivo-behandlingsstrategier .
Der findes flere metoder til at undersøge in vitro kontraktil funktion, herunder kraftmålinger i intakt trabeculae3 eller permeabiliserede myocytter4, samt losset forkortelse og Ca2+ transienter i intakte myocytter i nærvær og fravær af HF 5,6. Hver af disse tilgange fokuserer på hjertemyocytkontraktil funktion, som er direkte ansvarlig for hjertepumpefunktion 2,7. Analysen af både sammentrækning og E-C-kobling udføres dog oftest ved at måle forkortelse af muskellængden og Ca 2+ transienter i isolerede, Ca2+ tolerante voksne myocytter. Laboratoriet bruger en detaljeret offentliggjort protokol til at isolere myocytter fra rottehjerter til dette trin8.
Både Ca2+ forbigående og myofilamenter bidrager til forkortelse og forlængelse i intakte myocytter og kan bidrage til kontraktil dysfunktion 2,7. Således anbefales denne fremgangsmåde, når in vitro funktionel analyse kræver en intakt myocyt indeholdende Ca2+ cykelmaskiner plus myofilamenterne. For eksempel er intakte isolerede myocytter ønskelige til undersøgelse af kontraktil funktion efter ændring af myofilamentet eller Ca2+ cykelfunktionen via genoverførsel9. Derudover foreslås en intakt myocyttilgang til analyse af neurohormonernes funktionelle virkning, når man studerer virkningen af nedstrøms anden messenger-signalveje og / eller respons på terapeutiske midler2. En alternativ måling af belastningsafhængig kraft i enkelte myocytter udføres oftest efter membranpermeabilisering (eller flåning) ved lave temperaturer (≤15 °C) for at fjerne Ca2+ forbigående bidrag og fokusere på myofilamentfunktion10. Måling af belastningsafhængig kraft plus Ca2+ transienter i intakte myocytter er sjælden på grund af den komplekse og tekniske udfordring ved tilgang11, især når der er behov for højere gennemstrømning, såsom til måling af reaktioner på neurohormonsignalering eller som en skærm for terapeutiske midler. Analysen af hjertetrabeculae overvinder disse tekniske udfordringer, men kan også påvirkes af ikke-myocytter, fibrose og / eller ekstracellulær matrixombygning2. Hver af de ovenfor beskrevne tilgange kræver et præparat indeholdende voksne myocytter, fordi neonatale myocytter og myocytter afledt af inducerbare pluripotente stamceller (iPSC’er) endnu ikke udtrykker det fulde komplement af voksne myofilamentproteiner og normalt mangler niveauet af myofilamentorganisation, der er til stede i den voksne stavformede myocyt2. Til dato tyder beviser i iPSC’er på, at den fulde overgang til voksne isoformer overstiger mere end 134 dage i kultur12.
I betragtning af denne samlings fokus på HF inkluderer protokollerne tilgange og analyse til at differentiere kontraktil funktion i svigtende versus ikke-svigtende intakte myocytter. Repræsentative eksempler er givet fra rottemyocytter undersøgt 18-20 uger efter en supra-renal coarctation, beskrevet tidligere 5,13. Der foretages derefter sammenligninger med myocytter fra shambehandlede rotter.
Protokollen og billeddannelsesplatformen beskrevet her bruges til at analysere og overvåge ændringer i forkortelse og Ca2+ transienter i stavformede hjertemyocytter under udviklingen af HF. Til denne analyse belægges 2 x 104 Ca 2+-tolerante, stavformede myocytter på22 mm2 lamininbelagte glasdæksler (CS’er) og dyrkes natten over, som beskrevet tidligere8. De komponenter, der er samlet til denne billeddannelsesplatform, sammen med de medier og buffere, der bruges til optimal billeddannelse, findes i materialetabellen. En guide til dataanalyse ved hjælp af en software og de repræsentative resultater findes også her. Den overordnede protokol er opdelt i separate underafsnit, hvor de første tre sektioner fokuserer på isolerede rottemyocytter og dataanalyse efterfulgt af cellulære Ca2+ forbigående eksperimenter og dataanalyse i myocytter.
Den kroniske tempoprotokol, der er skitseret i trin 1, forlænger den nyttige tid til at studere isolerede myocytter og vurdere virkningen af længere behandlinger. I vores laboratorium blev der opnået konsistente resultater op til 4 dage efter isolering ved måling af kontraktil funktion ved hjælp af sarkomerlængde på kronisk pacede myocytter. Myocytkontraktil funktion forværres dog hurtigt, når du bruger medier, der er ældre end 1 uge til at pace myocytter.
For kontraktile funktionsun…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde støttes af National Institutes of Health (NIH) tilskud R01 HL144777 (MVW).
MEDIA | |||
Bovine serum albumin | Sigma (Roche) | 3117057001 | Final concentration = 0.2% (w/v) |
Glutathione | Sigma | G-6529 | Final concentration = 10 mM |
HEPES | Sigma | H-7006 | Final concentration = 15 mM |
M199 | Sigma | M-2520 | 1 bottle makes 1 L; pH 7.45 |
NaHCO3 | Sigma | S-8875 | Final concentration = 4 mM |
Penicillin/streptomycin | Fisher | 15140122 | Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin |
REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING | |||
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
Fura-2AM | Invitrogen (Molecular Probes) | F1221 | 50 μg/vial; Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO; Final Fura2-AM concentration in media is 5 μM |
Probenicid | Invitrogen (Fisher) | P36400 | Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM |
MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING | |||
#1 22 mm2 glass coverslips | Corning | 2845-22 | |
3 x 36 inch cables with banana jacks | Pomona Electronics | B-36-2 | Supplemental Figure 1, panel C |
37oC Incubator with 95% O2:5% CO2 | Forma | 3110 | Supplemental Figure 1, panel E. Multiple models are appropriate |
Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp | Forma | 1286 | Multiple models are appropriate |
Forceps – Dumont #5 5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 1800-45 | |
Low magnification inverted microscope | Leica | DM-IL | Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes; 4X and 10X objectives recommended |
Pacing chamber | Custom | Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22 | |
Stimulator | Ionoptix | Myopacer | Supplemental Figure 1, panel D. |
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS | ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options | ||
Additional components for Ca2+ imaging analysis | Ionoptix | Essential system components: — Photon counting system – Xenon power supply with dual excitation light source – Fluorescence interface | - The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera (panel A #4). – The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6. – The fluorescence interface between the computer and light source is shown in panel B, #12. |
CCD camera with image acquisition hardware and software (240 frames/s) | Ionoptix | Myocam with CCD controller | Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4 and panel A #5 & panel C #5 (right), respectively. The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14). |
Chamber stimulator | Ionoptix | Myopacer | Panel B, #13; Alternative: Grass model S48 |
Coverslip mounted perfusion chamber | Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws (arrow, panel F) | Panel A #10 & panel F; Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller). Commercial alternatives: Ionoptix FHD or C-stim cell chambers; Cell MicroControls culture stimulation system | |
Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients | Ionoptix | PC with Ionwizard PC board and software | Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. – A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator. The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below). |
Forceps – Dumont #5 TI | Fine Science Tools | 11252-40 | Panel F |
Insulated tube holder for media | Custom | Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm | |
Inverted brightfield microscope | Nikon | TE-2000S | Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging. A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging. |
Isolator Table | TMC Vibration Control | 30 x 36 inches | Panel A, #1; Desirable: elevated shelving, Faraday shielding |
Microscope eyepieces & objective | Nikon | 10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective | Panel A #3; 40X objective: n.a. 0.08; w.d. 2 mm. A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below). NOTE: water immersion dispensers also are now available for water-based objectives. |
Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | Panel A #8 and panel E |
small weigh boat | Fisher | 08-732-112 | |
Temperature controller | Cell MicroControls | TC2BIP | Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC. A preheater and objective heater are recommended for this platform. A Cell MicroControls HPRE2 preheater and HLS-1 objective heater are controlled by the TC2BIP temperature controller for our studies. |
Under cabinet LED light with motion sensor | Sylvania | #72423 LED light | Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light.. Alternative: A clip on flashlight/book light with flexible neck – multiple suppliers are available. |
Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter | Fisher | Tygon tubing – E363; polypropylene Ehrlenmeyer flask – 10-182-50B; Vacuum filter – 09-703-90 | Panel A #11 |