Summary

Dissection de la fonction autonome cellulaire de la protéine de retard mental de l’X fragile dans un circuit auditif par électroporation in ovo

Published: July 06, 2022
doi:

Summary

En utilisant l’électroporation in ovo , nous avons conçu une méthode pour transfecter sélectivement l’oreille interne auditive et le noyau cochléaire dans des embryons de poulet afin d’obtenir une élimination spécifique du groupe cellulaire de la protéine de retard mental fragile X pendant des périodes discrètes d’assemblage du circuit.

Abstract

La protéine de retard mental de l’X fragile (FMRP) est une protéine de liaison à l’ARNm qui régule la traduction locale des protéines. La perte ou le dysfonctionnement de la FMRP entraîne des activités neuronales et synaptiques aberrantes dans le syndrome de l’X fragile (FXS), qui se caractérise par une déficience intellectuelle, des anomalies sensorielles et des problèmes de communication sociale. Les études de la fonction FMRP et de la pathogenèse FXS ont principalement été menées avec Fmr1 (le gène codant pour FMRP) knockout chez des animaux transgéniques. Nous rapportons ici une méthode in vivo pour déterminer la fonction autonome cellulaire de la FMRP pendant la période d’assemblage du circuit et de formation synaptique à l’aide d’embryons de poulet. Cette méthode utilise l’électroporation spécifique au stade, au site et à la direction d’un système vectoriel inductible par médicament contenant un petit ARN en épingle à cheveux Fmr1 (shRNA) et un rapporteur EGFP. Avec cette méthode, nous avons obtenu un knockdown FMRP sélectif dans le ganglion auditif (AG) et dans l’une de ses cibles du tronc cérébral, le noyau magnocellularis (NM), fournissant ainsi une manipulation spécifique au composant dans le circuit AG-NM. De plus, le motif en mosaïque de la transfection permet des contrôles intra-animaux et des comparaisons neurones/fibres voisines pour une fiabilité et une sensibilité accrues dans l’analyse des données. Le système de vecteurs inductibles fournit un contrôle temporel de l’apparition de l’édition de gènes afin de minimiser l’accumulation d’effets sur le développement. La combinaison de ces stratégies fournit un outil innovant pour disséquer la fonction autonome cellulaire de la FMRP dans le développement synaptique et de circuits.

Introduction

Le syndrome de l’X fragile (FXS) est un trouble neurodéveloppemental caractérisé par une déficience intellectuelle, des anomalies sensorielles et des comportements autistiques. Dans la plupart des cas, le FXS est causé par une perte globale de la protéine de retard mental de l’X fragile (FMRP; codée par le gène Fmr1) à partir des premiers stades embryonnaires1. La FMRP est une protéine de liaison à l’ARN qui est normalement exprimée dans la plupart des neurones et des cellules gliales du cerveau, ainsi que dans les organes sensoriels 2,3,4. Dans le cerveau des mammifères, le FMRP est probablement associé à des centaines d’ARNm qui codent des protéines importantes pour diverses activités neuronales5. Des études sur des animaux knockout Fmr1 conventionnels ont démontré que l’expression de la FMRP est particulièrement importante pour l’assemblage et la plasticité de la neurotransmission synaptique6. Plusieurs modèles d’élimination conditionnelle et mosaïque ont en outre démontré que les actions et les signaux FMRP varient selon les régions du cerveau, les types de cellules et les sites synaptiques au cours de plusieurs événements de développement, y compris la projection axonale, la structuration dendritique et la plasticité synaptique 7,8,9,10,11,12,13,14 . La fonction aiguë de la FMRP dans la régulation de la transmission synaptique a été étudiée par administration intracellulaire d’anticorps inhibiteurs de la FMRP ou de la FMRP elle-même dans des tranches de cerveau ou des neurones en culture 15,16,17,18. Ces méthodes, cependant, n’offrent pas la possibilité de suivre les conséquences induites par la mauvaise expression du FMRP pendant le développement. Ainsi, le développement de méthodes in vivo pour étudier les fonctions autonomes cellulaires de la FMRP est très nécessaire et devrait aider à déterminer si les anomalies signalées chez les patients FXS sont des conséquences directes de la perte de FMRP dans les neurones et les circuits associés, ou des conséquences secondaires dérivées de changements à l’échelle du réseau au cours du développement19.

Le tronc cérébral auditif des embryons de poulet offre un modèle particulièrement avantageux pour des analyses fonctionnelles approfondies de la régulation FMRP dans le développement des circuits et des synapses. L’accès facile aux cerveaux de poulet embryonnaires et la technique d’électroporation in ovo bien établie pour la manipulation génétique ont grandement contribué à notre compréhension du développement du cerveau aux stades embryonnaires précoces. Dans une étude récemment publiée, cette technique a été combinée avec des outils moléculaires avancés qui permettent le contrôle temporel de la mauvaise expression du FMRP20,21. Ici, la méthodologie est avancée pour induire des manipulations sélectives des neurones présynaptiques et postsynaptiques séparément. Cette méthode a été développée dans le circuit auditif du tronc cérébral. Le signal acoustique est détecté par les cellules ciliées de l’oreille interne auditive, puis transmis au ganglion auditif (AG; également appelé ganglion en spirale chez les mammifères). Les neurones bipolaires de l’AG innervent les cellules ciliées avec leurs processus périphériques et envoient à leur tour une projection centrale (le nerf auditif) au tronc cérébral où ils se terminent par deux noyaux cochléaires primaires, le noyau magnocellulaire (NM) et le noyau angularis (NA). Les neurones de la NM sont structurellement et fonctionnellement comparables aux cellules sphériques touffues du noyau cochléaire antéroventral des mammifères. Dans le NM, les fibres nerveuses auditives (ANF) synapsent sur le somata des neurones NM via le grand bulbe terminal des terminaux Held22. Au cours du développement, les neurones NM proviennent des rhombomères 5 et 6 (r5/6) dans le cerveau postérieur23, tandis que les neurones AG sont dérivés de neuroblastes résidant dans l’otocyste24. Ici, nous décrivons la procédure pour renverser sélectivement l’expression FMRP dans les neurones AG présynaptiques et dans les neurones NM postsynaptiques séparément.

Protocol

Les œufs et les embryons de poulet ont été manipulés avec soin et respect conformément aux protocoles sur les animaux approuvés par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Jinan. 1. Préparation d’oeufs et de plasmides Préparation des œufsProcurez-vous des œufs de poule frais fécondés (Gallus gallus) de l’Université agricole de Chine méridionale et conservez-les à 16 °C avant l’incubation. Pour une…

Representative Results

En effectuant une électroporation in ovo à différents sites et à différents stades de développement, nous avons obtenu un knockdown FMRP sélectif soit dans la périphérie auditive, soit dans le tronc cérébral auditif. FMRP knockdown en NMUn petit ARN en épingle à cheveux (shRNA) contre le poulet Fmr1 a été conçu et cloné dans le système vectoriel Tet-On comme décrit précédemment20. La configuration de l’élect…

Discussion

Pour déterminer la fonction autonome cellulaire de la FMRP, il est nécessaire de manipuler son expression dans des groupes cellulaires individuels ou des types de cellules. Étant donné que l’une des principales fonctions de la FMRP est de réguler la formation synaptique et la plasticité, la manipulation sélective de chaque composant synaptique d’un certain circuit est une condition préalable à une compréhension complète du mécanisme FMRP dans la communication synaptique. E…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été financée par: une subvention de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 32000697); le Programme de science et de technologie de Guangzhou (202102080139); la Fondation des sciences naturelles du Guangdong (2019A1515110625, 2021A1515010619); les Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (11620324); a Research Grant of Key Laboratory of Regenerative Medicine, Ministère de l’éducation, Université de Jinan (No. ZSYXM202107); les Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales de Chine (21621054); et la Fondation pour la recherche scientifique médicale de la province chinoise du Guangdong (20191118142729581). Nous remercions le centre expérimental médical de l’Université de Jinan. Nous remercions le Dr Terra Bradley pour la révision minutieuse du manuscrit.

Materials

Egg incubation
16 °C refrigerator MAGAT Used for fertilized egg storage.
Egg incubator SHANGHAI BOXUN GZX-9240MBE
Fertilized eggs Farm of South China Agricultural University Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge Sigma 10016
Fast green Solarbio G1661 Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit QIAGEN 12162 Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889 Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator BTX ECM399
1 mL / 5 mL Syringe GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope CNOPTEC SZM-42
Doxcycline Sigma-Aldrich D9891 Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary BEIBOBOMEI RD0910 0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm PARAFILM PM996 transparent film
Pipette puller CHENGDU INSTRUMENT FACTORY WD-2 Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes Home made 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Platinum elctrodes Home made 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube Sigma-Aldrich A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps RWD F11020-11 Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools RWD
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW 01673921 For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat LEICA CM1850
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 From bovine skin.
Sliding microtome LEICA SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse Abcam ab150113 1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit Abcam ab150078 1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI Abcam ab285390 1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium Southern Biotech Sb-0100-01
FMRP antibody Y. Wang, Florida State University #8263 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody DSHB 39.3F7 1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate Corning 3478
Neurofilament antibody Sigma-Aldrich N4142 1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody Sigma-Aldrich P3088 1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody Abcam ab66066 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop ADOBE image editing software
Confocal microscope LEICA SP8
Fluorescent stereomicroscope OLYMPUS MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0 OlYMPUS commercial image processing software package

References

  1. Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).
  2. Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
  3. Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
  4. Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
  5. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  6. Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
  7. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  8. Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
  9. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  10. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  11. Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
  12. Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
  13. Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
  14. Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).
  15. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
  16. Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
  17. Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
  18. Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
  19. Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).
  20. Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
  21. Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
  22. Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
  23. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).
  24. Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
  25. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  26. Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).
  27. Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).
  28. Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  29. Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321 (2015).
  30. Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
  31. Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
  32. Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
  33. Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).
  34. Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).
  35. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
  36. Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628 (2022).

Play Video

Cite This Article
Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang, X. Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation. J. Vis. Exp. (185), e64187, doi:10.3791/64187 (2022).

View Video