Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ניתוח תפקוד אוטונומי של תאים של חלבון פיגור שכלי X שביר במעגל שמיעתי על ידי אלקטרופורציה של In Ovo

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/64187
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Division of Histology & Embryology, Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education, College of Medicine, Jinan University, 2Department of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Jinan University, 3Program in Neuroscience, Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University
* These authors contributed equally

Summary

תוך שימוש באלקטרופורציה של ovo , פיתחנו שיטה לטרנספציה סלקטיבית של האוזן הפנימית השמיעתית וגרעין השבלול בעוברי עוף כדי להשיג פגיעה ספציפית לקבוצת התאים של חלבון פיגור שכלי X שביר במהלך תקופות בדידות של הרכבת מעגלים.

Abstract

חלבון פיגור שכלי X שביר (FMRP) הוא חלבון קושר mRNA המווסת את תרגום החלבון המקומי. אובדן FMRP או תפקוד לקוי מוביל לפעילות עצבית וסינפטית חריגה בתסמונת X שביר (FXS), המאופיינת במוגבלות אינטלקטואלית, הפרעות חושיות ובעיות תקשורת חברתית. מחקרים על תפקוד FMRP ופתוגנזה של FXS נערכו בעיקר עם Fmr1 (הנוקאאוט של FMRP המקודד גנים בבעלי חיים מהונדסים. כאן אנו מדווחים על שיטת in vivo לקביעת התפקוד האוטונומי של FMRP במהלך תקופת הרכבת המעגלים והיווצרות סינפטית באמצעות עוברי עוף. שיטה זו משתמשת באלקטרופורציה ספציפית לשלב, לאתר ולכיוון של מערכת וקטורית הניתנת להשראה לתרופות המכילה Fmr1 RNA קטן של סיכות שיער (shRNA) וכתב EGFP. בשיטה זו, השגנו נוק-דאון סלקטיבי של FMRP בגנגליון השמיעתי (AG) ובאחת ממטרות גזע המוח שלו, הגרעין מגנוצלולריס (NM), ובכך סיפקנו מניפולציה ספציפית לרכיב בתוך מעגל AG-NM. בנוסף, תבנית הפסיפס של ההעברה מאפשרת בקרות בתוך בעלי חיים והשוואות נוירונים/סיבים שכנים לאמינות ורגישות משופרות בניתוח נתונים. מערכת הווקטורים האינדוקטיביים מספקת בקרה זמנית על הופעת עריכת גנים כדי למזער את ההשפעות ההתפתחותיות המצטברות. השילוב של אסטרטגיות אלה מספק כלי חדשני לנתח את הפונקציה התאית-אוטונומית של FMRP בפיתוח סינפטי ומעגלים.

Introduction

תסמונת X שביר (FXS) היא הפרעה נוירו-התפתחותית המאופיינת על ידי מוגבלות אינטלקטואלית, הפרעות חושיות והתנהגויות אוטיסטיות. ברוב המקרים, FXS נגרמת על ידי אובדן גלובלי של חלבון פיגור שכלי X שביר (FMRP; מקודד על ידי הגן Fmr1) החל משלבים עובריים מוקדמים1. FMRP הוא חלבון קושר RNA המתבטא בדרך כלל ברוב תאי העצב ותאי הגליה במוח, כמו גם באיברי החישה 2,3,4. במוחות של יונקים, FMRP קשור ככל הנראה למאות mRNA המקודדים חלבונים החשובים לפעילויות עצביות שונות5. מחקרים על חיות נוקאאוט Fmr1 קונבנציונליות הראו כי ביטוי FMRP חשוב במיוחד להרכבה ולפלסטיות של העברה עצבית סינפטית6. מספר מודלים של נוקאאוט מותנה ופסיפס הראו עוד כי פעולות ואותות FMRP משתנים בין אזורי מוח, סוגי תאים ואתרים סינפטיים במהלך מספר אירועים התפתחותיים, כולל הקרנה אקסונלית, דפוס דנדריטי ופלסטיות סינפטית 7,8,9,10,11,12,13,14 . תפקוד חריף של FMRP בוויסות ההעברה הסינפטית נחקר על ידי העברה תוך תאית של נוגדני FMRP מעכבים או FMRP עצמו בפרוסות מוח או נוירונים בתרבית15,16,17,18. עם זאת, שיטות אלה אינן מציעות את היכולת לעקוב אחר ההשלכות הנגרמות על ידי ביטוי שגוי של FMRP במהלך הפיתוח. לפיכך, פיתוח שיטות in vivo כדי לחקור את הפונקציות התאיות-אוטונומיות של FMRP הוא נחוץ מאוד, וצפוי לעזור לקבוע אם האנומליות המדווחות בחולי FXS הן השלכות ישירות של אובדן FMRP בנוירונים ובמעגלים הקשורים, או השלכות משניות הנגזרות משינויים ברחבי הרשת במהלך הפיתוח19.

גזע המוח השמיעתי של עוברי עוף מציע מודל בעל יתרון ייחודי לניתוחים תפקודיים מעמיקים של ויסות FMRP בהתפתחות מעגלים וסינפסות. הגישה הקלה למוחות של תרנגולות עובריות והטכניקה המבוססת היטב של אלקטרופורציה של אובו למניפולציה גנטית תרמו רבות להבנתנו את התפתחות המוח בשלבים עובריים מוקדמים. במחקר שפורסם לאחרונה, טכניקה זו שולבה עם כלים מולקולריים מתקדמים המאפשרים שליטה זמנית של ביטוי שגוי של FMRP20,21. כאן, המתודולוגיה מתקדמת כדי לגרום למניפולציות סלקטיביות של נוירונים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים בנפרד. שיטה זו פותחה במעגל גזע המוח השמיעתי. אות אקוסטי מזוהה על ידי תאי שערה באוזן הפנימית השמיעתית ולאחר מכן מועבר לגנגליון השמיעתי (AG; נקרא גם גנגליון ספירלי ביונקים). נוירונים דו-קוטביים ב-AG innervates את תאי השערה עם התהליכים ההיקפיים שלהם, ובתורם שולחים הקרנה מרכזית (עצב השמיעה) לגזע המוח, שם הם מסתיימים בשני גרעיני שבלול עיקריים, הגרעין מגנוצלולריס (NM) והגרעין הזוויתי (NA). תאי עצב ב-NM דומים מבחינה מבנית ותפקודית לתאי השיח הכדוריים של גרעין השבלול האנטרו-בנטרלי של היונקים. בתוך ה-NM, סיבי עצב השמיעה (ANFs) סינפסה על הסומטה של נוירוני NM דרך הקצה הגדול של הדקים22. במהלך ההתפתחות, נוירונים NM נובעים מרומבומרים 5 ו -6 (r5/6) במוח האחורי23, בעוד נוירונים AG נגזרים נוירובלסטים השוכנים באוטוציסט24. כאן אנו מתארים את הפרוצדורה לדיכוי סלקטיבי של ביטוי FMRP בנוירוני AG הקדם-סינפטיים ובנוירוני NM הפוסט-סינפטיים בנפרד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ביציות ועוברי תרנגולות טופלו בזהירות ובכבוד בהתאם לפרוטוקולים של בעלי חיים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'ינאן.

1. הכנת ביצים ופלסמידים

  1. הכנת ביצים
    1. השיגו ביצי עוף מופרות טריות (Gallus gallus) מהאוניברסיטה החקלאית של דרום סין ואחסנו בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס לפני הדגירה. לקבלת כדאיות אופטימלית, קבעו את כל הביצים לדגירה תוך שבוע מהגעתן.
    2. מניחים ביצים בצורה אופקית ודוגרים בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס למשך 46-48 שעות עד שלב המבורגר והמילטון (HH) 1225 להעברת התעלה העצבית, או למשך 54-56 שעות עד HH13 להעברת אוטוציזם. מכיוון שהקוטב החייתי של הביצה קל יותר מהקוטב הצמחי, מיקום אופקי ממקם את העובר על החלק העליון של הביצית למניפולציה קלה. היזהר כדי לשמור על הביצה אופקית זה ובכל השלבים הבאים.
    3. מיקום העובר מופיע כאזור כהה על קליפת הביצה בעת הטלת אור מתחתית הביצה באמצעות פנס. בשלבי HH הרצויים, השתמש בשיטת פנס זו כדי לסמן את מיקום העובר על קליפת הביצה בעיפרון.
    4. נגבו את הביצים בגזה המכילה 75% אתנול. קודחים חור בקצה המחודד של הביצים באמצעות קצה המספריים ומסירים 2 מ"ל אלבומין עם מזרק מחט 18 גרם. ודא שהחור גדול מספיק כדי לאפשר החדרת מחט. נגבו כל אלבומין דולף עם גזה וסתום את החור בנייר דבק שקוף.
    5. כדי למזער סדקים ולמנוע נפילת פסולת קליפה במהלך החלון, כסו את החלק העליון של הביצים בנייר דבק שקוף, ובמרכזו האזור הכהה המסומן בעיפרון.
  2. מיצוי דנ"א פלסמיד
    1. שיבוט עוף Fmr1 shRNA באמצעות מערכת Tet-on מבוססת טרנספוזון כפי שתואר קודםלכן 20. מערכת זו מכילה שלושה פלסמידים: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2, ו-pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA, המספקים מערכת וקטורית הניתנת להשראה לתרופות שבאמצעותה הביטוי של Fmr1 shRNA ו-EGFP מושתק לאחר הטרנספקציה וניתן להפעיל אותו על ידי אינדוקציה של דוקסיציקלין (Dox).
      הערה: פלסמידים אלה אינם זמינים כעת במאגר. המחברים מסכימים לספק את הפלסמידים על פי בקשה סבירה.
    2. חלץ DNAs פלסמידים באמצעות ערכת הכנה ללא אנדוטוקסין על פי הוראות היצרן וזרז על ידי הוספת 1/15 נפח של 7.5 M נתרן אצטט ונפח אחד של 100% איזופרופנול.
    3. מזרזים פלסמידים בטמפרטורה של -20°C למשך הלילה וצנטריפוגות בטמפרטורה של 13,000 x g למשך 10 דקות. ממיסים את הכדור עם חיץ Tris-EDTA המסופק בערכה לריכוז סופי של 4-5 מיקרוגרם/μL. ניתן לאחסן פלסמידים בטמפרטורה של -20°C למשך 12 חודשים ללא יעילות העברה מופחתת.
    4. ביום האלקטרופורציה, מערבבים היטב 2 μL מכל פלסמיד בצינור צנטריפוגה סטרילי באמצעות קצה פיפטה. הנפח המתקבל של 6 μL של תערובת הפלסמיד מספיק כדי לחשמל שלושה תריסר ביצים. כדי לעזור לדמיין את הפלסמיד במהלך האלקטרופורציה, הוסף 1 μL של 0.1% ירוק מהיר (מוכן ב ddH2O סטרילי) עבור כל 6 μL של תערובת DNA26, אשר הופך את תערובת פלסמיד כחול.

2. באלקטרופורציה של אובו

  1. חלון ביציות וזיהוי עוברים
    1. ביום של electroporation, להסיר את הביצים מן האינקובטור, תריסר ביצים בכל פעם. הרחקת ביצים מהאינקובטור שלהן למשך יותר משעה גורמת לשינויים התפתחותיים ומפחיתה את הכדאיות.
    2. נגב את כל כלי הניתוח עם גזה המכילה 75% אתנול.
    3. מניחים כל ביצה במחזיק קצף בהתאמה אישית. נגבו את האזור המכוסה בנייר דבק ב-75% אתנול וחתכו חלון (1-2 ס"מ2) סביב היקף סימן העיפרון באמצעות זוג מספריים קטן (איור 1A). בעת החיתוך, החזיקו את המספריים שטוחים כדי למנוע פגיעה בעובר שמתחת.
    4. מניחים את ביצית החלון מתחת לסטריאומיקרוסקופ עם עינית 10x וזום 2x ומזהים את העובר. התאם את הזווית והבהירות של מקור האור לתצוגה חזותית טובה יותר.
      הערה: נדרש תרגול וניסיון כדי לדמיין את העובר ולזהות את הצינור העצבי בשלב זה.
      1. למתחילים, השתמש בהזרקת הדיו האופציונלית הבאה כדי להקל על זיהוי העובר. הכן מראש תמיסת דיו הודי של 10% בתמיסת מלח עם אגירת פוספט (PBS) ואוטוקלאב בנפח 0.01 M. מלא מזרק של 1 מ"ל בתמיסת הדיו ולאחר מכן התאם מחט 27G. כופפו את המחט לזווית של 45° בעזרת מלקחיים.
      2. מתחת למיקרוסקופ, לתקוע בזהירות מקצה האופקה באזור ולהחדיר את המחט מתחת לעובר. להזריק ~ 50 μL של דיו, אשר יתפזר מתחת לאזור pellucida להדמיית העובר. הדיו יהווה רקע כהה להדמיה ברורה של העובר.
        הערה: יש להוציא את האוויר מהמזרק לפני ההחדרה וההזרקה. כאשר אתה מיומן בהדמיה חזותית, הימנע משלב הזרקת הדיו מכיוון שהוא מפחית את שיעור ההישרדות.
  2. הזרקת צינורות עצביים ואלקטרופורציה
    הערה: הליך זה מבוצע ב- HH12 עבור טרנספקציה של נוירוני NM בגזע המוח.
    1. משוך נימי זכוכית (~ 1 מ"מ קוטר ו 100 מ"מ אורך) לתוך פיפטות באמצעות מושך פיפטה. תחת מיקרוסקופ ניתוח, בזהירות לפתוח את קצה המחט נימי לקוטר 10-20 מיקרומטר עם מלקחיים. אחסנו את הפיפטות (בדרך כלל 5-10 בבת אחת) בקופסת אחסון עד לשימוש.
    2. מלאו פיפטה נימית עם 0.5-1 μL של תערובת פלסמיד על ידי הפעלת לחץ שלילי דרך צינור גומי בסוף הפיפטה. זה יכול להיות מושגת על ידי מזרק או משאבת אוויר.
    3. מניחים את הביצית מתחת למיקרוסקופ כך שהעובר מכוון אנכית עם הזנב קרוב אליכם (או אופקית להזרקת פיפטות נימיות באמצעות מניפולטור בעל שלושה צירים). החזיקו את הפיפטה הנימית ביד אחת או עם מניפולטור שלושת הצירים והניעו את קצה הפיפטה ל-r5/6 בכיוון זנב-אל-ראש.
      הערה: אזור המוח האחורי הקדמי ביותר הוא r1 וכל בליטה עוקבת לאורך הצינור העצבי היא רומבומרה בודדת. R5/6 נמצא באותה רמה אנטרופוסטרית כמו האוטוציסט, שהוא מבנה דמוי שניתן לזהותו בקלות (איור 1B-C).
    4. בעדינות לדחוף את הקצה דרך קרום vitelline לתוך הצינור העצבי הגבי ולאחר מכן למשוך את פיפטה קצת כך הקצה הוא לומן של הצינור העצבי. הזריקו את תערובת הפלסמיד על ידי הפעלת לחץ אוויר עד שהפלסמיד הכהה מתפזר במלואו ל-r5/6 ומתרחב ל-r3 ו-r4.
      הערה: אין צורך לבצע חריץ על קרום vitelline להזרקה.
    5. בדקו אם יש הזרקה מוצלחת, שמושגת כאשר תמיסת הפלסמיד הכחולה מתפזרת במהירות במורד התעלה העצבית מבלי לדלוף (איור 1B-C). כאשר מתרחשת דליפה, הכחול דוהה במהירות.
    6. מיד לאחר ההזרקה, הניחו אלקטרודת פלטינה דו-קוטבית משני צדי התעלה העצבית (איור 1D). ספק שתי פעימות של 12 וולט ומשך 50 אלפיות השנייה באמצעות אלקטרופורטור. שימו לב לבועות אוויר בקצות האלקטרודה הדו קוטבית, עם יותר בצד השלילי.
    7. בדוק אם אלקטרופורציה מוצלחת, אשר מושגת כאשר תערובת פלסמיד כהה נכנס לרקמת הצינור העצבי ליד הצד החיובי של האלקטרודה. לאחר אלקטרופורציה, להסיר בזהירות את האלקטרודה דו קוטבית.
    8. מכסים את החלון על קליפת הביצה בחתיכת סרט שקוף שנחתך מראש ל-2 ריבועים ומרוסס ב-75% אתנול. החזירו את הביצה לאינקובטור שלה.
    9. נקו את האלקטרודה הדו-קוטבית על ידי העברת 10-20 פולסים של 12 וולט ו-50 מילישניות במי מלח לפני שתמשיכו לביצה הבאה.
  3. הזרקת אוטוציסט ואלקטרופורציה
    הערה: הליך זה מבוצע ב- HH13 עבור טרנספקציה של תאי שיער ונוירוני AG באוזן הפנימית.
    1. ב- HH13 (שהוא ~יום עוברי 2.5), העובר הסתובב כך שהצד הימני של הראש פונה כלפי מעלה. מתחת למיקרוסקופ, מניחים את הביצית כך שהעובר יהיה אנכי, כשהזנב קרוב אליכם. החזיקו את הפיפטה הנימית ודחפו בעדינות את האוטוציסטה הימנית בכיוון הגבי (איור 2A).
      הערה: בשלב זה, האוטוציסט מופיע כמבנה מעגלי קטן בחלק העליון של הגוף באותה רמה אנטרופוסטרית כמו r5/6.
    2. מזריקים את תערובת הפלסמיד בלחץ אוויר עד שהאוטוציסט מתמלא בתמיסה כחולה27. בדוק אם יש הזרקה מוצלחת, אשר מושגת כאשר תערובת הפלסמיד הכחול כלואה בתוך האוטוציסט ואינה דולפת.
    3. מיד לאחר ההזרקה, הניחו את האלקטרודה הדו-קוטבית על האוטוציסט כפי שמתואר באיור 2B. מקם את הצדדים החיוביים והשליליים הקדמיים והאחוריים לאוטוציסט, בהתאמה. ספק שתי פעימות של 12 וולט ומשך 50 אלפיות השנייה עם האלקטרופורטור.
    4. בדוק אם אלקטרופורציה מוצלחת, אשר מושגת כאשר תערובת פלסמיד כחול נכנס לרקמה של otocyst ליד הצד החיובי של האלקטרודה. לאחר אלקטרופורציה, להסיר בזהירות את האלקטרודה דו קוטבית. מכסים את החלון על קליפת הביצה בסרט שקוף ומחזירים את הביצה לאינקובטור.

3. ניהול דוקס ליזום ולתחזק תמלול פלסמיד

  1. הכנת תמיסת דוקס
    1. מדוד 100 מ"ג של אבקת Dox מתחת למכסה מנוע כימי והמיס אותה ב-100 מ"ל של PBS סטרילי כדי ליצור תמיסת עבודה של 1 מ"ג/מ"ל. סנן את התמיסה עם מסנן 0.22 מיקרומטר ואחסן 1 מ"ל aliquots ב -20 °C. הגנה מפני אור20,28.
  2. המינהל של דוקס
    1. לעריכת גנים בעוצמה מלאה, 24 שעות לפני הגיל הרצוי, הפשירו אליקוט דוקס על קרח. זרוק 50 μL של דוקס ישירות על הקרום chorioallantoic של הביצה באמצעות מזרק חודר את הסרט שקוף. אטמו את חור המחט עם סרט שקוף או סרט לאחר ההזרקה.
    2. כדי לשמור על אפקט ההדחה, יש לתת את Dox אחת ליומיים עד לקצירת הרקמות בשלב ההתפתחותי הרצוי.

4. דיסקציה וחתך רקמות

  1. גזע המוח
    1. עבור עוברים בשלב עוברי 3 (E3) ו- E6, לפתוח את קליפת הביצה לחתוך את הקרום הקשור עם מספריים. הוציאו את העובר החוצה וטבלו אותו ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) במאגר פוספט של 0.1 M.
    2. עבור עוברי E9, פתחו את קליפת הביצה, ערפו את העובר במספריים והעבירו את הראש לצלחת עם תחתית סיליקון מלאה ב-PBS. מצמידים את הראש למטה דרך המסלולים וחותכים את החלק העליון של הגולגולת לגזרים. מניחים בזהירות את המלקחיים מתחת למוח משני הצדדים ומרימים את המוח כולו מהגולגולת עם כתפי המלקחיים. לטבול את המוח ב-4% PFA.
    3. עבור עוברי E15 ו-E19, פתחו את קליפת הביצה, ערפו את העובר במספריים והניחו את הראש על צלחת עם תחתית סיליקון מלאה ב-PBS. חותכים לפתוח את העור על גבי הראש כדי לחשוף את הגולגולת.
    4. חותכים דרך הגולגולת אנכית עם סכין גילוח כדי להפריד בין המוח הקדמי לבין המוח הקאודאלי. לטבול את הבלוק caudal ב PBS, להסיר את החלק העליון של הגולגולת, ולאחר מכן לקחת את המוח מן הגולגולת.
    5. הצמד את המוח למטה דרך האונה האופטית והפרד את המוח הקטן ואת גזע המוח. היזהר לא לפגוע בגזע המוח השמיעתי, אשר ממוקם ממש מתחת למוח הקטן. הסר כמה שיותר דורה מגזע המוח ולאחר מכן טבל אותו ב-4% PFA.
    6. שמור על עוברים ורקמות מוח ב-4% PFA בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, למעט גזעי מוח E19, אותם יש לשמור באותו מצב במשך 24 שעות.
    7. לאחר קיבוע, לייבש את הרקמה ב- PBS המכילה 30% סוכרוז עד שהיא שוקעת, מה שבדרך כלל לוקח 1-3 ימים, תלוי בגיל.
    8. חתכו את גזע המוח (E15 ו-E19) ב-30 מיקרומטר במישור הקורונלי באמצעות מיקרוטום מחליק. לאסוף חלקים ב- PBS ולאחסן ב 4 °C לפני immunostaining.
    9. עבור עוברי E3 ו- E6 וגזעי מוח E9, חתך ב 50 מיקרומטר רוחבי. לאסוף חלקים PBS ולאחסן ב 4 °C (64 °F). הרכיבו את החלקים על גבי שקופיות מיקרוסקופ מצופות ג'לטין לפני החיסון. איסוף חתכים עבים יותר לגילאים אלה מקל על הטיפול ברקמות.
  2. צינור השמיעה
    1. לאחר הסרת גזעי המוח מעוברי E9, E15 ו- E19, צינור השמיעה, המוטבע בעצם הטמפורלית, ניתן לזיהוי בקלות שוכב מתחת לגולגולת, והעצם הטמפורלית ניתנת להפרדה בקלות מהגולגולת שמסביב. עבור עוברי E9, תקן את כל העצם הטמפורלית ב-4% PFA. עבור עוברים מבוגרים יותר, הסר את המבנה הגרמי של העצם הטמפורלית כדי לבודד את צינור השמיעה ולתקן את צינור השמיעה ב 4% PFA.
    2. יש לשמור את כל העצמות הטמפורליות וצינורות השמיעה ב-4% PFA בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה לפני הטמעת הרקמות.
    3. בצע הטמעת רקמות כמתואר. הכינו את תמיסת ההטבעה באופן הבא: משרים 10% ג'לטין (מעור בקר) במים קרים עד שגרגירי הג'לטין מתנפחים ומתיישבים (כ-30 דקות). מחממים את התערובת ל~50°C כדי להמיס את הג'לטין ומוסיפים 20% סוכרוז לתמיסת הג'לטין ומערבבים עד להתמוססות. אחסנו את תמיסת הג'לטין-סוכרוז בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.
    4. לשימוש, מחממים את תמיסת הג'לטין-סוכרוז בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. משרים את העצמות הטמפורליות/צינורות השמיעה בתמיסת הג'לטין-סוכרוז החמה על צלחת של 96 מעלות צלזיוס בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהן שוקעות, בדרך כלל 30-60 דקות.
    5. מרפדים את תחתית הבארות של צלחת בת 12 בארות ברצועת סרט שקוף. מוסיפים שכבה של תמיסת ג'לטין-סוכרוז חמה ומחכים עד שהיא תתמצק. מעבירים עצם זמנית/צינור שמיעתי לכל באר.
    6. להשתיל את הרקמה עם שכבה שנייה של תמיסת ג'לטין-סוכרוז חם. התאם את מיקום הרקמה כך שהיא תהיה במרכז הג'ל וצינור השמיעה מכוון אופקית. מעבירים בזהירות את הצלחת למקרר של 4 מעלות צלזיוס ומחכים עד שהג'ל יתקשח.
    7. משכו את רצועת הסרט השקופה כדי להזיז את גוש רקמת הג'ל אל מחוץ לבאר. חותכים ג'ל נוסף לגוש מרובע וחותכים פינה של הבלוק כדי לזהות את הכיוון. עוטפים את גוש הג'לטין בנייר כסף, מקפיאים על קרח יבש, ואז מאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לחתך.
    8. חתך את הבלוק ב 20 μm לאורך קו האורך של צינור השמיעה עם cryostat. הרכיבו את החלקים ישירות על שקופיות מיקרוסקופ מצופות ג'לטין. יש לאחסן את המגלשות בטמפרטורה של -80°C לפני תחילת ההצבעה.
    9. לפני החיסון, טבלו את השקופיות ב-PBS שחומם מראש (45 מעלות צלזיוס) למשך 5 דקות כדי להמיס את הג'לטין, ולאחר מכן שטפו את השקופיות פי 3 עם PBS בטמפרטורת החדר כדי להסיר שאריות ג'לטין.

5. אימונוסטינינג והדמיית מיקרוסקופ

הערה: שני סוגים של אימונוסטינינג מבוצעים בהתאם לשאלה אם חלקים מותקנים על שקופיות או צפים בחופשיות ב- PBS.

  1. מכתמי חיסון בשקופיות
    1. לשטוף את השקופיות 3x במשך 10 דקות כל אחד עם PBS. הקיפו את האזור המכיל את החלקים בעט שמן כדי למנוע דליפת נוזלים במהלך הכתמים. מכסים את החלקים בתמיסת חסימה המכילה 5% סרום עיזים רגיל ב-PBS ומדגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. לדלל את הנוגדנים העיקריים (עבור הריכוז הסופי המשמש עיין טבלת החומרים) ב- PBS המכיל 0.3% TritonX-100 ו -5% סרום עיזים רגיל. הסר את תמיסת החסימה ולאחר מכן כסה את החלקים עם תמיסת הנוגדנים העיקרית. דגרו את המגלשות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בקופסה המכילה שכבה של מים מזוקקים בתחתית.
    3. שטפו את השקופיות 3x למשך 10 דקות עם PBS. יש למרוח נוגדנים משניים פלואורסצנטיים המדוללים בשעה 1:500 ב-PBS המכילים 0.3% TritonX-100 על שקופיות. לדגור על המגלשות בטמפרטורת החדר למשך 4 שעות, מוגן מפני אור.
    4. שטפו את השקופיות 3x עם PBS. יש להשליך בעדינות שתי טיפות של מדיום הרכבה על השקופיות ולכסות את החלקים בכיסויים. היזהרו שלא ליצור בועות אוויר בין הכיסוי למגלשה.
  2. חיסון לעוברים שלמים ולחלקים צפים חופשיים
    1. שטפו את העוברים / החלקים עם PBS 3x במשך 10 דקות כל אחד בצלחת באר. יש לדלל את הנוגדנים העיקריים ב-PBS המכילים 0.3% TritonX-100 ו-5% סרום עיזים רגיל בצינורות צנטריפוגליים. מעבירים כל עובר/חתך לצינור עם וו זכוכית ודוגרים על שייקר ב-60 סל"ד למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
    2. לשטוף עוברים / חלקים 3x עם PBS במשך 10 דקות כל אחד בצלחת באר. מעבירים כל עובר/חתך לצינור צנטריפוגלי כהה מלא בתמיסת נוגדנים משנית פלואורסצנטית ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 4 שעות על השייקר.
    3. שטפו את העוברים/מקטעים פי 3 עם PBS בצלחת באר. השתמשו במברשת כדי להרכיב את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ מצופות ג'לטין בכלי בגודל 15 ס"מ המכיל PBS. לאחר שהמגלשות מתייבשות מעט (~5 דקות), יש למרוח שתי טיפות של מדיום הרכבה ולהניח כיסוי. היזהרו שלא ליצור בועות אוויר בין הכיסוי למגלשה. שמור את כל רקמות ההר ב- PBS להדמיה.
  3. דימות
    1. דמיינו את כל רקמות ההרכבה ב-PBS בצלחת עם תחתית סיליקון המכילה אבקת פחמן, המספקת רקע שחור. צלם ועבד תמונות באמצעות חבילת תוכנה מסחרית לעיבוד תמונה אולימפוס, כפי שתואר קודםלכן 29.
    2. דמיינו את הקטעים בשקופיות במיקרוסקופ קונפוקלי כפי שתואר קודםלכן 20. צלם את המקטעים במישור מוקד יחיד עם מטרות של 10x, 20x ו- 63x. צלם את כל התמונות מאותה חיה באמצעות אותם פרמטרים. הקפד להתאים את רמת הלייזר ואת הגדרות רכישת ההדמיה כדי למנוע רוויית אות.
    3. בצע עיבוד תמונה באמצעות תוכנת פיג'י. לשם המחשה, התאם את הבהירות, הניגודיות והגמא של התמונה באמצעות תוכנה מקצועית לעריכת תמונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

על ידי ביצוע אלקטרופורציה של ovo באתרים שונים ובשלבי התפתחות שונים, השגנו נפילת FMRP סלקטיבית בפריפריה השמיעתית או בגזע המוח השמיעתי.

נוק-דאון של FMRP ב-NM
RNA סיכת שיער קטנה (shRNA) כנגד התרנגולת Fmr1 תוכנן ושוכפל למערכת הווקטורית Tet-On כפי שתואר קודםלכן 20. ההגדרה לאלקטרופורציה של אובו מוצגת באיור 1A. הדנ"א הפלסמיד הצבוע בירוק מהיר הוזרק לתעלה העצבית ברמת r5/r6 ב-HH12 (איור 1B-C). אלקטרודה דו-קוטבית פלטינה הונחה בכל צד של התעלה העצבית ברמת r5/6 (איור 1D). שני פולסים ב-12 וולט הועברו כדי להניע את הפלסמיד לתוך הרקמה ליד הצד החיובי של האלקטרודה. דוקס הוחל על הממברנה הכוריואלנטואית כדי להפעיל את הביטוי של Fmr1 shRNA ו- EGFP. לאחר 24 שעות של טיפול דוקס, EGFP היה ניכר תחת סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי. איור 1E-F מראה דוגמה ב-E3 כאשר דוקס הוחל ב-E2. מקטעים רוחביים אישרו את מיקומם של תאי EGFP המבטאים (EGFP+) בצד אחד של המוח האחורי (איור 1G-H). בנוסף, נמצאה קבוצה של תאים שעברו טרנספקציה קדמית לאוטוציסט; אלה היו תאי צמרת עצבית גולגולתית שנדדו באופן גחוני מהתעלה העצבית (איור 1F). עוברים אלקטרופורטיים יכולים גם להיות מודגרים זמן רב יותר כדי לחקור היווצרות מעגלים בשלבים מאוחרים יותר. ב-E15, EGFP נצפה בגזע המוח, אך רק בצד הטרנספקטי (איור 1I-J). חתכים ברמה של גזע המוח הגבי הדגימו קומץ נוירונים מסוג EGFP+ שהיו מפוזרים ב-NM בצד האלקטרופורציה (איור 1L). סיבי EGFP+ נצפו מקרינים למטרה של נוירוני NM: הגרעין הגבי למינריס (NL) בצד האיפסילטרלי (איור 1L) וה-NL הגחוני בצד הנגדי (איור 1K). ההשפעה של Fmr1 shRNA אומתה על-ידי הפחתה ניכרת בפעילות החיסונית של FMRP בתאי עצב NM שעברו טרנספקציה, בהשוואה לנוירונים שכנים שאינם טרנספקציה (איור 1M-N). בגנגליון השמיעתי (AG), תאי עצב לא עברו טרנספקציה (EGFP-), אף על פי שחלק מתאי הגליה המקיפים את תאי העצב של AG היו EGFP+ (איור 1O-P), ככל הנראה מקורם בתאי הצמרת העצבית הגולגולתית EGFP+ (ראו איור 1F). לפיכך, אסטרטגיית אלקטרופורציה זו מספקת טרנספקציה סלקטיבית של הנוירונים הפוסט-סינפטיים במעגל AG-NM.

נפילת FMRP בצינור השמיעה
תערובת הפלסמיד הוזרקה לאוטוציסט ב-HH13 (איור 2A), ולאחר מכן האלקטרופורציה על ידי הצבת הצד החיובי של האלקטרודה קדמית לאוטוציסט והצד השלילי אחורי לאוטוציסט (איור 2B). מקטעי ראש שלם ב-E6 הדגימו פלואורסצנטיות חזקה של EGFP באוטוציסט הימני, אך לא בגזע המוח (איור 2C). צינורות שמיעתיים מבודדים ב-E9 הציגו פלואורסצנטיות נרחבת של EGFP לכל אורך הצינור (איור 2D-E). בחתכים רוחביים, תאי EGFP+ אושרו בפפילה הבזילרית (BP) לאורך דופן צינור השבלול וב-AG (איור 2F-G). ההשפעה של Fmr1 shRNA אומתה על-ידי הפחתה ניכרת בפעילות החיסונית של FMRP בתאי שערה שעברו טרנספקציה (*, איור 2H-J) בהשוואה לתאי שערה שכנים שאינם מותמרים (•, איור 2H-J). עבור תאים תומכים, הפעילות החיסונית של FMRP הייתה חלשה הן בתאים שעברו טרנספקציה והן בתאים שאינם מותמרים (איור 2H-J). בדומה לתאי שערה, הפעילות החיסונית של FMRP פחתה במידה רבה בתאי עצב מסוג AG שעברו טרנספקציה, בהשוואה לתאי עצב שכנים שאינם טרנספקטיים (איור 2K-M).

לאחר מכן עקבנו אחר ההקרנה המרכזית של נוירוני AG שעברו טרנספקציה לגזע המוח דרך עצב השמיעה. תבנית הפסיפס של טרנספקציה של Fmr1 shRNA ב-AG אושרה עוד יותר ב-E6 באמצעות פעילות חיסונית של Islet-1 (איור 3A), סמן לאוזן הפנימית המתפתחת של התרנגולת31. כאשר חלק מה-AG הוצא עם גזע המוח במהלך דיסקציה, נוירוני EGFP+ AG מבודדים והסיבים שלהם בתוך גזע המוח הודגמו באתרם באותם תכשירים (איור 3B-C). במקטעים רוחביים ברמת ה-NM, EGFP+ ANFs הגיעו ל-NM ב-E9 (איור 3D) ונצפו ברציפות ב-E15 וב-E19 (איור 3E-F). תמונות בהגדלה גבוהה חשפו סופים דמויי חרוט גדילה של ANFs ב-E9 (איור 3H), שיצרו את הקצה הגדול דמוי כף היד ב-E15 לפני שהם גדלו לתוך הקצה המאופיין של המורפולוגיה של הלד עם ענפים מורכבים ב-E19 (איור 3I-J). מעבר ל-NM, ענפים נרחבים של ANFs נצפו גם ב-NA, גרעין שבלול ראשוני נוסף (איור 3E). זה היה צפוי, שכן אותם ANFs דו-קרבים כדי להחדיר גם את ה-NM וגם את ה-NA בתרנגולות32. ראינו גם סיבי EGFP+ נכנסים לקבוצות תאי שיווי המשקל הסמוכות, כולל גרעין שיווי המשקל היורד (VeD) כפי שמוצג באיור 3E. למרות שביצענו אופטימיזציה של המיקום של האלקטרודה האלקטרופוראטית כדי לכוון באופן מועדף לחלק הקדמי של האוטוציסט שבו נוצר AG, כמה נוירונים גנגליון שיווי משקל היו גם transfected. ניתן להשתמש ב-Immunostaining עבור parvalbumin, סמן ל-ANFs בתרנגולות, כדי להבדיל בין סיבים שמיעתיים לעומת סיבי שיווי משקל בגזע המוח (איור 3F-G).

לסיכום, אסטרטגיית אלקטרופורציה זו מספקת טרנספקציה סלקטיבית של הנוירונים הקדם-סינפטיים במעגל AG-NM וניתן להשתמש בה כדי לעקוב אחר התפתחות האנדבולב של Held ברמות מסוף בודדות לאחר מניפולציות גנטיות.

Figure 1
איור 1. נוקאאוט FMRP בעוף NM. (A) תמונה של הגדרת אלקטרופורציה. (B) שרטוט סכמטי המציג את אתר המיקרו-הזרקה ברמת r5/6 של עובר עוף HH12. קיצורים: NT = צינור עצבי; SO = סומיט. (C) לנראות משופרת, דיו הודי (שחור) הוזרק מתחת לעובר עם מזרק. תערובת פלסמיד צבועה בירוק מהיר הוזרקה לאחר מכן לומן של הצינור העצבי. (D) מיקום האלקטרודה הדו-קוטבית לאלקטרופורציה. + ו - מציינים את הצדדים החיוביים והשליליים, בהתאמה. שימו לב, תערובת הפלסמיד הכחולה התפזרה לתוך הצינור העצבי בצד החיובי לאחר האלקטרופורציה. (E-F) תמונת שדה בהיר (BF) (E) התמזגה עם ערוץ EGFP (F) של עובר עוף אלקטרופוריאלי ביום העוברי 3 (E3), והראתה טרנספקציה בצינור העצבי באותה רמה אנטרופוסטרית של האוטוציסט. דוקס הוחל ב- E2, 6 שעות לאחר האלקטרופורציה. תאי צמרת עצבית גולגולתית נודדת (CNC) מסומנים על ידי החץ הצהוב ומוגדלים בכניסה ב- F. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר ב- E, חל על E ו- F; 100 מיקרומטר בכניסה. (ז-ה) תאים שעברו טרנספקציה עם Fmr1 shRNA ו-EGFP בחתך של עובר E3 שעבר טרנספקציה. תאי EGFP+ היו כלואים בצד אחד של התעלה העצבית. החלק הוכתם פעמיים בתגובתיות חיסונית של FMRP (אפור). סרגל קנה מידה = 40 מיקרומטר ב- G, חל על G ו- H. (I-J) תמונת BF (I) התמזגה עם ערוץ EGFP (J) של גזע מוח E15 לאחר טיפול ב- Dox ב- E8. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ ב- I, חל על חתך רוחב I ו- J. (K-L) של גזע מוח E15 עם נוירונים EGFP+ NM בצד הטרנספקט (טרנס) בלבד. בצד הקונטרלטרלי (קונטרה) (K), אקסונים של EGFP+ נצפו בחלק הגחוני של גרעין הלמינריס (NL). (מ-נ) תמונות בהגדלה גבוהה של NM ב-E19 עם תיוג כפול של FMRP (אדום) ו-SNAP25 (כחול) של סימני חיסון. SNAP25 הוא סמן קדם-סינפטי המסמן את הנורה הסופית של Held. שים לב להפחתה הניכרת של הפעילות החיסונית של FMRP בתאי העצב הטרנספקטיים (ירוק; *) בהשוואה לנוירונים שכנים שאינם מותמרים (•). (או-פי) תמונות הגדלה גבוהות של גנגליון השמיעה (AG) ב- E19 עם פעילות חיסונית FMRP. נוירוני AG (AGN) לא עברו טרנספקציה (EGFP-). חלק מתאי הגליה שמקורם בתאי CNC המצוינים ב-F עברו טרנספקציה. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר ב- M, חל על M-P. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2. נפילת FMRP בצינור השמיעה של העוף. (A) תמונת שדה בהיר (BF) המציגה את המיקרו-הזרקה של פלסמידים לתוך האוטוציסט ב-HH13. דיו הודי (שחור) הוזרק מתחת לעובר כדי לשפר את הראות. (B) מיקום האלקטרודה הדו-קוטבית לאלקטרופורציה. הצד החיובי (מסומן בסמל פלוס, +) הוצב קדמית לאוטוציסט, והצד השלילי (מסומן בסמל מינוס, -) הוצב אחורית לאוטוציסט. (C) חתך רוחבי של ראש תרנגולת ב-E6 עבר כתם חיסוני עבור FMRP (אדום) ונוירופילמנט (NF; כחול). דוקס הוחל ב-E3 בעקבות האלקטרופורציה. פלואורסצנציה של EGFP זוהתה באוטוציסט אך לא בגזע המוח. סרגל קנה מידה = 100 μm. (D-E) תמונת BF (D) מוזגה עם ערוץ EGFP (E) של צינור שמיעה ב- E9. סרגל קנה מידה = 500 μm. (F-G) חתך רוחבי של צינור שמיעה E9 עם FMRP (אדום) ו- NF (כחול) אימונוסטינינג. תאי EGFP+ נצפו בדופן צינור השבלול, בפפילה בזילרית (BP) ובגנגליון השמיעה (AG). סרגל קנה מידה = 50 μm ב- F, חל על F ו- G. (H-J) תמונות הגדלה גבוהות של E9 BP המציגות פעילות חיסונית FMRP מופחתת במידה רבה בתאי שערה מותמרים (HCs; *) בהשוואה ל- HCs שאינם מותמרים (•). סיבים חיוביים ל-NF (כחול) היו העצבנות ההיקפית של נוירוני AG. (ק-מ) תמונות בהגדלה גבוהה של נוירוני AG ב-E9 עם חיסון FMRP (אדום). הפעילות החיסונית של FMRP הייתה חזקה בתאי עצב שאינם מותמרים (•) ולא ניתן היה לזהות אותה בתאי עצב שעברו טרנספקציה (EGFP+; *). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר ב- H, והוא חל על H-M. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3. מעקב אקסונאלי אחר נוירוני AG שעברו טרנספקציה בגזע המוח. העוברים עברו אלקטרופוזה ב-HH13 לצורך העברה אוטוציסטית של Fmr1 shRNA. יישום Dox התחיל ב- E2. (A) מקטעים רוחביים של ראש עוף E6 עם איון-1 וכתם נגדי של DAPI. תאי EGFP+ ניכרו בגנגליון השמיעתי (AG). כוכבים* מציינים מספר נוירוני AG שעברו טרנספקציה בכניסה. סרגל קנה מידה = 100 μm ב- A ו- 10 μm בכניסה. (ב-ג) תמונת שדה בהיר (BF) (B) התמזגה עם ערוץ EGFP (C) של גזע מוח E9. במקרה זה, חלק מה-AG (חיצים לבנים) נותר מחובר לגזע המוח השמיעתי. חץ צהוב מציין נוירוני AG (AGN) שעברו טרנספקציה בכניסה. סיבי EGFP+ ניכרו בצד הטרנספקטיבי של גזע המוח. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ ב- B, חל על B ו- C; 100 מיקרומטר בכניסה. (D) חתך רוחב של גזע המוח E9 ברמה המצוינת ב-C על ידי הקו המקווקו. סיבי עצב השמיעה EGFP+ (ANF; ירוק) השתרעו לאורך השוליים הגביים של גזע המוח והתקרבו לגרעין מגנוצלולריס (NM). סרגל קנה מידה = 100 μm. (E-G) סיבי EGFP+ ב- E15 (E) ו- E19 (F-G). חלק מהסיבים נצפו גם בגרעין הזוויתי (NA) ובגרעין שיווי המשקל היורד (VeD). מקטעי E19 הוכתמו עבור פעילות חיסונית של פרוואלבומין (PV) כסמן ל-ANFs. התיבה המקווקועת ב-F מוגדלת במערכים, ומציגה EGFP+ ANF, שהיה PV אימונו-אקטיבי. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר ב- E; 50 מיקרומטר ב-F, חל על F ו-G; 2 מיקרומטר במערכים. (ח-י) תמונות הגדלה גבוהה של מסופי ANF ב-NM ב-E9, E15 ו-E19, מראות את היווצרותה וההבשלה המתקדמת של הנורה של הלד. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר ב- H, חל על H-J. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי לקבוע את הפונקציה התאית-אוטונומית של FMRP, יש צורך במניפולציה של הביטוי שלה בקבוצות תאים בודדות או בסוגי תאים. מכיוון שאחד התפקידים העיקריים של FMRP הוא לווסת את ההיווצרות והפלסטיות הסינפטית, מניפולציה סלקטיבית של כל רכיב סינפטי של מעגל מסוים היא תנאי מוקדם להבנה מלאה של מנגנון FMRP בתקשורת סינפטית. באמצעות אלקטרופורציה של עופות ב-ovo, הדגמנו שיטה למיקוד ביטוי FMRP במעגל AG-NM, בין אם בנוירוני AG קדם-סינפטיים או בנוירוני NM פוסט-סינפטיים. כדי להשיג זאת, בחירת שלבי התפתחות מתאימים לאלקטרופורציה ומיקום מדויק של אלקטרופורציית האלקטרופורציה על העובר הם שלבים קריטיים. נוירוני NM נובעים מאבות עצביים בתעלה העצבית ברמת r5/6 ב- HH1223. באותו שלב, תאי הצמרת העצבית הגולגולתית נודדים מהקצה הגבי של התעלה העצבית אל הגנגליון השבלול כדי לעטוף נוירוני AGעתידיים 33. לפיכך, הן נוירוני NM והן תאי הגליה ב- AG נגזרים מצינור עצבי. לעומת זאת, תאי שיער ונוירונים מסוג AG מקורם באקטודרם24. האקטודרם הסמוך לרמת r5/6 מתעבה ב-HH10 ולאחר מכן מתעבה כדי ליצור את הגביע האוטי ב-HH13. לאחר מכן הגביע האוטי נסגר ונפרד מהאקטודרם ליצירת האוטוציסט, כאשר החלק הקדמי הופך לאיבר החישה השמיעתי והחלק האחורי תורם למערכת שיווי המשקל. הן בחלק השמיעתי והן בחלק הוסטיבולרי, תאי הנוירובלסט השוכנים בחלק הגחוני של הגביע האוטיסטי מתפרקים ונודדים ליצירת גנגליון שבלול. בהתבסס על מחקרי מיפוי גורלות אלה, שינינו את אבותיהם של נוירוני NM על-ידי אלקטרופולציה של הצינור העצבי ב-HH12, אסטרטגיה שנקבעה בעברב-26,28,34. למרות שאסטרטגיה זו מובילה להעברה נוספת של תאי גליה בגזע המוח וב-AG, אף אחד מתאי העצב של AG לא עבר טרנספקציה. העברה ספציפית לנוירונים יכולה להיות מושגת על ידי שימוש באסטרטגיה מונעת קידום Atoh1, כמו מה שעשינו בעבר21. לצורך העברה סלקטיבית של נוירוני AG, ביצענו אלקטרופוטציה של האוטוציסט ב-HH13. פלסמידים שהוזרקו לתוך הכוס האוטית נכנסו בעיקר לחלק הקדמי של האוטוציסט עבור תאי שיער וטרנספקציה של נוירון AG בו-זמנית בעת מיקום אלקטרודות כפי שמוצג באיור 2B. כדי להעדיף תאי עצב מסוג AG על פני תאי שערה, ניתן להזריק את תמיסת הפלסמיד היישר לאזור הסמוך לאוטוציסט הקדמי, שם נמצאים הנוירובלסטים הדלמינציה35. עם זאת, לשיטה זו יש יעילות נמוכה יותר של טרנספקציה של נוירון AG בהשוואה להזרקת אוטוציסט, שכן הפלסמידים מתפזרים במהירות לאחר ההזרקה. שיטה זו עשויה גם להוביל להעברה נוספת של התאים המזנכימליים של הראש שמסביב. שיטה אחת להעדיף תאי שערה על פני נוירונים מסוג AG היא לעכב את הזרקת האוטוציסט והאלקטרופורציה ל-HH18 (שהוא ~עובר יום 3), מכיוון שרוב הנוירובלסטים (מבשרי נוירונים AG) נדדו החוצה מהאוטוציסט בשלבזה 24.

עם שינויים, שיטה זו ניתן להרחיב כדי ללמוד את מערכת שיווי המשקל. עבור טרנספקציה של גנגליון שיווי משקל, יש להפוך את כיוון האלקטרודות המוצגות באיור 2B כדי להעביר את החלק האחורי של האוטוציסט בשל המיקום המובהק של מבשרי גנגליון שמיעתיים ושיווי משקל.

ב ovo אלקטרופורציה של עוברי עוף היא טכניקה מבוססת היטב לחקר שלבים מוקדמים של התפתחות (בתוך השבוע הראשון של הדגירה). עבור מחקרים ארוכי טווח, שיעור ההישרדות הוא דאגה מרכזית. כאשר מתחילים טיפול דוקס ב- E8, שיעור ההישרדות שנמצא כאן הוא ~ 60% ב- E9, אך יורד ל -30% ב- E15, ואף נמוך יותר ב- E19. אבקועים מביצים חשמליות אפשריים אך נדירים ויכולים לשרוד רק מספר ימים ברוב המקרים. כדי להגדיל את שיעור ההישרדות, יש לשקול את הדברים הבאים: 1) להשתמש אלקטרופורטור המספק גלים מרובעים במקום גלים חדים; 2) להחיל טיפה אחת או שתיים של PBS סטרילי על החלק העליון של העובר אם שכבת האלבומין אינה עבה מספיק כדי לקדם מוליכות חשמלית (זה יעזור להפחית את הטראומה החשמלית); 3) פתיחת קרום הוויטלין לחשיפת העובר במקום ההזרקה אינה נדרשת לצורך העברה מוצלחת ועלולה לפגוע בעובר; 4) כדי להפחית את הסיכון לזיהום, השתמש במזרק כדי לתקוע את הפרפילם ולתת דוקס במקום לפתוח מחדש את החלון. לאחר ההזרקה, לנגב את הסרט השקוף עם 75% אתנול ולכסות את פתח המחט עם סרט; 5) עבור טרנספקציה של אוטוציסט, להזריק פלסמידים לתוך האוטוציסט dorsolaterally עם פיפטה זוויתית 45° כדי למנוע נקב אפשרי של אבי העורקים dorsalis מתחת. אם אבי העורקים dorsalis פגום, דימום יהיה לשטוף את הפלסמידים ואף לגרום למוות; 6) במידת האפשר, הימנעו משימוש בדיו הודי כדי לדמיין את העובר. פחות טיפול ופחות הליכים יביאו לשיעור הישרדות גבוה יותר.

בנוסף ליכולת לבצע טרנספציה סלקטיבית של נוירוני AG או NM, אלקטרופורציה של ovo מספקת מערכת ייחודית המאפשרת השוואות שכנות לניתוחי נתונים. לאחר אלקטרופורציה, רק תת-קבוצה של תאים ב-NM או ב-AG עוברת טרנספקציה, מה שמאפשר לתאים הלא-טרנספקטיביים הסובבים באותה קבוצת תאים לשמש כבקרהאידיאלית 20. אם אינטראקציה פוטנציאלית בין נוירונים שכנים היא דאגה, עמיתים נוירונים מהצד הלא טרנספקטיבי של האוזן והמוח יכולים לשמש כבקרה נוספת. עבור מחקרים היסטולוגיים והדמיה, תוצאה זו מאפשרת ניתוח נתונים ביעילות גבוהה ברמת התא הבודד או הסיבים הבודדים. ניתוחים מולקולריים אפשריים גם בשילוב עם מיון תאים מבוסס פלואורסצנט וניתוחי חלבונים ורנ"א בקנה מידה גדול כגון ספקטרומטריית מסה וריצוף הדור הבא. עם זאת, השימוש באלקטרופורציה של אובו כאמצעי לעריכת גנים עשוי להיות מאתגר עבור מחקרים פונקציונליים והתנהגותיים מכיוון שאחוז התאים שעברו טרנספקציה בתוך קבוצת תאים עשוי שלא להיות גדול מספיק כדי לגרום לתוצאות פונקציונליות.

חיוני לבצע שני ניתוחי אימות בעת אימוץ גישת האלקטרופורציה in ovo. ראשית, יש לאשר את ההשפעה של עריכת גנים על החלבון המעניין. באלקטרופורציה של אובו מעבירה רק תת-קבוצה של נוירונים ב-NM או ב-AG (כלומר, תבנית פסיפס). ביצוע כתם מערבי על רקמות הומוגניות המכילות תערובת של נוירונים טרנספקטים ולא טרנספקטיביים אינו רגיש מספיק כדי לשקף במדויק את אפקט ההדחה. לפיכך, האימות חייב להתבצע ברמת התא הבודד באמצעות שיטות כגון אימונוציטוכימיה. לשם כך, יצרנו בעבר נוגדן המזהה FMRP עוף. הספציפיות של נוגדן זה אומתה על ידי אימונוציטוכימיה וכתם מערבי במחקר קודם30. ההשפעה של Fmr1 shRNA אומתה באופן כמותי על ידי התבוננות בהפחתה משמעותית בעוצמת הפעילות החיסונית של FMRP בנוירוני NM שעברו טרנספקציה, בהשוואה לנוירונים שכנים שאינם טרנספקציה. שנית, יש להשתמש בקבוצות ביקורת המשתמשות ב-RNA מקושקש, או במבני בקרה אחרים, כדי לאשר את הספציפיות של ההשפעות התאיות הנצפות של ביטוי שגוי של FMRP20,21. כדי להשיג מטרה זו, תכננו shRNA מקושקש, שיבטנו אותו לאותה מערכת וקטורית Tet-On, וביצענו אלקטרופוזה למבשרי NM, כפי שתואר קודםלכן 20. ביטוי ה-FMRP בתאי העצב של NM שעברו טרנספקציה עם ה-shRNA המקושקש לא הושפע, כפי שמעידה העוצמה הבלתי משתנה של הפעילות החיסונית של FMRP בהשוואה לנוירונים שכנים שאינם מותמרים. זיהינו גם מספר השפעות של טרנספקציה של Fmr1 shRNA על גדילה אקסונאלית, גיזום דנדריטי, היווצרות מסוף והעברה עצבית (נסקרה ב- Curnow and Wang, 2022)36. הסקנו שההשפעות האלה הושרו במיוחד על-ידי אובדן אוטונומי של FMRP מאחר שה-shRNA המקושקש לא הצליח לגרום לשינויים דומים.

לסיכום, טכניקת האלקטרופורציה in ovo מאפשרת עריכת גנים סלקטיבית של Fmr1 עם בקרה זמנית וספציפיות רכיבים במעגלי גזע האוזן-מוח השמיעתיים וניתן לשנות אותה כדי לתפעל את מערכת שיווי המשקל. פיתוח טכנולוגיה מתקדמת זו בעובר העוף, מודל מבוסס היטב בביולוגיה התפתחותית, תרם וימשיך לתרום להבנתנו את התפתחות המוח בתנאים נורמליים ולא תקינים כגון FXS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי: מענק של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '32000697); תוכנית המדע והטכנולוגיה של גואנגג'ואו (202102080139); קרן גואנגדונג למדעי הטבע (2019A1515110625, 2021A1515010619); קרנות המחקר הבסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות (11620324); מענק מחקר של מעבדת מפתח לרפואה רגנרטיבית, משרד החינוך, אוניברסיטת ג'ינאן (לא. ZSYXM202107); קרנות המחקר הבסיסיות של האוניברסיטאות המרכזיות של סין (21621054); וקרן המחקר המדעי הרפואי של מחוז גואנגדונג בסין (20191118142729581). אנו מודים למרכז הניסויים הרפואי של אוניברסיטת ג'ינאן. אנו מודים לד"ר טרה בראדלי על העריכה הקפדנית של כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Egg incubation
16 °C refrigerator MAGAT Used for fertilized egg storage.
Egg incubator SHANGHAI BOXUN GZX-9240MBE
Fertilized eggs Farm of South China Agricultural University Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge Sigma 10016
Fast green Solarbio G1661 Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit QIAGEN 12162 Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889 Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator BTX ECM399
1 mL / 5 mL Syringe GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope CNOPTEC SZM-42
Doxcycline Sigma-Aldrich D9891 Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary BEIBOBOMEI RD0910 0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm PARAFILM PM996 transparent film
Pipette puller CHENGDU INSTRUMENT FACTORY WD-2 Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes Home made 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube Sigma-Aldrich A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps RWD F11020-11 Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools RWD
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW 01673921 For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat LEICA CM1850
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 From bovine skin.
Sliding microtome LEICA SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse Abcam ab150113 1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit Abcam ab150078 1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI Abcam ab285390 1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium Southern Biotech Sb-0100-01
FMRP antibody Y. Wang, Florida State University #8263 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody DSHB 39.3F7 1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate Corning 3478
Neurofilament antibody Sigma-Aldrich N4142 1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody Sigma-Aldrich P3088 1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody Abcam ab66066 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop ADOBE image editing software
Confocal microscope LEICA SP8
Fluorescent stereomicroscope OLYMPUS MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0 OlYMPUS commercial image processing software package

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).
  2. Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
  3. Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
  4. Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
  5. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  6. Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
  7. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  8. Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
  9. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  10. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  11. Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
  12. Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
  13. Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
  14. Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).
  15. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
  16. Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
  17. Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
  18. Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
  19. Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).
  20. Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
  21. Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
  22. Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
  23. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).
  24. Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
  25. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  26. Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).
  27. Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).
  28. Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  29. Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321 (2015).
  30. Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
  31. Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
  32. Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
  33. Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).
  34. Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).
  35. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
  36. Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628 (2022).

Tags

מדעי המוח גיליון 185 תסמונת X שביר מעגל חושי אוזן פנימית גרעין שבלול היווצרות סינפסה התפתחות המוח אנדבול של הלד עובר עוף
ניתוח תפקוד אוטונומי של תאים של חלבון פיגור שכלי X שביר במעגל שמיעתי על ידי אלקטרופורציה <em>של In Ovo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang,… More

Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang, X. Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation. J. Vis. Exp. (185), e64187, doi:10.3791/64187 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter