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Neuroscience

Dissection de la fonction autonome cellulaire de la protéine de retard mental de l’X fragile dans un circuit auditif par électroporation in ovo

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/64187
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Division of Histology & Embryology, Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education, College of Medicine, Jinan University, 2Department of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Jinan University, 3Program in Neuroscience, Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University
* These authors contributed equally

Summary

En utilisant l’électroporation in ovo , nous avons conçu une méthode pour transfecter sélectivement l’oreille interne auditive et le noyau cochléaire dans des embryons de poulet afin d’obtenir une élimination spécifique du groupe cellulaire de la protéine de retard mental fragile X pendant des périodes discrètes d’assemblage du circuit.

Abstract

La protéine de retard mental de l’X fragile (FMRP) est une protéine de liaison à l’ARNm qui régule la traduction locale des protéines. La perte ou le dysfonctionnement de la FMRP entraîne des activités neuronales et synaptiques aberrantes dans le syndrome de l’X fragile (FXS), qui se caractérise par une déficience intellectuelle, des anomalies sensorielles et des problèmes de communication sociale. Les études de la fonction FMRP et de la pathogenèse FXS ont principalement été menées avec Fmr1 (le gène codant pour FMRP) knockout chez des animaux transgéniques. Nous rapportons ici une méthode in vivo pour déterminer la fonction autonome cellulaire de la FMRP pendant la période d’assemblage du circuit et de formation synaptique à l’aide d’embryons de poulet. Cette méthode utilise l’électroporation spécifique au stade, au site et à la direction d’un système vectoriel inductible par médicament contenant un petit ARN en épingle à cheveux Fmr1 (shRNA) et un rapporteur EGFP. Avec cette méthode, nous avons obtenu un knockdown FMRP sélectif dans le ganglion auditif (AG) et dans l’une de ses cibles du tronc cérébral, le noyau magnocellularis (NM), fournissant ainsi une manipulation spécifique au composant dans le circuit AG-NM. De plus, le motif en mosaïque de la transfection permet des contrôles intra-animaux et des comparaisons neurones/fibres voisines pour une fiabilité et une sensibilité accrues dans l’analyse des données. Le système de vecteurs inductibles fournit un contrôle temporel de l’apparition de l’édition de gènes afin de minimiser l’accumulation d’effets sur le développement. La combinaison de ces stratégies fournit un outil innovant pour disséquer la fonction autonome cellulaire de la FMRP dans le développement synaptique et de circuits.

Introduction

Le syndrome de l’X fragile (FXS) est un trouble neurodéveloppemental caractérisé par une déficience intellectuelle, des anomalies sensorielles et des comportements autistiques. Dans la plupart des cas, le FXS est causé par une perte globale de la protéine de retard mental de l’X fragile (FMRP; codée par le gène Fmr1) à partir des premiers stades embryonnaires1. La FMRP est une protéine de liaison à l’ARN qui est normalement exprimée dans la plupart des neurones et des cellules gliales du cerveau, ainsi que dans les organes sensoriels 2,3,4. Dans le cerveau des mammifères, le FMRP est probablement associé à des centaines d’ARNm qui codent des protéines importantes pour diverses activités neuronales5. Des études sur des animaux knockout Fmr1 conventionnels ont démontré que l’expression de la FMRP est particulièrement importante pour l’assemblage et la plasticité de la neurotransmission synaptique6. Plusieurs modèles d’élimination conditionnelle et mosaïque ont en outre démontré que les actions et les signaux FMRP varient selon les régions du cerveau, les types de cellules et les sites synaptiques au cours de plusieurs événements de développement, y compris la projection axonale, la structuration dendritique et la plasticité synaptique 7,8,9,10,11,12,13,14 . La fonction aiguë de la FMRP dans la régulation de la transmission synaptique a été étudiée par administration intracellulaire d’anticorps inhibiteurs de la FMRP ou de la FMRP elle-même dans des tranches de cerveau ou des neurones en culture 15,16,17,18. Ces méthodes, cependant, n’offrent pas la possibilité de suivre les conséquences induites par la mauvaise expression du FMRP pendant le développement. Ainsi, le développement de méthodes in vivo pour étudier les fonctions autonomes cellulaires de la FMRP est très nécessaire et devrait aider à déterminer si les anomalies signalées chez les patients FXS sont des conséquences directes de la perte de FMRP dans les neurones et les circuits associés, ou des conséquences secondaires dérivées de changements à l’échelle du réseau au cours du développement19.

Le tronc cérébral auditif des embryons de poulet offre un modèle particulièrement avantageux pour des analyses fonctionnelles approfondies de la régulation FMRP dans le développement des circuits et des synapses. L’accès facile aux cerveaux de poulet embryonnaires et la technique d’électroporation in ovo bien établie pour la manipulation génétique ont grandement contribué à notre compréhension du développement du cerveau aux stades embryonnaires précoces. Dans une étude récemment publiée, cette technique a été combinée avec des outils moléculaires avancés qui permettent le contrôle temporel de la mauvaise expression du FMRP20,21. Ici, la méthodologie est avancée pour induire des manipulations sélectives des neurones présynaptiques et postsynaptiques séparément. Cette méthode a été développée dans le circuit auditif du tronc cérébral. Le signal acoustique est détecté par les cellules ciliées de l’oreille interne auditive, puis transmis au ganglion auditif (AG; également appelé ganglion en spirale chez les mammifères). Les neurones bipolaires de l’AG innervent les cellules ciliées avec leurs processus périphériques et envoient à leur tour une projection centrale (le nerf auditif) au tronc cérébral où ils se terminent par deux noyaux cochléaires primaires, le noyau magnocellulaire (NM) et le noyau angularis (NA). Les neurones de la NM sont structurellement et fonctionnellement comparables aux cellules sphériques touffues du noyau cochléaire antéroventral des mammifères. Dans le NM, les fibres nerveuses auditives (ANF) synapsent sur le somata des neurones NM via le grand bulbe terminal des terminaux Held22. Au cours du développement, les neurones NM proviennent des rhombomères 5 et 6 (r5/6) dans le cerveau postérieur23, tandis que les neurones AG sont dérivés de neuroblastes résidant dans l’otocyste24. Ici, nous décrivons la procédure pour renverser sélectivement l’expression FMRP dans les neurones AG présynaptiques et dans les neurones NM postsynaptiques séparément.

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Protocol

Les œufs et les embryons de poulet ont été manipulés avec soin et respect conformément aux protocoles sur les animaux approuvés par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Jinan.

1. Préparation d’oeufs et de plasmides

  1. Préparation des œufs
    1. Procurez-vous des œufs de poule frais fécondés (Gallus gallus) de l’Université agricole de Chine méridionale et conservez-les à 16 °C avant l’incubation. Pour une viabilité optimale, préparez tous les œufs pour l’incubation dans la semaine suivant l’arrivée.
    2. Placer les œufs horizontalement et incuber à 38 °C pendant 46 à 48 h jusqu’au stade 1225 de Hamburger et Hamilton (HH) pour la transfection du tube neural, ou pendant 54 à 56 h jusqu’à HH13 pour la transfection des otocystes. Parce que le pôle animal de l’œuf est plus léger que le pôle végétal, le placement horizontal positionne l’embryon sur le dessus de l’œuf pour faciliter la manipulation. Soyez prudent pour garder l’œuf horizontal dans cette étape et toutes les suivantes.
    3. L’emplacement de l’embryon apparaît comme une zone sombre sur la coquille de l’œuf lors de la projection de lumière du fond de l’œuf à l’aide d’une lampe de poche. Aux stades HH souhaités, utilisez cette méthode de lampe de poche pour marquer l’emplacement de l’embryon sur la coquille d’œuf avec un crayon.
    4. Essuyez les œufs avec de la gaze contenant 75% d’éthanol. Percez un trou dans l’extrémité pointue des œufs à l’aide de la pointe des ciseaux et retirez 2 ml d’albumine avec une seringue à aiguille de 18 g. Assurez-vous que le trou est juste assez grand pour permettre l’insertion de l’aiguille. Essuyez toute fuite d’albumine avec de la gaze et scellez le trou avec du ruban adhésif transparent.
    5. Pour minimiser les fissures et empêcher la chute de débris de coquille pendant la fenêtrage, couvrez le dessus des œufs avec du ruban adhésif transparent, en se concentrant sur la zone sombre marquée au crayon.
  2. Extraction d’ADN plasmidique
    1. Clone poulet Fmr1 shRNA à l’aide d’un système Tet-on basé sur un transposon, comme décrit précédemment20. Ce système contient trois plasmides: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 et pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA, fournissant un système vectoriel inductible par un médicament par lequel l’expression de Fmr1 shRNA et EGFP est réduite au silence après la transfection et peut être activée par induction de doxycycline (Dox).
      Remarque : Ces plasmides ne sont pas actuellement disponibles dans un référentiel. Les auteurs acceptent de fournir les plasmides sur demande raisonnable.
    2. Extraire les ADN plasmidiques à l’aide d’une trousse de préparation sans endotoxines conformément aux instructions du fabricant et précipiter en ajoutant 1/15 volume d’acétate de sodium 7,5 M et 1 volume d’isopropanol à 100 %.
    3. Précipiter les plasmides à -20 °C pendant une nuit et centrifuger à 13 000 x g pendant 10 min. Dissoudre la pastille avec le tampon Tris-EDTA fourni dans le kit jusqu’à une concentration finale de 4-5 μg/μL. Les plasmides peuvent être conservés à -20 °C pendant 12 mois sans réduction de l’efficacité de la transfection.
    4. Le jour de l’électroporation, bien mélanger 2 μL de chaque plasmide dans un tube centrifuge stérile à l’aide d’un embout de pipette. Le volume résultant de 6 μL du mélange plasmidique est suffisant pour électroporer trois douzaines d’œufs. Pour aider à visualiser le plasmide pendant l’électroporation, ajoutez 1 μL de vert rapide à 0,1% (préparé dans du ddH2O stérile) pour chaque 6 μL de mélange d’ADN26, ce qui rend le mélange plasmidique bleu.

2. Électroporation in ovo

  1. Fenêtre des œufs et identification des embryons
    1. Le jour de l’électroporation, retirez les œufs de l’incubateur, une douzaine d’œufs à la fois. Garder les œufs hors de leur incubateur pendant plus de 1 h introduit des variations de développement et réduit la viabilité.
    2. Essuyez tous les outils chirurgicaux avec de la gaze contenant 75% d’éthanol.
    3. Placez chaque œuf dans un porte-mousse sur mesure. Essuyez la zone recouverte de ruban adhésif avec de l’éthanol à 75 % et coupez une fenêtre (1-2 cm2) autour de la circonférence de la marque du crayon à l’aide d’une petite paire de ciseaux (Figure 1A). Lors de la coupe, tenez les ciseaux à plat pour éviter d’endommager l’embryon en dessous.
    4. Placez l’œuf fenêtré sous un stéréomicroscope avec un oculaire 10x et un zoom 2x et identifiez l’embryon. Ajustez l’angle et la luminosité de la source lumineuse pour une meilleure visualisation.
      REMARQUE: Il faut de la pratique et de l’expérience pour visualiser l’embryon et identifier le tube neural à ce stade.
      1. Pour les débutants, utilisez l’injection d’encre facultative suivante pour faciliter l’identification de l’embryon. Préparer à l’avance une solution d’encre de Chine à 10 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 0,01 M et un autoclave. Remplissez une seringue de 1 mL avec la solution d’encre, puis installez une aiguille 27G. Pliez l’aiguille à un angle de 45° avec une pince.
      2. Sous le microscope, piquez soigneusement le bord de la zone opaca et insérez l’aiguille sous l’embryon. Injectez ~50 μL d’encre, qui diffusera sous la zone pellucide pour la visualisation de l’embryon. L’encre formera un fond sombre pour une visualisation claire de l’embryon.
        REMARQUE: Expulser l’air de la seringue avant l’insertion et l’injection. Lorsque vous êtes habile à visualiser, évitez l’étape d’injection d’encre car elle réduit le taux de survie.
  2. Injection de tube neural et électroporation
    REMARQUE: Cette procédure est effectuée à HH12 pour transfecter les neurones NM dans le tronc cérébral.
    1. Tirer les capillaires en verre (~1 mm de diamètre et 100 mm de long) dans des pipettes à l’aide d’un extracteur de pipettes. Sous un microscope à dissection, ouvrez soigneusement la pointe de l’aiguille capillaire à 10-20 μm de diamètre avec une pince. Conservez les pipettes (généralement 5 à 10 à la fois) dans une boîte de rangement jusqu’à utilisation.
    2. Remplir une pipette capillaire avec 0,5-1 μL du mélange plasmidique en appliquant une pression négative à travers un tube en caoutchouc à l’extrémité de la pipette. Cela peut être réalisé à l’aide d’une seringue ou d’une pompe à air.
    3. Placez l’œuf au microscope de manière à ce que l’embryon soit orienté verticalement avec la queue près de vous (ou horizontalement pour injecter des pipettes capillaires à l’aide d’un manipulateur à trois axes). Tenez la pipette capillaire d’une main ou avec le manipulateur à trois axes et enfoncez l’extrémité de la pipette vers le r5/6 dans le sens de la queue à la tête.
      REMARQUE: La zone la plus antérieure du cerveau postérieur est r1 et chaque renflement ultérieur le long du tube neural est un rhombomère individuel. R5/6 est au même niveau antéropostérieur que l’otocyste, qui est une structure en forme de coupe facilement reconnaissable (Figure 1B-C).
    4. Poussez doucement l’embout à travers la membrane vitelline et dans le tube neural dorsal, puis retirez un peu la pipette pour que l’embout soit dans la lumière du tube neural. Injecter le mélange plasmidique en appliquant une pression d’air jusqu’à ce que le plasmide teinté diffuse complètement dans r5/6 et s’étende en r3 et r4.
      REMARQUE: Il n’est pas nécessaire de faire une fente sur la membrane vitelline pour injection.
    5. Vérifiez si l’injection est réussie, ce qui est obtenu lorsque la solution de plasmide bleu diffuse rapidement dans le tube neural sans fuite (Figure 1B-C). En cas de fuite, le bleu s’estompe rapidement.
    6. Immédiatement après l’injection, placez une électrode bipolaire en platine de chaque côté du tube neural (Figure 1D). Délivrez deux impulsions de 12 V et une durée de 50 ms avec un électroporateur. Observez les bulles d’air aux extrémités de l’électrode bipolaire, avec plus du côté négatif.
    7. Vérifiez que l’électroporation est réussie, ce qui est obtenu lorsque le mélange plasmidique teinté pénètre dans le tissu du tube neural près du côté positif de l’électrode. Après l’électroporation, retirez délicatement l’électrode bipolaire.
    8. Couvrez la fenêtre sur la coquille de l’œuf avec un morceau de film transparent prédécoupé en carrés de 2 pouces et pulvérisé avec de l’éthanol à 75%. Replacez l’œuf dans son incubateur.
    9. Nettoyez l’électrode bipolaire en délivrant 10 à 20 impulsions de 12 V et une durée de 50 ms dans une solution saline avant de passer à l’œuf suivant.
  3. Injection et électroporation d’otocystes
    REMARQUE: Cette procédure est effectuée à HH13 pour transfecter les cellules ciliées et les neurones AG dans l’oreille interne.
    1. À HH13 (qui est ~ jour embryonnaire 2,5), l’embryon a tourné de sorte que le côté droit de la tête est tourné vers le haut. Sous le microscope, placez l’œuf de manière à ce que l’embryon soit vertical, avec la queue près de vous. Tenez la pipette capillaire et piquez doucement l’otocyste droit dans une direction dorsolatérale (Figure 2A).
      NOTE: A ce stade, l’otocyste apparaît comme une petite structure circulaire sur le dessus du corps au même niveau antéropostérieur que r5/6.
    2. Injecter le mélange plasmidique avec la pression de l’air jusqu’à ce que l’otocyste soit rempli de solution bleue27. Vérifiez une injection réussie, qui est obtenue lorsque le mélange plasmidique bleu est confiné dans l’otocyste et ne fuit pas.
    3. Immédiatement après l’injection, placez l’électrode bipolaire sur l’otocyste comme illustré à la figure 2B. Positionnez respectivement les côtés positif et négatif antérieur et postérieur à l’otocyste. Délivrez deux impulsions de 12 V et une durée de 50 ms avec l’électroporateur.
    4. Vérifiez que l’électroporation est réussie, ce qui est obtenu lorsque le mélange plasmidique bleu pénètre dans le tissu de l’otocyste près du côté positif de l’électrode. Après l’électroporation, retirez délicatement l’électrode bipolaire. Couvrez la fenêtre de la coquille d’œuf avec un film transparent et remettez l’œuf dans l’incubateur.

3. Administration de Dox pour initier et maintenir la transcription plasmidique

  1. Préparation de la solution Dox
    1. Mesurer 100 mg de poudre de Dox sous une hotte chimique et la dissoudre dans 100 mL de PBS stérile pour obtenir 1 mg/mL de solution de travail. Filtrer la solution avec un filtre de 0,22 μm et conserver 1 mL d’aliquotes à -20 °C. Protéger de la lumière20,28.
  2. Administration de Dox
    1. Pour l’édition génique à pleine puissance, à 24 h avant l’âge désiré, décongelez une partie aliquote Dox sur la glace. Déposer 50 μL de Dox directement sur la membrane chorio-allantoïdienne de l’œuf à l’aide d’une seringue pénétrant dans le film transparent. Scellez le trou de l’aiguille avec un film transparent ou du ruban adhésif après l’injection.
    2. Pour maintenir l’effet knockdown, administrer Dox tous les deux jours jusqu’à ce que les tissus prélèvent au stade de développement souhaité.

4. Dissection et sectionnement tissulaire

  1. Tronc cérébral
    1. Pour les embryons aux stades embryonnaires 3 (E3) et E6, ouvrez la coquille d’œuf et coupez la membrane associée avec des ciseaux. Retirer l’embryon à la cuillère et l’immerger dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans un tampon phosphate de 0,1 M.
    2. Pour les embryons E9, ouvrez la coquille d’œuf, décapitez l’embryon avec des ciseaux et transférez la tête sur une plaque à fond de silicium remplie de PBS. Épinglez la tête à travers les orbites et coupez le haut du crâne. Placez soigneusement les pinces sous le cerveau des deux côtés et élevez tout le cerveau du crâne avec les épaules des forceps. Immergez le cerveau dans 4% PFA.
    3. Pour les embryons E15 et E19, ouvrez la coquille d’œuf, décapitez l’embryon avec des ciseaux et placez la tête sur une plaque à fond de silicium remplie de PBS. Coupez la peau sur le dessus de la tête pour exposer le crâne.
    4. Inciser à travers le crâne verticalement avec un rasoir pour séparer le cerveau antérieur et le cerveau caudal. Immergez le bloc caudale dans PBS, retirez le haut du crâne, puis retirez le cerveau du crâne.
    5. Épinglez le cerveau à travers le lobe optique et séparez le cervelet et le tronc cérébral. Veillez à ne pas endommager le tronc cérébral auditif, situé juste en dessous du cervelet. Retirez autant de dure-mère que possible du tronc cérébral, puis immergez-le dans du PFA à 4%.
    6. Conserver les embryons et les tissus cérébraux dans du PFA à 4 % à 4 °C pendant la nuit, à l’exception des troncs cérébraux E19, qui doivent être conservés dans le même état pendant 24 heures.
    7. Après la fixation, déshydrater le tissu dans du PBS contenant 30% de saccharose jusqu’à ce qu’il se dépose, ce qui prend généralement 1 à 3 jours, selon l’âge.
    8. Couper le tronc cérébral (E15 et E19) à 30 μm au niveau du plan coronal à l’aide d’un microtome coulissant. Prélever les sections dans du PBS et conserver à 4 °C avant immunomarquage.
    9. Pour les embryons E3 et E6 et les troncs cérébraux E9, coupe transversale à 50 μm. Collecter les sections dans PBS et les conserver à 4 °C. Monter les sections sur des lames de microscope recouvertes de gélatine avant l’immunomarquage. La collecte de sections plus épaisses pour ces âges facilite la manipulation des tissus.
  2. Conduit auditif
    1. Après avoir retiré les troncs cérébraux des embryons E9, E15 et E19, le conduit auditif, qui est intégré dans l’os temporal, est facilement identifiable sous le crâne, et l’os temporal est facilement séparable du crâne environnant. Pour les embryons E9, fixer l’os temporal entier dans 4% PFA. Pour les embryons plus âgés, enlever la structure osseuse de l’os temporal pour isoler le conduit auditif et fixer le conduit auditif dans 4% PFA.
    2. Conserver tous les os temporaux et les conduits auditifs dans du PFA à 4 % à 4 °C pendant la nuit avant l’encastrement des tissus.
    3. Effectuer l’incorporation des tissus comme décrit. Préparer la solution d’enrobage comme suit: Faire tremper 10% de gélatine (de peau de bovin) dans de l’eau froide jusqu’à ce que les granules de gélatine gonflent et se déposent (environ 30 min). Chauffer le mélange à ~50 °C pour dissoudre la gélatine et ajouter 20% de saccharose dans la solution de gélatine et remuer pour dissoudre. Conservez la solution gélatine-saccharose à 4 °C jusqu’à un mois.
    4. Pour utilisation, chauffer la solution gélatine-saccharose à 37 °C. Faire tremper les os temporaux/conduits auditifs dans la solution chaude gélatine-saccharose sur une plaque de 96 puits à 37 °C jusqu’à ce qu’ils se déposent, généralement 30 à 60 min.
    5. Tapisser le fond des puits d’une plaque de 12 puits avec une bande de film transparent. Ajouter une couche de solution chaude gélatine-saccharose et attendre qu’elle se solidifie. Transférez un os temporel / conduit auditif à chaque puits.
    6. Implantez le tissu avec une deuxième couche de solution chaude de gélatine-saccharose. Ajustez la position du tissu de sorte qu’il soit au centre du gel et que le conduit auditif soit orienté horizontalement. Déplacez délicatement la plaque dans un réfrigérateur à 4 °C et attendez que le gel soit ferme.
    7. Tirez la bande de film transparent pour déplacer le bloc de tissu gel hors du puits. Coupez le gel supplémentaire en un bloc carré et coupez un coin du bloc pour identifier l’orientation. Envelopper le bloc de gélatine avec un morceau de papier d’aluminium, congeler sur de la glace sèche, puis conserver à -80 °C jusqu’à sectionnement.
    8. Couper le bloc à 20 μm le long de la longitude du conduit auditif à l’aide d’un cryostat. Montez les sections directement sur des lames de microscope recouvertes de gélatine. Conserver les lames à -80 °C avant l’immunomarquage.
    9. Avant l’immunomarquage, immerger les lames dans du PBS préchauffé (45 °C) pendant 5 minutes pour dissoudre la gélatine, puis laver les lames 3x avec du PBS à température ambiante pour éliminer la gélatine résiduelle.

5. Immunomarquage et imagerie au microscope

REMARQUE: Deux types d’immunomarquage sont effectués selon que les sections sont montées sur des glissières ou flottantes en PBS.

  1. Immunocoloration sur lames
    1. Lavez les lames 3x pendant 10 minutes chacune avec PBS. Encerclez la région contenant les sections avec un stylo à huile pour éviter les fuites de liquide pendant la coloration. Couvrir les sections avec une solution bloquante contenant 5% de sérum de chèvre normal dans du PBS et incuber pendant 30 min à température ambiante.
    2. Diluer les anticorps primaires (pour la concentration finale utilisée, voir le tableau des matières) dans du PBS contenant 0,3 % de TritonX-100 et 5 % de sérum de chèvre normal. Retirez la solution bloquante, puis couvrez les sections avec la solution d’anticorps primaires. Incuber les lames à 4 °C pendant une nuit dans une boîte contenant une couche d’eau distillée au fond.
    3. Rincez les lames 3x pendant 10 min avec du PBS. Appliquer des anticorps secondaires fluorescents dilués à 1:500 dans du PBS contenant 0,3% de TritonX-100 sur des lames. Incuber les lames à température ambiante pendant 4 h, à l’abri de la lumière.
    4. Lavez les lames 3x avec PBS. Déposez doucement deux gouttes de support de montage sur les glissières et couvrez les sections avec des lamelles de couverture. Veillez à ne pas générer de bulles d’air entre la lamelle de couverture et la glissière.
  2. Immunocoloration pour embryons montés entiers et sections flottantes
    1. Laver les embryons/sections avec PBS 3x pendant 10 min chacun dans une plaque de puits. Diluer les anticorps primaires dans du PBS contenant 0,3 % de TritonX-100 et 5 % de sérum de chèvre normal dans des tubes centrifuges. Transférer chaque embryon/section dans un tube à l’aide d’un crochet en verre et incuber sur un agitateur à 60 tr/min pendant une nuit à 4 °C.
    2. Laver les embryons/sections 3x avec du PBS pendant 10 min chacun dans une plaque de puits. Transvaser chaque embryon/section dans un tube centrifuge foncé rempli d’une solution d’anticorps secondaires fluorescents et incuber à température ambiante pendant 4 h sur l’agitateur.
    3. Laver les embryons/sections 3x avec du PBS dans une plaque de puits. Utilisez un pinceau pour monter les sections sur des lames de microscope recouvertes de gélatine dans une boîte de 15 cm contenant du PBS. Une fois les lames légèrement séchées (~5 min), appliquez deux gouttes de support de montage et placez une lamelle de couverture. Veillez à ne pas générer de bulles d’air entre la lamelle de couverture et la glissière. Conservez tous les tissus de montage dans PBS pour l’imagerie.
  3. Imagerie
    1. Imaginez l’ensemble des tissus de montage dans PBS dans un plat avec un fond en silicium contenant de la poudre de carbone, qui fournit un fond noir. Capturez et traitez des images à l’aide d’un progiciel commercial de traitement d’images Olympus, comme décrit précédemment29.
    2. Imagez les sections sur les lames avec un microscope confocal comme décrit précédemment20. Imagez les sections à un seul plan focal avec des objectifs 10x, 20x et 63x. Capturez toutes les images du même animal en utilisant les mêmes paramètres. Prenez soin d’ajuster le niveau laser et les paramètres d’acquisition d’images pour éviter la saturation du signal.
    3. Effectuer le traitement d’image à l’aide du logiciel Fidji. Pour l’illustration, réglez la luminosité, le contraste et le gamma de l’image à l’aide d’un logiciel de retouche d’image professionnel.

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Representative Results

En effectuant une électroporation in ovo à différents sites et à différents stades de développement, nous avons obtenu un knockdown FMRP sélectif soit dans la périphérie auditive, soit dans le tronc cérébral auditif.

FMRP knockdown en NM
Un petit ARN en épingle à cheveux (shRNA) contre le poulet Fmr1 a été conçu et cloné dans le système vectoriel Tet-On comme décrit précédemment20. La configuration de l’électroporation in ovo est illustrée à la figure 1A. L’ADN plasmidique teinté de vert rapide a été injecté dans le tube neural au niveau r5/r6 à HH12 (Figure 1B-C). Une électrode bipolaire en platine a été placée de chaque côté du tube neural au niveau r5/6 (Figure 1D). Deux impulsions à 12 V ont été délivrées pour conduire le plasmide dans le tissu près du côté positif de l’électrode. Dox a été appliqué sur la membrane chorio-allantoïdienne pour déclencher l’expression de Fmr1 shRNA et EGFP. Après 24 h de traitement Dox, l’EGFP était évident sous un stéréomicroscope fluorescent. La figure 1E-F montre un exemple à E3 lorsque Dox a été appliqué à E2. Des coupes transversales ont confirmé l’emplacement des cellules exprimant l’EGFP (EGFP+) d’un côté du cerveau postérieur (Figure 1G-H). De plus, un groupe de cellules transfectées a été trouvé avant l’otocyste; il s’agissait de cellules de la crête neurale crânienne migrant ventrolatéralement à partir du tube neural (Figure 1F). Les embryons électroporés peuvent également être incubés plus longtemps pour étudier la formation du circuit à des stades ultérieurs. À E15, l’EGFP a été observé dans le tronc cérébral, mais seulement du côté transfecté (Figure 1I-J). Des coupes transversales au niveau du tronc cérébral dorsal ont mis en évidence une poignée de neurones EGFP+ dispersés dans le NM du côté de l’électroporation (Figure 1L). Des fibres EGFP+ ont été observées en saillie vers la cible des neurones NM : le noyau laminaire dorsal (NL) du côté ipsilatéral (Figure 1L) et le NL ventral du côté controlatéral (Figure 1K). L’effet knockdown de Fmr1 shRNA a été validé par des réductions marquées de l’immunoréactivité FMRP dans les neurones NM transfectés par rapport aux neurones voisins non transfectés (Figure 1M-N). Dans le ganglion auditif (AG), les neurones étaient non transfectés (EGFP-), bien que certaines cellules gliales entourant les neurones AG étaient EGFP+ (Figure 1O-P), vraisemblablement dérivés des cellules de la crête neurale crânienne EGFP+ (voir Figure 1F). Ainsi, cette stratégie d’électroporation fournit une transfection sélective des neurones postsynaptiques dans le circuit AG-NM.

FMRP knockdown dans le conduit auditif
Le mélange plasmidique a été injecté dans l’otocyste à HH13 (Figure 2A), suivi d’une électroporation en plaçant le côté positif de l’électrode avant l’otocyste et le côté négatif postérieur à l’otocyste (Figure 2B). Les coupes de tête entière à E6 ont démontré une forte fluorescence EGFP dans l’otocyste droit, mais pas dans le tronc cérébral (Figure 2C). Les conduits auditifs isolés à E9 présentaient une fluorescence EGFP étendue sur toute la longueur du conduit (figure 2D-E). Sur les coupes transversales, des cellules EGFP+ ont été confirmées dans la papille basilaire (BP) le long de la paroi du canal cochléaire et dans l’AG (Figure 2F-G). L’effet knockdown de Fmr1 shRNA a été validé par des réductions marquées de l’immunoréactivité FMRP dans les cellules ciliées transfectées (*, Figure 2H-J) par rapport aux cellules ciliées non transfectées voisines (•, Figure 2H-J). Pour les cellules de soutien, l’immunoréactivité FMRP était faible dans les cellules transfectées et non transfectées (Figure 2H-J). Comme pour les cellules ciliées, l’immunoréactivité FMRP a été largement diminuée dans les neurones AG transfectés par rapport aux neurones voisins non transfectés (Figure 2K-M).

Nous avons ensuite suivi la projection centrale des neurones AG transfectés vers le tronc cérébral via le nerf auditif. Le schéma en mosaïque de la transfection de shRNA Fmr1 dans l’AG a été confirmé à E6 en utilisant l’immunoréactivité de l’îlot-1 (Figure 3A), un marqueur du développement de l’oreille internedu poulet 31. Lorsqu’une partie de l’AG a été extraite avec le tronc cérébral pendant la dissection, des neurones EGFP+ AG isolés et leurs fibres dans le tronc cérébral ont été visualisés in situ dans les mêmes préparations (Figure 3B-C). Sur les coupes transversales au niveau du NM, les ANF EGFP+ avaient atteint le NM à E9 (figure 3D) et ont été observés en continu à E15 et E19 (figure 3E-F). Les images à fort grossissement ont révélé des terminaisons coniques de croissance des ANF à E9 (Figure 3H), qui formaient le grand bulbe d’extrémité en forme de paume à E15 avant de devenir le bulbe terminal caractérisé de la morphologie Held avec des branches complexes à E19 (Figure 3I-J). Au-delà du NM, de vastes branches d’ANF ont également été observées dans le NA, un autre noyau cochléaire primaire (Figure 3E). On s’y attendait, car les mêmes ANF bifurquent pour innerver à la fois le NM et le NA chez les poulets32. Nous avons également vu des fibres EGFP+ pénétrer dans les groupes de cellules vestibulaires adjacents, y compris le noyau vestibulaire descendant (VeD), comme le montre la figure 3E. Bien que nous ayons optimisé l’emplacement de l’électrode d’électroporation pour cibler préférentiellement la partie antérieure de l’otocyste où l’AG est formée, certains neurones ganglionnaires vestibulaires ont également été transfectés. L’immunomarquage de la parvalbumine, un marqueur des ANF chez les poulets, peut être utilisé pour différencier les fibres auditives des fibres vestibulaires du tronc cérébral (Figure 3F-G).

En résumé, cette stratégie d’électroporation fournit une transfection sélective des neurones présynaptiques dans le circuit AG-NM et peut être utilisée pour suivre le développement du bulbe terminal de Held à des niveaux terminaux individuels à la suite de manipulations génétiques.

Figure 1
Graphique 1. FMRP knockdown dans le poulet NM. (A) Image de la configuration d’électroporation. (B) Dessin schématique montrant le site de micro-injection au niveau rhombomere r5/6 d’un embryon de poulet HH12. Abréviations : NT = tube neural; SO = somite. (C) Pour une meilleure visibilité, de l’encre de Chine (noire) a été injectée sous l’embryon avec une seringue. Un mélange plasmidique teinté de vert rapide a ensuite été injecté dans la lumière du tube neural. (D) Positionnement de l’électrode bipolaire pour l’électroporation. + et - indiquent respectivement les côtés positif et négatif. Notez que le mélange plasmidique bleu s’est diffusé dans le tube neural du côté positif après électroporation. (E-F) Image en champ clair (BF) (E) fusionnée avec le canal EGFP (F) d’un embryon de poulet électroporé au jour embryonnaire 3 (E3), montrant la transfection dans le tube neural au même niveau antéropostérieur de l’otocyste. Dox a été appliqué à E2, 6 h après l’électroporation. Les cellules de la crête neurale crânienne (CNC) migrantes sont indiquées par la flèche jaune et amplifiées dans l’encart dans F. Barre d’échelle = 500 μm dans E, s’applique à E et F; 100 μm dans l’encart. (G-H) Cellules transfectées avec Fmr1 shRNA et EGFP sur la coupe transversale d’un embryon E3 transfecté. Les cellules EGFP+ ont été confinées d’un côté du tube neural. La section était doublement colorée avec une immunoréactivité FMRP (grise). Barre d’échelle = 40 μm en G, s’applique à G et H. (I-J) image BF (I) fusionnée avec le canal EGFP (J) d’un tronc cérébral E15 après traitement Dox à E8. Barre d’échelle = 1 mm en I, s’applique à I et J. (K-L) Coupe efficace d’un tronc cérébral E15 avec des neurones EGFP+ NM du côté transfecté (trans) uniquement. Du côté controlatéral (contra) (K), des axones EGFP+ ont été observés dans la partie ventrale du noyau laminaire (NL). (M-N) Images à fort grossissement du NM à E19 avec double marquage de l’immunomarquage FMRP (rouge) et SNAP25 (bleu). SNAP25 est un marqueur présynaptique qui étiquette le bulbe d’extrémité de Held. Notez la réduction marquée de l’immunoréactivité FMRP dans les neurones transfectés (vert; *) par rapport aux neurones voisins non transfectés (•). (O-P) Images à fort grossissement du ganglion auditif (AG) à E19 avec immunoréactivité FMRP. Les neurones AG (AGN) n’ont pas été transfectés (EGFP-). Certaines cellules gliales dérivées de cellules CNC indiquées en F ont été transfectées. Barre d’échelle = 10 μm en M, s’applique à M-P. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Graphique 2. FMRP knockdown dans le conduit auditif du poulet. (A) Image en fond clair (BF) montrant la microinjection de plasmides dans l’otocyste à HH13. De l’encre de Chine (noire) a été injectée sous l’embryon pour une meilleure visibilité. (B) Positionnement de l’électrode bipolaire pour l’électroporation. Le côté positif (marqué avec un symbole plus, +) a été placé avant l’otocyste, et le côté négatif (étiqueté avec un symbole moins, -) a été placé postérieur à l’otocyste. (C) La section transversale d’une tête de poulet à E6 a été immunocolorée contre le FMRP (rouge) et le neurofilament (NF; bleu). Dox a été appliqué à l’E3 après l’électroporation. La fluorescence EGFP a été détectée dans l’otocyste mais pas dans le tronc cérébral. Barre d’échelle = 100 μm. (D-E) image BF (D) fusionnée avec le canal EGFP (E) d’un conduit auditif à E9. Barre d’échelle = 500 μm. (F-G) Coupe transversale d’un conduit auditif E9 avec immunomarquage FMRP (rouge) et NF (bleu). Des cellules EGFP+ ont été observées dans la paroi du canal cochléaire, la papille basilaire (BP) et le ganglion auditif (AG). La barre d’échelle = 50 μm en F, s’applique à F et G. (H-J) Images à fort grossissement d’une BP E9 montrant une immunoréactivité FMRP largement diminuée dans les cellules ciliées transfectées (HC; *) par rapport aux HC non transfectés (•). Les fibres NF-positives (bleu) étaient l’innervation périphérique des neurones AG. (K-M) Images à fort grossissement des neurones AG à E9 avec immunomarquage FMRP (rouge). L’immunoréactivité FMRP était forte dans les neurones non transfectés (•) et non détectable dans les neurones transfectés (EGFP+; *). Barre d’échelle = 50 μm en H, et s’applique à H-M. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Graphique 3. Suivi axonal des neurones AG transfectés dans le tronc cérébral. Les embryons ont été électroporés à HH13 pour la transfection d’otocystes de Fmr1 shRNA. L’application Dox a commencé à E2. (A) Coupes transversales d’une tête de poulet E6 avec immunomarquage de l’îlot-1 et contre-coloration DAPI. Les cellules EGFP+ étaient évidentes dans le ganglion auditif (AG). Les étoiles* indiquent plusieurs neurones AG transfectés dans l’encart de l’encart. Barre d’échelle = 100 μm en A et 10 μm en médaillon. (B-C) Image en champ lumineux (BF) (B) fusionnée avec le canal EGFP (C) d’un tronc cérébral E9. Dans ce cas, une partie de l’AG (flèches blanches) a été laissée connectée au tronc cérébral auditif. La flèche jaune indique les neurones AG transfectés (AGN) dans l’encart Les fibres EGFP+ étaient évidentes sur le côté transfecté du tronc cérébral. Barre d’échelle = 1 mm en B, s’applique à B et C; 100 μm dans l’encart. (D) Coupe transversale du tronc cérébral E9 au niveau indiqué en C par la ligne pointillée. Les fibres du nerf auditif EGFP+ (ANF; vert) s’étendaient le long de la marge dorsale du tronc cérébral et s’approchaient du noyau magnocellularis (NM). Barre d’échelle = 100 μm. (E-G) EGFP+ fibres à E15 (E) et E19 (F-G). Certaines fibres ont également été observées dans le noyau angularis (NA) et le noyau vestibulaire descendant (VeD). Les coupes E19 ont été colorées pour l’immunoréactivité de la parvalbumine (PV) en tant que marqueur des ANF. La boîte en pointillés en F est agrandie dans les encarts, montrant un ANF EGFP+, qui était immunoréactif PV. Barre d’échelle = 100 μm en E; 50 μm en F, s’applique à F et G; 2 μm dans les encarts. (H-J) Images à fort grossissement des terminaux ANF en NM à E9, E15 et E19, montrant la formation et la maturation progressive du bulbe d’extrémité de Held. Barre d’échelle = 5 μm en H, s’applique à H-J. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Pour déterminer la fonction autonome cellulaire de la FMRP, il est nécessaire de manipuler son expression dans des groupes cellulaires individuels ou des types de cellules. Étant donné que l’une des principales fonctions de la FMRP est de réguler la formation synaptique et la plasticité, la manipulation sélective de chaque composant synaptique d’un certain circuit est une condition préalable à une compréhension complète du mécanisme FMRP dans la communication synaptique. En utilisant l’électroporation in ovo d’embryons de poulet, nous avons démontré une méthode pour cibler l’expression de la FMRP dans le circuit AG-NM, soit dans les neurones AG présynaptiques, soit dans les neurones NM postsynaptiques. Pour ce faire, le choix des stades de développement appropriés pour l’électroporation et le positionnement précis de l’électrode d’électroporation sur l’embryon sont des étapes critiques. Les neurones NM proviennent de progéniteurs neuronaux dans le tube neural au niveau r5/6 à HH1223. Au même stade, les cellules de la crête neurale crânienne migrent de l’extrémité dorsale du tube neural vers le ganglion cochléovestibulaire pour envelopper les futurs neurones AG33. Ainsi, les neurones NM et les cellules gliales dans l’AG sont dérivés du tube neural. En revanche, les cellules ciliées et les neurones AG proviennent de l’ectoderme24. L’ectoderme adjacent au niveau r5/6 s’épaissit à HH10 puis invagine pour former la cupule otique à HH13. La coupe otique se ferme et se sépare de l’ectoderme pour former l’otocyste, la partie antérieure devenant l’organe sensoriel auditif et la partie postérieure contribuant au système vestibulaire. Dans les parties auditive et vestibulaire, les cellules neuroblastiques résidant dans la partie ventrale de la cupule otique se délaminent et migrent pour former le ganglion cochléovestibulaire. Sur la base de ces études de cartographie du destin, nous avons transfecté les progéniteurs des neurones NM en électropotant le tube neural à HH12, une stratégie qui a été établie précédemment26,28,34. Bien que cette stratégie conduise à une transfection supplémentaire des cellules gliales dans le tronc cérébral et l’AG, aucun des neurones AG n’a été transfecté. La transfection neuronale spécifique peut être réalisée en utilisant une stratégie Atoh1 pilotée par le moteur, comme ce que nous avons fait précédemment21. Pour la transfection sélective des neurones AG, nous avons électroporé l’otocyste à HH13. Les plasmides injectés dans la cupule otique ont principalement pénétré simultanément dans la partie antérieure de l’otocyste pour la transfection des cellules ciliées et des neurones AG lors du positionnement des électrodes, comme le montre la figure 2B. Pour cibler préférentiellement les neurones AG plutôt que les cellules ciliées, il est possible d’injecter la solution plasmidique directement dans la région adjacente à l’otocyste antérieur, où les neuroblastes délaminés localisent35. Cependant, cette méthode a une efficacité inférieure de la transfection des neurones AG par rapport à l’injection d’otocystes, car les plasmides diffusent rapidement après l’injection. Cette méthode peut également conduire à une transfection supplémentaire des cellules mésenchymateuses de la tête environnante. Une méthode pour cibler préférentiellement les cellules ciliées par rapport aux neurones AG consiste à retarder l’injection et l’électroporation des otocystes à HH18 (qui est ~embryonnaire jour 3), car la majorité des neuroblastes (précurseurs des neurones AG) ont migré hors de l’otocyste à ce stade24.

Avec des modifications, cette méthode peut être étendue à l’étude du système vestibulaire. Pour la transfection ganglionnaire vestibulaire, la direction des électrodes illustrée à la figure 2B doit être inversée pour transfecter la partie postérieure de l’otocyste en raison de l’emplacement distinct des précurseurs ganglionnaires auditifs et vestibulaires.

L’électroporation in ovo d’embryons de poulet est une technique bien établie pour étudier les premiers stades de développement (au cours de la première semaine d’incubation). Pour les études à long terme, le taux de survie est une préoccupation majeure. Lorsque vous commencez le traitement Dox à E8, le taux de survie trouvé ici est de ~60% à E9, mais tombe à 30% à E15, et encore plus bas à E19. Les nouveau-nés d’œufs électroporés sont possibles mais rares et ne peuvent survivre que plusieurs jours dans la plupart des cas. Pour augmenter le taux de survie, les éléments suivants doivent être envisagés: 1) utiliser un électroporateur qui fournit des ondes carrées au lieu d’ondes fortes; 2) appliquer une ou deux gouttes de PBS stérile sur le dessus de l’embryon si la couche d’albumine n’est pas assez épaisse pour favoriser la conductivité électrique (cela aidera à réduire les traumatismes électriques); 3) l’ouverture de la membrane vitelline pour exposer l’embryon au site d’injection n’est pas nécessaire pour une transfection réussie et peut nuire à l’embryon; 4) pour réduire le risque de contamination, utilisez une seringue pour piquer le parafilm et administrer Dox au lieu de rouvrir la fenêtre. Après l’injection, essuyez le film transparent avec de l’éthanol à 75% et couvrez l’ouverture de l’aiguille avec du ruban adhésif; 5) Pour la transfection des otocystes, injecter des plasmides dans l’otocyste dorsolatéralement avec une pipette inclinée à 45° pour éviter une éventuelle ponction de l’aorte dorsale en dessous. Si l’aorte dorsale est endommagée, le saignement éliminera les plasmides et causera même la mort; 6) si possible, évitez d’utiliser de l’encre de Chine pour visualiser l’embryon. Moins de manipulation et moins de procédures se traduiront par un taux de survie plus élevé.

En plus de la capacité de transfecter sélectivement les neurones AG ou NM, l’électroporation in ovo fournit un système unique qui permet des comparaisons voisines pour les analyses de données. Après électroporation, seul un sous-ensemble de cellules du NM ou de l’AG sont transfectées, ce qui permet aux cellules non transfectées environnantes du même groupe cellulaire de servir de contrôle idéal20. Si l’interaction potentielle entre les neurones voisins est une préoccupation, les homologues neuronaux du côté non transfecté de l’oreille et du cerveau peuvent servir de contrôle supplémentaire. Pour les études histologiques et d’imagerie, ce résultat permet des analyses de données avec une grande efficacité au niveau de la cellule unique ou de la fibre unique. Les analyses moléculaires sont également réalisables si elles sont combinées avec le tri cellulaire à base de fluorescence et les analyses de protéines et d’ARN à grande échelle telles que la spectrométrie de masse et le séquençage de nouvelle génération. Cependant, l’utilisation de l’électroporation in ovo comme moyen d’édition de gènes peut être difficile pour les études fonctionnelles et comportementales, car le pourcentage de cellules transfectées au sein d’un groupe cellulaire peut ne pas être assez important pour entraîner des conséquences fonctionnelles.

Il est essentiel d’effectuer deux analyses de vérification lors de l’adoption de l’approche d’électroporation in ovo. Tout d’abord, l’effet de l’édition de gènes sur la protéine d’intérêt doit être confirmé. L’électroporation in ovo ne transfecte qu’un sous-ensemble de neurones dans le NM ou l’AG (c.-à-d. un motif en mosaïque). L’exécution d’un transfert Western sur des tissus homogénéisés contenant un mélange de neurones transfectés et non transfectés n’est pas assez sensible pour refléter avec précision l’effet knockdown. Ainsi, la validation doit être effectuée au niveau de chaque cellule en utilisant des méthodes telles que l’immunocytochimie. À cette fin, nous avons précédemment généré un anticorps qui reconnaît le PRFM du poulet. La spécificité de cet anticorps a été vérifiée par immunocytochimie et Western blot dans une étude précédente30. L’effet knockdown de Fmr1 shRNA a été validé quantitativement en observant des réductions significatives de l’intensité de l’immunoréactivité FMRP dans les neurones NM transfectés par rapport aux neurones voisins non transfectés. Deuxièmement, des groupes témoins utilisant des ARN brouillés, ou d’autres constructions témoins, devraient être utilisés pour confirmer la spécificité des effets cellulaires observés de la mauvaise expression de la FMRP20,21. Pour atteindre cet objectif, nous avons conçu un shRNA brouillé, l’avons cloné dans le même système vectoriel Tet-On et l’avons électropoté en précurseurs NM, comme décrit précédemment20. L’expression de la FMRP dans les neurones NM transfectés avec le shRNA brouillé n’a pas été affectée, comme en témoigne l’intensité inchangée de l’immunoréactivité FMRP par rapport aux neurones voisins non transfectés. Nous avons également identifié un certain nombre d’effets de la transfection de l’ARNx Fmr1 sur la croissance axonale, l’élagage dendritique, la formation terminale et la neurotransmission (examinés dans Curnow et Wang, 2022)36. Nous avons conclu que ces effets étaient induits spécifiquement par la perte autonome cellulaire de FMRP parce que le shRNA brouillé n’a pas réussi à induire des changements similaires.

En conclusion, la technique d’électroporation in ovo permet l’édition sélective du gène Fmr1 avec contrôle temporel et spécificité des composants dans les circuits auditifs oreille-tronc cérébral et peut être modifiée pour manipuler le système vestibulaire. Le développement de cette technologie de pointe dans l’embryon de poulet, un modèle bien établi en biologie du développement, a contribué et continuera de contribuer à notre compréhension du développement du cerveau dans des conditions normales et anormales telles que le FXS.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par: une subvention de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 32000697); le Programme de science et de technologie de Guangzhou (202102080139); la Fondation des sciences naturelles du Guangdong (2019A1515110625, 2021A1515010619); les Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (11620324); a Research Grant of Key Laboratory of Regenerative Medicine, Ministère de l’éducation, Université de Jinan (No. ZSYXM202107); les Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales de Chine (21621054); et la Fondation pour la recherche scientifique médicale de la province chinoise du Guangdong (20191118142729581). Nous remercions le centre expérimental médical de l’Université de Jinan. Nous remercions le Dr Terra Bradley pour la révision minutieuse du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Egg incubation
16 °C refrigerator MAGAT Used for fertilized egg storage.
Egg incubator SHANGHAI BOXUN GZX-9240MBE
Fertilized eggs Farm of South China Agricultural University Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge Sigma 10016
Fast green Solarbio G1661 Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit QIAGEN 12162 Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889 Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator BTX ECM399
1 mL / 5 mL Syringe GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope CNOPTEC SZM-42
Doxcycline Sigma-Aldrich D9891 Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary BEIBOBOMEI RD0910 0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm PARAFILM PM996 transparent film
Pipette puller CHENGDU INSTRUMENT FACTORY WD-2 Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes Home made 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube Sigma-Aldrich A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps RWD F11020-11 Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools RWD
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW 01673921 For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat LEICA CM1850
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 From bovine skin.
Sliding microtome LEICA SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse Abcam ab150113 1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit Abcam ab150078 1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI Abcam ab285390 1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium Southern Biotech Sb-0100-01
FMRP antibody Y. Wang, Florida State University #8263 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody DSHB 39.3F7 1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate Corning 3478
Neurofilament antibody Sigma-Aldrich N4142 1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody Sigma-Aldrich P3088 1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody Abcam ab66066 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop ADOBE image editing software
Confocal microscope LEICA SP8
Fluorescent stereomicroscope OLYMPUS MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0 OlYMPUS commercial image processing software package

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References

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Neurosciences numéro 185 syndrome de l’X fragile circuit sensoriel oreille interne noyau cochléaire formation des synapses développement du cerveau bulbe terminal de Held embryon de poulet
Dissection de la fonction autonome cellulaire de la protéine de retard mental de l’X fragile dans un circuit auditif par électroporation <em>in ovo</em>
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Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang, X. Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation. J. Vis. Exp. (185), e64187, doi:10.3791/64187 (2022).

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