Summary
Met behulp van ovo-elektroporatie hebben we een methode ontwikkeld om selectief het auditieve binnenoor en de cochleaire kern in kippenembryo's te transfecteren om een celgroepspecifieke knockdown van fragiele X mentale retardatie-eiwit te bereiken tijdens discrete perioden van circuitassemblage.
Abstract
Fragiele X mentale retardatie-eiwit (FMRP) is een mRNA-bindend eiwit dat de lokale eiwittransformatie reguleert. FMRP-verlies of disfunctie leidt tot afwijkende neuronale en synaptische activiteiten bij fragiele X-syndroom (FXS), dat wordt gekenmerkt door intellectuele achterstand, sensorische afwijkingen en sociale communicatieproblemen. Studies naar FMRP-functie en FXS-pathogenese zijn voornamelijk uitgevoerd met Fmr1 (het gen dat codeert voor FMRP) knock-out bij transgene dieren. Hier rapporteren we een in vivo methode voor het bepalen van de cel-autonome functie van FMRP tijdens de periode van circuitassemblage en synaptische vorming met behulp van kippenembryo's. Deze methode maakt gebruik van fase-, plaats- en richtingsspecifieke elektroporatie van een geneesmiddel-induceerbaar vectorsysteem met Fmr1 klein haarspeld-RNA (shRNA) en een EGFP-verslaggever. Met deze methode bereikten we selectieve FMRP-knockdown in het auditieve ganglion (AG) en in een van zijn hersenstamdoelen, de nucleus magnocellularis (NM), waardoor een componentspecifieke manipulatie binnen het AG-NM-circuit werd geboden. Bovendien maakt het mozaïekpatroon van de transfectie controles binnen het dier en naburige neuron / vezelvergelijkingen mogelijk voor verbeterde betrouwbaarheid en gevoeligheid bij het analyseren van gegevens. Het induceerbare vectorsysteem biedt temporele controle over het begin van genbewerking om accumulerende ontwikkelingseffecten te minimaliseren. De combinatie van deze strategieën biedt een innovatief hulpmiddel om de cel-autonome functie van FMRP in synaptische en circuitontwikkeling te ontleden.
Introduction
Fragiele X-syndroom (FXS) is een neurologische ontwikkelingsstoornis die wordt gekenmerkt door een verstandelijke beperking, sensorische afwijkingen en autistisch gedrag. In de meeste gevallen wordt FXS veroorzaakt door een wereldwijd verlies van fragiel X-mentaal retardatie-eiwit (FMRP; gecodeerd door het Fmr1-gen) vanaf vroege embryonale stadia1. FMRP is een RNA-bindend eiwit dat normaal tot expressie komt in de meeste neuronen en gliacellen in de hersenen, evenals in sensorische organen 2,3,4. In zoogdierhersenen wordt FMRP waarschijnlijk geassocieerd met honderden mRNA's die coderen voor eiwitten die belangrijk zijn voor verschillende neurale activiteiten5. Studies van conventionele Fmr1 knock-out dieren toonden aan dat FMRP-expressie bijzonder belangrijk is voor de assemblage en plasticiteit van synaptische neurotransmissie6. Verschillende voorwaardelijke en mozaïek knock-outmodellen hebben verder aangetoond dat FMRP-acties en -signalen variëren tussen hersengebieden, celtypen en synaptische locaties tijdens verschillende ontwikkelingsgebeurtenissen, waaronder axonale projectie, dendritische patronen en synaptische plasticiteit 7,8,9,10,11,12,13,14 . Acute functie van FMRP bij het reguleren van synaptische transmissie werd bestudeerd door intracellulaire toediening van remmende FMRP-antilichamen of FMRP zelf in hersenplakken of gekweekte neuronen 15,16,17,18. Deze methoden bieden echter niet de mogelijkheid om FMRP-misexpressie-geïnduceerde gevolgen tijdens de ontwikkeling te volgen. Het ontwikkelen van in vivo methoden om de cel-autonome functies van FMRP te onderzoeken is dus in grote behoefte, en naar verwachting zal het helpen bepalen of de gerapporteerde anomalieën bij FXS-patiënten directe gevolgen zijn van FMRP-verlies in de geassocieerde neuronen en circuits, of secundaire gevolgen afgeleid van netwerkbrede veranderingen tijdens ontwikkeling19.
De auditieve hersenstam van kippenembryo's biedt een uniek voordelig model voor diepgaande functionele analyses van FMRP-regulatie in circuit- en synapsontwikkeling. De gemakkelijke toegang tot embryonale kippenhersenen en de gevestigde ovo-elektroporatietechniek voor genetische manipulatie hebben sterk bijgedragen aan ons begrip van de ontwikkeling van de hersenen in vroege embryonale stadia. In een onlangs gepubliceerde studie werd deze techniek gecombineerd met geavanceerde moleculaire hulpmiddelen die temporele controle van FMRP-misexpressie20,21 mogelijk maken. Hier is de methodologie geavanceerd om selectieve manipulaties van presynaptische en postsynaptische neuronen afzonderlijk te induceren. Deze methode is ontwikkeld in het auditieve hersenstamcircuit. Akoestisch signaal wordt gedetecteerd door haarcellen in het auditieve binnenoor en vervolgens overgebracht naar het auditieve ganglion (AG; ook wel het spiraalganglion bij zoogdieren genoemd). Bipolaire neuronen in de AG innerveren haarcellen met hun perifere processen en sturen op hun beurt een centrale projectie (de gehoorzenuw) naar de hersenstam waar ze eindigen in twee primaire cochleaire kernen, de nucleus magnocellularis (NM) en de nucleus angularis (NA). Neuronen in de NM zijn structureel en functioneel vergelijkbaar met de bolvormige bossige cellen van de anteroventrale cochleaire kern van zoogdieren. Binnen de NM synapsen gehoorzenuwvezels (ANF's) op de somata van NM-neuronen via de grote eindbulb van Held terminals22. Tijdens de ontwikkeling ontstaan NM-neuronen uit rhombomeren 5 en 6 (r5/6) in de achterhersenen23, terwijl AG-neuronen zijn afgeleid van neuroblasten die zich in de otocyste24 bevinden. Hier beschrijven we de procedure om selectief FMRP-expressie in de presynaptische AG-neuronen en in de postsynaptische NM-neuronen afzonderlijk af te slaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eieren en kippenembryo's werden met zorg en respect behandeld in overeenstemming met de dierprotocollen die zijn goedgekeurd door de Jinan University Animal Care and Use Committee.
1. Bereiding van eieren en plasmide
- Eierbereiding
- Verkrijg verse bevruchte kippeneieren (Gallus gallus) van de South China Agricultural University en bewaar bij 16 °C vóór de incubatie. Voor optimale levensvatbaarheid, zet alle eieren voor incubatie binnen een week na aankomst.
- Plaats de eieren horizontaal en broed bij 38 °C gedurende 46-48 uur tot Hamburger en Hamilton (HH) stadium 1225 voor neurale buistransfectie, of gedurende 54-56 uur tot HH13 voor otocyste transfectie. Omdat de dierlijke pool van het ei lichter is dan de plantaardige paal, plaatst horizontale plaatsing het embryo op de bovenkant van het ei voor eenvoudige manipulatie. Wees voorzichtig om het ei horizontaal te houden in deze en alle volgende stappen.
- De locatie van het embryo verschijnt als een donker gebied op de eierschaal bij het werpen van licht vanaf de bodem van het ei met behulp van een zaklamp. Gebruik in de gewenste HH-stadia deze zaklampmethode om de locatie van het embryo op de eierschaal met potlood te markeren.
- Veeg de eieren af met gaas dat 75% ethanol bevat. Boor een gat in het puntige uiteinde van de eieren met behulp van de punt van de schaar en verwijder 2 ml albumine met een naaldspuit van 18 G. Zorg ervoor dat het gat alleen groot genoeg is om naaldinbrenging mogelijk te maken. Veeg eventuele lekkende albumine weg met gaas en sluit het gat af met doorzichtige tape.
- Om scheuren te minimaliseren en om vallend schelpafval tijdens het vensteren te voorkomen, bedekt u de bovenkant van eieren met doorzichtige tape, gecentreerd op het met potlood gemarkeerde donkere gebied.
- Plasmide DNA extractie
- Kloon kip Fmr1 shRNA met behulp van een transposon-gebaseerd Tet-on systeem zoals eerder beschreven20. Dit systeem bevat drie plasmiden: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 en pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA, dat een geneesmiddel-induceerbaar vectorsysteem biedt waarmee de expressie van Fmr1-shRNA en EGFP na transfectie tot zwijgen wordt gebracht en kan worden ingeschakeld door doxycycline (Dox) inductie.
OPMERKING: Deze plasmiden zijn momenteel niet beschikbaar in een repository. De auteurs stemmen ermee in om de plasmiden op redelijk verzoek te verstrekken. - Extraheer plasmide-DNA's met behulp van een endotoxinevrije bereidingskit volgens de instructies van de fabrikant en stort neer door 1/15 volume van 7,5 M natriumacetaat en 1 volume van 100% isopropanol toe te voegen.
- Zet plasmiden 's nachts neer bij -20 °C en centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 10 minuten. Los de pellet op met de Tris-EDTA-buffer in de kit tot een eindconcentratie van 4-5 μg/μL. Plasmiden kunnen gedurende 12 maanden bij -20 °C worden bewaard zonder verminderde transfectie-efficiëntie.
- Meng op de dag van elektroporatie grondig 2 μL van elk plasmide in een steriele centrifugebuis met behulp van een pipetpunt. Het resulterende volume van 6 μL van het plasmidemengsel is voldoende om drie dozijn eieren te elektropoteren. Om het plasmide tijdens elektroporatie te visualiseren, voegt u 1 μL 0,1% snelgroen (bereid in steriel ddH2O) toe voor elke 6 μL DNA-mengsel26, waardoor het plasmidemengsel blauw wordt.
- Kloon kip Fmr1 shRNA met behulp van een transposon-gebaseerd Tet-on systeem zoals eerder beschreven20. Dit systeem bevat drie plasmiden: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 en pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA, dat een geneesmiddel-induceerbaar vectorsysteem biedt waarmee de expressie van Fmr1-shRNA en EGFP na transfectie tot zwijgen wordt gebracht en kan worden ingeschakeld door doxycycline (Dox) inductie.
2. In ovo elektroporatie
- Eivensters en embryo-identificatie
- Verwijder op de dag van elektroporatie de eieren uit de broedmachine, een dozijn eieren per keer. Eieren langer dan 1 uur uit hun broedmachine houden, introduceert ontwikkelingsvariaties en vermindert de levensvatbaarheid.
- Veeg alle operatiegereedschappen af met gaas dat 75% ethanol bevat.
- Leg elk ei in een op maat gemaakte schuimhouder. Veeg het met tape bedekte gebied af met 75% ethanol en knip een venster (1-2 cm2) rond de omtrek van de potloodmarkering met een kleine schaar (figuur 1A). Houd bij het knippen de schaar plat om te voorkomen dat het embryo eronder wordt beschadigd.
- Plaats het vensterei onder een stereomicroscoop met een 10x oculair en 2x zoom en identificeer het embryo. Pas de hoek en helderheid van de lichtbron aan voor een betere visualisatie.
OPMERKING: Het vergt oefening en ervaring om het embryo te visualiseren en de neurale buis in dit stadium te identificeren.- Voor beginners, gebruik de volgende optionele inktinjectie om de identificatie van embryo's te vergemakkelijken. Bereid 10% Indiase inktoplossing in 0,01 M fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en autoclaaf van tevoren. Vul een spuit van 1 ml met de inktoplossing en plaats vervolgens een naald van 27 G. Buig de naald in een hoek van 45° met een tang.
- Steek onder de microscoop voorzichtig vanaf de rand van het gebied opaca en steek de naald onder het embryo in. Injecteer ~ 50 μL inkt, die onder het gebied pellucida diffundeert voor embryovisualisatie. De inkt vormt een donkere achtergrond voor een duidelijke visualisatie van het embryo.
OPMERKING: Verwijder de lucht uit de spuit voordat u deze inbrengt en injecteert. Wanneer u bedreven bent in het visualiseren, vermijd dan de stap van de inktinjectie, omdat dit de overlevingskans vermindert.
- Neurale buisinjectie en elektroporatie
OPMERKING: Deze procedure wordt uitgevoerd bij HH12 voor het transfecteren van NM-neuronen in de hersenstam.- Trek glazen haarvaten (~ 1 mm in diameter en 100 mm lang) in pipetten met behulp van een pipettrekker. Open onder een ontleedmicroscoop voorzichtig de punt van de capillaire naald tot 10-20 μm in diameter met een tang. Bewaar de pipetten (meestal 5-10 tegelijk) in een opbergdoos tot gebruik.
- Vul een capillaire pipet met 0,5-1 μL van het plasmidemengsel door negatieve druk uit te oefenen door een rubberen buis aan het einde van de pipet. Dit kan worden bereikt door een spuit of luchtpomp.
- Plaats het ei onder de microscoop zodat het embryo verticaal georiënteerd is met de staart bij u in de buurt (of horizontaal voor het injecteren van capillaire pipetten met behulp van een drieassige manipulator). Houd de capillaire pipet met één hand of met de drieassige manipulator en drijf de punt van de pipet naar de r5/6 in een staart-tot-koprichting.
OPMERKING: Het meest voorste achterhersenengebied is r1 en elke volgende uitstulping langs de neurale buis is een individueel rhombomeer. R5/6 bevindt zich op hetzelfde anteroposteriorniveau als de otocyste, wat een gemakkelijk herkenbare bekerachtige structuur is (figuur 1B-C). - Prik de punt voorzichtig door het vitellinemembraan en in de dorsale neurale buis en trek vervolgens de pipet een beetje terug zodat de punt in het lumen van de neurale buis zit. Injecteer het plasmidemengsel door luchtdruk uit te oefenen totdat het getinte plasmide volledig diffundeert in r5/6 en zich uitstrekt tot r3 en r4.
OPMERKING: Het is niet nodig om een sleuf op het vitellinemembraan te maken voor injectie. - Controleer op een succesvolle injectie, die wordt bereikt wanneer de blauwe plasmide-oplossing snel door de neurale buis diffundeert zonder te lekken (figuur 1B-C). Wanneer er lekkage optreedt, vervaagt het blauw snel.
- Plaats onmiddellijk na de injectie een platina bipolaire elektrode aan weerszijden van de neurale buis (figuur 1D). Lever twee pulsen van 12 V en 50 ms met een elektroporator. Observeer luchtbellen aan de uiteinden van de bipolaire elektrode, met meer aan de negatieve kant.
- Controleer op succesvolle elektroporatie, die wordt bereikt wanneer het getinte plasmidemengsel het neurale buisweefsel in de buurt van de positieve kant van de elektrode binnendringt. Verwijder na elektroporatie voorzichtig de bipolaire elektrode.
- Bedek het venster op de eierschaal met een stuk transparante film dat in vierkanten in 2 is voorgesneden en met 75% ethanol is bespoten. Leg het ei terug in de broedmachine.
- Reinig de bipolaire elektrode door 10-20 pulsen van 12 V en 50 ms duur in zoutoplossing af te geven voordat u doorgaat naar het volgende ei.
- Otocyst injectie en elektroporatie
OPMERKING: Deze procedure wordt uitgevoerd bij HH13 voor het transfecteren van haarcellen en AG-neuronen in het binnenoor.- Bij HH13 (dat is ~embryonale dag 2.5) is het embryo gedraaid zodat de rechterkant van het hoofd naar boven is gericht. Plaats het ei onder de microscoop zo dat het embryo verticaal is, met de staart bij u in de buurt. Houd de capillaire pipet vast en prik de rechterotocyst voorzichtig in dorsolaterale richting (figuur 2A).
OPMERKING: In dit stadium verschijnt de otocyst als een kleine cirkelvormige structuur aan de bovenkant van het lichaam op hetzelfde anteroposteriorniveau als r5/6. - Injecteer het plasmidemengsel met luchtdruk totdat de otocyste is gevuld met blauwe oplossing27. Controleer op een succesvolle injectie, die wordt bereikt wanneer het blauwe plasmidemengsel zich in de otocyste bevindt en niet lekt.
- Plaats onmiddellijk na de injectie de bipolaire elektrode op de otocyste zoals afgebeeld in figuur 2B. Plaats de positieve en negatieve zijden respectievelijk voor en achteraan ten opzichte van de otocyste. Lever twee pulsen van 12 V en 50 ms duur met de elektroporator.
- Controleer op succesvolle elektroporatie, die wordt bereikt wanneer het blauwe plasmidemengsel het weefsel van de otocyste in de buurt van de positieve kant van de elektrode binnendringt. Verwijder na elektroporatie voorzichtig de bipolaire elektrode. Bedek het venster op de eierschaal met een transparante film en breng het ei terug naar de couveuse.
- Bij HH13 (dat is ~embryonale dag 2.5) is het embryo gedraaid zodat de rechterkant van het hoofd naar boven is gericht. Plaats het ei onder de microscoop zo dat het embryo verticaal is, met de staart bij u in de buurt. Houd de capillaire pipet vast en prik de rechterotocyst voorzichtig in dorsolaterale richting (figuur 2A).
3. Toediening van Dox om plasmidetranscriptie te initiëren en te onderhouden
- Bereiding van de Dox-oplossing
- Meet 100 mg Dox-poeder onder een chemische kap en los het op in 100 ml steriel PBS om een werkoplossing van 1 mg / ml te maken. Filtreer de oplossing met een filter van 0,22 μm en bewaar 1 ml aliquots bij -20 °C. Bescherm tegen licht 20,28.
- Toediening van Dox
- Voor volledige genbewerking, op 24 uur voor de gewenste leeftijd, ontdooi een Dox aliquot op ijs. Laat 50 μL Dox direct op het chorioallantoïsche membraan van het ei vallen met behulp van een spuit die de transparante film binnendringt. Sluit het naaldgat na injectie af met transparante film of tape.
- Om het knockdown-effect te behouden, dient u Dox om de andere dag toe totdat het weefsel in het gewenste ontwikkelingsstadium is geoogst.
4. Weefseldissectie en -sectie
- Hersenstam
- Voor embryo's in embryonaal stadium 3 (E3) en E6, open de eierschaal en knip het bijbehorende membraan met een schaar. Schep het embryo eruit en dompel het onder in 4% paraformaldehyde (PFA) in 0,1 M fosfaatbuffer.
- Voor E9-embryo's opent u de eierschaal, onthoofdt u het embryo met een schaar en brengt u de kop over op een plaat met siliciumbodem gevuld met PBS. Pin het hoofd naar beneden door de banen en snijd de bovenkant van de schedel uit elkaar. Plaats de tang voorzichtig van beide kanten onder de hersenen en til de hele hersenen uit de schedel met de schouders van de tang. Dompel de hersenen onder in 4% PFA.
- Voor E15- en E19-embryo's opent u de eierschaal, onthoofdt u het embryo met een schaar en plaatst u de kop op een plaat met siliconenbodem gevuld met PBS. Knip de huid bovenop het hoofd open om de schedel bloot te leggen.
- Snijd verticaal door de schedel met een scheermes om de voorhersenen en de caudale hersenen te scheiden. Dompel het caudale blok onder in PBS, verwijder de bovenkant van de schedel en haal vervolgens de hersenen van de schedel.
- Pin de hersenen vast door de optische kwab en scheid het cerebellum en de hersenstam. Zorg ervoor dat u de auditieve hersenstam, die zich direct onder het cerebellum bevindt, niet beschadigt. Verwijder zoveel mogelijk dura uit de hersenstam en dompel het vervolgens onder in 4% PFA.
- Houd embryo's en hersenweefsels 's nachts in 4% PFA bij 4 °C, behalve voor E19-hersenstammen, die gedurende 24 uur onder dezelfde conditie moeten worden bewaard.
- Na fixatie droogt u het weefsel in PBS met 30% sucrose uit totdat het bezinkt, wat meestal 1-3 dagen duurt, afhankelijk van de leeftijd.
- Sectie van de hersenstam (E15 en E19) op 30 μm op het coronale vlak met behulp van een glijdende microtoom. Verzamel secties in PBS en bewaar bij 4 °C voordat immunostaining.
- Voor E3- en E6-embryo's en E9-hersenstammen, sectie bij 50 μm transversaal. Verzamel secties in PBS en bewaar bij 4 °C. Monteer de secties op gelatine-gecoate microscoopglaasjes voordat ze immunostainen. Het verzamelen van dikkere secties voor deze leeftijden vergemakkelijkt de weefselbehandeling.
- Gehoorgang
- Na het verwijderen van de hersenstammen van E9-, E15- en E19-embryo's, is het gehoorkanaal, dat is ingebed in het temporale bot, gemakkelijk identificeerbaar onder de schedel en is het temporale bot gemakkelijk te scheiden van de omliggende schedel. Voor E9-embryo's fixeert u het hele temporale bot in 4% PFA. Verwijder voor oudere embryo's de benige structuur van het temporale bot om het gehoorkanaal te isoleren en het gehoorkanaal in 4% PFA te fixeren.
- Bewaar alle temporale botten en gehoorgangen in 4% PFA bij 4 °C 's nachts voordat weefsel zich insluit.
- Voer weefselinbedding uit zoals beschreven. Bereid de inbeddingsoplossing als volgt: Week 10% gelatine (van runderhuid) in koud water totdat de gelatinekorrels opzwellen en bezinken (ongeveer 30 min). Verwarm het mengsel tot ~50 °C om de gelatine op te lossen en voeg 20% sucrose toe aan de gelatine-oplossing en roer om op te lossen. Bewaar de gelatine-sucrose-oplossing bij 4 °C gedurende maximaal een maand.
- Verwarm voor gebruik de gelatine-sucrose-oplossing op 37 °C. Week de temporale botten/gehoorkanalen in de warme gelatine-sucrose-oplossing op een 96-well plaat bij 37 °C totdat ze bezinken, meestal 30-60 min.
- Bekleed de bodem van de putten van een 12-well plaat met een strook transparante film. Voeg een laag warme gelatine-sucrose-oplossing toe en wacht tot deze stolt. Breng een temporale bot / auditieve kanaal over naar elke put.
- Implanteer het weefsel met een tweede laag warme gelatine-sucrose-oplossing. Pas de positie van het weefsel aan zodat het zich in het midden van de gel bevindt en het gehoorkanaal horizontaal is georiënteerd. Plaats de plaat voorzichtig in een koelkast van 4 °C en wacht tot de gel stevig is.
- Trek aan de transparante filmstrook om het gelweefselblok uit de put te verplaatsen. Snijd extra gel in een vierkant blok en snijd een hoek van het blok om de oriëntatie te identificeren. Wikkel het gelatineblok met een stuk folie, vries het droogijs in en bewaar het vervolgens bij -80 °C tot het in sectie is genomen.
- Doorsnede van het blok op 20 μm langs de lengtegraad van het gehoorkanaal met een cryostaat. Monteer de secties direct op met gelatine beklede microscoopglaasjes. Bewaar de dia's bij -80 °C voordat ze immunostainen.
- Voordat u immunostaining gebruikt, dompelt u de dia's gedurende 5 minuten onder in voorverwarmd PBS (45 °C) om de gelatine op te lossen en wast u de dia's vervolgens 3x met PBS op kamertemperatuur om resterende gelatine te verwijderen.
5. Immunostaining en microscoop beeldvorming
OPMERKING: Er worden twee soorten immunostaining uitgevoerd, afhankelijk van of secties op dia's zijn gemonteerd of vrij zweven in PBS.
- Immunostaining op dia's
- Was de dia's 3x gedurende 10 minuten elk met PBS. Omcirkel het gebied met de secties met een oliepen om te voorkomen dat vloeistof lekt tijdens het kleuren. Bedek de secties met een blokkerende oplossing met 5% normaal geitenserum in PBS en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Verdun de primaire antilichamen (voor de uiteindelijke gebruikte concentratie raadpleegt u de tabel met materialen) in PBS met 0,3% TritonX-100 en 5% normaal geitenserum. Verwijder de blokkerende oplossing en bedek de secties vervolgens met de primaire antilichaamoplossing. Incubeer de dia's bij 4 °C 's nachts in een doos met een laag gedestilleerd water op de bodem.
- Spoel de dia's 3x gedurende 10 minuten af met PBS. Breng fluorescerende secundaire antilichamen verdund op 1:500 in PBS met 0,3% TritonX-100 aan op dia's. Incubeer de dia's bij kamertemperatuur gedurende 4 uur, afgeschermd van licht.
- Was de dia's 3x met PBS. Laat voorzichtig twee druppels montagemedium op de dia's vallen en bedek de secties met coverslips. Zorg ervoor dat u geen luchtbellen genereert tussen de coverslip en de dia.
- Immunostaining voor embryo's en vrij zwevende secties
- Was de embryo's/secties met PBS 3x gedurende 10 minuten elk in een putplaat. Verdun de primaire antilichamen in PBS met 0,3% TritonX-100 en 5% normaal geitenserum in centrifugale buizen. Breng elk embryo/elke sectie over in een buis met een glazen haak en incubeer op een shaker bij 60 rpm 's nachts bij 4 °C.
- Was embryo's/secties 3x met PBS gedurende 10 minuten elk in een putplaat. Breng elk embryo/elke sectie over in een donkere centrifugale buis gevuld met fluorescerende secundaire antilichaamoplossing en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 4 uur op de shaker.
- Was de embryo's/secties 3x met PBS in een putplaat. Gebruik een borstel om de secties op gelatine-gecoate microscoopglaasjes in een schaal van 15 cm met PBS te monteren. Nadat de dia's enigszins zijn gedroogd (~ 5 min), breng twee druppels montagemedium aan en plaats een coverslip. Zorg ervoor dat u geen luchtbellen genereert tussen de coverslip en de dia. Bewaar de hele montageweefsels in PBS voor beeldvorming.
- Beeldvorming
- Beeld de hele montageweefsels in PBS voor in een schaal met een siliconen bodem met koolstofpoeder, dat een zwarte achtergrond biedt. Leg beelden vast en verwerk ze met behulp van een Commercieel Olympus-softwarepakket voor beeldverwerking, zoals eerder beschreven29.
- Beeld de secties op de dia's af met een confocale microscoop zoals eerder beschreven20. Stel de secties voor op een enkel brandpuntsvlak met 10x, 20x en 63x doelstellingen. Leg alle afbeeldingen van hetzelfde dier vast met dezelfde parameters. Zorg ervoor dat u het laserniveau en de instellingen voor beeldvormingsacquisitie aanpast om signaalverzadiging te voorkomen.
- Voer beeldverwerking uit met behulp van de Fiji-software. Pas ter illustratie de helderheid, het contrast en het gamma van afbeeldingen aan met behulp van professionele beeldbewerkingssoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Door ovo-elektroporatie uit te voeren op verschillende locaties en in verschillende ontwikkelingsstadia, bereikten we selectieve FMRP-knockdown in de auditieve periferie of in de auditieve hersenstam.
FMRP knockdown in NM
Klein haarspeld RNA (shRNA) tegen de kip Fmr1 werd ontworpen en gekloond in het Tet-On vectorsysteem zoals eerder beschreven20. De opstelling voor in ovo-elektroporatie is weergegeven in figuur 1A. Het met snel groen getinte plasmide-DNA werd in de neurale buis geïnjecteerd op r5/r6-niveau bij HH12 (figuur 1B-C). Een platina bipolaire elektrode werd aan elke kant van de neurale buis op r5/6-niveau geplaatst (figuur 1D). Twee pulsen bij 12 V werden toegediend om het plasmide in het weefsel in de buurt van de positieve kant van de elektrode te drijven. Dox werd aangebracht op het chorioallantoïsche membraan om de expressie van Fmr1 shRNA en EGFP te activeren. Na 24 uur Dox-behandeling was EGFP duidelijk onder een fluorescerende stereomicroscoop. Figuur 1E-F toont een voorbeeld op E3 toen Dox werd toegepast op E2. Dwarsdoorsneden bevestigden de locatie van EGFP-expressiecellen (EGFP+) aan één kant van de achterhersenen (figuur 1G-H). Bovendien werd een groep getransfecteerde cellen gevonden die anterieur zijn aan de otocyste; dit waren craniale neurale crest-cellen die ventrolateraal uit de neurale buis migreerden (figuur 1F). Geëlektropoeerde embryo's kunnen ook langer worden geïncubeerd om circuitvorming in latere stadia te bestuderen. Bij E15 werd EGFP waargenomen in de hersenstam, maar alleen aan de getransfecteerde zijde (figuur 1I-J). Dwarsdoorsneden ter hoogte van de dorsale hersenstam toonden een handvol EGFP+ neuronen die verspreid waren in de NM aan de kant van elektroporatie (figuur 1L). EGFP+ vezels werden gezien die projecteerden naar het doel van NM-neuronen: de dorsale nucleus laminaris (NL) aan de ipsilaterale kant (figuur 1L) en de ventrale NL aan de contralaterale kant (figuur 1K). Het knockdown-effect van Fmr1 shRNA werd gevalideerd door duidelijke reducties in FMRP-immunoreactiviteit in getransfecteerde NM-neuronen in vergelijking met naburige niet-getransfecteerde neuronen (figuur 1M-N). In het auditieve ganglion (AG) waren neuronen niet-getransfecteerd (EGFP-), hoewel sommige gliacellen rond AG-neuronen EGFP+ waren (figuur 1O-P), vermoedelijk afgeleid van EGFP+ craniale neurale crestcellen (zie figuur 1F). Deze elektroporatiestrategie zorgt dus voor een selectieve transfectie van de postsynaptische neuronen in het AG-NM-circuit.
FMRP knockdown in het gehoorkanaal
Het plasmidemengsel werd geïnjecteerd in de otocyste bij HH13 (figuur 2A), gevolgd door elektroporatie door de positieve kant van de elektrode anterieur aan de otocyste en de negatieve kant achter aan de otocyste te plaatsen (figuur 2B). Secties met het hele hoofd op E6 vertoonden sterke EGFP-fluorescentie in de rechterotocyste, maar niet in de hersenstam (figuur 2C). Geïsoleerde gehoorkanalen bij E9 vertoonden uitgebreide EGFP-fluorescentie over de hele lengte van het kanaal (figuur 2D-E). Op dwarsdoorsnedes werden EGFP+-cellen bevestigd in de basilaire papilla (BP) langs de wand van het cochleaire kanaal en in de AG (figuur 2F-G). Het knockdown-effect van Fmr1-shRNA werd gevalideerd door duidelijke reducties in FMRP-immunoreactiviteit in getransfecteerde haarcellen (*, figuur 2H-J) in vergelijking met naburige niet-getransfecteerde haarcellen (•, figuur 2H-J). Voor ondersteunende cellen was de FMRP-immunoreactiviteit zwak in zowel getransfecteerde als niet-getransfecteerde cellen (figuur 2H-J). Net als bij haarcellen was fmrp-immunoreactiviteit grotendeels verminderd in getransfecteerde AG-neuronen in vergelijking met naburige niet-getransfecteerde neuronen (figuur 2K-M).
Vervolgens volgden we de centrale projectie van getransfecteerde AG-neuronen naar de hersenstam via de gehoorzenuw. Het mozaïekpatroon van Fmr1 shRNA-transfectie in de AG werd verder bevestigd op E6 met behulp van Islet-1 immunoreactiviteit (figuur 3A), een marker voor het zich ontwikkelende kippenbinnenoor31. Wanneer een deel van de AG tijdens dissectie met de hersenstam werd geëxtraheerd, werden geïsoleerde EGFP+ AG-neuronen en hun vezels in de hersenstam in situ in dezelfde preparaten gevisualiseerd (figuur 3B-C). Op dwarsdoorsneden ter hoogte van de NM hadden EGFP+ ANF's de NM op E9 bereikt (figuur 3D) en werden continu waargenomen bij E15 en E19 (figuur 3E-F). Beelden met een hoge vergroting toonden groeikegelachtige uiteinden van ANF's op E9 (figuur 3H), die de grote palmachtige eindbulb op E15 vormden voordat ze uitgroeiden tot de gekarakteriseerde eindbulb van heldmorfologie met complexe takken op E19 (figuur 3I-J). Buiten de NM werden ook uitgebreide takken van ANF's gezien in de NA, een andere primaire cochleaire kern (figuur 3E). Dit werd verwacht, omdat dezelfde ANF's zich splitsen om zowel de NM als de NA in kippen32 te innerveren. We zagen ook EGFP+ vezels de aangrenzende vestibulaire celgroepen binnendringen, waaronder de dalende vestibulaire kern (VeD) zoals weergegeven in figuur 3E. Hoewel we de locatie van de elektroporating-elektrode hebben geoptimaliseerd om zich bij voorkeur te richten op het voorste deel van de otocyste waar AG wordt gevormd, werden sommige vestibulaire ganglionneuronen ook getransfecteerd. Immunostaining voor parvalbumine, een marker voor ANF's bij kippen, kan worden gebruikt om auditieve versus vestibulaire vezels in de hersenstam te onderscheiden (figuur 3F-G).
Samenvattend biedt deze elektroporatiestrategie een selectieve transfectie van de presynaptische neuronen in het AG-NM-circuit en kan worden gebruikt om de ontwikkeling van endbulb van Held op individuele terminale niveaus te volgen na genetische manipulaties.
Figuur 1. FMRP knockdown in de kip NM. (A) Afbeelding van elektroporatie-instellingen. (B) Schematische tekening met de micro-injectieplaats op het rhombomeer r5/6-niveau van een HH12-kippenembryo. Afkortingen: NT = neural tube; SO = somiet. (C) Voor een betere zichtbaarheid werd Indiase inkt (zwart) onder het embryo geïnjecteerd met een spuit. Plasmidemengsel getint met snel groen werd vervolgens geïnjecteerd in het lumen van de neurale buis. (D) Positionering van de bipolaire elektrode voor elektroporatie. + en - geven respectievelijk de positieve en negatieve kanten aan. Merk op dat het blauwe plasmidemengsel na elektroporatie aan de positieve kant in de neurale buis diffundeerde. (E-F) Bright field (BF) afbeelding (E) samengevoegd met EGFP-kanaal (F) van een geëlektropoeerd kippenembryo op embryonale dag 3 (E3), met transfectie in de neurale buis op hetzelfde anteroposteriorniveau van de otocyste. Dox werd aangebracht op E2, 6 uur na de elektroporatie. Migrerende craniale neurale crest (CNC) cellen worden aangegeven met de gele pijl en vergroot in de inzet in F. Schaalbalk = 500 μm in E, geldt voor E en F; 100 μm in de inzet. (G-H) Getransfecteerde cellen met Fmr1 shRNA en EGFP op de doorsnede van een getransfecteerd E3-embryo. EGFP+ cellen zaten opgesloten aan één kant van de neurale buis. De sectie was dubbel gekleurd met FMRP-immunoreactiviteit (grijs). Schaalbalk = 40 μm in G, van toepassing op G en H. (I-J) BF-afbeelding (I) samengevoegd met EGFP-kanaal (J) van een E15-hersenstam na Dox-behandeling bij E8. Schaalbalk = 1 mm in I, geldt alleen voor I en J. (K-L) Doorsnede van een E15 hersenstam met EGFP+ NM neuronen aan de getransfecteerde (trans) zijde. Aan de contralaterale (contra) kant (K) werden EGFP+ axonen gezien in het ventrale gedeelte van de nucleus laminaris (NL). (M-N) Hoge vergrotingsbeelden van de NM op E19 met dubbele labeling van FMRP (rood) en SNAP25 (blauw) immunostaining. SNAP25 is een presynaptische marker die de eindbulb van Held labelt. Let op de duidelijke vermindering van FMRP-immunoreactiviteit in de getransfecteerde (groene; *) neuronen in vergelijking met naburige niet-getransfecteerde neuronen (•). (O-P) Hoge vergrotingsbeelden van het auditieve ganglion (AG) op E19 met FMRP-immunoreactiviteit. AG-neuronen (AGN) waren niet getransfecteerd (EGFP-). Sommige gliacellen afgeleid van CNC-cellen aangegeven in F werden getransfecteerd. Schaalbalk = 10 μm in M, geldt voor M-P. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. FMRP knockdown in het gehoorkanaal van de kip. (A) Bright field (BF) afbeelding toont de micro-injectie van plasmiden in de otocyste bij HH13. Indiase inkt (zwart) werd onder het embryo geïnjecteerd voor een betere zichtbaarheid. (B) Positionering van de bipolaire elektrode voor elektroporatie. De positieve kant (gelabeld met een plussymbool, +) werd anterieur aan de otocyste geplaatst en de negatieve kant (gelabeld met een minsymbool, -) werd achteraan bij de otocyste geplaatst. (C) Transversale sectie van een kippenkop op E6 was immunoskleurd voor FMRP (rood) en neurofilament (NF; blauw). Dox werd toegepast op de E3 na de elektroporatie. EGFP-fluorescentie werd gedetecteerd in de otocyste, maar niet in de hersenstam. Schaalbalk = 100 μm. (D-E) BF-beeld (D) samengevoegd met EGFP-kanaal (E) van een gehoorkanaal op E9. Schaalbalk = 500 μm. (F-G) Dwarsdoorsnede van een E9-gehoorkanaal met FMRP (rood) en NF (blauw) immunostaining. EGFP+ cellen werden gezien in de cochleaire kanaalwand, basilaire papilla (BP) en auditief ganglion (AG). Schaalbalk = 50 μm in F, geldt voor F en G. (H-J) Hoge vergrotingsbeelden van een E9 BP met grotendeels verminderde FMRP-immunoreactiviteit in getransfecteerde haarcellen (HC's; *) in vergelijking met niet-getransfecteerde HC's (•). NF-positieve vezels (blauw) waren de periferie-innervatie van AG-neuronen. (K-M) Hoge vergrotingsbeelden van AG-neuronen op E9 met FMRP-immunostaining (rood). FMRP-immunoreactiviteit was sterk in niet-getransfecteerde neuronen (•) en niet detecteerbaar in getransfecteerde neuronen (EGFP+; *). Schaalbalk = 50 μm in H, en geldt voor H-M. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Axonale tracking van getransfecteerde AG-neuronen in de hersenstam. Embryo's werden geëlektropoeerd bij HH13 voor otocyste transfectie van Fmr1 shRNA. Dox applicatie gestart op E2. (A) Dwarsdoorsneden van een E6-kippenkop met Islet-1 immunostaining en DAPI counterstain. EGFP+ cellen waren zichtbaar in het auditieve ganglion (AG). Sterren* duiden op verschillende getransfecteerde AG-neuronen in de inzet. Schaalbalk = 100 μm in A en 10 μm in inzet. (B-C) Bright field (BF) beeld (B) samengevoegd met EGFP kanaal (C) van een E9 hersenstam. In dit geval werd een deel van de AG (witte pijlen) verbonden gelaten met de auditieve hersenstam. Gele pijl geeft getransfecteerde AG-neuronen (AGN) aan in de inzet. EGFP+ vezels waren zichtbaar aan de getransfecteerde kant van de hersenstam. Schaalbalk = 1 mm in B, geldt voor B en C; 100 μm in de inzet. (D) Doorsnede van de E9-hersenstam op het niveau dat in C wordt aangegeven door de stippellijn. EGFP+ gehoorzenuwvezels (ANF; groen) strekten zich uit langs de dorsale rand van de hersenstam en naderden de nucleus magnocellularis (NM). Schaalbalk = 100 μm. (E-G) EGFP+ vezels bij E15 (E) en E19 (F-G). Sommige vezels werden ook gezien in de nucleus angularis (NA) en de dalende vestibulaire kern (VeD). E19-secties werden gekleurd voor parvalbumine (PV) immunoreactiviteit als marker voor ANF's. Het onderbroken vak in F is uitvergroot in de inzetstukken, met een EGFP + ANF, die PV-immunoreactief was. Schaalbalk = 100 μm in E; 50 μm in F, geldt voor F en G; 2 μm in de inzetstukken. (H-J) Hoge vergrotingsbeelden van ANF-terminals in NM op E9, E15 en E19, die de vorming en progressieve rijping van de eindbulb van Held laten zien. Schaalbalk = 5 μm in H, geldt voor H-J. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om de cel-autonome functie van FMRP te bepalen, is het manipuleren van de expressie ervan in individuele celgroepen of celtypen noodzakelijk. Aangezien een van de belangrijkste functies van FMRP is om synaptische vorming en plasticiteit te reguleren, is het selectief manipuleren van elke synaptische component van een bepaald circuit een voorwaarde voor een volledig begrip van het FMRP-mechanisme in synaptische communicatie. Met behulp van ovo-elektroporatie van kippenembryo's demonstreerden we een methode om FMRP-expressie in het AG-NM-circuit te richten, hetzij in presynaptische AG-neuronen of postsynaptische NM-neuronen. Om dit te bereiken, zijn het kiezen van geschikte ontwikkelingsstadia voor elektroporatie en het nauwkeurig positioneren van de elektroporatie-elektrode op het embryo kritieke stappen. NM-neuronen ontstaan uit neurale voorlopers in de neurale buis op het r5/6-niveau bij HH1223. In hetzelfde stadium migreren craniale neurale crestcellen van de dorsale punt van de neurale buis naar het cochleovestibbulaire ganglion om toekomstige AG-neuronen te omhullen33. Zowel de NM-neuronen als de gliacellen in de AG zijn dus afgeleid van de neurale buis. Haarcellen en AG-neuronen daarentegen zijn afkomstig van het ectoderm24. Het ectoderm grenzend aan het r5/6-niveau wordt dikker bij HH10 en invagineert vervolgens om de otic cup te vormen bij HH13. De otische beker sluit dan en scheidt zich van het ectoderm om de otocyste te vormen, waarbij het voorste deel het auditieve sensorische orgaan wordt en het achterste deel bijdraagt aan het vestibulaire systeem. In zowel het auditieve als het vestibulaire gedeelte delamineren de neuroblastcellen die zich in het ventrale deel van de otische beker bevinden en migreren om het cochleovestibbulaire ganglion te vormen. Voortbouwend op deze fate mapping studies, hebben we de voorlopers van NM-neuronen getransfecteerd door de neurale buis bij HH12 te elektropoderen, een strategie die eerder is vastgesteld 26,28,34. Hoewel deze strategie leidt tot extra transfectie van gliacellen in de hersenstam en de AG, werd geen van de AG-neuronen getransfecteerd. Neuronale specifieke transfectie kan worden bereikt door een Atoh1 promotor-gedreven strategie te gebruiken, zoals we eerder deden21. Voor selectieve transfectie van AG-neuronen hebben we de otocyste geëlektroporeerd bij HH13. Plasmiden die in de otic cup werden geïnjecteerd, kwamen voornamelijk gelijktijdig het voorste deel van de otocyste voor haarcel- en AG-neurontransfectie binnen bij het positioneren van elektroden zoals weergegeven in figuur 2B. Om ag-neuronen bij voorkeur boven haarcellen te richten, is het mogelijk om de plasmide-oplossing rechtstreeks in het gebied naast de voorste otocyste te injecteren, waar de gedigamineerde neuroblasten35 lokaliseren. Deze methode heeft echter een lagere efficiëntie van AG-neurontransfectie in vergelijking met otocyste-injectie, omdat de plasmiden snel na injectie diffunderen. Deze methode kan ook leiden tot extra transfectie van de omliggende mesenchymale cellen van het hoofd. Een methode om haarcellen bij voorkeur te richten op AG-neuronen is om de otocyste injectie en elektroporatie uit te stellen tot HH18 (wat ~ embryonale dag 3 is), omdat de meerderheid van de neuroblasten (AG-neuronvoorlopers) in dit stadium uit de otocyste zijn gemigreerd24.
Met aanpassingen kan deze methode worden uitgebreid om het vestibulaire systeem te bestuderen. Voor vestibulaire gangliontransfectie moet de richting van de elektroden in figuur 2B worden omgekeerd om het achterste deel van de otocyste te transfecteren vanwege de duidelijke locatie van auditieve en vestibulaire ganglionvoorlopers.
In ovo is elektroporatie van kippenembryo's een gevestigde techniek voor het onderzoeken van vroege stadia van ontwikkeling (binnen de eerste week van incubatie). Voor langetermijnstudies is de overlevingskans een grote zorg. Bij het starten van de Dox-behandeling op E8 is de overlevingskans die hier wordt gevonden ~ 60% bij E9, maar daalt tot 30% bij E15 en zelfs lager bij E19. Jongen uit geëlektropoeerde eieren zijn mogelijk maar zeldzaam en kunnen in de meeste gevallen slechts enkele dagen overleven. Om de overlevingskans te verhogen, moet het volgende worden overwogen: 1) gebruik een elektroporator die vierkante golven levert in plaats van scherpe golven; 2) breng een of twee druppels steriele PBS aan op de bovenkant van het embryo als de albuminelaag niet dik genoeg is om elektrische geleidbaarheid te bevorderen (dit zal helpen elektrisch trauma te verminderen); 3) het openen van het vitellinemembraan om het embryo op de injectieplaats bloot te stellen, is niet vereist voor een succesvolle transfectie en kan het embryo schaden; 4) om het risico op besmetting te verminderen, gebruik een spuit om de parafilm te prikken en Dox toe te dienen in plaats van het raam te heropenen. Veeg na injectie de transparante film af met 75% ethanol en bedek de naaldopening met tape; 5) injecteer voor otocyste transfectie plasmiden in de otocyste dorsolateraal met een 45° schuine pipet om mogelijke punctie van de aorta dorsalis eronder te voorkomen. Als de aorta dorsalis beschadigd is, zal het bloeden de plasmiden wegspoelen en zelfs de dood veroorzaken; 6) vermijd indien mogelijk het gebruik van Indiase inkt om het embryo te visualiseren. Minder hantering en minder procedures zullen resulteren in een hogere overlevingskans.
Naast de mogelijkheid om selectief AG- of NM-neuronen te transfecteren, biedt in ovo-elektroporatie een uniek systeem dat naburige vergelijkingen voor gegevensanalyses mogelijk maakt. Na elektroporatie wordt slechts een subset van cellen in de NM of de AG getransfecteerd, waardoor de omliggende niet-getransfecteerde cellen in dezelfde celgroep als ideale controlekunnen dienen 20. Als potentiële interactie tussen naburige neuronen een probleem is, kunnen neuron-tegenhangers van de niet-getransfecteerde kant van het oor en de hersenen dienen als een extra controle. Voor histologische en beeldvormingsstudies maakt deze uitkomst data-analyses mogelijk met een hoge efficiëntie op het niveau van één cel of enkele vezel. Moleculaire analyses zijn ook haalbaar in combinatie met fluorescentiegebaseerde celsortering en grootschalige eiwit- en RNA-analyses zoals massaspectrometrie en next-generation sequencing. Het gebruik van in ovo-elektroporatie als een middel voor genbewerking kan echter een uitdaging zijn voor functionele en gedragsstudies, omdat het percentage getransfecteerde cellen binnen een celgroep mogelijk niet groot genoeg is om functionele gevolgen te hebben.
Het is essentieel om twee verificatieanalyses uit te voeren bij het aannemen van de in ovo-elektroporatiebenadering. Ten eerste moet het effect van genbewerking op het eiwit van belang worden bevestigd. In ovo-elektroporatie transfecteert alleen een subset van neuronen in de NM of AG (d.w.z. een mozaïekpatroon). Het uitvoeren van western blot op gehomogeniseerde weefsels die een mengsel van getransfecteerde en niet-getransfecteerde neuronen bevatten, is niet gevoelig genoeg om het knockdown-effect nauwkeurig weer te geven. De validatie moet dus op individueel celniveau worden uitgevoerd met behulp van methoden zoals immunocytochemie. Hiervoor hebben we eerder een antilichaam gegenereerd dat kip FMRP herkent. De specificiteit van dit antilichaam werd geverifieerd door immunocytochemie en western blot in een eerdere studie30. Het knockdown-effect van Fmr1 shRNA werd kwantitatief gevalideerd door significante verminderingen in de intensiteit van FMRP-immunoreactiviteit in getransfecteerde NM-neuronen te observeren in vergelijking met naburige niet-getransfecteerde neuronen. Ten tweede moeten controlegroepen die gecodeerde RNA's of andere controleconstructies gebruiken, worden gebruikt om de specificiteit van waargenomen cellulaire effecten van FMRP-misexpressie20,21 te bevestigen. Om dit doel te bereiken, ontwierpen we een gecodeerd shRNA, kloonden het in hetzelfde Tet-On vectorsysteem en elektropomeerden het in NM-precursoren, zoals eerder beschreven20. FMRP-expressie in de NM-neuronen getransfecteerd met het gecodeerde shRNA werd niet beïnvloed, zoals blijkt uit de onveranderde intensiteit van FMRP-immunoreactiviteit in vergelijking met naburige niet-getransfecteerde neuronen. We hebben ook een aantal effecten van Fmr1 shRNA-transfectie op axonale groei, dendritische snoei, terminale vorming en neurotransmissie geïdentificeerd (beoordeeld in Curnow en Wang, 2022)36. We concludeerden dat deze effecten specifiek werden geïnduceerd door celautonoom verlies van FMRP omdat het gecodeerde shRNA geen vergelijkbare veranderingen induceerde.
Kortom, de in ovo elektroporatietechniek maakt selectieve Fmr1-genbewerking mogelijk met temporele controle en componentspecificiteit in de auditieve oor-hersenstamcircuits en kan worden aangepast om het vestibulaire systeem te manipuleren. De ontwikkeling van deze geavanceerde technologie in het kippenembryo, een goed ingeburgerd model in de ontwikkelingsbiologie, heeft en zal blijven bijdragen aan ons begrip van de ontwikkeling van de hersenen onder normale en abnormale omstandigheden zoals FXS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door: een national natural science foundation of China grant (nr. 32000697); het wetenschaps- en technologieprogramma van Guangzhou (202102080139); de Guangdong Natural Science Foundation (2019A1515110625, 2021A1515010619); de Fondsen voor fundamenteel onderzoek voor de Centrale Universiteiten (11620324); een onderzoeksbeurs van Key Laboratory of Regenerative Medicine, Ministerie van Onderwijs, Jinan University (Nr. ZSYXM202107); de fondsen voor fundamenteel onderzoek voor de centrale universiteiten van China (21621054); en de Medical Scientific Research Foundation van de provincie Guangdong in China (20191118142729581). We bedanken het medisch experimenteel centrum van Jinan University. Wij danken Dr. Terra Bradley voor de zorgvuldige bewerking van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Egg incubation | |||
| 16 °C refrigerator | MAGAT | Used for fertilized egg storage. | |
| Egg incubator | SHANGHAI BOXUN | GZX-9240MBE | |
| Fertilized eggs | Farm of South China Agricultural University | Eggs must be used in one week for optimal viability. | |
| Plasmid preparation | |||
| Centrifuge | Sigma | 10016 | |
| Fast green | Solarbio | G1661 | Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave. |
| Plasmid Maxi-prep kit | QIAGEN | 12162 | Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Make 7.5M working solution in nuclase-free water. |
| Electroporation and Doxycycline Administration | |||
| Electroporator | BTX | ECM399 | |
| 1 mL / 5 mL Syringe | GUANGZHOU KANGFULAI | ||
| Dissecting microscope | CNOPTEC | SZM-42 | |
| Doxcycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C. |
| Glass capillary | BEIBOBOMEI | RD0910 | 0.9-1.1 mm*100 mm |
| Laboratory parafilm | PARAFILM | PM996 | transparent film |
| Pipette puller | CHENGDU INSTRUMENT FACTORY | WD-2 | Pulling condition: 500 °C for 15 s |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Rubber tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Tissue Dissection and Fixation | |||
| Forceps | RWD | F11020-11 | Tip size: 0.05*0.01 mm |
| Other surgery tools | RWD | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week. |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 01673921 | For black background plates, food-grade carbon powder is applied. |
| Sectioning | |||
| Cryostat | LEICA | CM1850 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | From bovine skin. |
| Sliding microtome | LEICA | SM2010 | |
| Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse | Abcam | ab150113 | 1:500 dilution, RRID: AB_2576208 |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit | Abcam | ab150078 | 1:500 dilution, RRID: AB_2722519 |
| DAPI | Abcam | ab285390 | 1: 1000 dilution |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotech | Sb-0100-01 | |
| FMRP antibody | Y. Wang, Florida State University | #8263 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242 |
| Islet-1 antibody | DSHB | 39.3F7 | 1:100 dilution, RRID: AB_1157901 |
| Netwell plate | Corning | 3478 | |
| Neurofilament antibody | Sigma-Aldrich | N4142 | 1:1000 dilution, RRID: AB_477272 |
| Parvalbumin antibody | Sigma-Aldrich | P3088 | 1:10000 dilution, RRID: AB_477329 |
| SNAP25 antibody | Abcam | ab66066 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052 |
| Imaging | |||
| Adobe photoshop | ADOBE | image editing software | |
| Confocal microscope | LEICA | SP8 | |
| Fluorescent stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Olympus Image-Pro Plus 7.0 | OlYMPUS | commercial image processing software package |
References
- Hagerman, R. J., et al.
- Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
- Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
- Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
- Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
- Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
- Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
- Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
- Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
- Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
- Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
- Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
- Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
- Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
- Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).
- Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
- Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
- Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).
- Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).
- Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).
- Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
- Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321 (2015).
- Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
- Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
- Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
- Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).
- Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).
- Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
- Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628 (2022).
