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Neuroscience

Dissecando a Função Autônoma Celular da Proteína de Retardo Mental do X Frágil em um Circuito Auditivo por Eletroporação In Ovo

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/64187
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Division of Histology & Embryology, Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education, College of Medicine, Jinan University, 2Department of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Jinan University, 3Program in Neuroscience, Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University
* These authors contributed equally

Summary

Usando a eletroporação do ovo , desenvolvemos um método para transfectar seletivamente o ouvido interno auditivo e o núcleo coclear em embriões de galinha para alcançar uma derrubada específica do grupo celular da proteína de retardo mental X frágil durante períodos discretos de montagem do circuito.

Abstract

A proteína de retardo mental do X frágil (FMRP) é uma proteína de ligação ao mRNA que regula a tradução de proteínas locais. A perda ou disfunção da FMRP leva a atividades neuronais e sinápticas aberrantes na síndrome do X frágil (FXS), que é caracterizada por deficiência intelectual, anormalidades sensoriais e problemas de comunicação social. Estudos da função da FMRP e da patogênese da FXS foram conduzidos principalmente com o knockout de Fmr1 (o gene que codifica a FMRP) em animais transgênicos. Aqui relatamos um método in vivo para determinar a função autônoma celular da FMRP durante o período de montagem do circuito e formação sináptica usando embriões de galinha. Este método emprega eletroporação específica de estágio, local e direção de um sistema vetorial induzível por droga contendo Fmr1 small hairpin RNA (shRNA) e um repórter EGFP. Com este método, obteve-se o knockdown seletivo da FMRP no gânglio auditivo (GA) e em um de seus alvos do tronco encefálico, o núcleo magnocelular (NM), proporcionando assim uma manipulação componente-específica dentro do circuito AG-NM. Além disso, o padrão de mosaico da transfecção permite controles dentro de animais e comparações de neurônios / fibras vizinhas para maior confiabilidade e sensibilidade na análise de dados. O sistema vetorial induzível fornece controle temporal do início da edição gênica para minimizar os efeitos acumulados no desenvolvimento. A combinação dessas estratégias fornece uma ferramenta inovadora para dissecar a função autônoma celular da FMRP no desenvolvimento sináptico e de circuitos.

Introduction

A síndrome do X Frágil (FXS) é um transtorno do neurodesenvolvimento caracterizado por deficiência intelectual, anormalidades sensoriais e comportamentos autistas. Na maioria dos casos, a FXS é causada por uma perda global de proteína de retardo mental X frágil (FMRP; codificada pelo gene Fmr1) a partir dos estágios embrionários iniciais1. A FMRP é uma proteína ligadora de RNA que normalmente é expressa na maioria dos neurônios e células gliais do cérebro, bem como nos órgãos sensoriais 2,3,4. Em cérebros de mamíferos, a FMRP provavelmente está associada a centenas de mRNAs que codificam proteínas importantes para várias atividades neurais5. Estudos de animais knockout Fmr1 convencionais demonstraram que a expressão de FMRP é particularmente importante para a montagem e plasticidade da neurotransmissão sináptica6. Vários modelos de knockout condicional e mosaico demonstraram ainda que as ações e sinais da FMRP variam entre regiões cerebrais, tipos de células e sítios sinápticos durante vários eventos de desenvolvimento, incluindo projeção axonal, padronização dendrítica e plasticidade sináptica 7,8,9,10,11,12,13,14 . A função aguda da PRFM na regulação da transmissão sináptica foi estudada pela liberação intracelular de anticorpos inibitórios da PRFM ou da própria PRFM em cortes cerebrais ou neurônios cultivados15,16,17,18. Esses métodos, no entanto, não oferecem a capacidade de rastrear as consequências induzidas por erros de expressão da FMRP durante o desenvolvimento. Assim, o desenvolvimento de métodos in vivo para investigar as funções autônomas celulares da FMRP é de grande necessidade e espera-se que ajude a determinar se as anomalias relatadas em pacientes com FXS são consequências diretas da perda de FMRP nos neurônios e circuitos associados, ou consequências secundárias derivadas de mudanças em toda a rede durante o desenvolvimento19.

O tronco encefálico auditivo de embriões de galinha oferece um modelo excepcionalmente vantajoso para análises funcionais aprofundadas da regulação da FMRP no desenvolvimento de circuitos e sinapses. O fácil acesso a cérebros de galinhas embrionárias e a técnica bem estabelecida de eletroporação de ovoterapia para manipulação genética contribuíram grandemente para a nossa compreensão do desenvolvimento cerebral em estágios embrionários iniciais. Em estudo recentemente publicado, essa técnica foi combinada com ferramentas moleculares avançadas que permitem o controle temporal da expressão incorreta daPRFM 20,21. Aqui, a metodologia é avançada para induzir manipulações seletivas de neurônios pré-sinápticos e pós-sinápticos separadamente. Este método foi desenvolvido no circuito auditivo de tronco encefálico. O sinal acústico é detectado pelas células ciliadas no ouvido interno auditivo e, em seguida, transportado para o gânglio auditivo (AG; também chamado de gânglio espiral em mamíferos). Os neurônios bipolares no GA inervam as células ciliadas com seus processos periféricos e, por sua vez, enviam uma projeção central (o nervo auditivo) para o tronco encefálico, onde terminam em dois núcleos cocleares primários, o núcleo magnocelular (NM) e o núcleo angularis (NA). Os neurônios no NM são estrutural e funcionalmente comparáveis às células espessas esféricas do núcleo coclear anteroventral de mamíferos. Dentro do NM, as fibras nervosas auditivas (FANs) fazem sinapse na somata dos neurônios NM através do grande bulbo final dos terminais de Held22. Durante o desenvolvimento, os neurônios NM surgem dos rombomeres 5 e 6 (r5/6) no rombencéfalo23, enquanto os neurônios AG são derivados de neuroblastos residentes no otocisto24. Aqui, descrevemos o procedimento para derrubar seletivamente a expressão de FMRP nos neurônios AG pré-sinápticos e nos neurônios NM pós-sinápticos separadamente.

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Protocol

Ovos e embriões de galinha foram manuseados com cuidado e respeito, de acordo com os protocolos de animais aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Jinan.

1. Preparação de óvulos e plasmídeos

  1. Preparação de ovos
    1. Obter ovos de galinha fertilizados frescos (Gallus gallus) da Universidade Agrícola do Sul da China e armazenar a 16 °C antes da incubação. Para uma viabilidade ideal, coloque todos os ovos para incubação dentro de uma semana após a chegada.
    2. Colocar os ovos horizontalmente e incubar a 38 °C por 46-48 h até o estágio 1225 de Hamburger e Hamilton (HH) para transfecção do tubo neural, ou por 54-56 h até HH13 para transfecção de otocisto. Como o polo animal do ovo é mais leve que o polo vegetal, a colocação horizontal posiciona o embrião no topo do ovo para facilitar a manipulação. Tenha cuidado para manter o ovo horizontal nesta e em todas as etapas a seguir.
    3. A localização do embrião aparece como uma área escura na casca do ovo ao lançar luz do fundo do ovo usando uma lanterna. Nos estágios desejados de HH, use este método de lanterna para marcar a localização do embrião na casca do ovo com lápis.
    4. Limpe os ovos com gaze contendo 75% de etanol. Faça um furo na extremidade pontiaguda dos ovos usando a ponta da tesoura e remova 2 mL de albumina com uma seringa de agulha de 18 G. Certifique-se de que o orifício seja grande o suficiente para permitir a inserção da agulha. Limpe qualquer vazamento de albumina com gaze e sele o orifício com fita adesiva.
    5. Para minimizar rachaduras e evitar a queda de detritos de casca durante a janela, cubra a parte superior dos ovos com fita adesiva, centrando-se na área escura marcada com lápis.
  2. Extração de DNA plasmídico
    1. Clone chicken Fmr1 shRNA usando um sistema Tet-on baseado em transposon, conforme descrito anteriormente20. Este sistema contém três plasmídeos: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 e pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA, fornecendo um sistema vetorial induzível por drogas pelo qual a expressão de Fmr1 shRNA e EGFP é silenciada após a transfecção e pode ser ativada por indução de doxiciclina (Dox).
      Observação : esses plasmídeos não estão atualmente disponíveis em um repositório. Os autores concordam em fornecer os plasmídeos mediante solicitação razoável.
    2. Extraia os DNAs plasmídicos usando um kit de preparação livre de endotoxinas de acordo com as instruções do fabricante e precipite adicionando 1/15 volume de acetato de sódio 7,5 M e 1 volume de isopropanol a 100%.
    3. Plasmídeos precipitados a -20 °C durante a noite e centrifugação a 13.000 x g durante 10 min. Dissolva o pellet com o tampão Tris-EDTA fornecido no kit até uma concentração final de 4-5 μg/μL. Os plasmídeos podem ser armazenados a -20 °C por 12 meses sem redução da eficiência da transfecção.
    4. No dia da eletroporação, misture bem 2 μL de cada plasmídeo em um tubo de centrífuga estéril usando uma ponta de pipeta. O volume resultante de 6 μL da mistura plasmídica é suficiente para eletroporar três dúzias de ovos. Para ajudar a visualizar o plasmídeo durante a eletroporação, adicione 1 μL de 0,1% de verde rápido (preparado em ddHestéril 2O) para cada 6 μL de mistura de DNA26, o que torna a mistura plasmídica azul.

2. Na eletroporação do ovo

  1. Janela de ovos e identificação de embriões
    1. No dia da eletroporação, retire os ovos da incubadora, uma dúzia de ovos de cada vez. Manter os ovos fora de sua incubadora por mais de 1 h introduz variações de desenvolvimento e reduz a viabilidade.
    2. Limpe todas as ferramentas de cirurgia com gaze contendo etanol a 75%.
    3. Coloque cada ovo em um suporte de espuma personalizado. Limpe a área coberta de fita com etanol a 75% e corte uma janela (1-2 cm 2) ao redor da circunferência da marca de lápis usando um pequeno par de tesouras (Figura 1A). Ao cortar, segure a tesoura plana para evitar danificar o embrião por baixo.
    4. Coloque o ovo em janela sob um estereomicroscópio com uma ocular de 10x e zoom de 2x e identifique o embrião. Ajuste o ângulo e o brilho da fonte de luz para uma melhor visualização.
      NOTA: É preciso prática e experiência para visualizar o embrião e identificar o tubo neural nesta fase.
      1. Para iniciantes, use a seguinte injeção de tinta opcional para facilitar a identificação do embrião. Prepare 10% de solução de tinta indiana em solução salina tamponada com fosfato (PBS) 0,01 M e autoclave com antecedência. Encha uma seringa de 1 ml com a solução de tinta e, em seguida, coloque uma agulha 27G. Dobre a agulha para um ângulo de 45° com fórceps.
      2. Sob o microscópio, cutuque cuidadosamente a borda da área opaca e insira a agulha sob o embrião. Injete ~50 μL de tinta, que se difundirá abaixo da área da pellúcida para visualização embrionária. A tinta formará um fundo escuro para uma visualização clara do embrião.
        NOTA: Expulse o ar da seringa antes da inserção e injeção. Quando habilidoso em visualizar, evite a etapa de injeção de tinta, pois reduz a taxa de sobrevivência.
  2. Injeção e eletroporação do tubo neural
    NOTA: Este procedimento é realizado em HH12 para transfecção de neurônios NM no tronco encefálico.
    1. Puxe capilares de vidro (~1 mm de diâmetro e 100 mm de comprimento) para pipetas usando um puxador de pipetas. Sob um microscópio de dissecação, abra cuidadosamente a ponta da agulha capilar a 10-20 μm de diâmetro com fórceps. Armazene as pipetas (geralmente 5-10 de uma só vez) em uma caixa de armazenamento até o uso.
    2. Encha uma pipeta capilar com 0,5-1 μL da mistura plasmídica aplicando pressão negativa através de um tubo de borracha no final da pipeta. Isto pode ser conseguido através de uma seringa ou bomba de ar.
    3. Coloque o ovo sob o microscópio de modo que o embrião seja orientado verticalmente com a cauda perto de você (ou horizontalmente para injetar pipetas capilares usando um manipulador de três eixos). Segure a pipeta capilar com uma mão ou com o manipulador de três eixos e conduza a ponta da pipeta para o r5/6 no sentido cauda-cabeça.
      NOTA: A área mais anterior do rombencéfalo é r1 e cada protuberância subsequente ao longo do tubo neural é um rombomere individual. R5/6 está no mesmo nível anteroposterior que o otocisto, que é uma estrutura em forma de copo facilmente reconhecível (Figura 1B-C).
    4. Gentilmente cutuque a ponta através da membrana vitelina e no tubo neural dorsal e, em seguida, retire a pipeta um pouco para que a ponta esteja no lúmen do tubo neural. Injete a mistura de plasmídeos aplicando pressão de ar até que o plasmídeo colorido se difunda totalmente em r5/6 e se estenda para r3 e r4.
      NOTA: Não é necessário fazer um slot na membrana vitelina para injeção.
    5. Verifique se há uma injeção bem-sucedida, que é alcançada quando a solução de plasmídeo azul se difunde rapidamente pelo tubo neural sem vazar (Figura 1B-C). Quando ocorre vazamento, o azul desaparece rapidamente.
    6. Imediatamente após a injeção, coloque um eletrodo bipolar de platina em ambos os lados do tubo neural (Figura 1D). Forneça dois pulsos de 12 V e 50 ms de duração com um eletroporador. Observe bolhas de ar nas extremidades do eletrodo bipolar, com mais no lado negativo.
    7. Verifique se há eletroporação bem-sucedida, que é alcançada quando a mistura de plasmídeos coloridos entra no tecido do tubo neural perto do lado positivo do eletrodo. Após a eletroporação, remova cuidadosamente o eletrodo bipolar.
    8. Cubra a janela na casca do ovo com um pedaço de filme transparente que é pré-cortado em 2 em quadrados e pulverizado com etanol a 75%. Coloque o ovo de volta em sua incubadora.
    9. Limpe o eletrodo bipolar fornecendo 10-20 pulsos de 12 V e 50 ms de duração em solução salina antes de prosseguir para o próximo ovo.
  3. Injeção e eletroporação de otocistos
    NOTA: Este procedimento é realizado no HH13 para transfecção de células ciliadas e neurônios AG no ouvido interno.
    1. No HH13 (que é ~dia embrionário 2.5), o embrião virou de modo que o lado direito da cabeça está voltado para cima. Sob o microscópio, coloque o ovo de modo que o embrião fique vertical, com a cauda perto de você. Segure a pipeta capilar e cutuque suavemente o otocisto direito na direção dorsolateral (Figura 2A).
      NOTA: Nesta fase, o otocisto aparece como uma pequena estrutura circular no topo do corpo no mesmo nível anteroposterior que r5/6.
    2. Injetar a mistura plasmídica com pressão de ar até que o otocisto seja preenchido com solução azul27. Verifique se há uma injeção bem-sucedida, que é alcançada quando a mistura de plasmídeo azul está confinada dentro do otocisto e não vaza.
    3. Imediatamente após a injeção, coloque o eletrodo bipolar no otocisto, conforme descrito na Figura 2B. Posicione os lados positivo e negativo anterior e posterior ao otocisto, respectivamente. Forneça dois pulsos de 12 V e 50 ms de duração com o eletroporador.
    4. Verifique se há eletroporação bem-sucedida, que é alcançada quando a mistura de plasmídeo azul entra no tecido do otocisto perto do lado positivo do eletrodo. Após a eletroporação, remova cuidadosamente o eletrodo bipolar. Cubra a janela na casca do ovo com uma película transparente e devolva o ovo à incubadora.

3. Administração de Dox para iniciar e manter a transcrição plasmídica

  1. Preparação da solução Dox
    1. Meça 100 mg de Dox pó sob um exaustor químico e dissolvê-lo em 100 mL de PBS estéril para fazer um 1 mg / mL de solução de trabalho. Filtrar a solução com um filtro de 0,22 μm e conservar 1 ml de alíquotas a -20 °C. Proteger da luz20,28.
  2. Administração de Dox
    1. Para edição de genes de força total, às 24 h antes da idade desejada, descongele uma alíquota Dox no gelo. Solte 50 μL de Dox diretamente na membrana corioalantóica do ovo usando uma seringa penetrando no filme transparente. Sele o orifício da agulha com filme transparente ou fita adesiva após a injeção.
    2. Para manter o efeito knockdown, administre Dox a cada dois dias até a colheita de tecido no estágio de desenvolvimento desejado.

4. Dissecção e secção de tecidos

  1. Tronco cerebral
    1. Para embriões em estágio embrionário 3 (E3) e E6, abra a casca do ovo e corte a membrana associada com uma tesoura. Coloque o embrião na colher e mergulhe-o em paraformaldeído a 4% (PFA) em tampão fosfato 0,1 M.
    2. Para embriões E9, abra a casca do ovo, decapite o embrião com uma tesoura e transfira a cabeça para uma placa com fundo de silício cheia de PBS. Prenda a cabeça para baixo através das órbitas e corte o topo do crânio. Coloque cuidadosamente o fórceps abaixo do cérebro de ambos os lados e eleve todo o cérebro do crânio com os ombros do fórceps. Mergulhe o cérebro em 4% de PFA.
    3. Para embriões E15 e E19, abra a casca do ovo, decapite o embrião com uma tesoura e coloque a cabeça em uma placa com fundo de silício cheia de PBS. Abra a pele no topo da cabeça para expor o crânio.
    4. Incise através do crânio verticalmente com uma navalha para separar o prosencéfalo e o cérebro caudal. Mergulhe o bloco caudal no PBS, remova o topo do crânio e, em seguida, tire o cérebro do crânio.
    5. Prenda o cérebro através do lobo óptico e separe o cerebelo e o tronco encefálico. Tome cuidado para não danificar o tronco encefálico auditivo, que está localizado logo abaixo do cerebelo. Remova o máximo de dura-máter possível do tronco encefálico e, em seguida, mergulhe-o em 4% de PFA.
    6. Manter embriões e tecidos cerebrais em PFA a 4% a 4 °C durante a noite, com exceção dos caules cerebrais E19, que devem ser mantidos sob a mesma condição durante 24 h.
    7. Após a fixação, desidrate o tecido em PBS contendo 30% de sacarose até que ele se instale, o que geralmente leva de 1 a 3 dias, dependendo da idade.
    8. Seção do tronco encefálico (E15 e E19) a 30 μm no plano coronal usando um micrótomo deslizante. Recolher secções em PBS e conservar a 4 °C antes da imunocoloração.
    9. Para embriões E3 e E6 e espetros encefálicos E9, secção a 50 μm transversalmente. Recolher secções em PBS e armazenar a 4 °C. Monte as seções em lâminas de microscópio revestidas de gelatina antes da imunocoloração. A coleta de seções mais espessas para essas idades facilita o manuseio do tecido.
  2. Ducto auditivo
    1. Depois de remover os caules cerebrais dos embriões E9, E15 e E19, o ducto auditivo, que está embutido no osso temporal, é facilmente identificável sob o crânio, e o osso temporal é facilmente separável do crânio circundante. Para embriões E9, fixe todo o osso temporal em 4% de PFA. Para embriões mais velhos, remova a estrutura óssea do osso temporal para isolar o ducto auditivo e fixar o ducto auditivo em 4% de PFA.
    2. Manter todos os ossos temporais e ductos auditivos em PFA a 4% a 4 °C durante a noite antes da incorporação do tecido.
    3. Realize a incorporação de tecido conforme descrito. Prepare a solução de incorporação da seguinte forma: Mergulhe 10% de gelatina (de pele bovina) em água fria até que os grânulos de gelatina inchem e assentem (cerca de 30 min). Aqueça a mistura a ~50 °C para dissolver a gelatina e adicione 20% de sacarose à solução de gelatina e mexa para dissolver. Conservar a solução de gelatina-sacarose a 4 °C durante um mês.
    4. Para utilização, aquecer a solução de gelatina-sacarose a 37 °C. Mergulhe os ossos temporais/ductos auditivos na solução quente de gelatina-sacarose em uma placa de 96 poços a 37 °C até que eles se assentem, geralmente 30-60 min.
    5. Forre o fundo dos poços de uma placa de 12 poços com uma tira de filme transparente. Adicione uma camada de solução quente de gelatina-sacarose e espere até solidificar. Transfira um osso temporal/ducto auditivo para cada poço.
    6. Implante o tecido com uma segunda camada de solução quente de gelatina-sacarose. Ajuste a posição do tecido para que ele fique no centro do gel e o ducto auditivo seja orientado horizontalmente. Mova cuidadosamente a placa para um frigorífico a 4 °C e aguarde até que o gel esteja firme.
    7. Puxe a tira de filme transparente para mover o bloco de tecido de gel para fora do poço. Apare o gel extra em um bloco quadrado e corte um canto do bloco para identificar a orientação. Envolva o bloco de gelatina com um pedaço de papel alumínio, congele no gelo seco e, em seguida, guarde a -80 °C até à secção.
    8. Seção do bloco a 20 μm ao longo da longitude do ducto auditivo com um criostato. Monte as seções diretamente em lâminas de microscópio revestidas de gelatina. Conservar as lâminas a -80 °C antes da imunocoloração.
    9. Antes da imunocoloração, mergulhe as lâminas em PBS pré-aquecido (45 °C) por 5 minutos para dissolver a gelatina e, em seguida, lave as lâminas 3x com PBS à temperatura ambiente para remover a gelatina residual.

5. Imunocoloração e microscópio

NOTA: Dois tipos de imunocoloração são realizados dependendo se as seções são montadas em lâminas ou flutuam livremente na PBS.

  1. Imunocoloração em lâminas
    1. Lave as lâminas 3x por 10 min cada com PBS. Circule a região que contém as seções com uma caneta de óleo para evitar o vazamento de líquido durante a coloração. Cobrir as secções com uma solução de bloqueio contendo 5% de soro de cabra normal em PBS e incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente.
    2. Diluir os anticorpos primários (para a concentração final utilizada consulte Tabela de Materiais) em PBS contendo 0,3% de TritonX-100 e 5% de soro de cabra normal. Remova a solução de bloqueio e, em seguida, cubra as secções com a solução de anticorpos primários. Incubar as lâminas a 4 °C durante a noite numa caixa contendo uma camada de água destilada no fundo.
    3. Lave as lâminas 3x por 10 min com PBS. Aplicar anticorpos secundários fluorescentes diluídos a 1:500 em PBS contendo TritonX-100 a 0,3% em lâminas. Incubar as lâminas à temperatura ambiente durante 4 h, protegidas da luz.
    4. Lave as lâminas 3x com PBS. Solte suavemente duas gotas de meio de montagem sobre as lâminas e cubra as seções com deslizamentos de cobertura. Tome cuidado para não gerar bolhas de ar entre o deslizamento da tampa e o deslizamento.
  2. Imunocoloração para embriões inteiros e seções flutuantes
    1. Lave os embriões/seções com PBS 3x por 10 min cada um em uma placa de poço. Diluir os anticorpos primários em PBS contendo 0,3% de TritonX-100 e 5% de soro de cabra normal em tubos centrífugos. Transferir cada embrião/secção para um tubo com um gancho de vidro e incubar num agitador a 60 rpm durante a noite a 4 °C.
    2. Lave os embriões/seções 3x com PBS por 10 min cada em uma placa de poço. Transferir cada embrião/secção para um tubo centrífugo escuro preenchido com solução de anticorpos secundários fluorescentes e incubar à temperatura ambiente durante 4 h no agitador.
    3. Lave os embriões/seções 3x com PBS em uma placa de poço. Use uma escova para montar as seções em lâminas de microscópio revestidas de gelatina em um prato de 15 cm contendo PBS. Depois que as lâminas estiverem levemente secas (~ 5 min), aplique duas gotas de meio de montagem e coloque uma tampa. Tome cuidado para não gerar bolhas de ar entre o deslizamento da tampa e o deslizamento. Mantenha todos os tecidos de montagem em PBS para geração de imagens.
  3. Imagiologia
    1. Imagine todos os tecidos de montagem em PBS em um prato com um fundo de silício contendo pó de carbono, que fornece um fundo preto. Capturar e processar imagens usando um pacote de software comercial de processamento de imagens da Olympus, conforme descrito anteriormente29.
    2. Fotografe as seções nas lâminas com um microscópio confocal conforme descrito anteriormente20. Imagine as seções em um único plano focal com objetivos de 10x, 20x e 63x. Capture todas as imagens do mesmo animal usando os mesmos parâmetros. Tome cuidado para ajustar o nível do laser e as configurações de aquisição de imagens para evitar a saturação do sinal.
    3. Execute o processamento de imagens usando o software Fiji. Para ilustração, ajuste o brilho, o contraste e a gama da imagem usando um software profissional de edição de imagens.

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Representative Results

Realizando-se em ovo-eletroporação em diferentes locais e em diferentes estágios de desenvolvimento, obteve-se knockdown seletivo da FMRP tanto na periferia auditiva quanto no tronco encefálico auditivo.

Knockdown da FMRP em NM
O pequeno RNA hairpin (shRNA) contra a galinha Fmr1 foi projetado e clonado no sistema vetorial Tet-On conforme descrito anteriormente20. A configuração para eletroporação in ovo é mostrada na Figura 1A. O DNA plasmidial tingido de verde rápido foi injetado no tubo neural no nível r5/r6 em HH12 (Figura 1B-C). Um eletrodo bipolar de platina foi colocado em cada lado do tubo neural no nível r5/6 (Figura 1D). Dois pulsos a 12 V foram entregues para conduzir o plasmídeo para o tecido perto do lado positivo do eletrodo. Dox foi aplicado na membrana corioalantóica para desencadear a expressão de Fmr1 shRNA e EGFP. Após 24 h de tratamento com Dox, o EGFP ficou evidente sob estereomicroscópio fluorescente. A Figura 1E-F mostra um exemplo em E3 quando o Dox foi aplicado em E2. Cortes transversais confirmaram a localização das células expressivas de EGFP (EGFP+) em um lado do rombencéfalo (Figura 1G-H). Além disso, um grupo de células transfectadas foi encontrado anteriormente ao otocisto; eram células da crista neural craniana migrando ventrolateralmente do tubo neural (Figura 1F). Embriões eletroporados também podem ser incubados por mais tempo para estudar a formação de circuitos em estágios posteriores. Em E15, o EGFP foi observado no tronco encefálico, mas apenas no lado transfectado (Figura 1I-J). Cortes transversais ao nível do tronco encefálico dorsal demonstraram um punhado de neurônios EGFP+ que estavam espalhados no NM no lado da eletroporação (Figura 1L). Fibras EGFP+ foram vistas projetando-se para o alvo dos neurônios NM: o núcleo laminar dorsal (NL) no lado ipsilateral (Figura 1L) e o NL ventral no lado contralateral (Figura 1K). O efeito knockdown do shRNA Fmr1 foi validado por reduções acentuadas na imunorreatividade da FMRP em neurônios NM transfectados em comparação com neurônios vizinhos não transfectados (Figura 1M-N). No gânglio auditivo (GA), os neurônios não foram transfectados (EGFP-), embora algumas células gliais ao redor dos neurônios AG fossem EGFP+ (Figura 1O-P), presumivelmente derivadas de células da crista neural craniana EGFP+ (ver Figura 1F). Assim, esta estratégia de eletroporação fornece uma transfecção seletiva dos neurônios pós-sinápticos no circuito AG-NM.

Knockdown FMRP no ducto auditivo
A mistura plasmídica foi injetada no otocisto no HH13 (Figura 2A), seguida de eletroporação pela colocação do lado positivo do eletrodo anterior ao otocisto e do lado negativo posterior ao otocisto (Figura 2B). Cortes de cabeça inteira em E6 demonstraram forte fluorescência do EGFP no otocisto direito, mas não no tronco encefálico (Figura 2C). Os ductos auditivos isolados em E9 apresentaram extensa fluorescência do EGFP em toda a extensão do ducto (Figura 2D-E). Nos cortes transversais, as células EGFP+ foram confirmadas na papila basilar (PA) ao longo da parede do ducto coclear e no GA (Figura 2F-G). O efeito knockdown do shRNA Fmr1 foi validado por reduções acentuadas na imunorreatividade da FMRP em células ciliadas transfectadas (*, Figura 2H-J) em comparação com células ciliadas vizinhas não transfectadas (•, Figura 2H-J). Para as células de suporte, a imunorreatividade da FMRP foi fraca tanto nas células transfectadas quanto nas não transfectadas (Figura 2H-J). Semelhante às células ciliadas, a imunorreatividade da FMRP foi amplamente diminuída nos neurônios AG transfectados em comparação com os neurônios vizinhos não transfectados (Figura 2K-M).

Em seguida, rastreamos a projeção central de neurônios AG transfectados para o tronco encefálico através do nervo auditivo. O padrão de mosaico da transfecção de shRNA Fmr1 no GA foi confirmado em E6 usando imunorreatividade do Ilhéu-1 (Figura 3A), um marcador para a orelha interna da galinha em desenvolvimento31. Quando uma parte do GA foi extraída com o tronco encefálico durante a dissecção, os neurônios EGFP+ AG isolados e suas fibras dentro do tronco encefálico foram visualizados in situ nas mesmas preparações (Figura 3B-C). Nos cortes transversais ao nível do NM, os ANFs EGFP+ atingiram o NM em E9 (Figura 3D) e foram continuamente observados em E15 e E19 (Figura 3E-F). Imagens de alta ampliação revelaram terminações em forma de cone de crescimento de FAN em E9 (Figura 3H), que formaram o grande bulbo em forma de palma em E15 antes de crescerem no bulbo final caracterizado da morfologia de Held com ramos complexos em E19 (Figura 3I-J). Além do NM, ramos extensos de FAN também foram observados no NA, outro núcleo coclear primário (Figura 3E). Isso era esperado, pois os mesmos FAN se bifurcam para inervar tanto o NM quanto o NA em frangos32. Também foram observadas fibras EGFP+ entrando nos grupos de células vestibulares adjacentes, incluindo o núcleo vestibular descendente (VeD), como mostra a Figura 3E. Embora tenhamos otimizado a localização do eletrodo eletroporante para atingir preferencialmente a porção anterior do otocisto, onde o GA é formado, alguns neurônios ganglionares vestibulares também foram transfectados. A imunocoloração para parvalbumina, um marcador de FAN em frangos, pode ser usada para diferenciar fibras auditivas e vestibulares no tronco encefálico (Figura 3F-G).

Em resumo, esta estratégia de eletroporação fornece uma transfecção seletiva dos neurônios pré-sinápticos no circuito AG-NM e pode ser usada para rastrear o desenvolvimento do bulbo final de Held em níveis terminais individuais após manipulações genéticas.

Figure 1
Figura 1. FMRP knockdown no NM galinha. (A) Imagem da configuração da eletroporação. (B) Desenho esquemático mostrando o local de microinjeção no nível de rombômero r5/6 de um embrião de galinha HH12. Abreviaturas: NT = tubo neural; SO = somite. (C) Para maior visibilidade, tinta indiana (preta) foi injetada sob o embrião com uma seringa. A mistura de plasmídeos tingida com verde rápido foi então injetada no lúmen do tubo neural. (D) Posicionamento do eletrodo bipolar para eletroporação. + e - indicam os lados positivo e negativo, respectivamente. Note-se que a mistura de plasmídeos azuis se difundiu no tubo neural no lado positivo após a eletroporação. (E-F) Imagem de campo brilhante (GC) (E) fundida com o canal EGFP (F) de um embrião de galinha eletroporada no dia 3 embrionário (E3), mostrando transfecção no tubo neural no mesmo nível anteroposterior do otocisto. Dox foi aplicado em E2, 6 h após a eletroporação. As células migratórias da crista neural craniana (CNC) são indicadas pela seta amarela e ampliadas na inserção em F. Barra de escala = 500 μm em E, aplica-se a E e F; 100 μm na inserção. (G-H) Células transfectadas com fmr1 shRNA e EGFP na seção transversal de um embrião E3 transfectado. As células EGFP+ foram confinadas em um lado do tubo neural. O corte foi duplamente corado com imunorreatividade FMRP (cinza). Barra de escala = 40 μm em G, aplica-se a G e H. (I-J) imagem BF (I) mesclada com canal EGFP (J) de um tronco encefálico E15 após o tratamento com Dox em E8. Barra de escala = 1 mm em I, aplica-se a I e J. (K-L) seção transversal de um tronco encefálico E15 com neurônios EGFP+ NM apenas no lado transfectado (trans). No lado contralateral (contra) (K), axônios EGFP+ foram observados na porção ventral do núcleo laminar (NL). (M-N) Imagens de alta ampliação do NM no E19 com dupla marcação de FMRP (vermelho) e SNAP25 (azul). SNAP25 é um marcador pré-sináptico que rotula a lâmpada final de Held. Observe a redução acentuada da imunorreatividade da FMRP nos neurônios transfectados (verde; *) em comparação com os neurônios vizinhos não transfectados (•). (O-P) Imagens de alta ampliação do gânglio auditivo (GA) em E19 com imunorreatividade à FMRP. Os neurônios AG (AGN) não foram transfectados (EGFP-). Algumas células gliais derivadas de células CNC indicadas em F foram transfectadas. Barra de escala = 10 μm em M, aplica-se a M-P. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Knockdown FMRP no ducto auditivo de galinha. (A) Imagem de campo brilhante (GC) mostrando a microinjeção de plasmídeos no otocisto no HH13. Tinta indiana (preta) foi injetada abaixo do embrião para maior visibilidade. (B) Posicionamento do eletrodo bipolar para eletroporação. O lado positivo (marcado com um símbolo de mais, +) foi posicionado anteriormente ao otocisto, e o lado negativo (marcado com um símbolo de menos, -) foi colocado posteriormente ao otocisto. (C) A secção transversal de uma cabeça de galinha em E6 foi imunocorada para FMRP (vermelho) e neurofilamento (NF; azul). Dox foi aplicado em E3 após a eletroporação. A fluorescência do EGFP foi detectada no otocisto, mas não no tronco encefálico. Barra de escala = 100 μm. (D-E) imagem do AM (D) mesclada com o canal EGFP (E) de um ducto auditivo em E9. Barra de escala = 500 μm. (F-G) Secção transversal de um ducto auditivo E9 com imunomarcação FMRP (vermelho) e NF (azul). Células EGFP+ foram observadas na parede do ducto coclear, papila basilar (PA) e gânglio auditivo (GA). Barra de escala = 50 μm em F, aplica-se a F e G. (H-J) Imagens de alta ampliação de uma PA E9 mostrando imunorreatividade FMRP amplamente diminuída em células ciliadas transfectadas (HCs; *) em comparação com HCs não transfectados (•). As fibras NF-positivas (azul) foram a inervação periférica dos neurônios AG. (K-M) Imagens de alta ampliação de neurônios AG em E9 com imunocoloração FMRP (vermelho). A imunorreatividade da FMRP foi forte em neurônios não transfectados (•) e não detectável em neurônios transfectados (EGFP+; *). Barra de escala = 50 μm em H, e aplica-se a H-M. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Rastreamento axonal de neurônios AG transfectados no tronco encefálico. Os embriões foram eletroporados no HH13 para transfecção otocista de fmr1 shRNA. O aplicativo Dox começou no E2. (A) Cortes transversais de uma cabeça de galinha E6 com imunocoloração Islet-1 e contracoloração DAPI. As células EGFP+ foram evidentes no gânglio auditivo (GA). Estrelas* indicam vários neurônios AG transfectados no inserção. Barra de escala = 100 μm em A e 10 μm em inserção. (B-C) Imagem de campo brilhante (BF) (B) fundida com o canal EGFP (C) de um tronco encefálico E9. Neste caso, uma porção do GA (setas brancas) foi deixada conectada ao tronco encefálico auditivo. A seta amarela indica neurônios AG transfectados (AGN) na inserção. As fibras EGFP+ foram evidentes no lado transfectado do tronco encefálico. Barra de escala = 1 mm em B, aplica-se a B e C; 100 μm na inserção. (D) Secção transversal do tronco encefálico E9 ao nível indicado em C pela linha tracejada. As fibras do nervo auditivo EGFP+ (ANF; verde) se estendiam ao longo da margem dorsal do tronco encefálico e se aproximavam do núcleo magnocelular (NM). Barra de escala = 100 μm. (E-G) de fibras EGFP+ em E15 (E) e E19 (F-G). Algumas fibras também foram observadas no núcleo angular (NA) e no núcleo vestibular descendente (VeD). Os cortes E19 foram corados para imunorreatividade da parvalbumina (PV) como marcador para os FANs. A caixa tracejada em F é ampliada nas inserções, mostrando um FAN EGFP+, que foi imunorreativo ao PV. Barra de escala = 100 μm em E; 50 μm em F, aplica-se a F e G; 2 μm nas inserções. (H-J) Imagens de alta ampliação dos terminais ANF em NM em E9, E15 e E19, mostrando a formação e maturação progressiva do bulbo final de Held. Barra de escala = 5 μm em H, aplica-se a H-J. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Para determinar a função autônoma celular da FMRP, é necessário manipular sua expressão em grupos celulares individuais ou tipos de células. Uma vez que uma das principais funções da FMRP é regular a formação sináptica e a plasticidade, manipular seletivamente cada componente sináptico de um determinado circuito é pré-requisito para uma compreensão completa do mecanismo FMRP na comunicação sináptica. Utilizando na ovoporação embriões de galinha, demonstramos um método para direcionar a expressão da FMRP no circuito AG-NM, seja em neurônios AG pré-sinápticos ou neurônios NM pós-sinápticos. Para conseguir isso, escolher estágios de desenvolvimento apropriados para a eletroporação e posicionar com precisão o eletrodo de eletroporação no embrião são etapas críticas. Os neurônios NM surgem de progenitores neurais no tubo neural no nível r5/6 em HH1223. No mesmo estágio, as células da crista neural craniana migram da ponta dorsal do tubo neural para o gânglio cocleovestibular para envolver futuros neurônios AG33. Assim, tanto os neurônios NM quanto as células da glia no AG são derivados do tubo neural. Em contraste, as células ciliadas e os neurônios AG se originam do ectoderma24. O ectoderma adjacente ao nível r5/6 engrossa em HH10 e, em seguida, invagina para formar o copo ótico em HH13. O copo ótico então se fecha e se separa do ectoderma para formar o otocisto, com a porção anterior se tornando o órgão sensorial auditivo e a porção posterior contribuindo para o sistema vestibular. Tanto na porção auditiva quanto na vestibular, as células neuroblásticas residentes na parte ventral do copo ótico se delaminam e migram para formar o gânglio cocleovestibular. Com base nesses estudos de mapeamento de destino, transfectamos os progenitores de neurônios NM eletroporizando o tubo neural em HH12, uma estratégia que foi estabelecida anteriormente26,28,34. Embora essa estratégia leve à transfecção adicional de células gliais no tronco encefálico e no GA, nenhum dos neurônios AG foi transfectado. A transfecção neuronal-específica pode ser alcançada empregando-se uma estratégia promotora de Atoh1, como o que fizemos anteriormente21. Para a transfecção seletiva de neurônios do GA, eletroporamos o otocisto no HH13. Os plasmídeos injetados no copo ótico entraram predominantemente na porção anterior do otocisto para transfecção de células ciliadas e neurônios AG simultaneamente ao posicionar eletrodos, como mostra a Figura 2B. Para atingir preferencialmente os neurônios AG sobre as células ciliadas, é viável injetar a solução plasmídica diretamente na região adjacente ao otocisto anterior, onde se localizam os neuroblastos delaminados35. No entanto, este método tem uma menor eficiência de transfecção de neurônios AG em comparação com a injeção de otocisto, pois os plasmídeos se difundem rapidamente após a injeção. Este método também pode levar à transfecção adicional das células mesenquimais da cabeça circundantes. Um método para atingir preferencialmente as células ciliadas sobre os neurônios AG é retardar a injeção e eletroporação do otocisto para HH18 (que é ~dia embrionário 3), já que a maioria dos neuroblastos (precursores de neurônios AG) migrou para fora do otocisto neste estágio24.

Com modificações, esse método pode ser estendido para estudar o sistema vestibular. Para a transfecção do gânglio vestibular, a direção dos eletrodos mostrados na Figura 2B deve ser invertida para transfectar a porção posterior do otocisto, devido à localização distinta dos precursores dos gânglios auditivos e vestibulares.

Na ovo , a eletroporação de embriões de galinha é uma técnica bem estabelecida para investigar os estágios iniciais de desenvolvimento (na primeira semana de incubação). Para estudos de longo prazo, a taxa de sobrevivência é uma grande preocupação. Ao iniciar o tratamento com Dox em E8, a taxa de sobrevivência encontrada aqui é de ~60% em E9, mas cai para 30% em E15, e ainda menor em E19. Filhotes de ovos eletroporados, são possíveis, mas raros e só podem sobreviver por vários dias na maioria dos casos. Para aumentar a taxa de sobrevivência, deve-se considerar: 1) usar um eletroporador que forneça ondas quadradas em vez de ondas agudas; 2) aplicar uma ou duas gotas de PBS estéril no topo do embrião se a camada de albumina não for espessa o suficiente para promover a condutividade elétrica (isso ajudará a reduzir o trauma elétrico); 3) a abertura da membrana vitelina para expor o embrião no local da injeção não é necessária para uma transfecção bem-sucedida e pode prejudicar o embrião; 4) para reduzir o risco de contaminação, use uma seringa para cutucar o parafilme e administrar Dox em vez de reabrir a janela. Após a injeção, limpe o filme transparente com etanol a 75% e cubra a abertura da agulha com fita adesiva; 5) para transfecção de otocisto, injetar plasmídeos no otocisto dorsolateralmente com uma pipeta angular de 45° para evitar possível punção da aorta dorsalis por baixo. Se a aorta dorsalis estiver danificada, o sangramento liberará os plasmídeos e até causará a morte; 6) se possível, evite usar tinta indiana para visualizar o embrião. Menos manuseio e menos procedimentos resultarão em uma maior taxa de sobrevivência.

Além da capacidade de transfectar seletivamente neurônios AG ou NM, a eletroporação in ovo fornece um sistema único que permite comparações vizinhas para análises de dados. Após a eletroporação, apenas um subconjunto de células no NM ou no AG é transfectado, permitindo que as células não transfectadas circundantes no mesmo grupo celular sirvam como um controle ideal20. Se a interação potencial entre os neurônios vizinhos é uma preocupação, as contrapartes dos neurônios do lado não transfectado do ouvido e do cérebro podem servir como um controle adicional. Para estudos histológicos e de imagem, esse desfecho possibilita análises de dados com alta eficiência no nível de célula única ou fibra única. As análises moleculares também são viáveis se combinadas com a classificação celular baseada em fluorescentes e análises de proteína e RNA em larga escala, como espectrometria de massa e sequenciamento de próxima geração. No entanto, o uso de ovoporação como meio de edição de genes pode ser um desafio para estudos funcionais e comportamentais, porque a porcentagem de células transfectadas dentro de um grupo de células pode não ser grande o suficiente para resultar em consequências funcionais.

É essencial realizar duas análises de verificação ao adotar a abordagem de eletroporação in ovo. Primeiro, o efeito da edição de genes sobre a proteína de interesse deve ser confirmado. Em transfectos de eletroporação de ovo, apenas um subconjunto de neurônios no NM ou AG (ou seja, um padrão de mosaico). Realizar western blot em tecidos homogeneizados que contêm uma mistura de neurônios transfectados e não transfectados não é sensível o suficiente para refletir com precisão o efeito knockdown. Assim, a validação deve ser realizada no nível celular individual usando métodos como a imunocitoquímica. Para isso, geramos previamente um anticorpo que reconhece o frango FMRP. A especificidade desse anticorpo foi verificada por imunocitoquímica e western blot em estudo prévio30. O efeito knockdown do shRNA Fmr1 foi validado quantitativamente pela observação de reduções significativas na intensidade da imunorreatividade da FMRP em neurônios NM transfectados em comparação com neurônios vizinhos não transfectados. Em segundo lugar, grupos controle utilizando RNAs embaralhados, ou outros construtos de controle, devem ser empregados para confirmar a especificidade dos efeitos celulares observados da expressão incorreta da FMRP20,21. Para atingir esse objetivo, projetamos um shRNA embaralhado, clonamos no mesmo sistema vetorial Tet-On e o eletroporamos em precursores NM, conforme descrito anteriormente20. A expressão de FMRP nos neurônios NM transfectados com o shRNA embaralhado não foi afetada, como evidenciado pela intensidade inalterada da imunorreatividade da FMRP em comparação com neurônios vizinhos não transfectados. Também identificamos uma série de efeitos da transfecção de shRNA Fmr1 no crescimento axonal, poda dendrítica, formação terminal e neurotransmissão (revisada em Curnow e Wang, 2022)36. Concluímos que esses efeitos foram induzidos especificamente pela perda autônoma celular de FMRP porque o shRNA embaralhado não conseguiu induzir mudanças semelhantes.

Em conclusão, a técnica de eletroporação in ovo permite a edição seletiva do gene Fmr1 com controle temporal e especificidade de componentes nos circuitos auditivos orelha-tronco encefálico e pode ser modificada para manipular o sistema vestibular. O desenvolvimento desta tecnologia avançada no embrião de galinha, um modelo bem estabelecido na biologia do desenvolvimento, contribuiu e continuará a contribuir para a nossa compreensão do desenvolvimento do cérebro em condições normais e anormais, como o FXS.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este estudo foi apoiado por: uma bolsa da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 32000697); o Programa de Ciência e Tecnologia de Guangzhou (202102080139); a Fundação de Ciências Naturais de Guangdong (2019A1515110625, 2021A1515010619); os Fundos de Investigação Fundamental para as Universidades Centrais (11620324); uma Bolsa de Pesquisa do Laboratório Chave de Medicina Regenerativa, Ministério da Educação, Universidade de Jinan (No. ZSYXM202107); os Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais da China (21621054); e a Fundação de Pesquisa Científica Médica da Província de Guangdong, na China (20191118142729581). Agradecemos ao centro médico experimental da Universidade de Jinan. Agradecemos ao Dr. Terra Bradley pela cuidadosa edição do manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Egg incubation
16 °C refrigerator MAGAT Used for fertilized egg storage.
Egg incubator SHANGHAI BOXUN GZX-9240MBE
Fertilized eggs Farm of South China Agricultural University Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge Sigma 10016
Fast green Solarbio G1661 Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit QIAGEN 12162 Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889 Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator BTX ECM399
1 mL / 5 mL Syringe GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope CNOPTEC SZM-42
Doxcycline Sigma-Aldrich D9891 Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary BEIBOBOMEI RD0910 0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm PARAFILM PM996 transparent film
Pipette puller CHENGDU INSTRUMENT FACTORY WD-2 Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes Home made 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube Sigma-Aldrich A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps RWD F11020-11 Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools RWD
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW 01673921 For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat LEICA CM1850
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 From bovine skin.
Sliding microtome LEICA SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse Abcam ab150113 1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit Abcam ab150078 1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI Abcam ab285390 1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium Southern Biotech Sb-0100-01
FMRP antibody Y. Wang, Florida State University #8263 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody DSHB 39.3F7 1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate Corning 3478
Neurofilament antibody Sigma-Aldrich N4142 1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody Sigma-Aldrich P3088 1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody Abcam ab66066 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop ADOBE image editing software
Confocal microscope LEICA SP8
Fluorescent stereomicroscope OLYMPUS MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0 OlYMPUS commercial image processing software package

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Dissecando a Função Autônoma Celular da Proteína de Retardo Mental do X Frágil em um Circuito Auditivo por <em>Eletroporação In Ovo</em>
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Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang,… More

Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang, X. Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation. J. Vis. Exp. (185), e64187, doi:10.3791/64187 (2022).

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