Summary
利用 卵 电穿孔，我们设计了一种选择性转染鸡胚胎中听觉内耳和耳蜗核的方法，以实现在电路组装的离散期间脆性X智力迟钝蛋白的细胞组特异性敲低。
Abstract
脆性X染色体智力低下蛋白（FMRP）是一种调节局部蛋白质翻译的mRNA结合蛋白。FMRP丧失或功能障碍导致脆性X综合征（FXS）的神经元和突触活动异常，其特征是智力障碍，感觉异常和社会沟通问题。FMRP功能和FXS发病机制的研究主要在转基因动物中使用 Fmr1 （编码FMRP的基因）敲除进行。在这里，我们 报告了一种体内 方法，该方法用于使用鸡胚胎确定FMRP在电路组装和突触形成期间的细胞自主功能。该方法采用含有 Fmr1 小发夹RNA（shRNA）和EGFP报告基因的药物诱导载体系统的阶段，位点和方向特异性电穿孔。通过这种方法，我们在听觉神经节（AG）及其脑干靶标之一大细胞核（NM）中实现了选择性FMRP敲低，从而在AG-NM电路中提供了组件特异性操作。此外，转染的镶嵌模式允许动物内对照和邻近神经元/纤维比较，以提高数据分析的可靠性和灵敏度。诱导载体系统提供基因编辑开始的时间控制，以最大限度地减少累积的发育影响。这些策略的组合为剖析FMRP在突触和电路发育中的细胞自主功能提供了一种创新工具。
Introduction
脆性 X 综合征 （FXS） 是一种以智力障碍、感觉异常和自闭症行为为特征的神经发育障碍。在大多数情况下，FXS是由从早期胚胎阶段开始的脆性X智力迟钝蛋白（FMRP;由Fmr1基因编码）的全球损失引起的1。FMRP是一种RNA结合蛋白，通常在大脑中的大多数神经元和神经胶质细胞以及感觉器官中表达2，3，4。在哺乳动物的大脑中，FMRP可能与数百种编码对各种神经活动很重要的蛋白质的mRNA有关5。对常规Fmr1基因敲除动物的研究表明，FMRP表达对突触神经传递的组装和可塑性尤为重要6。一些条件和马赛克敲除模型进一步证明，FMRP作用和信号在几个发育事件中因大脑区域，细胞类型和突触部位而异，包括轴突投影，树突状图案和突触可塑性7，8，9，10，11，12，13，14.通过在脑切片或培养的神经元中细胞内递送抑制性FMRP抗体或FMRP本身来研究FMRP在调节突触传递方面的急性功能15，16，17，18。然而，这些方法不能在开发过程中跟踪FMRP误表达诱导的后果。因此，非常需要开发体内方法来研究FMRP的细胞自主功能，并有望帮助确定FXS患者中报告的异常是相关神经元和回路中FMRP丢失的直接后果，还是发育过程中网络范围变化的继发性后果19。
鸡胚胎的听觉脑干为电路和突触发育中FMRP调节的深入功能分析提供了一个独特的优势模型。易于获得胚胎鸡脑和成熟的用于遗传操作的 卵 电穿孔技术极大地促进了我们对早期胚胎阶段大脑发育的理解。在最近发表的一项研究中，该技术与先进的分子工具相结合，可以对FMRP错误表达进行时间控制20，21。在这里，该方法被推进到分别诱导突触前和突触后神经元的选择性操作。这种方法是在听觉脑干回路中开发的。声音信号由听觉内耳中的毛细胞检测到，然后传递到听神经节（AG;在哺乳动物中也称为螺旋神经节）。AG中的双极神经元通过其外周过程支配毛细胞，进而将中枢投影（听觉神经）发送到脑干，在那里它们终止于两个初级耳蜗核，即大细胞核（NM）和角核（NA）。NM中的神经元在结构和功能上与哺乳动物前腹侧耳蜗核的球形灌丛细胞相当。在NM内，听觉神经纤维（ANF） 突触通过 Hold终端22的大端球在NM神经元的躯体上突触。在发育过程中，NM 神经元起源于后脑23 中的菱形 5 和 6 （r5/6），而 AG 神经元源自耳囊24 中的神经母细胞。在这里，我们分别描述了在突触前AG神经元和突触后NM神经元中选择性敲低FMRP表达的过程。
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Protocol
鸡蛋和鸡胚胎按照暨南大学动物护理和使用委员会批准的动物规程进行谨慎和尊重的处理。
1. 卵子和质粒制备
- 鸡蛋准备
- 从华南农业大学获得新鲜受精鸡蛋（Gallus gallus），并在孵化前储存在16°C。为了获得最佳的活力，请在到达后一周内设置所有种蛋进行孵化。
- 将鸡蛋水平放置并在38°C下孵育46-48小时，直到汉堡和汉密尔顿（HH）阶段1225 进行神经管转染，或54-56小时直到HH13进行耳囊转染。由于卵子的动物极比植物极轻，因此水平放置将胚胎放置在卵的顶部以便于操作。在此步骤和所有后续步骤中，请小心保持鸡蛋水平。
- 当使用手电筒从鸡蛋底部投射光线时，胚胎的位置在蛋壳上显示为黑暗区域。在所需的HH阶段，使用这种手电筒方法用铅笔标记胚胎在蛋壳上的位置。
- 用含有75%乙醇的纱布擦拭鸡蛋。用剪刀尖端在鸡蛋的尖端钻一个孔，然后用 2 G 针头注射器取出 18 mL 白蛋白。确保孔仅足够大以允许针头插入。用纱布擦去任何泄漏的白蛋白，并用透明胶带密封孔。
- 为了尽量减少裂缝并防止在开窗过程中掉落的贝壳碎屑，请用透明胶带覆盖鸡蛋的顶部，以铅笔标记的黑暗区域为中心。
- 质粒DNA提取
- 如前所述，使用基于转座子的Tet-on系统克隆鸡Fmr1 shRNA。该系统包含三种质粒：pCAGGS-T2TP、pT2K-CAGGS-rtTA-M2和pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA，提供药物诱导载体系统，通过该系统，Fmr1 shRNA和EGFP的表达在转染后沉默，并可通过强力霉素（Dox）诱导开启。
注意：这些质粒目前在存储库中不可用。作者同意根据合理要求提供质粒。 - 根据制造商的说明使用无内毒素制备试剂盒提取质粒DNA，并通过加入1/15体积的7.5 M乙酸钠和1体积的100%异丙醇沉淀。
- 在-20°C下沉淀质粒过夜，并以13，000× g 离心10分钟。用试剂盒中提供的Tris-EDTA缓冲液溶解沉淀至4-5μg/μL的终浓度。 质粒可在-20°C下储存12个月，而不会降低转染效率。
- 在电穿孔当天，使用移液器吸头在无菌离心管中彻底混合 2 μL 每个质粒。所得的 6 μL 体积的质粒混合物足以电穿孔三打卵。为了在电穿孔过程中帮助可视化质粒，每 6 μL DNA 混合物26 加入 1 μL 0.1% 快速绿（在无菌 ddH2O 中制备），使质粒混合物变成蓝色。
- 如前所述，使用基于转座子的Tet-on系统克隆鸡Fmr1 shRNA。该系统包含三种质粒：pCAGGS-T2TP、pT2K-CAGGS-rtTA-M2和pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA，提供药物诱导载体系统，通过该系统，Fmr1 shRNA和EGFP的表达在转染后沉默，并可通过强力霉素（Dox）诱导开启。
2. 卵内 电穿孔
- 卵子窗口化和胚胎鉴定
- 在电穿孔当天，从孵化器中取出鸡蛋，一次一打鸡蛋。将种蛋从孵化器中取出超过 1 小时会引入发育变化并降低活力。
- 用含有75%乙醇的纱布擦拭所有手术工具。
- 将每个鸡蛋放入定制的泡沫架中。用75%乙醇擦拭胶带覆盖的区域，并使用一把小剪刀在铅笔标记的圆周周围切一个窗口（1-2厘米2）（图1A）。切割时，将剪刀平放，以免损坏下面的胚胎。
- 将有窗的鸡蛋放在带有10倍目镜和2倍变焦的立体显微镜下，并识别胚胎。调整光源的角度和亮度以获得更好的可视化效果。
注意：在这个阶段，可视化胚胎和识别神经管需要实践和经验。- 对于初学者，请使用以下可选的墨水注射来促进胚胎识别。在0.01M磷酸盐缓冲盐水（PBS）中制备10%印度墨水溶液，并提前高压灭菌。用墨水溶液填充 1 mL 注射器，然后安装 27G 针头。用镊子将针头弯曲成45°角。
- 在显微镜下，小心地从opaca区域的边缘戳出，然后将针头插入胚胎下方。注入 ~50 μL 墨水，其将扩散到透明区域下方以进行胚胎可视化。墨水将形成深色背景，以清晰地显示胚胎。
注意：在插入和注射之前从注射器中排出空气。熟练地进行可视化时，请避免墨水注入步骤，因为它会降低存活率。
- 神经管注射和电穿孔
注意：此过程在HH12下进行，用于转染脑干中的NM神经元。- 使用移液器拉拔器将玻璃毛细管（直径~1 mm，长100 mm）拉入移液器中。在解剖显微镜下，用镊子小心地将毛细管针的尖端打开直径至10-20μm。将移液器（通常一次5-10个）存放在储物盒中直至使用。
- 通过移液器末端的橡胶管施加负压，用 0.5-1 μL 质粒混合物填充毛细管移液器。这可以通过注射器或气泵来实现。
- 将卵子放在显微镜下，使胚胎垂直定向，尾巴靠近您（或水平方向使用三轴操纵器注射毛细管移液器）。用一只手或三轴机械手握住毛细管移液器，并以尾对头方向将移液器的尖端驱动到 r5/6。
注意：最前的后脑区域是r1，随后沿着神经管的每个凸起都是一个单独的菱形。R5/6与耳囊处于同一前后水平，耳囊是一种易于识别的杯状结构（图1B-C）。 - 轻轻地将尖端穿过卵黄膜并插入背神经管，然后稍微撤回移液器，使尖端在神经管腔内。通过施加气压注入质粒混合物，直到有色质粒完全扩散到 r5/6 中并延伸到 r3 和 r4 中。
注意：没有必要在玻璃膜上制作一个用于注射的槽。 - 检查注射是否成功，这是当蓝色质粒溶液快速扩散到神经管而不泄漏时实现的（图1B-C）。当泄漏发生时，蓝色会迅速褪色。
- 注射后，立即在神经管的两侧放置一个铂双极电极（图1D）。使用电穿孔器提供两个持续时间为 12 V 和 50 ms 的脉冲。观察双极电极末端的气泡，负极端的气泡更多。
- 检查电穿孔是否成功，这是在有色质粒混合物进入电极正极附近的神经管组织时实现的。电穿孔后，小心地取出双极电极。
- 用一块透明薄膜覆盖蛋壳上的窗户，该薄膜预先切成 2 个正方形并喷洒 75% 乙醇。将鸡蛋放回孵化器中。
- 在进行下一个鸡蛋之前，通过在盐水中提供 10-20 V 和 50 ms 持续时间的脉冲来清洁双极电极。
- 耳囊注射和电穿孔
注意：此过程在HH13进行，用于转染内耳中的毛细胞和AG神经元。- 在HH13（~胚胎第2.5天），胚胎已经转动，因此头部的右侧朝上。在显微镜下，将卵子放在垂直的位置，使胚胎垂直，尾巴靠近您。握住毛细管移液管，沿背外侧方向轻轻戳右耳囊（图2A）。
注意：在这个阶段，耳囊在身体顶部显示为一个小的圆形结构，与r5 / 6的前后水平相同。 - 用气压注入质粒混合物，直到耳囊充满蓝色溶液27。检查注射是否成功，这是当蓝色质粒混合物被限制在耳囊内并且不泄漏时实现的。
- 注射后，立即将双极电极放在耳囊上，如图 2B所示。将阳性和阴侧分别放置在耳囊的前方和后方。使用电穿孔器提供两个持续时间为 12 V 和 50 ms 的脉冲。
- 检查电穿孔是否成功，这是当蓝色质粒混合物进入电极正极附近的耳囊组织时实现的。电穿孔后，小心地取出双极电极。用透明薄膜盖住蛋壳上的窗口，然后将鸡蛋放回孵化器。
- 在HH13（~胚胎第2.5天），胚胎已经转动，因此头部的右侧朝上。在显微镜下，将卵子放在垂直的位置，使胚胎垂直，尾巴靠近您。握住毛细管移液管，沿背外侧方向轻轻戳右耳囊（图2A）。
3. 施用 Dox 以启动和维持质粒转录
- Dox溶液的制备
- 在化学罩下测量 100 mg Dox 粉末，并将其溶解在 100 mL 无菌 PBS 中，制成 1 mg/mL 的工作溶液。用0.22μm过滤器过滤溶液，并将1mL等分试样储存在-20°C。 避光20，28。
- Dox 的管理
- 对于全强度基因编辑，在所需年龄前24小时，在冰上解冻Dox等分试样。使用穿透透明薄膜的注射器将 50 μL Dox 直接滴在鸡蛋的脉络膜尿囊膜上。注射后用透明薄膜或胶带密封针孔。
- 为了保持敲低效果，每隔一天施用Dox，直到在所需的发育阶段收获组织。
4. 组织解剖和切片
- 脑干
- 对于胚胎阶段 3 （E3） 和 E6 的胚胎，打开蛋壳并用剪刀剪断相关的膜。用勺子将胚胎取出，并将其浸入0.1M磷酸盐缓冲液中的4%多聚甲醛（PFA）中。
- 对于E9胚胎，打开蛋壳，用剪刀将胚胎斩首，然后将头部转移到装有PBS的硅底板上。将头部向下穿过眼眶，将头骨顶部切开。小心地将镊子从两侧放在大脑下方，并用镊子的肩膀将整个大脑从颅骨抬起。将大脑浸入4%的PFA中。
- 对于E15和E19胚胎，打开蛋壳，用剪刀斩首胚胎，然后将头部放在充满PBS的硅底板上。切开头顶的皮肤以露出头骨。
- 用剃刀垂直切开颅骨，将前脑和尾脑分开。将尾块浸入PBS中，去除头骨顶部，然后将大脑从头骨上取下。
- 将大脑向下固定通过视叶并将小脑和脑干分开。注意不要损坏位于小脑正下方的听觉脑干。从脑干中去除尽可能多的硬脑膜，然后将其浸入4%PFA中。
- 将胚胎和脑组织保持在4°C的4%PFA中过夜，除了E19脑干，应在相同条件下保持24小时。
- 固定后，在含有30%蔗糖的PBS中脱水组织直至沉淀，这通常需要1-3天，具体取决于年龄。
- 使用滑动切片机在冠状平面处以30μm处切片脑干（E15和E19）。在PBS中收集切片并在免疫染色前储存在4°C。
- 对于E3和E6胚胎和E9脑干，横向切片50μm。收集PBS中的切片并储存在4°C。 免疫染色前将切片安装在明胶包被的显微镜载玻片上。收集这些年龄段的较厚切片有助于组织处理。
- 听道
- 从E9、E15和E19胚胎中取出脑干后，嵌入颞骨的听觉管很容易识别，位于颅骨下方，颞骨很容易与周围的头骨分离。对于E9胚胎，将整个颞骨固定在4%PFA中。对于年龄较大的胚胎，去除颞骨的骨结构以隔离听觉管并将听觉管固定在 4% PFA 中。
- 在组织包埋之前，将所有颞骨和听管保持在4°C的4%PFA中过夜。
- 按照描述进行组织包埋。准备包埋溶液如下：将10%明胶（来自牛皮）浸泡在冷水中，直到明胶颗粒膨胀并沉降（约30分钟）。将混合物加热至~50°C以溶解明胶，并在明胶溶液中加入20%蔗糖并搅拌溶解。将明胶 - 蔗糖溶液在4°C下储存长达一个月。
- 使用时，在37°C下加热明胶 - 蔗糖溶液。 将颞骨/听管浸泡在37°C的96孔板上的温明胶 - 蔗糖溶液中，直到它们沉降，通常为30-60分钟。
- 用透明薄膜条排列 12 孔板孔的底部。加入一层温热的明胶-蔗糖溶液，等到它凝固。将颞骨/听管转移到每个孔中。
- 用第二层温热的明胶 - 蔗糖溶液植入组织。调整组织的位置，使其位于凝胶的中心，并且听觉导管水平定向。小心地将板移动到4°C冰箱中，等待凝胶变硬。
- 拉动透明膜条将凝胶组织块移出孔。将多余的凝胶修剪成方形块，并切开块的一角以确定方向。用箔纸包裹明胶块，在干冰上冷冻，然后在-80°C下储存直至切片。
- 用低温恒温器沿听道经度在20μm处切片块。将切片直接安装在涂有明胶的显微镜载玻片上。免疫染色前将载玻片储存在-80°C。
- 在免疫染色之前，将载玻片浸入预热的PBS（45°C）中5分钟以溶解明胶，然后用室温PBS洗涤载玻片3次以除去残留的明胶。
5. 免疫染色和显微镜成像
注意：根据切片是安装在载玻片上还是在PBS中自由浮动，执行两种类型的免疫染色。
- 载玻片上的免疫染色
- 用PBS清洗载玻片3次，每次10分钟。用油笔在包含切片的区域周围画圈，以防止染色过程中液体泄漏。用含有PBS中5%正常山羊血清的封闭溶液覆盖切片，并在室温下孵育30分钟。
- 在含有0.3%TritonX-100和5%正常山羊血清的PBS中稀释一抗（使用的最终浓度请参阅材料表）。取出封闭溶液，然后用一抗溶液覆盖切片。将载玻片在4°C下在底部装有一层蒸馏水的盒子中孵育过夜。
- 用PBS冲洗载玻片3次10分钟。在载玻片上应用在含有 0.3% TritonX-100 的 PBS 中以 1：500 稀释的荧光二抗。将载玻片在室温下孵育4小时，避光。
- 用PBS清洗载玻片3次。将两滴安装剂轻轻滴在载玻片上，并用盖玻片覆盖这些部分。注意不要在盖玻片和载玻片之间产生气泡。
- 全安装胚胎和自由漂浮切片的免疫染色
- 用PBS 3x在孔板中洗涤胚胎/切片10分钟。在离心管中稀释含有 0.3% TritonX-100 和 5% 正常山羊血清的 PBS 中的一抗。将每个胚胎/切片转移到带有玻璃钩的管中，并在4°C下以60rpm在振荡器上孵育过夜。
- 用PBS在孔板中洗涤胚胎/切片3次，每次10分钟。将每个胚胎/切片转移到装有荧光二抗溶液的深色离心管中，并在室温下在摇床上孵育4小时。
- 在孔板中用PBS清洗胚胎/切片3次。使用刷子将切片安装在含有PBS的15厘米培养皿中的明胶涂层显微镜载玻片上。载玻片稍微干燥（~5分钟）后，涂上两滴封片剂并放置盖玻片。注意不要在盖玻片和载玻片之间产生气泡。将整个封片组织保存在PBS中进行成像。
- 成像
- 在带有含有碳粉的硅底的培养皿中对PBS中的整个安装组织进行成像，该培养皿提供黑色背景。使用商业图像处理奥林巴斯软件包捕获和处理图像，如前所述29.
- 如前所述，用共聚焦显微镜对载玻片上的切片进行成像20.使用10倍、20倍和63倍物镜在单个焦平面上对切片进行成像。使用相同的参数捕获来自同一动物的所有图像。注意调整激光电平和成像采集设置，以避免信号饱和。
- 使用斐济软件进行图像处理。为了说明，使用专业的图像编辑软件调整图像亮度、对比度和伽玛。
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Representative Results
通过在不同部位和不同发育阶段进行 卵 电穿孔，我们在听觉外周或听觉脑干中实现了选择性FMRP敲低。
新墨西哥州的FMRP敲低
如前所述，设计针对鸡Fmr1的小发夹RNA（shRNA）并将其克隆到Tet-On载体系统中20。 卵内电穿孔的设置如图1A所示。将带有快速绿色着色的质粒DNA在HH12下以r5 / r6水平注射到神经管中（图1B-C）。在r5/6水平的神经管的每一侧放置一个铂双极电极（图1D）。传递两个12 V脉冲以将质粒驱动到电极正极附近的组织中。将Dox施加在脉络膜尿囊膜上以触发Fmr1 shRNA和EGFP的表达。Dox处理24小时后，EGFP在荧光体视显微镜下明显。图 1E-F 显示了在 E3 上应用 Dox 时的示例。横截面证实了后脑一侧表达EGFP（EGFP +）细胞的位置（图1G-H）。此外，在耳囊前方发现了一组转染的细胞;这些是从神经管腹外侧迁移的颅神经嵴细胞（图1F）。电穿孔胚胎也可以孵育更长时间，以研究后期的回路形成。在E15，在脑干中观察到EGFP，但仅在转染侧（图1I-J）。背侧脑干水平的横截面显示少数EGFP +神经元分散在电穿孔一侧的NM中（图1L）。观察到EGFP+纤维投射到NM神经元的靶标：同侧的背核海带（NL）（图1L）和对侧的腹侧NL（图1K）。与邻近的非转染神经元相比，转染的NM神经元中的FMRP免疫反应性显着降低，验证了Fmr1 shRNA的敲低效果（图1M-N）。在听神经节（AG）中，神经元是非转染的（EGFP-），尽管AG神经元周围的一些神经胶质细胞是EGFP+（图1O-P），可能来源于EGFP+颅神经嵴细胞（见图1F）。因此，这种电穿孔策略提供了AG-NM回路中突触后神经元的选择性转染。
耳管中的FMRP敲低
将质粒混合物以HH13注入耳囊（图2A），然后通过将电极的正侧放置在耳囊前方和负侧置于耳囊后方进行电穿孔（图2B）。E6的全头切片在右耳囊中显示出强烈的EGFP荧光，但在脑干中没有（图2C）。E9处的孤立听道在整个导管长度上表现出广泛的EGFP荧光（图2D-E）。在横截面上，EGFP+细胞在沿耳蜗管壁的基底（BP）和AG中得到证实（图2F-G）。与邻近的非转染毛细胞（•，图2H-J）相比，转染毛细胞（*，图2H-J）中的FMRP免疫反应性显着降低，验证了Fmr1 shRNA的敲低效果。对于支持细胞，FMRP免疫反应性在转染和非转染细胞中都很弱（图2H-J）。与毛细胞类似，与邻近的非转染神经元相比，转染的AG神经元中的FMRP免疫反应性大大降低（图2K-M）。
接下来，我们追踪了转染的AG神经元通过听觉神经向脑干的中心投射。在E6处使用胰岛-1免疫反应性（图3A）进一步证实了AG中Fmr1 shRNA转染的镶嵌模式，胰岛-1是发育中的鸡内耳31的标志物。当在解剖过程中用脑干提取AG的一部分时，在相同的制剂中原位观察分离的EGFP + AG神经元及其在脑干内的纤维（图3B-C）。在NM水平的横向切片上，EGFP+ ANF在E9处到达NM（图3D），并在E15和E19处连续观察到（图3E-F）。高放大倍率图像显示 ANF 在 E9 处的生长锥状末端（图 3H），在 E15 处形成大的手掌状末端球茎，然后它们在 E19 处长成具有复杂分支的 Held 形态的特征末端球茎（图 3I-J）。除了NM之外，在另一个主要耳蜗核NA中也看到了ANF的广泛分支（图3E）。这是意料之中的，因为相同的ANF分叉以支配鸡的NM和NA32。我们还看到EGFP+纤维进入相邻的前庭细胞群，包括下行的前庭核（VeD），如图3E所示。虽然我们优化了电穿电极的位置，以优先靶向形成AG的耳囊前部，但也转染了一些前庭神经节神经元。小白蛋白的免疫染色是鸡中ANF的标志物，可用于区分脑干中的听觉纤维和前庭纤维（图3F-G）。
总之，这种电穿孔策略提供了AG-NM回路中突触前神经元的选择性转染，并可用于跟踪遗传操作后单个末端水平的Held终球的发展。
图1.FMRP击倒鸡NM。（A）电穿孔装置的图像。（B）示意图显示HH12鸡胚的菱形r5/6水平的显微注射部位。缩写：NT = 神经管;SO = 体质。（C）为了提高能见度，用注射器将印度墨水（黑色）注射到胚胎下方。然后将用快速绿色着色的质粒混合物注射到神经管腔中。（D）电穿孔用双极电极的定位。+ 和 - 分别表示正反两面。注意，蓝色质粒混合物在电穿孔后扩散到正侧的神经管中。（E-F） 胚胎第3天（E3）的明场（BF）图像（E）与电穿孔鸡胚胎的EGFP通道（F）合并，显示耳囊相同前后水平的神经管转染。在电穿孔后6小时在E2处施用Dox。迁移的颅神经嵴（CNC）细胞由黄色箭头表示，并在F中的插图中放大.比例尺= 500μm在E中，适用于E和F;插图中为 100 μm。 （G-H） 在转染的E3胚胎的横截面上转染Fmr1 shRNA和EGFP的细胞。EGFP+细胞被限制在神经管的一侧。切片用FMRP免疫反应性（灰色）双重染色。比例尺 = 40 μm 在 G 中，适用于 G 和 H.（I-J） BF 图像 （I） 在 E8 处进行 Dox 处理后与 E15 脑干的 EGFP 通道 （J） 合并。 比例尺 = I 中的 1 mm，仅适用于 E15 脑干的 I 和 J. （K-L） 横截面，仅在转染（反式）侧具有 EGFP+ NM 神经元。在对侧（K）侧，在层状核（NL）的腹侧部分观察到EGFP+轴突。（周一至新） 在E19处NM的高放大倍率图像，具有FMRP（红色）和SNAP25（蓝色）免疫染色的双重标记。SNAP25 是一种突触前标记物，用于标记 Held 的末端灯泡。请注意，与邻近的非转染神经元（•）相比，转染（绿色;*）神经元中的FMRP免疫反应性显着降低。（O-P） 具有FMRP免疫反应性的E19听神经节（AG）的高放大倍率图像。AG神经元（AGN）未被转染（EGFP-）。转染一些来源于F所示CNC细胞的神经胶质细胞。比例尺 = 10 μm 以 M 为单位，适用于 M-P。请点击此处查看此图的大图。
图2.鸡听道中的FMRP敲低。（A）明场（BF）图像显示质粒在HH13处显微注射到耳囊中。在胚胎下方注入印度墨水（黑色）以提高可见度。（B）电穿孔双极电极的定位。阳性侧（用加号+标记）位于耳囊的前方，负侧（用减号-标记）放置在耳囊的后方。（C）对E6处鸡头的横截面进行FMRP（红色）和神经丝（NF;蓝色）免疫染色。电穿孔后在E3上施用Dox。在耳囊中检测到EGFP荧光，但在脑干中未检测到EGFP荧光。比例尺 = 100 μm. （D-E） BF 图像 （D） 与 E9 处听觉导管的 EGFP 通道 （E） 合并。 比例尺 = 500 μm. （F-G） E9 听觉导管的横向截面，带有 FMRP（红色）和 NF（蓝色）免疫染色。EGFP+细胞见于耳蜗管壁、基底（BP）和听神经节（AG）。比例尺 = 50 μm 在 F 中，适用于 F 和 G。 （H-J） E9 BP 的高放大倍率图像显示，与非转染的 HC 相比，转染毛细胞 （HC; *） 中的 FMRP 免疫反应性大大降低 （•）。NF阳性纤维（蓝色）是AG神经元的外围神经支配。（K-M） 具有FMRP免疫染色的E9处AG神经元的高放大倍率图像（红色）。FMRP免疫反应性在非转染神经元中很强（•），在转染神经元中检测不到（EGFP+; *）。比例尺 = 50 μm 以 H 为单位，适用于 H-M。请点击此处查看此图的大图。
图3.脑干中转染AG神经元的轴突跟踪。胚胎在HH13下电穿孔，用于Fmr1 shRNA的耳囊转染。Dox 应用程序在 E2 开始。（A） 带有胰岛-1 免疫染色和 DAPI 复染的 E6 鸡头的横向切片。EGFP+细胞在听神经节（AG）中很明显。星号*表示插图中转染的几个AG神经元。比例尺 = A 中的 100 μm 和插图中的 10 μm。（乙-丙） 明场（BF）图像（B）与E9脑干的EGFP通道（C）合并。在这种情况下，AG的一部分（白色箭头）与听觉脑干相连。黄色箭头表示插图中转染的AG神经元（AGN）。EGFP+纤维在脑干的转染侧很明显。比例尺 = B 中的 1 毫米，适用于 B 和 C;插图中为 100 μm。（D）E9脑干的横截面在C中虚线表示的水平。EGFP+听觉神经纤维（ANF;绿色）沿着脑干背缘延伸并接近大细胞核（NM）。比例尺 = 100 μm. （E-G） E15 （E） 和 E19 （F-G） 的 EGFP+ 纤维。在角核（NA）和下降前庭核（VeD）中也观察到一些纤维。对E19切片进行染色，以确定作为ANF的标志物，以确定细小白蛋白（PV）的免疫反应性。F中的虚线框在插图中放大，显示EGFP + ANF，这是PV免疫反应。比例尺 = 100 μm 在 E 中;F中的50μm，适用于F和G;插图为 2 μm。（H-J） 在E9、E15和E19处NM中ANF端子的高放大倍率图像，显示了Held末端灯泡的形成和逐渐成熟。比例尺 = 5 μm 以 H 为单位，适用于 H-J。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
为了确定FMRP的细胞自主功能，需要操纵其在单个细胞组或细胞类型中的表达。由于FMRP的主要功能之一是调节突触形成和可塑性，因此选择性地操纵某个回路的每个突触组件是充分了解突触通信中FMRP机制的先决条件。在鸡胚胎的卵电穿孔中，我们展示了一种在突触前AG神经元或突触后NM神经元中靶向AG-NM回路中FMRP表达的方法。为了实现这一目标，为电穿孔选择合适的发育阶段并将电穿孔电极准确定位在胚胎上是关键步骤。NM 神经元起源于神经管中 r5/6 水平的神经祖细胞，位于 HH1223。在同一阶段，颅神经嵴细胞从神经管的背尖迁移到耳蜗前庭神经节，以包裹未来的AG神经元33。因此，AG中的NM神经元和神经胶质细胞都是神经管衍生的。相比之下，毛细胞和AG神经元起源于外胚层24。与r5/6水平相邻的外胚层在HH10处增厚，然后在HH13处内陷形成耳杯。然后耳杯关闭并与外胚层分离形成耳囊，前部成为听觉感觉器官，后部为前庭系统做出贡献。在听觉和前庭部分，位于耳杯腹侧部分的神经母细胞分层并迁移形成耳蜗前庭神经节。在这些命运映射研究的基础上，我们通过在HH12处电穿神经管来转染NM神经元的祖细胞，这种策略在之前已经建立26，28，34。尽管这种策略导致脑干和AG中神经胶质细胞的额外转染，但没有一个AG神经元被转染。神经元特异性转染可以通过采用Atoh1促导驱动策略来实现，就像我们之前所做的那样21.对于AG神经元的选择性转染，我们在HH13处电穿孔耳囊。如图2B所示，当定位电极时，注射到耳杯中的质粒主要同时进入耳囊的前部进行毛细胞和AG神经元转染。为了优先靶向毛细胞上的AG神经元，可以将质粒溶液直接注射到耳前囊附近的区域，其中分层的神经母细胞位于35。然而，与耳囊注射相比，该方法的AG神经元转染效率较低，因为质粒在注射后迅速扩散。这种方法还可能导致周围头部间充质细胞的额外转染。优先靶向毛细胞而不是AG神经元的一种方法是将耳囊注射和电穿孔延迟到HH18（即~胚胎第3天），因为大多数神经母细胞（AG神经元前体）已在此阶段从耳囊中迁移出来24。
通过修改，这种方法可以扩展到研究前庭系统。对于前庭神经节转染，由于听觉和前庭神经节前体的位置不同，必须反转 图2B 所示的电极方向以转染耳囊的后部。
在蛋中， 鸡胚胎电穿孔是一种成熟的技术，用于研究发育的早期阶段（在孵化的第一周内）。对于长期研究，生存率是一个主要问题。当在E8开始Dox治疗时，这里发现的存活率在E9为~60%，但在E15时下降到30%，在E19时甚至更低。电穿孔卵的幼雏是可能的，但很少见，在大多数情况下只能存活几天。为了提高存活率，应考虑以下几点：1）使用提供方波而不是尖波的电穿孔器;2）如果白蛋白层不够厚以促进导电性，则在胚胎顶部滴一两滴无菌PBS（这将有助于减少电创伤）;3）成功转染不需要打开玻璃黄碱膜以暴露胚胎，并且可能会伤害胚胎;4）为了降低污染的风险，请使用注射器戳封口膜并施用Dox，而不是重新打开窗户。注射后，用75%乙醇擦拭透明膜，并用胶带覆盖针口;5）对于耳囊转染，用45°角移液管将质粒从背侧注射到耳囊中，以避免可能刺穿下面的主动脉背侧。如果背主动脉受损，出血会冲出质粒，甚至导致死亡;6）如果可能的话，避免使用印度墨水来观察胚胎。更少的处理和更少的程序将导致更高的存活率。
除了选择性转染AG或NM神经元的能力外， 卵电 穿孔还提供了一个独特的系统，允许进行数据分析的相邻比较。电穿孔后，仅转染NM或AG中的细胞子集，允许同一细胞组中周围的非转染细胞作为理想对照20。如果相邻神经元之间的潜在相互作用是一个问题，那么来自耳朵和大脑非转染侧的神经元对应物可以作为额外的对照。对于组织学和影像学研究，这一结果能够在单细胞或单纤维水平上高效进行数据分析。如果与基于荧光的细胞分选和大规模蛋白质和RNA分析（如质谱和下一代测序）相结合，分子分析也是可行的。然而，使用 卵中 电穿孔作为基因编辑的手段对于功能和行为研究可能具有挑战性，因为细胞组中转染细胞的百分比可能不足以导致功能后果。
采用 卵内 电穿孔方法时，必须进行两次验证分析。首先，应确认基因编辑对目标蛋白质的影响。 在卵 中，电穿孔仅转染NM或AG中的神经元子集（即镶嵌图案）。对含有转染和非转染神经元混合物的匀浆组织进行蛋白质免疫印迹不够灵敏，无法准确反映敲低效应。因此，必须使用免疫细胞化学等方法在单个细胞水平上进行验证。为此，我们之前产生了一种识别鸡FMRP的抗体。在先前的一项研究中，通过免疫细胞化学和蛋白质印迹验证了该抗体的特异性30。通过观察转染NM神经元中FMRP免疫反应强度的显着降低，与邻近的非转染神经元相比，定量验证了 Fmr1 shRNA的敲低效果。其次，应采用使用加扰RNA或其他对照构建体的对照组来确认观察到的FMRP错误表达的细胞效应的特异性20，21。为了实现这一目标，我们设计了一种打乱的shRNA，将其克隆到相同的Tet-On载体系统中，并将其电穿孔成NM前体，如前所述20。用加扰的shRNA转染的NM神经元中的FMRP表达不受影响，与邻近的非转染神经元相比，FMRP免疫反应性的强度不变证明了这一点。我们还确定了 Fmr1 shRNA 转染对轴突生长、树突状修剪、末端形成和神经传递的许多影响（Curnow 和 Wang，2022 年综述）36。我们得出结论，这些效应是由FMRP的细胞自主丧失引起的，因为打乱的shRNA未能诱导类似的变化。
总之， 卵内 电穿孔技术能够在听觉耳-脑干回路中通过时间控制和成分特异性进行选择性 Fmr1 基因编辑，并且可以修改以操纵前庭系统。在鸡胚中开发这种先进技术，这是发育生物学中一个成熟的模型，已经并将继续有助于我们理解正常和异常条件下的大脑发育，如FXS。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究得到以下资助：国家自然科学基金（第32000697号）;广州市科技计划（202102080139）;广东省自然科学基金（2019A1515110625，2021A1515010619）;中央高校基本科研业务费专项资金（11620324）;暨南大学再生医学教育部重点实验室研究经费（No.ZSYXM202107）;中央高校基本科研业务费专项资金（21621054）;中国广东省医学科学研究基金（20191118142729581）。感谢暨南大学医学实验中心。我们感谢Terra Bradley博士对手稿的精心编辑。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Egg incubation | |||
| 16 °C refrigerator | MAGAT | Used for fertilized egg storage. | |
| Egg incubator | SHANGHAI BOXUN | GZX-9240MBE | |
| Fertilized eggs | Farm of South China Agricultural University | Eggs must be used in one week for optimal viability. | |
| Plasmid preparation | |||
| Centrifuge | Sigma | 10016 | |
| Fast green | Solarbio | G1661 | Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave. |
| Plasmid Maxi-prep kit | QIAGEN | 12162 | Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Make 7.5M working solution in nuclase-free water. |
| Electroporation and Doxycycline Administration | |||
| Electroporator | BTX | ECM399 | |
| 1 mL / 5 mL Syringe | GUANGZHOU KANGFULAI | ||
| Dissecting microscope | CNOPTEC | SZM-42 | |
| Doxcycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C. |
| Glass capillary | BEIBOBOMEI | RD0910 | 0.9-1.1 mm*100 mm |
| Laboratory parafilm | PARAFILM | PM996 | transparent film |
| Pipette puller | CHENGDU INSTRUMENT FACTORY | WD-2 | Pulling condition: 500 °C for 15 s |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Rubber tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Tissue Dissection and Fixation | |||
| Forceps | RWD | F11020-11 | Tip size: 0.05*0.01 mm |
| Other surgery tools | RWD | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week. |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 01673921 | For black background plates, food-grade carbon powder is applied. |
| Sectioning | |||
| Cryostat | LEICA | CM1850 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | From bovine skin. |
| Sliding microtome | LEICA | SM2010 | |
| Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse | Abcam | ab150113 | 1:500 dilution, RRID: AB_2576208 |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit | Abcam | ab150078 | 1:500 dilution, RRID: AB_2722519 |
| DAPI | Abcam | ab285390 | 1: 1000 dilution |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotech | Sb-0100-01 | |
| FMRP antibody | Y. Wang, Florida State University | #8263 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242 |
| Islet-1 antibody | DSHB | 39.3F7 | 1:100 dilution, RRID: AB_1157901 |
| Netwell plate | Corning | 3478 | |
| Neurofilament antibody | Sigma-Aldrich | N4142 | 1:1000 dilution, RRID: AB_477272 |
| Parvalbumin antibody | Sigma-Aldrich | P3088 | 1:10000 dilution, RRID: AB_477329 |
| SNAP25 antibody | Abcam | ab66066 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052 |
| Imaging | |||
| Adobe photoshop | ADOBE | image editing software | |
| Confocal microscope | LEICA | SP8 | |
| Fluorescent stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Olympus Image-Pro Plus 7.0 | OlYMPUS | commercial image processing software package |
References
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