Summary

Рассечение клеточно-автономной функции хрупкого белка умственной отсталости X в слуховой цепи с помощью электропорации In Ovo

Published: July 06, 2022
doi:

Summary

Используя электропорацию ово , мы разработали метод селективной трансфекции слухового внутреннего уха и кохлеарного ядра у куриных эмбрионов для достижения специфического для клеточной группы нокдауна хрупкого белка умственной отсталости X в течение дискретных периодов сборки цепи.

Abstract

Хрупкий белок умственной отсталости X (FMRP) является мРНК-связывающим белком, который регулирует локальную трансляцию белка. Потеря или дисфункция FMRP приводит к аберрантной нейрональной и синаптической активности при синдроме хрупкого X (FXS), который характеризуется умственной отсталостью, сенсорными аномалиями и проблемами социальной коммуникации. Исследования функции FMRP и патогенеза FXS в основном проводились с нокаутом Fmr1 (ген, кодирующий FMRP) у трансгенных животных. Здесь мы сообщаем о методе in vivo для определения клеточно-автономной функции FMRP в период сборки цепи и синаптического образования с использованием куриных эмбрионов. Этот метод использует стадийную, участковую и направленную электропорацию векторной системы, индуцируемой лекарственным средством, содержащей небольшую шпильковую РНК Fmr1 (шРНК) и репортер EGFP. С помощью этого метода мы достигли селективного нокдауна FMRP в слуховом ганглии (AG) и в одной из его мишеней ствола мозга, ядре magnocellularis (NM), тем самым обеспечивая компонентно-специфическую манипуляцию в цепи AG-NM. Кроме того, мозаичный рисунок трансфекции позволяет проводить внутри животных контроль и сравнение соседних нейронов / волокон для повышения надежности и чувствительности при анализе данных. Индуцируемая векторная система обеспечивает временной контроль начала редактирования генов, чтобы свести к минимуму накапливающиеся эффекты развития. Сочетание этих стратегий обеспечивает инновационный инструмент для препарирования клеточно-автономной функции FMRP в синаптическом и схемном развитии.

Introduction

Синдром хрупкой Х (FXS) — это расстройство нервного развития, характеризующееся умственной отсталостью, сенсорными аномалиями и аутистическим поведением. В большинстве случаев FXS вызван глобальной потерей хрупкого белка умственной отсталости X (FMRP; кодируется геном Fmr1), начиная с ранних эмбриональных стадий1. FMRP представляет собой РНК-связывающий белок, который обычно экспрессируется в большинстве нейронов и глиальных клеток головного мозга, а также ворганах чувств 2,3,4. В мозге млекопитающих FMRP, вероятно, связан с сотнями мРНК, которые кодируют белки, важные для различных нейронных активностей5. Исследования обычных нокаутирующих животных Fmr1 показали, что экспрессия FMRP особенно важна для сборки и пластичности синаптической нейротрансмиссии6. Несколько условных и мозаичных нокаутных моделей дополнительно продемонстрировали, что действия и сигналы FMRP варьируются в разных областях мозга, типах клеток и синаптических участках во время нескольких событий развития, включая аксональную проекцию, дендритный паттерн и синаптическую пластичность 7,8,9,10,11,12,13,14 . Острая функция FMRP в регуляции синаптической передачи изучалась внутриклеточной доставкой ингибирующих антител FMRP или самой FMRP в срезах мозга или культивируемых нейронах 15,16,17,18. Эти методы, однако, не дают возможности отслеживать последствия, вызванные неправильной экспрессией FMRP, во время развития. Таким образом, разработка методов in vivo для исследования клеточно-автономных функций FMRP очень необходима и, как ожидается, поможет определить, являются ли зарегистрированные аномалии у пациентов с FXS прямыми последствиями потери FMRP в ассоциированных нейронах и цепях или вторичными последствиями, полученными из общесетевых изменений во время развития19.

Слуховой ствол мозга куриных эмбрионов предлагает уникально выгодную модель для углубленного функционального анализа регуляции FMRP в цепном и синапсовом развитии. Легкий доступ к эмбриональному куриному мозгу и хорошо зарекомендовавшая себя техника электропорации в ово для генетических манипуляций в значительной степени способствовали нашему пониманию развития мозга на ранних эмбриональных стадиях. В недавно опубликованном исследовании этот метод был объединен с передовыми молекулярными инструментами, которые позволяют временно контролировать неправильную экспрессию FMRP20,21. Здесь усовершенствована методология индуцирования селективных манипуляций с пресинаптическими и постсинаптическими нейронами по отдельности. Этот метод был разработан в слуховой цепи ствола мозга. Акустический сигнал обнаруживается волосковыми клетками в слуховом внутреннем ухе, а затем передается в слуховой ганглий (AG; также называемый спиральным ганглием у млекопитающих). Биполярные нейроны в АГ иннервируют волосковые клетки своими периферическими отростками и, в свою очередь, посылают центральную проекцию (слуховой нерв) в ствол мозга, где они заканчиваются двумя первичными кохлеарными ядрами, ядром magnocellularis (NM) и ядром angularis (NA). Нейроны в НМ структурно и функционально сопоставимы со сферическими кустистыми клетками антеровентрального кохлеарного ядра млекопитающих. В NM, слуховые нервные волокна (ANF) синапс на соматах nm нейронов через большую конечную бульбу Held terminals22. Во время развития нейроны NM возникают из ромбомеров 5 и 6 (r5/6) в заднем мозге23, в то время как нейроны AG получены из нейробластов, находящихся в отоцисте24. Здесь мы описываем процедуру селективного сбивания экспрессии FMRP в пресинаптических нейронах AG и в постсинаптических нейронах NM по отдельности.

Protocol

Яйца и куриные эмбрионы обрабатывались с осторожностью и уважением в соответствии с протоколами для животных, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Университета Цзинань. 1. Препарат яиц и плазмид Приготовление яицПолучите свежие ?…

Representative Results

Выполняя электропорацию ово на разных участках и на разных стадиях развития, мы добились селективного нокдауна FMRP либо на слуховой периферии, либо в слуховом стволе мозга. Нокдаун FMRP в NMМалая шпилька РНК (шРНК) против курицы Fmr1 была разработана и клон…

Discussion

Для определения клеточно-автономной функции FMRP необходимо манипулировать его экспрессией в отдельных клеточных группах или типах клеток. Поскольку одной из основных функций FMRP является регулирование синаптического образования и пластичности, избирательное манипу?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано: грантом Национального фонда естественных наук Китая (No 32000697); Научно-техническая программа Гуанчжоу (202102080139); Гуандунский фонд естественных наук (2019A1515110625, 2021A1515010619); Фонды фундаментальных исследований центральных университетов (11620324); Исследовательский грант Ключевой лаборатории регенеративной медицины, Министерство образования, Университет Цзинань (No. ZSYXM202107); Фонды фундаментальных исследований для центральных университетов Китая (21621054); и Фонд медицинских научных исследований китайской провинции Гуандун (20191118142729581). Благодарим медицинский экспериментальный центр Университета Цзинань. Мы благодарим доктора Терру Брэдли за тщательное редактирование рукописи.

Materials

Egg incubation
16 °C refrigerator MAGAT Used for fertilized egg storage.
Egg incubator SHANGHAI BOXUN GZX-9240MBE
Fertilized eggs Farm of South China Agricultural University Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge Sigma 10016
Fast green Solarbio G1661 Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit QIAGEN 12162 Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889 Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator BTX ECM399
1 mL / 5 mL Syringe GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope CNOPTEC SZM-42
Doxcycline Sigma-Aldrich D9891 Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary BEIBOBOMEI RD0910 0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm PARAFILM PM996 transparent film
Pipette puller CHENGDU INSTRUMENT FACTORY WD-2 Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes Home made 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Platinum elctrodes Home made 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube Sigma-Aldrich A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps RWD F11020-11 Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools RWD
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW 01673921 For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat LEICA CM1850
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 From bovine skin.
Sliding microtome LEICA SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse Abcam ab150113 1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit Abcam ab150078 1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI Abcam ab285390 1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium Southern Biotech Sb-0100-01
FMRP antibody Y. Wang, Florida State University #8263 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody DSHB 39.3F7 1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate Corning 3478
Neurofilament antibody Sigma-Aldrich N4142 1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody Sigma-Aldrich P3088 1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody Abcam ab66066 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop ADOBE image editing software
Confocal microscope LEICA SP8
Fluorescent stereomicroscope OLYMPUS MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0 OlYMPUS commercial image processing software package

References

  1. Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).
  2. Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
  3. Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
  4. Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
  5. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  6. Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
  7. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  8. Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
  9. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  10. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  11. Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
  12. Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
  13. Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
  14. Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).
  15. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
  16. Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
  17. Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
  18. Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
  19. Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).
  20. Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
  21. Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
  22. Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
  23. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).
  24. Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
  25. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  26. Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).
  27. Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).
  28. Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  29. Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321 (2015).
  30. Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
  31. Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
  32. Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
  33. Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).
  34. Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).
  35. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
  36. Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628 (2022).

Play Video

Cite This Article
Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang, X. Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation. J. Vis. Exp. (185), e64187, doi:10.3791/64187 (2022).

View Video